CN113030361A - 基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药品和个人护理用品(PPCPs)的高通量筛查和定量领域，具体涉及一种基于UHPLC‑MS/MS(超高效液相色谱‑串联质谱)技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，可以达到快速识别不同SPE柱适合处理水相中哪些PPCPs的目的。运用UHPLC‑MS/MS结合主成分分析、正交偏最小二乘判别分析、单变量分析等代谢组学分析方法，对于给定的多种不同SPE柱，寻找这些SPE柱对于多种PPCPs进行前处理后的“生物标志物”，达到识别这n种不同SPE柱分别适合在水相中对于所述m种PPCPs的具体哪些PPCPs进行前处理的目的，为水环境中PPCPs前处理过程选取合适的SPE柱，从而获得理想的前处理效果提供一种参考方法。
Description
技术领域
本发明属于药品和个人护理用品(PPCPs)的高通量筛查和定量领域，具体涉及一种基于 UHPLC-MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱)技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，可以达到快速识别不同SPE柱适合处理水相中哪些PPCPs的目的。
背景技术
近年来，随着越来越多的药品和个人护理用品(PPCPs)在水环境中的不断检出，对PPCPs 高通量筛查和准确定量获得了分析化学和环境科学等领域研究人员的广泛关注。前人在对 PPCPs的研究中，采用不同的前处理方法，获得了良好的筛查和定量结果。固相萃取(SPE) 柱的选择作为前处理过程中重要一环，对PPCPs的筛查和定量起到决定性作用。选取合适的用于富集目标PPCPs的SPE柱，可能对PPCPs的后续分析起到决定性作用。随着商品柱的不断发展，适用于更宽pH范围和更多种类PPCPs的SPE柱获得了青睐。在PPCPs前处理过程中，往往多种具有相似功能的SPE柱可供选择。通过测定每一个/类PPCPs在功能相近的不同SPE柱上的回收率，确实可以找到最适合该(类)化合物前处理过程的SPE柱，但随着 PPCPs种类和数量剧增，以及商业化SPE柱的不断出现，逐个/类筛查这种方法带来的工作量相当巨大。究其原因，缺少一种能够全面、快速、准确地判断出特定环境条件下，目标PPCPs 选择何种SPE柱能够具有相对良好的前处理效果的高通量识别方法。
代谢组学作为基因组学、转录组学和蛋白质组学等之后发展快速的一门新兴组学方法，已被广泛应用于食品掺假、疾病治疗、植物学和毒理学等领域。该方法依托高通量、高分辨率、高精度的现代化分析仪器，通过海量数据处理，进行信息提取和结果分析。代谢组学研究产生大量的数据，这些数据具有高维、小样本、高噪声等复杂特征。如何从复杂的代谢组学数据中提取出有价值的信息，筛选出潜在的“生物标志物”成为近年来代谢组学研究的热点和难点。
目前，代谢组学分析技术主要为核磁共振(NMR)、气相色谱质谱联用(GC-MS)和高效液相色谱质谱联用(LC-MS)等。NMR技术是在定性同时又能在微摩尔浓度下定量有机化合物的技术，但该方法灵敏度相对较低，不适合分析数量大、含量低的代谢物。NMR技术对样品纯度要求很高，同时对样品量要求也较大，限制了NMR技术在代谢组学中的应用。GC-MS技术满足同时具有较高分辨率和灵敏度，其最大优势在于具有可检索的质谱库。在对挥发性化合物测定时，需要对样品进行衍生化，该过程可能时间较长，而且复杂的衍生过程中存在的其他副反应可能造成较大实验误差。LC-MS相比GC-MS的一个巨大优势是前者不需要对非挥发性物质进行衍生化，从而有效节省分析时间。另外，LC-MS在分析极性更大和相对分子质量更高化合物时具有优势。近年来，高分辨质谱应用于代谢组学研究发展迅速，其为检测的代谢物离子提供更高的质量精度。高分辨质谱通过全扫描模式获得所测样本代谢物的所有母离子信息，有助于解析代谢物结构及元素组成，因而可用于代谢组学中潜在“生物标志物”的鉴定。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，运用UHPLC-MS/MS结合代谢组学分析方法，对于给定的多种(设为n种)不同SPE柱，寻找这些SPE柱对于多种(设为m种)PPCPs进行处理后的“生物标志物”，达到识别这n种不同SPE柱分别适合在水相中对于所述m种PPCPs的具体哪些PPCPs进行前处理的目的，为水环境中PPCPs前处理过程选取合适的SPE柱，从而获得理想的前处理效果提供一种参考方法。
在本发明中，“生物标志物”是指PPCPs经某种SPE柱进行前处理后产生的“代谢物”中，经过UHPLC-MS/MS测试后，相对其他SPE柱能明显检测出的特异性标志物。“代谢物”中的具体物质种类可以体现在经过UHPLC-MS/MS测试后获得的色/质谱数据矩阵中的变量 (具体为包含分子量和出峰时间信息的质谱峰)中，也对应特定种类的PPCPs。“生物标志物”可以体现特定SPE柱对于特定种类的PPCPs具有显著高于其他SPE柱的回收率，适合用于该种类PPCPs的前处理。
本发明的具体方案如下：
S1：PPCPs和SPE柱的选取：选取要检测的m种不同的PPCPs和n种不同的SPE柱；
S2：样品制备：将要检测的m种PPCPs标准品用甲醇配制成混合标准溶液，混合标准溶液中各种类的PPCPs浓度(质量体积浓度)相等，优选1mg/L，将混合标准溶液用超纯水定容，制备成特定浓度(优选50μg/L)的水样；
S3：样品检测：将水样分别经n种不同的SPE柱前处理，每种SPE柱设定若干个平行样品，将每种SPE柱前处理后的若干个平行样品归为同一组，这样每一组前处理样品对应一种 SPE柱，获得n组前处理样品；每一个前处理后的样品分别取出等量体积的溶液进行涡旋混匀，作为质控(QC)样品在UHPLC-MS/MS检测过程中分别安排到每组前处理样品的检测之后，用于考察仪器稳定性，优选每组前处理样品安排3个以上质控样品；将包含质控样品的n组前处理样品进行超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测，获得检测数据；
S4：数据分析：将获得的检测数据进行处理，处理后的数据通过代谢组学分析，获得每组样品的“生物标志物”，即测试的m种PPCPs经每种SPE柱进行前处理后的“生物标志物”，鉴定“生物标志物”对应的PPCPs种类；由于每组样品对应一种SPE柱，所以每组样品获得的“生物标志物”对应的PPCPs种类，即为所测试的m种PPCPs中，在水环境中适合采用该组样品的SPE柱进行前处理的PPCPs种类。
上述方法中，所述n种不同的SPE柱可以为不同品牌的SPE柱，也可以为品牌相同但柱填料量或/和柱容量不同的SPE柱，也可以以上二种情况结合。
优选的，所述步骤S3中SPE柱前处理的方法包括以下步骤：
(1)活化：用甲醇活化SPE柱；
(2)平衡：加入超纯水，在重力作用下自然滴下，保持SPE柱始终湿润；
(3)上样：将柱管用转接头连接于SPE柱上方，将步骤S2中制成的水样转移至管中，在真空泵的作用下上样，上样结束后将SPE柱中的液体抽干；
(4)淋洗：在真空泵的作用下，用超纯水淋洗，然后将SPE柱中的液体抽干；
(5)洗脱：在重力作用下，用甲醇-乙腈混合液洗脱若干次，合并洗脱液，氮气吹干，用甲醇-水溶液复溶并过滤，获得经该种SPE柱前处理之后的前处理样品。
上述方法中，所述步骤S3中进行超高效液相色谱-串联质谱检测可采用适用于所述的m 种PPCPs水相检测和分辨的参数和条件，本领域技术人员可以根据实际需要分析的PPCPs种类进行调整。
优选的，所述步骤S4中处理检测数据的方法为：将所有样品的色/质谱分析结果采用 XCMS软件进行峰自动检测、峰对齐与保留时间校准，再对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，将质控(QC)样品中相对标准偏差>30％的无效变量剔除，获得横坐标为变量名称、纵坐标为样品名称的数据矩阵，矩阵中横坐标的“变量”是指质谱检测出的物质，包括质谱峰的分子量和出峰时间信息，“变量”对应的是测试的PPCPs经过SPE柱进行前处理后获得“代谢物”中物质的种类，矩阵中记录的数据即为经过归一化、中心化、尺度化和数据转换后的峰强度数据。
上述方法中，步骤S4中的通过代谢组学分析，获得每组样品的“生物标志物”可按以下方法进行：
首先，可以采用无监督的模式识别方法—主成分分析(principal componentanalysis,PCA) 进行数据处理，在获得的PCA得分图中，可以通过观察QC样品的空间分布判断数据质量，如果QC样品紧密聚集则证明数据质量高。还可以通过各组前处理样品在PCA得分图的组间分离程度，分析所述的n种不同SPE柱处理m种不同PPCPs的结果差异性，如果彼此分离明显，则可以推断根据n种SPE柱处理m种PPCPs后的回收率结果可能是具有显著差异的，说明寻找每种SPE柱特有的“生物标志物”具有潜在可能。
之后采用有监督模式识别方法—正交偏最小二乘判别分析(orthogonalprojections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)进一步处理。对于第i组(1≤i≤n)前处理样品，将第i组样品和其余的n-1组样品划分为两个大组进行OPLS-DA分析，通过OPLS-DA的 Permutations图判断OPLS-DA模型是否过度拟合，划定S-plot图中变量置信度绝对值>0.9作为筛查“生物标志物”的临界值，将变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1 的变量对应的物质作为第i组样品的备选“生物标志物”。
最后，进行单变量分析：通过比较数据矩阵中备选“生物标志物”对应变量在n组SPE 柱样品中的峰强度值，筛选出第i组SPE柱样品的备选“生物标志物”中峰强度与其余的n-1 组SPE柱样品有显著差异性(即P值小于0.05)的物质/变量，作为第i组样品的“生物标志物”，也即第i组样品对应的SPE柱的“生物标志物”。由此可获得每一组样品的“生物标志物”。
本发明的有益效果：本发明运用UHPLC-MS/MS结合代谢组学方法，通过寻找不同SPE 柱对多种PPCPs处理后的“生物标志物”，达到识别不同SPE柱适合处理水相中哪些PPCPs 的目的，为水环境中PPCPs前处理过程选取合适的SPE柱从而获得理想的前处理效果提供一种参考方法。本方法同样适用于其他基质，如食品、土壤、沉积物、动植物等，能够快速、全面、准确地判断出特定环境条件下，多种目标PPCPs选择何种SPE柱会具有相对理想的前处理效果。
附图说明
图1为本发明实施例中64种PPCPs经5种SPE柱处理后的总离子流图。
图2为本发明实施例中5个样品组和QC样品的PCA得分图。
图3为本发明实施例中5个样品组OPLS-DA得分图。
图4为本发明实施例中样品组S-plot图。
图5为本发明实施例中样品组置换检验200次的Permutations图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行说明，实施例内容不作为对本发明保护范围的限制。
本发明实施例中采用的仪器、试剂与材料如下：
超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive plus，美国Thermo Fisher Scientific公司)，配可加热的电喷雾离子源(HESI)；固相萃取装置(Supelco-24，美国Supelco 公司)；氮吹仪(N-EVAP-112，美国Organomation公司)。
甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；乙腈(HPLC级，德国Merck公司)；甲酸(HPLC级，上海安谱科学仪器有限公司)；过滤膜(0.45μm，美国Agilent Technologies公司)；大体积柱管及连接转换头(25mL，天津艾杰尔科技有限公司)；Cleanert PEP-2(60mg/3mL，天津艾杰尔科技有限公司)；Oasis HLB(60mg/3mL，美国Waters公司)；ProElut PLS(60mg/1mL、60mg/3 mL、100mg/6mL，北京迪马科技公司)；超纯水经Milli-Q超纯水器纯化得到；64种PPCPs 类标准品信息如表1所示，其纯度均大于98.3％，分别购自于美国Sigma公司、美国FirstStandard公司、德国Dr.Ehrenstorfer公司及加拿大TRC公司。
表1 64种PPCPs基本信息
Table 1 Basic information of 64 PPCPs
表1 64种PPCPs基本信息
Table 1 Basic information of 64 PPCPs
本实施例运用UHPLC-MS/MS结合代谢组学方法，通过寻找5种不同SPE柱(CleanertPEP-2，60mg/3mL，天津艾杰尔科技有限公司；Oasis HLB，60mg/3mL，美国Waters公司；ProElut PLS，60mg/1mL、60mg/3mL、100mg/6mL，北京迪马科技公司)对64种PPCPs (如表1所示)处理后的“生物标志物”，达到识别不同SPE柱适合处理水相中哪些PPCPs 的目的。具体包括以下步骤：
S1：PPCPs和SPE柱的选取：选取要检测的64种不同的PPCPs和5种不同的SPE柱，具体种类如上所述；
S2：样品制备：首先，将64种PPCPs标准品用甲醇配制成浓度为100mg/L的储备液，再各取1mL，用甲醇定容至100mL，此时混合标准溶液浓度为1mg/L，放置在-18℃的冰箱中保存。取上述混合标准溶液50mL，用超纯水(pH＝7.0)定容至1L容量瓶中，即得到50μg/L 溶液(水样)，此时测定溶液pH值为7.0。
S3：样品检测：将水样分别经5种不同的SPE柱前处理，每种SPE柱前处理后的若干个平行样品归为同一组，获得5组前处理样品；每一个前处理后的样品分别取出等量体积的溶液进行涡旋混匀，作为质控样品在超高效液相色谱-串联质谱检测过程中分别安排到每组前处理样品之后；将5组前处理样品和质控样品进行超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS) 检测，获得检测数据；
具体来说，采用以下方法分别使用5种不同的SPE柱对水样进行前处理和UHPLC-MS/MS 测试：
活化：用3mL甲醇活化SPE柱；平衡：加入3mL超纯水，在重力作用下自然滴下，保持SPE柱始终湿润；上样：将25mL大体积柱管用转接头连接于SPE柱上方，将制备的50mL 水样转移至管中，在真空泵的作用下，以8～10mL/min的速度上样，上样结束后将SPE柱中的液体抽干；淋洗：在真空泵的作用下，用3mL超纯水淋洗，然后将SPE柱中的液体抽干；洗脱：在重力作用下，用1mL甲醇-乙腈(1:1,V/V)洗脱3次，合并洗脱液，于40℃下氮气吹干，用1mL20％(V/V)的甲醇-水溶液复溶，过滤后上机进行UHPLC-MS/MS检测。
每个SPE柱样品设置9次平行，共计9个结果，设定为一组。本研究涉及5种SPE柱，则共有5组样品，将PEP-2柱设定为组1，包括9个样品，分别为Sample 1-1,Sample 1-2,…Sample 1-9)。以此类推，Oasis HLB柱、ProElut PLS(60mg/1mL)柱、ProElut PLS(60mg/3mL) 柱和ProElut PLS(100mg/6mL)柱分别设为2～5组，对应样品名称分别为Sample组序号-1、 Sample组序号-2、…Sample组序号-9。将过滤后的5组SPE柱溶液(共计45个样品)每个样品中取出20μL混合到一起，涡旋混匀，作为质控(Quality Control,QC)样品。在每组SPE柱样品进行UHPLC-MS/MS检测后安排3个QC样品(共计15个，分别为QC 1,QC 2,…QC 15)的检测，用于考察仪器稳定性。
UHPLC-MS/MS检测的色谱条件为：色谱柱：Accucore RP-MS(柱长100mm×柱内径2.1mm,柱填料粒径2.6μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)；柱温：40℃；流动相A：0.1％(V/V)的甲酸-水溶液；流动相B：0.1％(V/V)的甲酸-甲醇溶液；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；分离梯度：5％B(0min)～5％B(2min)～30％B(7min)～90％B(11min)～90％ B(13min)～5％B(16min)。
UHPLC-MS/MS检测的质谱分析条件为：扫描模式：正离子模式；毛细管温度：320℃；加热温度：320℃；鞘气：N2，流速40arb；辅助气：N2，流速10arb；喷雾电压(spray voltage)：3200V；透镜电压：50V；扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2)，一级质谱参数设置：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标(AGC target)l×106，最大驻留时间(maximum IT)100ms，扫描范围m/z 100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，AGCtarget 2×105，最大驻留时间50ms。
S4：数据分析：
将5组SPE柱前处理后的样品和1组QC样品色谱-质谱检测结果(共计60个)中后缀为 raw的文件通过ProteoWizard软件转化为mzXML格式，进一步上传到Workflow4Metabolomics (W4M)平台(https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/)。图1是正离子模式下64种PPCPs 经过5种SPE柱前处理后在平台中XCMS软件中显示的总离子流图，可知不同SPE柱处理后结果差异比较明显，为接下来寻找不同SPE柱的“生物标志物”奠定了基础。采用平台中 XCMS软件进行峰自动检测、峰对齐与保留时间校准等，再对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，将QC样品中相对标准偏差>30％的无效变量剔除，获得4714×60的数据矩阵，横坐标为变量名称、纵坐标为样品名称。数据矩阵可用于进行下一步的数据分析。
将处理后的数据矩阵导入Simca 14.1软件进行多元统计学分析。首先，采用无监督的模式识别方法—主成分分析(principal component analysis,PCA)进行数据处理，之后采用有监督模式识别方法—正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projections tolatent structures discriminant analysis,OPLS-DA)进一步处理。通过OPLS-DA的Permutations图判断OPLS-DA 模型是否过度拟合，划定S-plot图中变量置信度绝对值>0.9作为筛查“生物标志物”的临界值，以其中变量投影重要性(variable importance inprojection,VIP)>1的变量作为潜在的备选“生物标志物”，再通过单变量分析筛选有效的“生物标志物”。通过与表1中64种PPCPs 结果进行保留时间、精确分子量(误差绝对值小于5ppm)和加合物结构比较，鉴定“生物标志物”，确定“生物标志物”对应的PPCPs种类。
主成分分析(PCA)结果如图2中的PCA得分图所示，从图2可知，样品可信度全部处于95％置信区间内。通过观察QC组样品的空间分布可以判断数据质量，如果QC组样品紧密聚集则证明数据质量高，从图2中可知，15个QC样品聚集紧密，说明本研究获得的数据质量高，可以进一步深入研究。从图2可知，ProElut PLS(60mg/1mL)和ProElut PLS(60mg/3 mL)两种SPE柱分析结果在第一主成分上未能完全分离，但在第二主成分上达到完全分离。5 组样本各自紧密聚集，说明样品平行性良好。
尽管3种品牌SPE柱均具有适用各类极性和非极性化合物的特点，以及0～14的pH适用范围，但在处理多种不同类型PPCPs时，3种品牌SPE柱还是表现出了一定差异(图2中5组样品彼此分离明显)。即便是同一品牌下的ProElut PLS柱，由于柱填料量(60和100mg)和柱容量(1、3和6mL)的差别，SPE柱的表现也具有明显差异(图2中3组ProElut PLS柱样品彼此分离明显)。基于以上分析，推断根据5种SPE柱处理64种PPCPs回收率结果可能具有显著差异，为寻找每种SPE柱特有的“生物标志物”带来潜在可能。
正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)结果如图3、图4、图5所示。将每种SPE柱对应的样品组与其他4种SPE柱对应的样品组分为两个大组，获得OPLS-DA散点图，如图 3所示。每种SPE柱与其他4种SPE柱在第一主成分轴上明显分开，说明每种SPE柱都有明显区别于其他4种SPE柱的变量。图4是OPLS-DA分析中的S-plot图，图中每个点代表一个变量，X轴代表变量贡献，该点距离原点越远，说明该变量对组间分组贡献越大；Y轴代表变量置信度，距离原点越远，置信度越高，变量代表组间差异越大。选择变量置信度绝对值>0.9作为筛查“生物标志物”临界值。因此，越是在S-plot图的两个端点，代表该化合物在该组的含量越高，越可能成为“生物标志物”，即可以列入备选“生物标志物”。本实施例中，寻找一种SPE柱具有回收率显著高于其他SPE柱的变量，应在S-plot图左端的变量中。通过图5置换检验200次的Permutations图判断OPLS-DA是否过度拟合。模型验证参数值均为R2Y＝0.999和Q2＝0.999，说明所有OPLS-DA模型的可靠性及预测性均良好，不存在过度拟合。选择变量投影重要度(VIP)>1的变量作为备选“生物标志物”。通过以上筛查，经过与表1中64种PPCPs结果进行保留时间、精确分子量和加合物结构等结果进行比较后，鉴定出Cleanert PEP-2(60mg/3mL)、Oasis HLB(60mg/3mL)、ProElut PLS(60mg/1mL)、ProElut PLS(60mg/3mL)和ProElutPLS(100mg/6mL)等5种SPE柱下备选“生物标志物”对应的 PPCPs分别有10、15、28、5和6种，结果见表2。通过比较数据矩阵中备选“生物标志物”在5组SPE柱样品中的峰强度值，确认所有的特定SPE柱下获得的备选“生物标志物”对应峰强度显著高于其他4组SPE柱样品(P<0.05)，证明筛查出的备选“生物标志物”均有效。
表2中，Var ID即变量，包含质谱峰的分子量和出峰时间信息，如M214T408，表达的意思是该质谱峰分子量为214，出峰时间为408秒，变量也对应“代谢物”中的具体物质种类和PPCPs种类。从表2可知，ProElut PLS(60mg/1mL)柱具有最多的“生物标志物”(28 种)，说明在pH＝7.0条件下，50μg/L的64种PPCPs水溶液在经过该柱前处理过程后，有28 种PPCPs具有最高的回收率。28种PPCPs包括硝基咪唑类(3种)、喹诺酮类(4种)、磺胺类(4 种)、非甾体抗炎药(5种)、激动剂(2种)、头孢菌素类(6种)、类固醇(3种)和大环内酯类(1种) 等8类，每一类中“生物标志物”数量占所加入该类PPCPs(见表1)的比例分别为60％、25％、 36％、100％、29％、67％、43％和50％，说明ProElut PLS(60mg/1mL)柱对本研究中涉及的硝基咪唑类、非甾体抗炎药和头孢菌素类具有较好的前处理效果，对喹诺酮类、磺胺类、激动剂和类固醇具有较差的前处理效果。其中，ProElut PLS(60mg/1mL)柱对非甾体抗炎药的前处理效果最好，加入的5种非甾体抗炎药在该SPE柱上均具有最高回收率，但该柱对喹诺酮类物质前处理效果非常不理想，16种喹诺酮类物质中只有4种表现出好的前处理效果。相对来说，Oasis HLB(60mg/3mL)柱则表现出对喹诺酮类物质非常好的前处理效果，16种喹诺酮类物质中的10种在该SPE柱上具有最高的回收率。Cleanert PEP-2(60mg/3mL)柱对激动剂类物质表现出较好的前处理效果，7种该类物质中的5种具有最高回收率。尽管ProElut PLS(60mg/3mL)和ProElut PLS(100mg/6mL)等2种SPE柱与ProElut PLS(60mg/1mL)柱使用的是完全相同的柱填料，但填料量和柱容量的差别还是造成了对目标PPCPs前处理效果的明显差异。与ProElut PLS柱具有相似亲水亲脂性能的Cleanert PEP-2和Oasis HLB柱，当三者具有相同的填料量(60mg)和柱容量(3mL)时，分别具有5、10和15种“生物标志物”，三者对目标PPCPs的前处理效果差别也很明显，其中，Cleanert PEP-2和Oasis HLB柱分别对激动剂和喹诺酮类物质表现出了非常好的前处理效果，而ProElut PLS柱并未表现出对任何类物质具有明显良好的前处理效果。
表2正离子模式下筛查出的“生物标志物”
Table 2‘Biomarkers’screened in positive ion mode
表2正离子模式下筛查出的“生物标志物”
Table 2‘Biomarkers’screened in positive ion mode
注：质量误差(ppm)＝(XCMS软件提取分子量-质谱仪提取分子量)*106/质谱仪提取分子量。
Claims (9)
1.一种基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：PPCPs和SPE柱的选取：选取要检测的m种不同的PPCPs和n种不同的SPE柱；
S2：样品制备：将要检测的m种PPCPs标准品用甲醇配制成混合标准溶液，将混合标准溶液用超纯水定容，制备成水样；
S3：样品检测：将水样分别经n种不同的SPE柱前处理，每种SPE柱前处理后的若干个平行样品归为同一组，获得n组前处理样品；每一个前处理后的样品分别取出等量体积的溶液进行涡旋混匀，作为质控样品在超高效液相色谱-串联质谱检测过程中分别安排到每组前处理样品之后；将n组前处理样品和质控样品进行超高效液相色谱-串联质谱检测，获得检测数据；
S4：数据分析：将获得的检测数据进行处理，处理后的数据通过代谢组学分析，获得每组样品的“生物标志物”，即每种SPE柱进行前处理后的“生物标志物”，鉴定“生物标志物”对应的PPCPs种类；每组样品获得的“生物标志物”对应的PPCPs种类，为水环境中适合采用该组样品的SPE柱进行前处理的PPCPs种类。
2.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述m种不同PPCPs为以下表格中的64种：
3.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述n种不同的SPE柱为不同品牌的SPE柱或/和品牌相同但柱填料量或/和柱容量不同的SPE柱。
4.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S2中制备的水样的浓度为50μg/L。
5.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S3中SPE柱前处理的方法包括以下步骤：
(1)活化：用甲醇活化SPE柱；
(2)平衡：加入超纯水，在重力作用下自然滴下，保持SPE柱始终湿润；
(3)上样：将柱管用转接头连接于SPE柱上方，将步骤S2中制成的水样转移至管中，在真空泵的作用下上样，上样结束后将SPE柱中的液体抽干；
(4)淋洗：在真空泵的作用下，用超纯水淋洗，然后将SPE柱中的液体抽干；
(5)洗脱：在重力作用下，用甲醇-乙腈混合液洗脱若干次，合并洗脱液，氮气吹干，用甲醇-水溶液复溶并过滤，获得经该种SPE柱前处理之后的前处理样品。
6.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S4中处理检测数据的方法为：将所有样品的色/质谱分析结果采用XCMS软件进行峰自动检测、峰对齐与保留时间校准，再对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换，将质控样品中相对标准偏差>30％的无效变量剔除，获得横坐标为变量名称、纵坐标为样品名称的数据矩阵。
7.根据权利要求7所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S4中通过代谢组学分析，获得每组样品的“生物标志物”的方法为：
设所分析的前处理样品组为第i组，将第i组样品数据和其余的n-1组样品数据划分为两个大组，进行OPLS-DA分析，通过OPLS-DA的Permutations图判断OPLS-DA模型是否过度拟合，划定OPLS-DA分析中的S-plot图中变量置信度绝对值>0.9作为筛查“生物标志物”的临界值，将变量投影重要性>1的变量对应的物质作为第i组样品的备选“生物标志物”，通过比较数据矩阵中备选“生物标志物”对应变量在n组SPE柱样品中的峰强度值，筛选出第i组SPE柱样品的备选“生物标志物”中峰强度与其余的n-1组SPE柱样品有显著差异性，即P值小于0.05的物质种类，作为第i组样品的“生物标志物”。
8.根据权利要求8所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，在进行OPLS-DA分析之前，对数据进行主成分分析。
9.根据权利要求1所述的基于UHPLC-MS/MS技术的固相萃取柱处理水相PPCPs的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S3中每组前处理样品安排质控样品数目为3个以上。
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