CN113156027A - 一种羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法 - Google Patents

一种羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法，其中，羧基类代谢物的衍生化方法包括：步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羧基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，之后加入三乙醇胺和2‑溴‑1‑(4‑二甲基氨基苯基)乙酮，混合均匀后加热进行孵育；孵育完成后加入三甘氨酸，之后加热进行孵育，获得衍生化样本。非靶向代谢组学高效分析方法采用上述衍生化方法同步进行12C标记+13C标记，使得代谢物检测灵敏度升高，可同时检测到更多的代谢物，代谢物覆盖率更高；检测到的代谢物为一个峰对，降低仪器漂移和基质带来的影响，使得定量更精准。

Description

一种羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析 方法
技术领域
本发明涉及代谢组学分析技术，尤其是一种羧基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法。
背景技术
代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在临床医学领域具有广泛的应用前景。代谢组学分析技术包括：NMR、GC-MS、CE-MS、LC-MS，这些技术虽然在一定程度上都能检测出代谢物，但是仍然存在诸多困难，如代谢物离子化效率低、质谱信号弱、定量缺少同位素内标、检测到的代谢物数量少、干扰多等问题。
例如，LC-MS采用液相色谱-质谱联用的方法进行分析，比较不同样本中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。而且，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此出现测不准问题。
为了解决上述问题，现有技术中有采用靶向代谢组学技术，对特定目标进行分析。靶向代谢组学是指：针对几种目标化合物或某条通路上涉及的全部或部分代谢物，利用标准品，构建特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，对目标化合物进行定量与分析。靶向代谢组学只重点研究已知可能具有生物学效应的几种或几类代谢物，因此其数据处理相比于非靶向代谢组学更为简单方便。例如，专利申请CN107085032A公开了一种化学衍生化基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)的分析方法，包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50-100:1加入到pH为4-6的磷酸缓冲液中，在5-37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI-TOF-MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式。该方法使用二醛类化合物对含有氨基结构药物代谢物进行修饰，仅限于药物中的氨基代谢物的情况，虽然有同位素内标，但是不是为所有检测到的代谢物提供相应的同位素内标，因此仍然存在不准确问题。
相对的，非靶向代谢组学是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。由于非靶向代谢组学没有确定的靶向，因此，原始数据的差异性大，且数据量大，如何从其中获得理想的分析结果，是非靶向代谢组学所要解决的问题之一。
羧基类代谢物一般存在于绝大多数生物样本中，例如各类动物体液(血液、尿液、脑脊液等)、动植物组织样本、细胞等。中国发明专利申请CN111610246A公开了一种羧基衍生化试剂组合物，包括I化合物和酰胺缩合剂，将衍生化试剂组合物与样品进行衍生化反应，得到经衍生化的样品液；对所述经衍生化的样品液在正离子模式下进行质谱分析，得到质谱的谱图及谱峰数据，从而同时检测待测样品中脂肪酸和磷脂，以解决脂肪酸丰度低，离子化效率低，难以被检测出来的问题，以及正、负离子模式差异造成的脂肪酸和磷脂不能同步被检测的问题。该方法仍然是基于靶向分析技术，针对性对与脂肪酸和磷脂相关的代谢物进行衍生化。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的代谢组学技术存在的问题，提供一种羧基类代谢物的衍生化方法，可以对含有羧基的一类代谢物进行衍生化标记，从而便于后续的液质分析进行代谢物的识别。该方法可检测的样本类型种类丰富，如血浆、血清、组织、细胞、尿液、毛发等，几乎覆盖全品类待检样品，因此运用对象广。
本发明中，羧基类代谢物的衍生化方法包括步骤1，主要是将代谢物从样本中使用溶剂进行提取，再将含有代谢物的溶剂干燥。提取的方法包括了血浆样本分析中的蛋白沉淀，组织匀浆处理等。对羧基类代谢物进行干燥，目的是除去溶剂干扰，得到没有溶剂的干燥样本，溶剂可能是水、甲醇等。对于蛋白质含量较高的样品，例如血浆或血清、组织应先进行蛋白质沉淀，取上清液进行干燥获得干燥样本。对于蛋白质含量低的样本，例如尿液、细胞，可以省去蛋白质沉淀。对于尿液，若存在浑浊，则可以增加过滤操作，例如：将尿液样品在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，将获得的上清液采用0.2-0.3μm过滤器进行过滤，过滤后，取滤液用真空离心浓缩仪将获得的滤液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥。
需要说明的是，本发明步骤1奠定了后续步骤的基础，通过步骤1除去了各类代谢物中溶剂的干扰，降低了代谢物中蛋白质类干扰，确立了以可溶性代谢物作为衍生化及检测的方向。本发明中，羧基类代谢物的衍生化方法包括步骤2，为衍生化处理，利用标记试剂与代谢物反应，获得衍生化样本。其中，反应原理如下：
Figure BDA0003048324220000041
在上述反应中，R为任意化学基团，X为12C或者13C，标记试剂为2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮，CAS号：37904-72-6；三乙醇胺为反应催化剂，经过孵育反应形成标记后代谢物，可被紫外识别，从而为后续操作奠定基础。
在上述孵育反应后，还加入了三甘氨酸，CAS号：556-33-2，用于淬灭过量的标记试剂。
本发明还提供一种基于上述衍生化处理的非靶向代谢组学高效分析方法，该方法通过12C标记+13C标记，为所有羧基类代谢物提供同位素内标，检测到的代谢物以峰对的形式呈现，而杂质干扰为单独的峰，便于识别，大大提高定量的准确性，可检测到几千至上万种的代谢物，使得检测结果更可靠。
具体方案如下：
一种羧基类代谢物的衍生化方法，包括以下步骤：
步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羧基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；
步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，之后加入三乙醇胺和2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮，混合均匀后加热进行孵育；孵育完成后加入三甘氨酸，之后加热进行孵育，获得衍生化样本。
进一步的，步骤1中，将待检测样品进行蛋白质沉淀处理后，进行离心处理取上清液，对所述上清液进行干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述第一溶剂为甲醇、水或者甲醇水溶液；
任选的，所述第二溶剂为所述衍生化样本进行液相色谱分离的洗脱剂，优选为乙腈水溶液。
进一步的，步骤1中，所述待检测样品为血浆或血清样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，加入甲醇，进行涡旋处理，使蛋白完全沉淀，然后进行离心，取上清液，用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为尿液样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为组织样品，将组织样品与甲醇混合，进行匀浆处理，之后置于-20℃孵育10-15分钟；孵育结束后，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为细胞样品，最少需要106个细胞，将所述细胞样品进行细胞裂解处理，得到的裂解液在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本。
进一步的，步骤2中，三乙醇胺作为催化剂，2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮为标记试剂，孵育温度为75-85℃条件下孵育60-70分钟；孵育完成后，加入三甘氨酸，作为淬灭试剂，用于淬灭过量的所述标记试剂，之后在75-85℃条件下孵育20-30分钟，获得所述衍生化样本。
优选地，孵育温度为80℃，反应更完全。
本发明还提供一种非靶向代谢组学高效分析方法，包括以下步骤：
步骤A：将待测对象等分成至少2份，分别采用所述羧基类代谢物的衍生化方法，进行衍生化，其中衍生化样本a采用的所述标记试剂为12C标记试剂，即12C-2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮；衍生化样本b采用的所述标记试剂为13C标记试剂，即13C-2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮；
步骤B：将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：1的体积比混合，获得检测样本；
步骤C：将步骤B获得的所述检测样本送入LC-MS装置，进行液质分析，获得代谢物的特征峰图，所述代谢物以峰对的形式呈现在所述特征峰图中，通过所述特征峰图识别所述代谢物。
进一步的，步骤C中所述液质分析的条件包括，液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为甲酸的水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合溶液。优选地，流动相A为：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为：含0.1％甲酸的乙腈溶液。
梯度方法为：t＝0min,25％MPB；t＝10min,99％MPB；t＝13min,99％MPB；t＝15min,99％MPB；t＝15.1min,25％MP B；t＝18min,25％MPB，这里的百分含量为体积含量，MPB代表流动相B，采用这种梯度洗脱，大大缩短了样品的分析时间，提高分析效率，使分析通量提高。
进一步的，步骤C中所述液质分析的条件包括，质谱扫描范围m/z＝220-1000。
进一步的，步骤C中，所述特征峰图中以单峰形式存在的物质为干扰噪声，不是真实的代谢物。
有益效果：本发明提供的羧基类代谢物的衍生化方法，样品经过衍生化后，代谢物检测灵敏度升高，可同时检测到更多的代谢物，代谢物覆盖率更高。
进一步的，所述非靶向代谢组学高效分析方法，采用所述羧基类代谢物的衍生化方法处理后的，检测到的代谢物为一个峰对，为所有衍生化代谢物生成同位素内标，降低仪器漂移和基质带来的影响，消除噪声干扰，使得定量更精准。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1是本发明一个实施例1提供的血浆样品特征峰图；
图2是本发明一个对比例1提供的血清样品特征峰图之一；
图3是本发明一个对比例1提供的液质分析局部图之一；
图4是本发明一个对比例1提供的液质分析局部图之二；
图5是本发明一个对比例1提供的血清样品特征峰图之二。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1
取血浆样品，在4℃、离心力>15000g(12000rpm)的条件下离心15分钟，离心后取上清液至0.5mL离心管；移取样品上清液30μL至相应的微量离心管中，在含有30μL样品的离心管中加入90μL预冷的LC-MS或HPLC级甲醇，对含有样品和甲醇的离心管进行充分涡旋，使蛋白完全沉淀，然后对离心管进行低速离心，使管内混合物沉于离心管底部。将涡旋后的混合物放置-20℃冰箱至少1小时；1小时后，将离心管从冰箱中取出，在离心力>10000g下离心15分钟，吸取90μL上清液至新的微量离心管中。用真空离心浓缩仪将90μL上清液完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，并于-80℃冰箱保存所获得的干燥样本，用于后续衍生化处理。说明：上述90μL上清液干燥大约需要1-2小时。任何残留的溶剂都会严重干扰化学标记反应，但干燥时间太长(例：干燥超过3小时)也会导致代谢物含量流失。
下面结合非靶向代谢组学高效分析方法进行介绍，将上述干燥样本等分为3份，取其中2份进行衍生化处理，1份留样备查。2份中取1份干燥样本，向其中加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后在样本中加入10μL反应催化试剂(三乙醇胺)，25μL的12C标记试剂(2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮)，在涡旋混匀后置于80℃条件下孵育60分钟。孵育完成后，加入40μL试剂(三甘氨酸)，用于淬灭过量的标记试剂，并将混合溶液在80℃条件下孵育30分钟，得到衍生化样本a。
另取1份干燥样本里加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后在样本中加入10μL反应催化试剂(三乙醇胺)，25μL的13C标记试剂(2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮)，在涡旋混匀后置于80℃条件下孵育60分钟。孵育完成后，加入40μL试剂(三甘氨酸)，用于淬灭过量的标记试剂，并将混合溶液在80℃条件下孵育30分钟，得到衍生化样本b。
将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：1的体积比混合，获得检测样本。
将上述检测样本送入LC-MS装置，进行液质分析，具体条件参见表1，获得代谢物的特征峰图参见图1。
表1液质分析主要参数表
Figure BDA0003048324220000091
表1中洗脱梯度中，MPB代表流动相B，百分比皆为体积百分数。采用这种洗脱方法，大大缩短了样品的分析时间，提高分析效率，使分析通量提高。
从图1可以看到，检测到的代谢物以峰对的形式存在，峰对是指质谱图里会出现一个12C标记的峰和一个13C标记的峰，但是这两个峰指的是同一个物质，而干扰噪音为单峰，从而过滤掉一些干扰噪声，降低仪器漂移和基质带来的影响，使得被检测到代谢物更准确。并且被标记过后的代谢物，灵敏度提高，原本浓度或者响应低的代谢物也能被检测到，因此被检测到的代谢物数量提高了，一个血液样本大概可以检测到2000多个代谢产物。
另外，本方法为所有羧基类衍生化代谢物生成内标，除非代谢物中不含有羧基类代谢物，否则都会被检出，这样就实现了不预设检测目标，因此，相对常规靶向代谢组学检测方法而言，本发明所述方法获得数据的全面性更好，通过这些数据进一步分析的准确度更高。
实施例2
对尿液样品，在4℃、离心力＞15000g(12000rpm)的条件下离心15分钟，离心后取上清液至1.5mL离心管。用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，获得干燥样本。
如果尿液样品之前未进行过滤，则需要将上清液采用0.2-0.3μm过滤器进行过滤。过滤后，取滤液至离心管中。之后用真空离心浓缩仪进行干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，获得干燥样本。
干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。
实施例3
取组织样品，称取组织重量，置于离心管中。如果样品太大，则切下原始样品，使样品的重量在150-200mg左右。向离心管中加入预冷的甲醇/水溶液按照500μL甲醇/水溶液溶液：100mg组织的比例，甲醇/水溶液为4:1，v/v。使用均质仪将组织样品匀浆15秒。必要时可根据样品类型调整匀浆速度和时间(例：质地较硬的组织需要更高的速率和更长的时间)。匀浆后，将样品放在-20℃冰箱孵育10分钟。孵育结束后，在4℃、离心力>10000g条件下离心10分钟。取上清液至离心管中，低速离心每个离心管，使管壁上的样品液滴沉于离心管底部。取上清液用真空离心浓缩仪将其完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，并于-80℃冰箱保存所获得的样本，作为干燥样本。
干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。
实施例4
取哺乳动物细胞样品，最少需要106个细胞。通过抽吸操作除去培养皿的培养基，在培养皿中轻轻加入预冷的PBS(4℃)，洗涤3次，以去除残留的培养基和细胞外代谢物。加入预冷(-20℃)的甲醇，以停止细胞代谢。用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮除。在刮除每个培养皿/孔前，应彻底清洁刮刀。将刮下的细胞和甲醇溶剂转移至2mL微量离心管中。再次加入等量的预冷(-20℃)甲醇到培养皿中，将剩余的细胞和溶剂刮除并转移至同一微量离心管。用离心真空浓缩仪将含有细胞和溶剂的微量离心管干燥。在干燥后的离心管中加入400μL预冷的甲醇-水(1:1，v/v)。充分涡旋离心管使细胞重新溶解，使用反复冻融法对进行细胞裂解，步骤如下：用镊子将试管置于液氮中2分钟，确保液体完全冻结，取出试管，放在冰水浴中，在水里摇晃2分钟解冻样品，重复冻融操作4次以上，将离心管于4℃、离心力>15000g条件下离心10min，小心地将上清液转移至新的试管中，用离心真空浓缩仪将上清液完全干燥，得到干燥样本。
干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。
对比例1
对比例1采用血清样品进行分析，方法与实施例1基本相同，区别在于，衍生化处理时不采用淬灭试剂三甘氨酸，即干燥样本中加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后在样本中加入10μL反应催化试剂(三乙醇胺)，25μL的12C标记试剂(2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮)，在涡旋混匀后置于80℃条件下孵育60分钟，得到衍生化样本a。
另取一份干燥样本中加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后在样本中加入10μL反应催化试剂(三乙醇胺)，25μL的13C标记试剂(2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮)，在涡旋混匀后置于80℃条件下孵育60分钟，得到衍生化样本b。
经过液质分析，得到的谱图见图2，图中椭圆形区域显示出，反应剩余的标记试剂质谱检测信号过强并且拖尾，干扰并抑制实际代谢物检测的信号。
为了解决该问题，发明人尝试多种试剂移除过量的标记试剂，例如采用三苯基乙酸，CAS号：595-91-5，结果见图3，从图3可以看到，三苯基乙酸淬灭能力较弱，淬灭完成后仍可检测到大量标记试剂的信号，如图3中10-15min处的特征峰。同时，三苯基乙酸不溶于水或者乙腈，需使用丙酮进行溶解，与反应体系不一致(乙腈/水体系)，且丙酮易挥发，毒性较大。
经过不断探索，发明人发现，衍生化处理时采用淬灭试剂三甘氨酸，同样进行上述血清样本检测，可以极大削弱标记样本的特征峰，见图4，从图4可以看到，10-15min处标记试剂的特征峰被极大削弱，说明三甘氨酸对标记试剂的淬灭能力强。同时三甘氨酸溶于水，与淬灭反应体系一致，无需使用丙酮等有毒溶剂，具有多重优点。参照实施例1进行同样的非靶向代谢组学高效分析，最终获得的谱图见图5。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种羧基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羧基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；
步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，之后加入三乙醇胺和2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮，其中，2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮为标记试剂，混合均匀后加热进行孵育；孵育完成后加入三甘氨酸，之后加热进行孵育，获得衍生化样本。
2.根据权利要求1所述羧基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤1中，将待检测样品进行蛋白质沉淀处理后，进行离心处理取上清液，对所述上清液进行干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述第一溶剂为甲醇、水或者甲醇水溶液；
任选的，所述第二溶剂为所述衍生化样本进行液相色谱分离的洗脱剂，优选为乙腈水溶液。
3.根据权利要求2所述羧基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤1中，所述待检测样品为血浆或血清样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，加入甲醇，进行涡旋处理，使蛋白完全沉淀，然后进行离心，取上清液，用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为尿液样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为组织样品，将组织样品与甲醇混合，进行匀浆处理，之后置于-20℃孵育10-15分钟；孵育结束后，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；
任选的，所述待检测样品为细胞样品，最少需要106个细胞，将所述细胞样品进行细胞裂解处理，得到的裂解液在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本。
4.根据权利要求1-3中任一项所述羧基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤2中，三乙醇胺作为催化剂，2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮为标记试剂，孵育温度为75-85℃条件下孵育60-70分钟；孵育完成后，加入三甘氨酸，作为淬灭试剂，用于淬灭过量的所述标记试剂，之后在75-85℃条件下孵育20-30分钟，获得所述衍生化样本。
5.根据权利要求4所述羧基类代谢物的衍生化方法，其特征在于：步骤2中，三乙醇胺作为催化剂，2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮为标记试剂，孵育温度为80℃条件下孵育60-70分钟；孵育完成后，加入三甘氨酸，作为淬灭试剂，用于淬灭过量的所述标记试剂，之后在80℃条件下孵育20-30分钟，获得所述衍生化样本。
6.一种非靶向代谢组学高效分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤A：将待测对象等分成至少2份，分别采用权利要求1-5任一项所述羧基类代谢物的衍生化方法，进行衍生化，其中衍生化样本a采用的所述标记试剂为12C标记试剂，即12C-2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮；衍生化样本b采用的所述标记试剂为13C标记试剂，即13C-2-溴-1-(4-二甲基氨基苯基)乙酮；
步骤B：将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：1的体积比混合，获得检测样本；
步骤C：将步骤B获得的所述检测样本送入LC-MS装置，进行液质分析，获得代谢物的特征峰图，所述代谢物以峰对的形式呈现在所述特征峰图中，通过所述特征峰图识别所述代谢物。
7.根据权利要求6所述非靶向代谢组学高效分析方法，其特征在于：步骤C中所述液质分析的条件包括，液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为甲酸的水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合溶液。
8.根据权利要求7所述非靶向代谢组学高效分析方法，其特征在于：步骤C中，所述液相色谱的流动相A为：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B为：含0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度方法如下：t＝0min,25％MPB；t＝10min,99％MPB；t＝13min,99％MPB；t＝15min,99％MPB；t＝15.1min,25％MP B；t＝18min,25％MPB，其中％为体积含量，MPB代表流动相B。
9.根据权利要求6所述非靶向代谢组学高效分析方法，其特征在于：步骤C中所述液质分析的条件包括，质谱扫描范围m/z＝220-1000。
10.根据权利要求6-9任一项所述非靶向代谢组学高效分析方法，其特征在于：步骤C中，所述特征峰图中以单峰形式存在的物质为干扰噪声，不是真实的代谢物。
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