CN115266985B - 一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 - Google Patents
一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115266985B CN115266985B CN202210909244.6A CN202210909244A CN115266985B CN 115266985 B CN115266985 B CN 115266985B CN 202210909244 A CN202210909244 A CN 202210909244A CN 115266985 B CN115266985 B CN 115266985B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- analysis
- lipid
- serum
- laryngeal cancer
- lipidomic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 48
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 48
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 89
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 32
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 17
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 11
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 6
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 4
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims description 4
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 4
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 claims description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol Chemical compound OC.ClCCl WGLUMOCWFMKWIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- GRTOGORTSDXSFK-XJTZBENFSA-N ajmalicine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4[C@H](C)OC=C([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 GRTOGORTSDXSFK-XJTZBENFSA-N 0.000 claims 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims 1
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 7
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000091 biomarker candidate Substances 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- -1 lipid compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- LKQLRGMMMAHREN-YJFXYUILSA-N N-stearoylsphingosine-1-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC LKQLRGMMMAHREN-YJFXYUILSA-N 0.000 description 6
- DUXYWXYOBMKGIN-UHFFFAOYSA-N trimyristin Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCC DUXYWXYOBMKGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- ULXTYUPMJXVUHQ-OVTFQNCVSA-N lipid II Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CC[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(\C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ULXTYUPMJXVUHQ-OVTFQNCVSA-N 0.000 description 4
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N sphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@@H](N)CO OTKJDMGTUTTYMP-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- KLJBLQFSKZACGJ-MMKOEKFTSA-N 1,2-di-[(6Z)-octadecenoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C/CCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCC\C=C/CCCCCCCCCCC KLJBLQFSKZACGJ-MMKOEKFTSA-N 0.000 description 2
- AFSHUZFNMVJNKX-LLWMBOQKSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC AFSHUZFNMVJNKX-LLWMBOQKSA-N 0.000 description 2
- 108010052187 1-Acylglycerophosphocholine O-Acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- YAMUFBLWGFFICM-PTGWMXDISA-N 1-O-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C YAMUFBLWGFFICM-PTGWMXDISA-N 0.000 description 2
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 1-oleoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)CO RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 208000021959 Abnormal metabolism Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100038805 Lysophospholipid acyltransferase 2 Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N dihydrosphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(N)CO OTKJDMGTUTTYMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- SECPDKKEUKDCPG-QGZVFWFLSA-N 1-decanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C SECPDKKEUKDCPG-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-VYOBOKEXSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-HSZRJFAPSA-N 1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-HSZRJFAPSA-N 0.000 description 1
- DCBSHORRWZKAKO-INIZCTEOSA-N 1-myristoyl-sn-glycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)CO DCBSHORRWZKAKO-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 241000599985 Beijerinckia mobilis Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002576 laryngoscopy Methods 0.000 description 1
- 108010051201 lipid I Proteins 0.000 description 1
- 230000013190 lipid storage Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002542 parent ion scan Methods 0.000 description 1
- 238000010239 partial least squares discriminant analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8696—Details of Software
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于UHPLC‑QTOF‑MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，该方法包括以下步骤：1)取样，采集志愿者血清；2)12种脂质标准品分析方法的建立；3)血清样品前处理及非靶向脂质组学检测；4)差异脂质的鉴定及统计学分析。本发明通过12种脂质标准品为探针以优化分析方法并利用该方法完成了喉癌患者血清中的脂质检测，从脂质组学的角度阐明了喉癌脂质代谢通路网络变化，筛选到了关键差异代谢物，为喉癌候选生物标志提供了新的可能。
Description
技术领域
本发明属于脂质组学研究领域，具体而言是一种基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱联用(UHPLC-QTOF-MS)技术对喉癌患者血清的脂质组学检测方法。
背景技术
喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道肿瘤，其临床诊断主要包括病史和体格检查、临床常规化验、喉镜观察、组织活检以及临床成像等。近年来，在喉癌初步诊断中也会采用一些辅助性的肿瘤标志物如鳞状细胞癌相关性抗原，但其灵敏度差且不具备特异性，在肺癌和子宫颈癌等其他类型癌症中同样存在异常表达。脂质、氨基酸等在内的小分子代谢物类的生物标志物是最接近表型的生化指标，具有非入侵、灵敏的特点，近年来被广泛关注。由于晚期喉癌患者多次放化疗后免疫功能受损严重，喉癌切除手术后生活质量会严重降低，面临复发危险，所以挖掘新的生物标志物对于喉癌早期诊断、监测治疗反应和复发趋势是十分必要的。
脂质作为人体中重要的内源性代谢物之一，因其丰富的生物学功能而备受关注，脂质可以参与生物膜的构成和跨膜蛋白的功能形成，以及作为信号分子参与肿瘤的生长调控等，具有重要的生物学意义。脂质代谢在喉癌中具有一定的研究基础，但是已有的研究大多聚焦的是喉癌组织中脂质代谢相关酶和蛋白的表达，并且集中于脂肪酸代谢，针对其他脂类代谢如磷脂、鞘脂、甘油酯类的相关研究严重不足，机体整体脂质代谢谱的变化并不清楚。
脂质组学是代谢组学的一个重要分支,它是研究生物体、组织、细胞或体液中脂质的结构、功能及代谢途径的一门学科。利用脂质组学可以全面研究脂质的异常代谢与疾病之间的联系，进行高通量、整体性的脂质变化分析，找到与疾病相关的早期特征性生物标志物。
但脂质分析具有一定的挑战性，主要由于脂质种类繁多、结构具有复杂多样性。进行脂质组学检测时需要一步完成不同类别不同脂质的分析，也需要在有限的时间内完成脂质定性定量，这对于分析低含量、离子化程度低以及具有同分异构体的脂质而言是极具挑战的，需要不断进行分析方法的改进。
脂质组学检测中脂质的定性定量过程会产生大量多维的数据信息，其数据处理流程包括：自动化数据处理、数据的统计分析、信号通路及网络的分析和数学建模。脂质谱图数据处理过程通常包括：谱图筛选、质谱峰检测、校准、基线校正等，有许多常用的自动化处理软件，其中Metascope 4.0是bruker公司开发的一款处理非靶向代谢组学数据的商业化软件，能够进行大批量的LC-QTOF-MS数据处理，如质谱峰检测、校准、基线校正、谱图筛选等。其包含的Lipidblast数据库，是目前最全面的脂质数据库之一，有超过45000种脂质化合物的MS/MS图谱，可以实现脂质定性。为了获取更为直观、有深度的数据信息，还应进行可视化和生物统计分析。单变量分析和多变量分析相结合的策略有助于建立稳健、准确的模型帮助筛选差异代谢物。
发明内容
本发明提供一种基于UHPLC-QTOF-MS技术的喉癌患者血清的脂质组学检测方法，该方法为进行疾病脂质组学检测，建立喉癌与脂质异常代谢间的联系，筛选喉癌早期潜在的生物标志物提供了一定的参考意义。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于UHPLC-QTOF-MS技术的喉癌患者血清的脂质组学检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：取样，获取志愿者血清：招募喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群，对志愿者进行筛选，采集所有受试者的空腹血液。将新鲜血液经预处理离心得到血清，分离与分装过程在冰上进行，所有样品通过液氮速冻后于超低温冰箱﹣80℃保存。
步骤二：针对12种脂质标准品建立分析方法：将12种脂质标准品作为探针进行液相色谱-质谱串联(LC-MS)分析方法优化，并完成方法学考察。
步骤三：血清样品前处理及非靶向脂质组学检测：对不同组别的所有入选志愿者血清进行样品前处理，并通过已建立的脂质分析方法，用UHPLC-QTOF-MS进行非靶向血清脂质组学检测：
步骤四：差异脂质的鉴定及统计学分析：进行多变量分析：建立主成分分析(PCA)分析模型，观察样本和质控样本的分布。建立正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型，通过置换分析观察模型的拟合程度，并筛选出VIP＞1的变量。对样本中的代谢物的显著性进行单变量分析，结合多变量分析结果筛选出VIP>1，P<0.05的变量。对可能的差异脂质逐一完成定性、注释和生物学意义分析。
进一步地，步骤一中征集的志愿者分组包括三组：喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群。
进一步地，步骤二中12种脂质标准品作为探针进行LC-MS分析方法优化的具体步骤如下：
(1)质控(QC)样本前处理：QC样本是挑选喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群三类受试者各5例样品，每例样品吸取100μL进行混合，分别按照加标样品前处理流程和不加标前处理流程进行处理。
(2)配制脂质I级储备液、混合脂质标准储备液、混合内标溶液、脂质II级储备液与标曲工作液。
(3)利用脂质标准品溶液进行色谱柱类型、柱温、流速和流动相梯度条件优化以及质谱条件优化。
(4)LC-MS测定加标QC样品和不加标QC样品，完成检出限、定量限、线性范围、精密度、准确度和回收率的方法学考察。
进一步地，步骤(1)中QC样本为喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群三组志愿者的混合血清样本。
进一步地，步骤二中12种脂质标准品为：三肉豆蔻酸甘油酯(TAG 14:0/14:0/14:0)、1-油酰基-rac-甘油(MAG 18:1/0:0/0:0)、1,2-二油酰基-sn-甘油(DAG 18:1/18:1/0:0)、二氢神经鞘氨醇(SA d18:0)、N-硬脂酰-D-神经鞘磷脂(SM d18:1/18:0)、1,2-二(6Z-油酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC 18:1(6Z)/18:1(6Z))、1-棕榈酰-2-(9Z-油酰基)-sn甘油-3-磷酸胆碱(PC 16:0/18:1(9Z))、1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC 16:0/0:0)、1-葵酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC 19:0/0:0)、1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(LysoPC 14:0/0:0)、1-(9Z-油酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC 18:1(9Z)/0:0)、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC 18:0/0:0)
进一步地，步骤(2)中12种脂质标准品I级储备液的配制溶剂为二氯甲烷-甲醇(2:1,v/v)混合溶液，所有标准品浓度均为1mg/mL。
进一步地，步骤(2)中混合内标溶液采用的是Avanti Polar Lipids公司开发的氘化标准混合物产品EquiSPLASHTM 该内标混合物是商业化的单个浓度为100μg/mL的13种氘化脂质内标的混合物(含15:0-18:1(d7)PC、18:1(d7)Lyso PC、15:0-18:1(d7)-15:0TAG、15:0-18:1(d7)DAG、18:1(d7)MAG、d18:1-18:1(d9)SM、15:0-18:1(d7)PE、18:1(d7)Lyso PE、15:0-18:1(d7)PG(钠盐)、15:0-18:1(d7)PI(铵盐)、15:0-18:1(d7)PS(钠盐)、18:1(d7)固醇酯、C15神经酰胺-d7)，溶剂为甲醇溶液。
进一步地，步骤(2)中12种脂质标准品II级储备液与标曲工作液的配制溶剂为异丙醇溶液。
进一步地，步骤一及步骤三中有10例喉癌患者、10例喉良性肿瘤患者和10例健康患者入组。
进一步地，步骤三中血清样本前处理过程为：血清样品在4℃条件下解冻2h，将120μL异丙醇加至40μL血清中，涡旋样品后在室温下孵育10min，将样品放置﹣20℃下储存过夜，以改善蛋白质沉淀，然后于4℃，14000g离心20min。收集上清液100μL加入100μL乙腈：水(2:98，v/v)溶液将水含量调整为50％，涡旋60s，然后4℃，14000g离心10min后取上清进行仪器分析，所有前处理过程均在冰上操作。
进一步地，步骤三中非靶向脂质组学检测中色谱条件为：流动相A为乙腈/水(60:40,v/v)加10mM甲酸铵和0.1％甲酸，流动相B为异丙醇/乙腈(90:10,v/v)加10mM甲酸铵和0.1％甲酸。梯度时长为20min，流速为0.4mL/min。采用反相色谱柱Waters CSH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)进行分离，色谱柱温度为55℃。进样体积为2μL。
进一步地，步骤三中非靶向脂质组学检测中质谱条件为：采用配备了电喷雾离子源的Bruker impact II四极杆飞行时间质谱，正离子模式。碰撞气体：氩气。质谱参数设置如下：离子源温度220℃；喷雾电压，4500V；干燥气8L/min；雾化器气1.8Bar；碰撞能量为7eV，传输时间为80μs。在Auto MSn模式下进行二级碎片扫描，扫描质量范围50-1300Da，扫描频率为10Hz。质量精度由甲酸钠溶液校正。
进一步地，步骤四中差异脂质的鉴定及统计学分析过程中：利用SIMCA软件进行多变量分析，采用SPSS 22.0软件的非参数检验Mann-Whitney U分析对样本中的代谢物进行单变量分析。根据4.0分析软件对可能的差异脂质完成逐一定性及注释。
本发明的优点在于：
喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道肿瘤，晚期喉癌患者多次放化疗后免疫功能受损严重，喉癌切除手术后生活质量会严重降低，面临复发危险。现有的生物标志物灵敏度、特异性不佳。脂质代谢在喉癌进展中具有重要的意义，本研究通过12种脂质标准品完成分析方法的优化并将其应用于脂质组学检测中。基于UHPLC-QTOF-MS技术利用脂质组学技术阐明了喉癌进展中脂质代谢的变化，揭示了脂质在喉癌发生发展中的生物学意义，挖掘喉癌早期潜在的生物标志物，以获取相关的中间信息，对于喉癌早期诊断、监测治疗反应和复发趋势是十分有意义。
附图说明
图1为正离子模式最佳分析条件下12种物质的总离子流图；
图2是喉癌、喉良性肿瘤及健康人群血清样品脂质分析的PCA分析图；
图3是喉癌、喉良性肿瘤及健康人群血清样品脂质分析OPLS-DA图；
图4是正离子模式下，不同色谱柱条件下脂质化合物总离子流图；
图5是正离子模式下，不同流速条件下脂质化合物总离子流图；
图6是正离子模式下，不同色谱柱柱温条件下脂质化合物总离子流图；
图7是正离子模式下，不同梯度条件下脂质化合物总离子流图。
具体实施方式
以下结合具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：一种基于UHPLC-QTOF-MS技术的喉癌患者血清的脂质组学检测方法。
(1)仪器与试剂
仪器：高效液相色谱串联质谱仪，由美国Agilent公司1290高效液相色谱仪(包括G7129B自动进样器、G7120A二元溶剂泵、G7130A柱温箱)及AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪(配ESI离子源)组成，数据采集与处理软件为Analyst 1.5.1Software；高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，由美国Thermo Fisher Scientific公司Ultimate 3000UHPLC高效液相色谱仪(包括HPG-3400 SD泵、WPS-3000 SL自动取样器和TCC-3000SD柱温箱)，质谱检测采用德国Bruker公司的impact II四极杆飞行时间质谱仪(配ESI源)；微量移液枪(10、20、100、200、1000μL，德国Eppendorf公司)；电子天平(ME104/02，瑞士Mettler公司)；超声波清洗机(YM-100S，深圳方奥微电子有限公司)；高速冷冻离心机(Heraeus Megafuge 8R，美国赛默飞世尔科技)；小型涡旋振荡仪(Vortex-Genie2，美国Scientific Industry公司)。
试剂：氯化钠(纯度≥99.99％)、氢氧化钠(纯度≥98.0％)甲酸铵(纯度≥99.99％)和色谱级甲酸(纯度≥98.0％)，购买自美国Sigma-Aldrich公司；色谱级二氯甲烷、乙腈、甲醇、异丙醇购买自德国Merck公司；甲酸铵标准品购买自美国Sigma-Aldrich公司和美国Advanti Polar Lipids公司；实验用水均为去离子水，由Millipore纯水仪制得。12种脂质标准品为：三肉豆蔻酸甘油酯(TAG(14:0/14:0/14:0),＞99％,Sigma-Aldrich公司)、1-油酰基-rac-甘油(MAG(18:1)/0:0/0:0),＞99％,Sigma-Aldrich公司)、1,2-二油酰基-sn-甘油(DAG(18:1/18:1/0:0),＞99％,Sigma-Aldrich公司)、二氢神经鞘氨醇(SA(d18:0)，＞99％，Sigma-Aldrich公司)、N-硬脂酰-D-神经鞘磷脂(SM(d18:1/18:0),＞99％，Sigma-Aldrich公司)、1,2-二(6Z-油酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC(18:1(6Z)/18:1(6Z)),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)、1-棕榈酰-2-(9Z-油酰基)-sn甘油-3-磷酸胆碱(PC(16:0/18:1(9Z)),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)、1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC(16:0/0:0),＞99％，Sigma-Aldrich公司)、1-葵酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC(19:0/0:0),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)、1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC(14:0/0:0),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)、1-(9Z-油酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC(18:1(9Z)/0:0),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Lyso PC(18:0/0:0),＞99％，Advanti Polar Lipids公司)。
(2)12种脂质标准品分析仪器工作条件
12种脂质标准品的LC-MS/MS分析在Aglient 1290II系统和配备ESI源的AB SCIEX5500三重四极杆质谱仪上进行。
液相条件：流动相A为乙腈/水(60:40,v/v)加10mM甲酸铵和0.1％甲酸，流动相B为异丙醇/乙腈(90:10,v/v)加10mM甲酸铵和0.1％甲酸。梯度洗脱程序如下：0-2min，45％-60％B；2-4min，60％B；4-4.1min，60％-80％B；4.1-7min，80％-85％B；7-7.1min，85％-45％B；7.1-10min，45％B。流速为0.4mL/min。采用反相色谱柱Waters CSH C18色谱柱2.1×100mm,1.7μm)进行分离，色谱柱温度为55℃。进样体积为2μL。
质谱条件：为进行方法学验证采用三重四级杆质谱仪作为检测器。质谱检测模式；正离子模式，气帘气为25psi，离子源温度为450℃，离子化电压为5500V，碰撞气为7psi，雾化气55psi，干燥气为65psi。入口电压10V，碰撞单元出口电压10V。通过对12种脂质标准品进行Q1母离子扫描、子离子扫描、MRM扫描进行DP优化、CE优化，得到的12种脂质的MRM参数如下：
注：*为定量离子对
(3)标准工作溶液配制
①脂质I级储备液的配制：分别称取适量12种标准品，分别溶于二氯甲烷-甲醇(2:1,v/v)混合溶液中，制备脂质标准储备液，所有标准品浓度均为1mg/mL，保存于﹣20℃。
②混合脂质标准储备液的配制：分别取适量的12种脂质标准储备液，用异丙醇定容至10mL，配制成含有不同脂质标准品浓度的混合溶液，轻轻摇匀，超声5min，静置30min得到混合脂质标准储备溶液(含48μg/mL TAG(14:0/14:0/14:0)、400μg/mL MAG(18:1/0:0/0:0)、12.8μg/mL DAG(18:1/18:1/0:0)、32μg/mL SA(d18:0)、16μg/mL SM(d18:1/18:0)、160μg/mL PC(18:1(6Z)/18:1(6Z))、128μg/mL PC(16:0/18:1(9Z))、64μg/mL Lyso PC(16:0/0:0)、1.6μg/mL Lyso PC(19:0/0:0)、1.6μg/mLLyso PC(14:0/0:0)、16μg/mL Lyso PC(18:1(9Z)/0:0)、32μg/mL Lyso PC(18:0/0:0))，保存于﹣20℃。
③混合内标溶液采用的是Avanti Polar Lipids公司开发的氘化标准混合物产品，即EquiSPLASHTM 该内标混合物是商业化的单个浓度为100μg/mL的13种氘化脂质内标的混合物(含15:0-18:1(d7)PC、18:1(d7)Lyso PC、15:0-18:1(d7)-15:0TAG、15:0-18:1(d7)DAG、18:1(d7)MAG、d18:1-18:1(d9)SM、15:0-18:1(d7)PE、18:1(d7)LysoPE、15:0-18:1(d7)PG(钠盐)、15:0-18:1(d7)PI(铵盐)、15:0-18:1(d7)PS(钠盐)、18:1(d7)固醇酯、C15神经酰胺-d7)，溶剂为甲醇溶液，其浓度已经过验证可以用作定量标准品，保存于﹣20℃。
④脂质II级储备液与标曲工作液的配制：分别吸取5mL、2.5mL、1.25mL储备液I，用异丙醇定容至10mL，配制成脂质II级储备液1、II级储备液2、II级储备液3。取0.5mL脂质II级储备液3，用异丙醇定容至10mL，配制为表1浓度8的标准工作溶液，对该浓度进行逐级稀释，即得到浓度1-浓度7的标曲工作溶液如下表：
表1标准曲线浓度表(ng/mL)
(4)QC样品前处理
QC样品是挑选喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群三类受试者各5例样品按相同体积混合而成，用于方法学评价。
不加标空白样品前处理流程：血清样品在4℃条件下解冻2h，取40μL血清于1.5mL离心管中，加入120μL异丙醇，加入16μL 100μg/mL混合内标溶液，涡旋60s，在室温下孵育10min后，将样品在﹣20℃下储存过夜，以改善蛋白质沉淀，然后于4℃，14 000g离心20min。收集上清液100μL，加入稀释剂3900μL(乙腈-水溶液＝2:98，v/v)，涡旋60s，然后4℃以14000g离心10min，取上清液在色谱瓶中进行仪器分析。
加标样品前处理流程：血清样品在4℃条件下解冻2h，取40μL血清于1.5mL离心管中，加入40μL异丙醇，80μL三种已知浓度的脂质II级储备液，16μL 100μg/mL混合内标溶液，涡旋60s，后续操作同上。
(5)样品测定
将(3)所得标准工作溶液和(4)所得的血清样品分别进行LC-MS/MS分析，在(2)条件下，标准工作溶液中目标物色谱总离子流图如图1所示。以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线。
(6)方法学验证
根据最低级标准工作溶液，按照3倍信噪比计算该方法的检出限，该方法的线性范围、线性系数、检出限如表2所示。
表2 12种脂质标准品的检测限、最低定量限、标曲线性范围及线性方程
采用II级储备液1、II级储备液2、II级储备液3分别配制低、中、高3个浓度梯度的QC样品，每个浓度重复六个样品。单日内进样一遍，计算日内精密度，重复3天，计算日间精密度。12种脂质标准品的日内精密度、日间精密度和准确度见表3。
表3 12种脂质标准品的日内精密度、日间精密度和准确度
(7)脂质组学分析仪器工作条件
色谱条件：由于非靶向脂质组学检测过程中实际样品在10min内不能出峰完全，原梯度优化20min与10min分离效果同样较佳，因此选用20min的梯度1，即0～2min，40％～43％B；2～2.1min，50％B；2.1～12min，50％～54％B；12～12.1min，54％～70％B；12.1～18min，70％～99％B；18～18.1min，40％B。流动相、色谱柱、柱温、流速采用已建立的脂质分析方法，参照(2)。质谱条件如下：为获取更为广泛准确的定性信息采用飞行时间质谱。质谱测定模式：正离子模式。碰撞气体：氩气。质谱参数设置如下：离子源温度220℃；喷雾电压，4500V；干燥气8L/min；雾化器气1.8Bar；碰撞能量为7eV，传输时间为80μs。采用数据依赖采集方法(DDA，data dependence acquisition)进行二级碎片扫描获得代谢物的MS/MS信息，扫描质量范围50-1300Da，扫描频率为10Hz。质量精度由甲酸钠校正。
(8)脂质组学检测的样品前处理
选取10例喉癌患者、10例喉良性肿瘤患者和10例健康受试者为入组志愿者，将其血清样品在4℃条件下解冻2h，取40μL血清于1.5mL离心管中，加入120μL异丙醇，加入16μL100μg/mL混合内标溶液，涡旋60s，在室温下孵育10min后，将样品在﹣20℃下储存过夜，以改善蛋白质沉淀，然后于4℃，14 000g离心20min。收集上清液100μL，加入稀释剂3900μL(乙腈-水溶液＝2:98，v/v)，涡旋60s，然后4℃以14 000g离心10min，取上清液在色谱瓶中进行仪器分析。
(9)统计分析
获取所有样本非靶向脂质组学原始数据后，将每个样本的数据上传到4.0(Bruker，德国)，软件根据特征峰信息及二级谱数据进行搜库(lipidblast数据库)及碎片匹配，完成定性。将所有鉴定到的脂质原始峰面积导出到Microsoft Excel，得到峰表。对峰表采用R语言stattarget包对数据进行正态检验、缺失值补充和数据校正，根据校正后的峰表进行统计学分析。经预处理后的数据矩阵导入SIMCA-P 14.0，进行多变量统计分析。通过PCA对组间分离度进行观察，由图2可以看出QC样本聚集较好，因此批次间系统稳定性较好。健康组和喉癌组、喉良性肿瘤组间分类趋势明显，说明其中一定有能够对组别进行区分的脂质标志物。由图3可以看出，癌症组与健康组、良性肿瘤组与健康组、癌症组和良性肿瘤组的OPLS-DA模型预测能力非常好；200次置换检验的结果表明所建立的三个OPLS-DA模型不存在过拟合，模型可靠。采用SPSS 22.0软件进行单变量分析，采用非参数检验(MannWhitney U检验)，根据显著性差异筛选出满足P<0.05的变量，单变量与多变量相结合的分析能够有效筛选出差异性脂质，共筛选出57种满足VIP>1且P<0.05的差异性脂质，见表4。
差异性脂质的代谢变化主要聚焦磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和鞘磷脂(SM)代谢。磷脂酶A2(PLA2)、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)可能是喉癌脂质代谢调控的关键酶，其高表达会促进喉癌的发生发展。差异性脂质中，SM 42:2_2O和SM 42:3_2O在三组人群间均存在显著性差异，其浓度水平与疾病发展具有相关性，可以作为喉癌早期诊断的潜在生物标志物。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
/>
/>
实施例2：色谱柱的选择实验
本研究利用混合脂质标准溶液进行色谱条件的优化：主要对BEH C18、CSH C18和HSS T3三种不同色谱柱进行比较。在正离子模式下的总离子流色谱图显示(图4)，对比脂质标准品的峰响应和分离度，可以看出CSH C18色谱柱分离效果稍好，且色谱柱材料适合甲酸氨水体系，与本研究使用的流动相体系较为一致，因此选择最适色谱柱为CSH C18(2.1×100mm，1.7μm)。
实施例3：流速的选择实验
流速对化合物的保留属性和色谱柱的柱效的变化有一定的影响。本实验在相同洗脱条件的前提下，以出峰时间和色谱峰形为指标，考察三种流速(0.26mL/min，0.3mL/min，0.4mL/min)对LC-MS/MS分析脂质的影响。在正离子模式下的总离子流色谱图显示(图5)，流速升高至0.4mL/min时，整个出峰时间缩短了约0.5min。由此说明，提高流速，可以加快化合物的出峰时间而缩短分析时间，减少流动相的使用，节约分析成本。当流速为0.5mL/min时柱压会超出仪器最高耐压值，色谱柱的柱效会受影响，故没有列入进行对比。因此综合考虑，将色谱柱的流速设为0.4mL/min。
实施例4：色谱柱柱温的选择实验
温度会对化合物的保留时间和选择性产生影响，随着柱温的升高，化合物出峰提前，而色谱峰半峰宽会变窄，峰高变高，而对定量产生影响。因此，需要实际考察哪种影响对脂质化合物的保留占主导地位，故比较了45℃、50℃和55℃条件下脂质响应所受的影响。结果表明(图6)，55℃条件下，色谱柱对物质的选择性更好，分离度有所改善，且出峰提前，峰响应增强。
实施例5：流动相梯度的选择实验
流动相梯度的变化能引起流动相极性的变化，从而调节样品中各组分在流动相中的分配系数，以达到各组分良好的洗脱和分离的目的。本实验以液相色谱的总离子流图为指标，对三种梯度洗脱条件下LC-MS/MS的检测能力的影响进行考察。梯度1：0～2min，40％～43％B；2～2.1min，50％B；2.1～12min，50％～54％B；12～12.1min，54％～70％B；12.1～18min，70％～99％B；18～18.1min，40％B；18.1～20min，40％B。梯度2：0～4min，60％B；4～4.1min，60％～80％B；4.1～8min，80％～90％B；8～8.1min，90％～60％B；8.1～10min，60％B。梯度3：0～2min，45％～60％B；2～4min，60％B；4～4.1min，60％～80％B；4.1～7min，80％～85％B；7～7.1min，85％～45％B；7.1～10min，45％B。
在正离子模式下的总离子流色谱图显示(图7)，脂质化合物在梯度1和3下能够得到更好的分离。但是梯度1需要20min，而梯度3需要10min，为了提高分析效率，综合考虑，选择梯度3进行下一步优化。
Claims (8)
1.一种基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于：包括以下具体过程：
步骤一：取样，获取志愿者血清：招募喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群，对志愿者进行筛选，采集所有受试者的空腹血液；将新鲜血液经预处理离心得到血清，分离与分装过程在冰上进行，所有样品通过液氮速冻后于超低温冰箱﹣80 ℃保存；
步骤二：针对 12 种脂质标准品建立分析方法：将 12 种脂质标准品作为探针进行高效液相色谱-三重四级杆质谱LC-MS分析方法优化，并完成方法学考察；12 种脂质标准品作为探针进行 LC-MS 分析方法优化的具体步骤如下：
（1）质控QC样本前处理： QC样本是挑选喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群三类受试者各 5 例样品，每例样品吸取100μL进行混合，分别按照加标样品前处理流程和不加标前处理流程进行处理；
（2）配制12种脂质标准品 I 级储备液、混合脂质标准储备液、混合内标溶液、12种脂质标准品II 级储备液与标曲工作液；
（3）利用脂质标准品溶液进行色谱柱类型、柱温、流速和流动相梯度条件优化以及质谱条件优化；
（4） LC-MS测定加标QC样品和不加标QC样品，完成检出限、定量限、线性范围、精密度、准确度和回收率的方法学考察；
步骤三：血清样品前处理及非靶向脂质组学检测：对不同组别的所有入选志愿者血清进行样品前处理，并通过步骤二已建立的分析方法，用高效液相色谱-飞行时间质谱UHPLC-QTOF-MS平台进行更为广泛的非靶向血清脂质组学检测；
步骤四：差异脂质的鉴定及统计学分析：进行多变量分析：建立主成分分析PCA分析模型，观察样本和质控样本的分布；建立正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA模型，通过置换分析观察模型的拟合程度，并筛选出变量重要性投影VIP＞1的变量；对样本中的代谢物的显著性进行单变量分析，结合多变量分析结果筛选出 VIP>1，P<0.05 的变量；对可能的差异脂质完成定性、注释和生物学意义分析。
2.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，征集的志愿者分组包括三组：喉癌患者、喉良性肿瘤患者和健康人群。
3.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，12种脂质标准品I级储备液的配制溶剂为二氯甲烷-甲醇体积比2:1混合溶液，所有标准品浓度均为 1 mg/mL；12种脂质标准品II 级储备液与标曲工作液的配制溶剂为异丙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，混合内标溶液采用的是 Avanti Polar Lipids 公司开发的氘化标准混合物产品EquiSPLASH™ LIPIDOMIX®。
5.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，步骤一中10例喉癌患者、10例喉良性肿瘤患者和10例健康患者入组。
6.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，血清样本前处理过程为：血清样品在4 ℃条件下解冻2 h，将120 μL异丙醇加至40μL 血清中，涡旋样品后在室温下孵育10 min，将样品放置﹣20 ℃ 下储存过夜，以改善蛋白质沉淀，然后于4 ℃，14000 g 离心20 min；收集上清液100 μL 加入100 μL 2:98， v/v的乙腈/水溶液将水含量调整为50％，涡旋60 s，然后4 ℃，14000 g 离心10 min后取上清进行仪器分析，所有前处理过程均在冰上操作。
7.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，
非靶向脂质组学检测中色谱条件为：流动相 A 为60:40，v/v的乙腈/水、加 10 mM 甲酸铵和 0.1%甲酸，流动相 B 为90:10, v/v的异丙醇/乙腈、加 10 mM 甲酸铵和 0.1%甲酸；梯度时长为20 min，流速为 0.4 mL/min；采用规格2.1×100 mm，1.7μm的反相色谱柱Waters CSH C18 色谱柱，进行分离，色谱柱温度为 55 ˚C，进样体积为 2μL；
非靶向脂质组学检测中质谱条件为：采用配备了电喷雾离子源的 Bruker impact II四极杆飞行时间质谱，正离子模式；碰撞气体：氩气；质谱参数设置如下：离子源温度 220℃；喷雾电压，4500 V；干燥气 8 L/min；雾化器气 1.8 Bar；碰撞能量为 7 eV，传输时间为80 μs；在 Auto MSn 模式下进行二级碎片扫描，扫描质量范围 50-1300 Da，扫描频率为10Hz；质量精度由甲酸钠溶液校正。
8.根据权利要求1所述的基于UHPLC-QTOF-MS的喉癌患者血清脂质组学检测方法，其特征在于，差异脂质的鉴定及统计学分析过程中：利用SIMCA软件进行多变量分析，采用 SPSS22.0 软件的非参数检验 Mann-Whitney U 分析对样本中的代谢物进行单变量分析，根据Metaboscape® 4.0 分析软件对可能的差异脂质完成定性及注释。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210909244.6A CN115266985B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210909244.6A CN115266985B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115266985A CN115266985A (zh) | 2022-11-01 |
| CN115266985B true CN115266985B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=83746355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210909244.6A Active CN115266985B (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115266985B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106370741A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-02-01 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法 |
| CN108680745A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-10-19 | 湖州市中心医院 | 血清脂质生物标志物在nsclc早期诊断中的应用方法 |
| CN109596748A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法 |
| CN109668984A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-23 | 山西医科大学第医院 | 一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法 |
| EP3575793A1 (en) * | 2018-05-29 | 2019-12-04 | Univerzita Pardubice | A method of diagnosing cancer based on lipidomic analysis of a body fluid |
| CN112843056A (zh) * | 2021-04-08 | 2021-05-28 | 宁夏医科大学总医院 | 氧化苦参碱在降低银屑病患者脂毒性所致表皮细胞死亡中的应用 |
| PL432015A1 (pl) * | 2019-11-29 | 2021-05-31 | Uniwersytet Medyczny W Białymstoku | Sposób oceny skuteczności leczenia chemioterapeutycznego raka płuca, panel biomarkerów metabolicznych i zestaw do monitorowania skuteczności leczenia chemioterapeutycznego raka płuca |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020061296A1 (en) * | 2018-09-21 | 2020-03-26 | Waters Technologies Corporation | System and method for lipid quantification |
-
2022
- 2022-07-29 CN CN202210909244.6A patent/CN115266985B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106370741A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-02-01 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法 |
| CN108680745A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-10-19 | 湖州市中心医院 | 血清脂质生物标志物在nsclc早期诊断中的应用方法 |
| EP3575793A1 (en) * | 2018-05-29 | 2019-12-04 | Univerzita Pardubice | A method of diagnosing cancer based on lipidomic analysis of a body fluid |
| CN109596748A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-09 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法 |
| CN109668984A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-23 | 山西医科大学第医院 | 一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法 |
| PL432015A1 (pl) * | 2019-11-29 | 2021-05-31 | Uniwersytet Medyczny W Białymstoku | Sposób oceny skuteczności leczenia chemioterapeutycznego raka płuca, panel biomarkerów metabolicznych i zestaw do monitorowania skuteczności leczenia chemioterapeutycznego raka płuca |
| CN112843056A (zh) * | 2021-04-08 | 2021-05-28 | 宁夏医科大学总医院 | 氧化苦参碱在降低银屑病患者脂毒性所致表皮细胞死亡中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 唾液代谢组学在流行性腮腺炎和急性化脓性腮腺炎中的初步分析;郑义彩;肖国岫;洪文伟;吴情;徐斌;;口腔颌面外科杂志(第03期);全文 * |
| 基于拟靶向液相色谱-质谱联用的胃癌患者血清代谢组分析;杨太忠;罗萍;李艳丽;华瑞;尹沛源;许国旺;;色谱(第02期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115266985A (zh) | 2022-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109884302B (zh) | 基于代谢组学和人工智能技术的肺癌早期诊断标志物及其应用 | |
| CN110646554B (zh) | 基于代谢组学的胰腺癌诊断标志物及其筛选方法和应用 | |
| Lin et al. | Direct infusion mass spectrometry or liquid chromatography mass spectrometry for human metabonomics? A serum metabonomic study of kidney cancer | |
| CN108414660B (zh) | 一组与肺癌早期诊断相关的血浆代谢小分子标志物的应用 | |
| Min et al. | Shotgun lipidomics for candidate biomarkers of urinary phospholipids in prostate cancer | |
| CN111289736A (zh) | 基于代谢组学的慢阻肺早期诊断标志物及其应用 | |
| Maniscalco et al. | Clinical metabolomics of exhaled breath condensate in chronic respiratory diseases | |
| CN105044361B (zh) | 一种适合于食管鳞状细胞癌早期诊断的诊断标记物及其筛选方法 | |
| CN111579665B (zh) | 一种基于uplc/hrms的代谢组学相对定量分析方法 | |
| CN111562338B (zh) | 透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用 | |
| BRPI0711967A2 (pt) | ensaio de biomarcador de espectrometria de massa | |
| US8653006B2 (en) | Metabolite biomarkers for the detection of esophageal cancer using NMR | |
| CN113777209B (zh) | 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 | |
| Yang et al. | Serum metabolic profiling study of endometriosis by using wooden-tip electrospray ionization mass spectrometry | |
| CN113406226B (zh) | 一种基于非靶向代谢组学检测gist患者血浆中伊马替尼代谢物的方法 | |
| CN116413432A (zh) | 基于肠道菌群代谢组学的胰腺癌诊断标志物及其筛选方法和应用 | |
| CN112183616A (zh) | 一种脑胶质瘤诊断的诊断标志物、试剂盒及筛选方法和脑胶质瘤诊断模型的构建方法 | |
| CN109946411B (zh) | 用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物及其筛选方法 | |
| CN113567585A (zh) | 一种基于外周血的食管鳞癌筛查标志物及试剂盒 | |
| CN115266985B (zh) | 一种基于uhplc-qtof-ms的喉癌患者血清脂质组学检测方法 | |
| CN113552227A (zh) | 一组用于诊断儿童哮喘病的联合标志物及其应用和检测试剂盒 | |
| CN113484518B (zh) | 一种区分肺部疾病的诊断生物标志物 | |
| CN113138274A (zh) | 一种组合物和应用及肺癌患者诊断试剂盒 | |
| CN109387593B (zh) | 急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒及其应用 | |
| CN115825414B (zh) | 血液或尿液代谢标志物及其在子宫内膜癌早筛中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |