CN109668984A - 一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，该模型的构建方法包括：收集喉癌患者以及没有患喉癌或者类似疾病人群的血清样本，进行样本的制备，对样本进行液质联用检测，得到原始代谢指纹图谱，将原始谱图转化为包括保留时间、质荷比以及响应值的三维矩阵，对三维矩阵数据进行归一化以及标准化处理后依次进行主成分分析以及正交信号下的偏最小二乘判别分析，差异代谢物的筛选与指认，去掉无关变量后再次进行判别模型的建立，通过筛选后的变量建立的模型对喉癌的判别灵敏度及特异性提高。本发明可用于喉癌潜在人群的快速批量筛查，提高喉癌发生早期筛查效率，降低患者痛苦。

Description

一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法
技术领域
本发明属于代谢组学分析技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，用于对喉癌高发人群进行快速筛查。
背景技术
喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，发病率有逐年上升趋势，约93％-99％患者的组织类型为鳞状细胞癌。根据肿瘤发生部位可分为声门上型、声门型、跨声门型以及声门下型。喉癌症状主要为声嘶、呼吸困难、咳嗽、吞咽困难、颈部淋巴结转移等。不同原发部位症状出现顺序可能不同。引发喉癌的病因尚不明确，可能有多种因素共同导致，如吸烟、饮酒、空气污染以及病毒感染等，且喉癌发病率具有明显的性别偏向及地域性，男性发病率高于女性，北方高于南方。
喉癌病发早期症状不明显不易发觉，现有的用于确诊喉癌的技术主要依靠组织活检，样本的采集在喉镜下完成，甚至有些需要反复多次活检才能证实。由于其直观且特异性高，目前没有可替代方法。喉癌组织活检为有创检查，一方面患者体验痛苦，依从性不高；另一方面也容易促进肿瘤生长及扩散，甚至给预后带来不良影响。因此，研究其他的用于喉癌早期筛查或者辅助检查的技术手段十分必要。
代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发等领域。代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科，它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。喉癌患者早期表现出的症状不明显，但是机体中代谢谱会发生变化，利用代谢组底端放大的特点找到喉癌特征代谢物进行建模分析，以此提高早期喉癌筛查效率。
目前尚没有有关喉癌判别模型构建用于其早期辅助诊断的报道，现有的关于其他疾病的代谢组学模型构建方法所用变量为高通量检测所得全部变量，虽具有全面性但是不够灵敏特异，本发明在一次建模过程中经过对模型贡献的筛选，去除掉无关变量的干扰，采用贡献较大的变量组合进行二次建模，一方面提高了模型的灵敏度以及特异性，另一方面也简化了验证集的检测方法，只需检测筛选的变量组合即可，提高了检测效率。
发明内容
为解决现有技术中喉癌检查的局限性，本发明旨在提供一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，该判别模型构建方法简单，可用于喉癌潜在人群的快速批量筛查，提高喉癌发生早期筛查效率，降低患者痛苦。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)样本的收集：收集喉癌患者血清样本，将收集的患者血清样本随机分为探索集和验证集两组，并收集没有患喉癌或者类似疾病人群的血清作为对照样本；所有样本各取10μL混合作为质量控制样本；
(2)样本的制备：用移液器吸取100μL待测样本，加入4倍体积的蛋白沉淀溶剂进行提取，涡旋30s以沉淀蛋白；然后于高速离心机中离心；移取上清液在离心浓缩仪中悬干；悬干的样本用100μL体积比为80％的蛋白沉淀溶剂-水溶液进行复溶，于高速离心机中离心，将上清液转移至液质联用进样瓶中进样；
(3)样本的检测：对样本进行液质联用检测，每隔几个样本插入一针质量控制样本，得到原始代谢指纹图谱；
(4)数据矩阵的建立：将原始代谢谱图进行预处理并转化为包括保留时间、质荷比m/z以及响应值在内的三维数据矩阵，并进行归一化以及标准化处理；
(5)一次建模：将步骤(4)中预处理的数据进行PCA主成分分析以及偏最小二乘判别分析，对PCA主成分分析拟合出的多个主成分，选取其中的第一主成分和第二主成分用于建模，对偏最小二乘判别分析得到的偏最小二乘模型进行七次交互循环验证；
(6)差异代谢物的筛选与鉴定：根据探索集所有变量一次建模的结果，通过多变量分类模型S-Plot与T检验进行差异代谢物变量的筛选，确定变量重要性因子VIP值以及用来判定假设检验结果的统计量P值；利用本地数据库以及公用数据库HMDB、METLIN以及Massbank进行差异代谢物的指认；
(7)二次建模：将步骤(6)中鉴定得到的差异代谢物的保留时间，质荷比m/z值以及响应值的三维矩阵数据导入多元统计分析软件SIMCA-P中进行OPLS-DA正交偏最小二乘判别分析的模型建立，找到伴随模型贡献较大的代谢物变量，并通过这些代谢物变量的联合使用建立判别模型；
(8)用验证集的样本数据对建立的判别模型进行验证。
上述构建方法中，在步骤(1)样本的收集中，所述收集患者血清样本是指收集声门上型、声门下型、声门型以及跨声门型喉癌患者血清样本。
上述构建方法中，在步骤(2)样本的制备过程中，加入的蛋白沉淀溶剂为乙腈。
上述构建方法中，在步骤(2)样本的制备过程中，样本于高速离心机中离心的具体参数为：温度为4℃，离心机转速为13000rpm，离心时间为15分钟。
上述构建方法中，在步骤(3)样本的检测中，每隔几个样本插入一针质量控制样本，具体为每隔10个样本插入一针质量控制样本。
上述构建方法中，在步骤(3)样本的检测中，液质联用检测的液相条件和质谱条件分别为：
质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极为3.5KV，负极为2.5KV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围：质荷比m/z为100-1500，正负离子切换采集模式；分辨率采用MS FullScan 35000FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；
液相条件：相色谱所用色谱柱为Waters HSS T3柱，规格为2.1×100mm,1.8μm，进样量为3μL，流动相A为0.1％的甲酸水；流动相B为0.1％的甲酸乙腈，梯度洗脱：0-2min为2％B；2-13min为2％-35％B；13-28min为35％-98％B；28min-30min为98％B；30min-30.5min为98％-2％B；30.5-33min，2％B。
上述构建方法中，在步骤(4)数据矩阵的建立中，对原始谱图进行预处理是指用Compound Discover 2.0对原始谱图进行背景扣除、基线校正，峰识别以及总峰面积归一化处理，得到包含保留时间、质荷比m/z值以及峰响应值在内的三维数据矩阵，用于后期统计分析。
上述构建方法中，在步骤(5)的一次建模中，偏最小二乘判别分析模型中，可预测值R2须大于0.5。
与现有技术中的传统喉癌筛选方法相比，本发明具有如下有益效果：
1、喉癌患者的早期症状表现不明显，常常被忽视而错过最佳治疗时机，本发明根据人体发生病变会导致机体代谢谱发生变化的原理，利用代谢组底端放大的特点找到喉癌特征代谢物进行建模分析，将血清代谢组学分析技术应用于喉癌的早期筛查。本发明可以对喉癌潜在人群进行初步筛查，仅需采集患者的血清样本就可方便快捷地完成初步筛查，具有痛苦小，患者依从性好；费用低，方法简单，便于推广应用；无创伤，防止肿瘤扩散等优点。
2、本发明在一次建模过程中将原始代谢谱图预处理后的数据进行PCA主成分分析以及偏最小二乘判别分析，对PCA主成分分析拟合出的多个主成分，选取其中的第一主成分和第二主成分用于建模，对偏最小二乘判别分析得到的偏最小二乘模型进行七次交互循环验证。去除掉无关变量的干扰，采用贡献较大的变量组合进行二次建模，一方面提高了模型的灵敏度以及特异性，另一方面也简化了验证集的检测方法，只需检测筛选的变量组合即可，提高了检测效率，以此提高早期喉癌筛查效率和准确度。
3、本发明的推广应用，可以提高对喉癌潜在人群的筛选效率，降低筛选成本，使喉癌患者早发现早治疗，为喉癌的早期判别提供有力的支持，对喉癌的研究与治疗具有积极的作用。
附图说明
图1为所有样本主成分分析结果图，纵轴t[1]为第一主成分，横轴t[2]为第二主成分，其中，质量控制样本聚集，说明方法稳定可靠；
图2为探索集主成分分析结果图，纵轴t[1]为第一主成分，横轴t[2]为第二主成分；
图3为探索集七次交互循环验证排列实验结果，R2为可解释度，Q2为可预测性；
图4为采用探索集所有变量一次建模的结果,纵轴t[1]为第一主成分，横轴t[2]为第二主成分；
图5为多变量分类模型S-Plot检验筛选差异代谢物结果，横轴P(corr)[1]为每个变量的协方差，纵轴p[1]为每个变量的相关度；
图6为采用筛选完后的变量进行OPLS-DA正交偏最小二乘判别分析及二次建模的结果,纵轴t[1]表示自动校正后的第一主成分，横轴t0[1]表示自动校正后的第二主成分；
图7为验证集主成分分析PCA的结果，纵轴t[1]为第一主成分，横轴t[2]为第二主成分；
图8为验证集采用筛选变量进行正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA二次建模的结果,纵轴t[1]为自动校正后的第一主成分，横轴t0[1]为自动校正后的第二主成分。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体的描述。
本发明的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法是应用液质联用技术，检测血清样本中的代谢物，找到喉癌的判别标志物。包括：收集没有患喉癌或者类似疾病人以及各类型喉癌患者血清样本，将收集的患者血清样本随机分为探索集和验证集两组，将收集没有患喉癌或者类似疾病人群的血清作为对照样本，所有样品各取10μL混合作为质量控制样本；样本经处理后通过液质联用检测分析；通过一次建模筛选出喉癌患者与没有患喉癌或者类似疾病人之间代谢谱差异；根据数据库比对进行差异物指认；然后去除无关变量的影响，放大差异变量的贡献，用差异变量进行二次建模以优化模型并提高模型的灵敏度。
实施例中，一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法的具体步骤如下：
一、实验材料和测试方法
(1)样本的收集与制备：
收集声门上型、声门下型、声门型以及跨声门型喉癌患者血清样本59份，将收集的患者血清样本随机分为探索集和验证集两组，并收集没有患喉癌或者类似疾病人群的血清作为对照样本30份；所有样品各取10μL混合作为质量控制样本。
用移液器吸取100μL待测样本，加入4倍体积的乙腈进行提取，涡旋30s以沉淀蛋白；然后于高速离心机中在4℃下以13000rpm离心15min；移取上清液在离心浓缩仪中悬干；悬干的样本用100μL体积比为80％的乙腈-水溶液进行复溶，于高速离心机中在4℃下以13000rpm离心15min，将上清液转移至液质联用进样瓶中，进样分析。
(2)测试条件：
液相条件：流动相A，含0.1％甲酸的水；流动相B，含0.1％甲酸的乙腈。梯度洗脱：0～2min，2％B；2～3min，2％B-35％B；3～28min，35％B-98％B；28～30min，98％B；30-30.5min，为98％B-2％B；30.5-33min为2％B。进样量:3μL；流速，0.2mL/min；柱温:35℃；HSST3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm。
质谱条件:采用HESI离子化方式；喷雾电压：正极为3.5kV，负极为2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速为35arb，辅助气流速为10arb；扫描模式为FullScan/dd-MS2，采集范围为质荷比m/z为100～1500，正负离子切换采集模式；分辨率采用MSFull Scan 35000FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV。
(3)样本的检测：
将样本在上述的液相条件和质谱条件下进行液质联用检测，检测前先进5针调节质量控制样本，每10个样本插入一针质量控制样本，得到原始代谢指纹图谱。
(4)数据矩阵的建立：将原始代谢谱图进行预处理并转化为包括保留时间、质荷比以及响应值在内的三维数据矩阵，并进行归一化以及标准化处理；具体是用CompoundDiscover 2.0对原始代谢指纹谱图进行背景扣除、基线校正，峰识别以及总峰面积归一化处理，得到包含保留时间、质荷比m/z值以及峰响应值在内的三维数据矩阵，用于后期统计分析。
(5)一次建模：将步骤(4)中预处理的数据进行PCA主成分分析以及偏最小二乘判别分析，对PCA主成分分析拟合出的多个主成分，选取其中的第一主成分和第二主成分用于建模，对偏最小二乘判别分析得到的偏最小二乘模型进行七次交互循环验证。
得到所有样本主成分分析结果图，如图1所示，在图1中，质量控制样本聚成一团，说明实验说明方法稳定可靠；
得到探索集主成分分析结果图，如图2所示，通过主成分分析可以看出，相比于没有患喉癌或类似疾病的人，喉癌患者的代谢谱发生明显偏移，被第一主成分分开，可预测值R2＝0.526，可解释值Q2＝0.325。
得到探索集七次交互循环验证排列实验结果，如图3所示，然后采用排列实验对模型进行拟合，没有出现过拟合现象。
对探索集所有变量进行正交信号的偏最小二乘建模分析，结果如图4所示，可以看到有一个正常样本出现误判现象。
(6)差异代谢物的筛选与鉴定：根据模型的变量重要性因子VIP值以及用来判定假设检验结果的统计量P值，通过多变量分类模型S-Plot与T检验进行差异代谢物的筛选；利用本地数据库以及公用数据库HMDB、METLIN以及Massbank进行差异代谢物的指认；
根据图4中探索集所有变量一次建模的结果，通过多变量分类模型S-Plot与T检验进行差异代谢物变量筛选，确定变量重要性因子VIP值以及用来判定假设检验结果的统计量P值，图5为多变量分类模型S-Plot筛选差异代谢物结果；并比对HMDB,METLIN以及Massbank数据库进行指认，得到19个差异代谢物，具体信息如表1所示。
(7)二次建模：将步骤(6)中鉴定得到的差异代谢物的保留时间，质荷比m/z值以及响应值的三维矩阵数据导入多元统计分析软件SIMCA-P中进行OPLS-DA正交偏最小二乘判别分析的模型建立，找到伴随模型贡献较大的代谢物变量，并通过这些代谢物变量的联合使用建立判别模型；其中，找到伴随模型贡献较大的19个代谢物变量，并通过这19个贡献较大的代谢物变量的联合使用建立判别模型；
用19个贡献较大的代谢物变量进行OPLS-DA正交偏最小二乘判别分析及二次建模得到如图6所示模型，正常血清样本与喉癌血清样本被第一主成分完全分开，正确判别率可达100％。
(8)用验证集的样本数据对建立的判别模型进行验证。
最后用验证集检测19个差异变量，结果如图7所示；再用差异变量响应值数据进行多元统计分析进行验证，正常血清样本与喉癌血清样本被第一主成分完全分开，正确判别率可达100％，得到相同的结论，结果如图8所示。
二、结果
所有喉癌和健康样本通过液质联用测试，得到喉癌患者以及正常对照血清样本的代谢谱。图1中质量控制样本聚成一团，说明实验过程中仪器方法可靠稳定。如图2所示，通过主成分分析可以看出，相比于正常人，喉癌患者的代谢谱发生明显偏移，被第一主成分分开，可解释度R2＝0.526，可预测性Q2＝0.325。然后采用七次交互循环验证排列实验对模型进行拟合，没有出现过拟合现象，如图3所示。用所有变量进行正交信号得偏最小二乘建模分析，结果如图4所示，可以看到有一个正常样本出现误判现象。通过多变量分类模型S-Plot与T检验进行差异变量筛选并比对数据库进行指认，得到19个差异代谢物，具体信息如表1所示。用19个差异变量进行二次建模得到如图6所示模型，正常血清样品与喉癌血清样品被第一主成分完全分开，正确判别率可达100％。最后用验证集检测19个差异变量，再用差异变量响应值数据进行多元统计分析进行验证，得到相同的结论。
表1：
表1差异代谢物指认信息表

Claims (8)

1.一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样本的收集：收集喉癌患者血清样本，将收集的患者血清样本随机分为探索集和验证集两组，并收集没有患喉癌或者类似疾病人群的血清作为对照样本；所有样本各取10μL混合作为质量控制样本；
(2)样本的制备：用移液器吸取100μL待测样本，加入4倍体积的蛋白沉淀溶剂进行提取，涡旋30s以沉淀蛋白；然后于高速离心机中离心；移取上清液在离心浓缩仪中悬干；悬干的样本用100μL体积比为80％的蛋白沉淀溶剂-水溶液进行复溶，于高速离心机中离心，将上清液转移至液质联用进样瓶中进样；
(3)样本的检测：对样本进行液质联用检测，每隔几个样本插入一针质量控制样本，得到原始代谢指纹图谱；
(4)数据矩阵的建立：将原始代谢谱图进行预处理并转化为包括保留时间、质荷比m/z以及响应值在内的三维数据矩阵，并进行归一化以及标准化处理；
(5)一次建模：将步骤(4)中预处理的数据进行PCA主成分分析以及偏最小二乘判别分析，对PCA主成分分析拟合出的多个主成分，选取其中的第一主成分和第二主成分用于建模，对偏最小二乘判别分析得到的偏最小二乘模型进行七次交互循环验证；
(6)差异代谢物的筛选与鉴定：根据探索集所有变量一次建模的结果，通过多变量分类模型S-Plot与T检验进行差异代谢物变量的筛选，确定变量重要性因子VIP值以及用来判定假设检验结果的统计量P值；利用本地数据库以及公用数据库HMDB、METLIN以及Massbank进行差异代谢物的指认；
(7)二次建模：将步骤(6)中鉴定得到的差异代谢物的保留时间，质荷比m/z值以及响应值的三维矩阵数据导入多元统计分析软件SIMCA-P中进行OPLS-DA正交偏最小二乘判别分析的模型建立，找到伴随模型贡献较大的代谢物变量，并通过这些代谢物变量的联合使用建立判别模型；
(8)用验证集的样本数据对建立的判别模型进行验证。
2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(1)样本的收集中，所述收集患者血清样本是指收集声门上型、声门下型、声门型以及跨声门型喉癌患者血清样本。
3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(2)样本的制备过程中，加入的蛋白沉淀溶剂为乙腈。
4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(2)样本的制备过程中，样本于高速离心机中离心的具体参数为：温度为4℃，离心机转速为13000rpm，离心时间为15分钟。
5.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(3)样本的检测中，每隔几个样本插入一针质量控制样本，具体为每隔10个样本插入一针质量控制样本。
6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(3)样本的检测中，液质联用检测的液相条件和质谱条件分别为：
质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极为3.5KV，负极为2.5KV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围：质荷比m/z为100-1500，正负离子切换采集模式；分辨率采用MS Full Scan35000FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；
液相条件：相色谱所用色谱柱为Waters HSS T3柱，规格为2.1×100mm,1.8μm，进样量为3μL，流动相A为0.1％的甲酸水；流动相B为0.1％的甲酸乙腈，梯度洗脱：0-2min为2％B；2-13min为2％-35％B；13-28min为35％-98％B；28min-30min为98％B；30min-30.5min为98％-2％B；30.5-33min，2％B。
7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(4)数据矩阵的建立中，对原始谱图进行预处理是指用Compound Discover2.0对原始谱图进行背景扣除、基线校正，峰识别以及总峰面积归一化处理，得到包含保留时间、质荷比m/z值以及峰响应值在内的三维数据矩阵，用于后期统计分析。
8.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的喉癌血清判别模型的构建方法，其特征在于：在步骤(5)的一次建模中，偏最小二乘判别分析模型中，可预测值R2须大于0.5。
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