CN108548883B - 用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物、方法及应用 - Google Patents
用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物，包括：苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和半胱氨酸。生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法，包括：检测人体血清中的生物标志物的浓度，若该人体内苯丙氨酸的浓度高于正常水平的41％以上、酪氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、谷氨酸的浓度高于正常水平的65％以上、鸟氨酸的浓度高于正常水平的30％以上，且半胱氨酸的浓度高于正常水平的43％以上，认为该人体存在药物性肝损伤。生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用。本发明提供的氨基酸生物标志物，具有较高的诊断价值。同时，本发明的诊断方法和诊断试剂，大大提高了肝损伤诊断的效率和准确性。
Description
技术领域
本发明属于肝损伤诊断技术领域，涉及用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物、方法及应用。
背景技术
目前临床诊断指标与缺陷：目前临床尚无统一、公认的药物性肝损伤的诊断标准，仅根据丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)等传统指标进行判断，特异性较差，很难完全反映肝损伤的严重程度，并且无法鉴别肝损伤类型与诱导因素。另外，病理组织学检查具有侵袭性，也无法在肝损伤发生之前进行及时准确的预警。传统指标的滞后性使其不适合作为早期预警与疗效评价的标准，不能做到有效的预防与预后判断，加重患者机体及经济的双重负担。而氨基酸类生物标志物具有如下优势：1、氨基酸是反映机体代谢功能的重要小分子代谢物，氨基酸的异常紊乱与疾病的发生发展具有紧密的关联。2、生物标志物的变化发生在药物性肝损伤之前，相比于传统指标的滞后性，具有预警的作用。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物。
本发明另有一个目的是提供生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法。
本发明再有一个目的是提供生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物，所述生物标志物包括：苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和半胱氨酸。
优选的是，所述的用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物还包括：异亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸和β-丙氨酸。
优选的是，所述的用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物还包括：牛磺酸和天门冬氨酸。
所述的生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法，包括如下步骤：检测人体血清中的所述生物标志物的浓度，若该人体内苯丙氨酸的浓度高于正常水平的41％以上、酪氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、谷氨酸的浓度高于正常水平的65％以上、鸟氨酸的浓度高于正常水平的30％以上，且半胱氨酸的浓度高于正常水平的43％以上，认为该人体存在药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法，还包括如下步骤：若该人体内异亮氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、赖氨酸的浓度高于正常水平的28％以上、丝氨酸的浓度高于正常水平的18％以上，且β-丙氨酸的浓度高于正常水平的46％以上，则认为该人体存在药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法，还包括如下步骤：若该人体内牛磺酸的浓度低于正常水平的13％以上，且天门冬氨酸的浓度高于正常水平的27％以上，则认为该人体存在药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法，还包括提供一纯化装置，所述纯化装置用于在检测血清中的所述生物标志物的浓度之前纯化血清，所述纯化装置包括：
多级过滤器，其呈螺旋形，所述多级过滤器内沿竖直方向依次设置有的第一过滤膜、第二过滤膜和第三过滤膜，彼此相邻的过滤膜之间的间隔为至少3cm，所述第一过滤膜的孔径为1μm，所述第二过滤膜的孔径为0.5μm，所述第三过滤膜的孔径为0.3μm；
导引部，其包括第一圆柱体和第一锥形部，所述第一圆柱体的下端与所述多级过滤器的进样口连通，所述第一锥形部的直径由上到下逐渐减小，所述第一锥形部的下端与所述第一圆柱体的上端连通；
导流部，其包括第二圆柱体和第二锥形部，所述第二圆柱体的上部与所述多级过滤器的出样口连通，所述第二圆柱体的下部与所述第二锥形部的上端连通，所述第二锥形部的直径由上到下逐渐减小，且所述第二锥形部的直径最小处小于1cm；
制冷部，其套设于所述导引部和多级过滤器的外部，所述制冷部包括彼此连接的第一柱状冰袋和第二柱状冰袋，所述导引部位于所述第一柱状冰袋的中央空腔内，所述多级过滤器位于所述第二柱状冰袋的中央空腔内。
所述的生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用。
优选的是，所述的应用中，所述肝损伤诊断试剂盒包括生物标志物母液和生物标志物储备液，所述生物标志物母液包括：浓度为10mg·ml-1的苯丙氨酸、10mg·ml-1酪氨酸、10mg·ml-1谷氨酸、10mg·ml-1鸟氨酸、10mg·ml-1半胱氨酸、10mg·ml-1异亮氨酸、10mg·ml-1赖氨酸、10mg·ml-1丝氨酸、10mg·ml-1β-丙氨酸、10mg·ml-1牛磺酸和10mg·ml-1天门冬氨酸；所述生物标志物储备液包括：浓度为1mg·ml-1的苯丙氨酸、1mg·ml-1酪氨酸、1mg·ml-1谷氨酸、1mg·ml-1鸟氨酸、1mg·ml-1半胱氨酸、1mg·ml-1异亮氨酸、1mg·ml-1赖氨酸、1mg·ml-1丝氨酸、1mg·ml-1β-丙氨酸、1mg·ml-1牛磺酸和1mg·ml-1天门冬氨酸。
本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的氨基酸生物标志物，与药物性肝损伤患者的诊断和治疗过程相关联，用于肝损伤诊断时具有较高的诊断价值，为药物性肝损伤早期发现的潜在生物标志物研究和药物性肝损伤的发生机制研究提供基础与思路。同时，本发明还提供有诊断方法和诊断试剂且，检测手段快速、方便，大大提高了肝损伤诊断的效率和准确性，诊断和预警准确率达到100％。此外，本发明的纯化装置通过三级过滤再次纯化分离的血清样本，并且，将多级过滤器设计为螺旋形，以在有限的空间内提供较长的过滤通道，同时，本发明中设置有导流部，便于将待纯化的血清导流如过滤器中，设置有导引部将纯化后的血清样本直接导流入所需要的容器中，比如Epp管中，以方便使用。同时，还在导引部和多级过滤器的外部设置有制冷部，以便于能够在过滤中更好地保存血清样本，以提高血清样本的纯度和贮存良好性，便于后期检测
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明寻找并确认临床药物肝损伤早期发现与疗效评价相关可能生物标志物的氨基酸组学研究思路；
图2A为正离子检测模式下的健康者血清的总离子流图，图2B分别为正离子检测模式下的药物性肝损伤患者血清的总离子流图，图2C为负离子检测模式下的健康者的总离子流图，图2D为负离子检测模式下的药物性肝损伤患者的总离子流图；
图3A为正离子检测模式下QC样本主成分PCA得分图，图3B负离子检测模式下QC样本主成分PCA得分图，图3C为正离子检测模式下QC样本的主成分PCA的线性偏差图，图3D为负离子检测模式下QC样本的主成分PCA的线性偏差图，峰面积偏差由X、Y轴的分布确定；
图4A为正离子模式下的健康者、药物性肝损伤初诊患者与治疗转归患者血清OPLS-DA得分图，图4B为负离子模式下的健康者、药物性肝损伤初诊患者与治疗转归患者血清OPLS-DA得分图，其中，■药物性肝损伤初诊患者，●药物性肝损伤接受治疗患者,◆健康者,＊QC质控组；
图5A为正离子模式下的药物性肝损伤初诊患者与健康者血清的OPLS-DA得分图，图5B为负离子模式下的药物性肝损伤初诊患者与健康者血清的OPLS-DA得分图，其中，■药物性肝损伤初诊患者,●健康者；
图6A为正离子检测模式下PLS-DA数据模型的得分图，图6B为正离子检测模式下数据模型的置换验证结果，图6C为负离子检测模式下PLS-DA数据模型的得分图，图6D为负离子检测模式下数据模型的置换验证结果，其中，●健康者■药物性肝损伤初诊患者；
图7A为正离子检测模式下健康者和肝损伤患者血清代谢轮廓的S-plot载荷图，图7B为负离子检测模式下健康者和肝损伤患者血清代谢轮廓的S-plot载荷图，图中远离聚集中心的红色标注为对分组有贡献的差异变量(VIP>1)；
图8A和8B分别为应用jack-knifed置信区间验证并确定对药物性肝损伤组初诊病例与健康组分组有贡献且可靠的变量；
图9A和9B分别为正、负离子检测模式下，药物性肝损伤初诊患者与治疗后转归患者的OPLS-DA得分图，9(A正离子检测模式，9(B)负离子检测模式■药物性肝损伤初诊患者；●药物性肝损伤转归患者；
图10A和10C分别为正和负离子检测模式下PLS-DA数据模型的得分图；图10C和10D分别为正和负离子检测模式下数据模型置换验证结果，■药物性肝损伤初诊患者；●药物性肝损伤接受治疗的患者；
图11A和11B分别为正和负离子检测模式下的数据模型置信区间的载荷图；
图12为健康者和药物性肝损伤初诊患者以及治疗后转归患者获得的相关生物标志物进行共有及特有性比较；
图13A和13B分别为在正和负离子检测模式下，健康者、药物性肝损伤初诊与治疗后样本获得的共有与特有可能生物标志物，正离子检测模式共有可能生物标志物7个，负离子检测模式共有可能生物标志物12个；
图14A为苯丙氨酸在健康者、DILI初诊患者与治疗后转归患者血清中的浓度趋势变化，图14B为二甲基鸟苷在健康者、DILI初诊患者与治疗后转归患者血清中的浓度趋势变化；
图15为抗肿瘤药物、中药与降脂药引发损伤病例与健康组血清的OPLS-DA分类得分图，■中药，◆他汀，＊抗肿瘤药物，●健康者；
图16A和16B分别为在正和负离子检测模式下，抗肿瘤药物与健康组血清的OPLS-DA分类得分图，■抗肿瘤药物性肝损伤初诊患者，●健康者；
图17A和17B分别为在正和负离子检测模式下，中药与健康组血清的OPLS-DA分类得分图，■中药药物性肝损伤初诊患者，●健康者；
图18A和18B分别为在正和负离子检测模式下，他汀与健康组血清的OPLS-DA分类得分图，■他汀药物性肝损伤初诊患者，●健康者；
图19为本发明其中一个实施例中生物标志物苯丙氨酸的ROC曲线图；
图20为本发明其中一个实施例中纯化装置的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物，所述生物标志物包括：苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鸟氨酸和半胱氨酸。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物还包括：异亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸和β-丙氨酸。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述生物标志物还包括：牛磺酸和天门冬氨酸。
本发明还提供所述的生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法，包括如下步骤：检测人体血清中的所述生物标志物的浓度，若该人体内苯丙氨酸的浓度高于正常水平的41％以上、酪氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、谷氨酸的浓度高于正常水平的65％以上、鸟氨酸的浓度高于正常水平的30％以上，且半胱氨酸的浓度高于正常水平的43％以上，认为该人体存在药物性肝损伤。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括如下步骤：若该人体内异亮氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、赖氨酸的浓度高于正常水平的28％以上、丝氨酸的浓度高于正常水平的18％以上，且β-丙氨酸的浓度高于正常水平的46％以上，则认为该人体存在药物性肝损伤。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括如下步骤：若该人体内牛磺酸的浓度低于正常水平的13％以上，且天门冬氨酸的浓度高于正常水平的27％以上，则认为该人体存在药物性肝损伤。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括提供一纯化装置，所述纯化装置用于在检测血清中的所述生物标志物的浓度之前纯化血清，所述纯化装置包括：多级过滤器1，其呈螺旋形，所述多级过滤器内沿竖直方向依次设置有的第一过滤膜101、第二过滤膜102和第三过滤膜103，彼此相邻的过滤膜之间的间隔为至少3cm，所述第一过滤膜的孔径为1μm，所述第二过滤膜的孔径为0.5μm，所述第三过滤膜的孔径为0.3μm；导引部2，其包括第一圆柱体和第一锥形部，所述第一圆柱体的下端与所述多级过滤器的进样口连通，所述第一锥形部的直径由上到下逐渐减小，所述第一锥形部的下端与所述第一圆柱体的上端连通；导流部3，其包括第二圆柱体和第二锥形部，所述第二圆柱体的上部与所述多级过滤器的出样口连通，所述第二圆柱体的下部与所述第二锥形部的上端连通，所述第二锥形部的直径由上到下逐渐减小，且所述第二锥形部的直径最小处小于1cm；制冷部4，其套设于所述导引部和多级过滤器的外部，所述制冷部包括彼此连接的第一柱状冰袋和第二柱状冰袋，所述导引部位于所述第一柱状冰袋的中央空腔内，所述多级过滤器位于所述第二柱状冰袋的中央空腔内。本发明的纯化装置通过三级过滤再次纯化分离的血清样本，并且，将多级过滤器设计为螺旋形，以在有限的空间内提供较长的过滤通道，同时，本发明中设置有导流部，便于将待纯化的血清导流如过滤器中，设置有导引部将纯化后的血清样本直接导流入所需要的容器中，比如Epp管中，以方便使用。同时，还在导引部和多级过滤器的外部设置有制冷部，以便于能够在过滤中更好地保存血清样本，以提高血清样本的纯度和贮存良好性，便于后期检测。
本发明还提供所述的生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的应用中，所述肝损伤诊断试剂盒包括生物标志物母液和生物标志物储备液，所述生物标志物母液包括：浓度为10mg·ml-1的苯丙氨酸、10mg·ml-1酪氨酸、10mg·ml-1谷氨酸、10mg·ml-1鸟氨酸、10mg·ml-1半胱氨酸、10mg·ml-1异亮氨酸、10mg·ml-1赖氨酸、10mg·ml-1丝氨酸、10mg·ml-1β-丙氨酸、10mg·ml-1牛磺酸和10mg·ml-1天门冬氨酸；所述生物标志物储备液包括：浓度为1mg·ml-1的苯丙氨酸、1mg·ml-1酪氨酸、1mg·ml-1谷氨酸、1mg·ml-1鸟氨酸、1mg·ml-1半胱氨酸、1mg·ml-1异亮氨酸、1mg·ml-1赖氨酸、1mg·ml-1丝氨酸、1mg·ml-1β-丙氨酸、1mg·ml-1牛磺酸和1mg·ml-1天门冬氨酸。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
实施例1
(1)本项目经首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会审议批准。
(2)健康志愿者入选标准(20名)年龄：18～60岁；性别：男性或者女性均可；体重：体重指数在19～24之内(体重指数＝体重/身高2(kg/m2))，应避免体重过重或过轻者，男性体重一般不要低于50kg，女性体重一般不低于45kg；身体健康，无心、肝、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史，血压、心率、心电图、呼吸状况、肝肾功能，血常规、尿常规、胸片正常或异常无临床意义者。近期未服用抗生素类、抗肿瘤类、抗结核类、降糖类、激素、抗心律失常药、中草药等药物。
(3)药物性肝损伤患者入选标准(30名)年龄：18～60岁；性别：男性或者女性均可；近期较单一使用抗菌药物或抗肿瘤药物任意一种并引发肝损伤，在应用药物期间出现异常的ALT、ALP升高，ALT≥3倍正常值上限(ULN)或者ALP≥2倍正常值上限(ULN)。
(4)排除标准严格排除不符合纳入标准者；住院时间较短(住院天数少于7天)，无法观察肝功能变化及完善必要检查者；未达肝损伤标准，ALT、AST、ALP均升高不足正常值两倍；用药过于复杂，难以判断由一类药物引发的肝损伤；近期有病毒性肝炎(HAV、HBV、HCV或HEV)感染；代谢和遗传性肝病者；酒精性肝病(饮酒史、酒精水平、AST/ALT>2∶1)；近期有提示巨细胞病毒感染；经常吸烟、嗜酒者(吸烟超过5支/日，每周饮用超过21单位的酒精，1单位＝360mL啤酒或45mL白酒或150mL葡萄酒)。
(5)建立病例信息库向患者详细介绍本研究为科学研究，患者自愿签署由研究负责单位伦理委员会批准的知情同意书，并且保留在研究档案中，保障患者隐私。详细记录患者的性别、年龄、体重、用药情况、治疗进展情况及临床生化指标的检测结果。
(6)样本的收集以药物性肝损伤患者确诊当日为初始取样点，之后每三天取样一次，直至药物性肝损伤有效缓解及痊愈为收集终点，同时收集20例健康人的全血样本与尿液样本。将全血样本低温离心、取上清液后获得血清样本，当天测定血清样本中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)等临床生化指标，对尿液进行酶法的尿肌酐值测定，其余血清与尿液样本均置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。
2氨基酸组学样品的前处理与检测：
(1)样本前处理：对健康人、药物性肝损伤初诊患者及治疗不同阶段血清进行乙腈沉淀蛋白的样本前处理，将上述样本经Captiva 96孔过滤板去除残余的蛋白(AgilentTechnologies，Germany)，以提高检测灵敏度，避免堵塞液相色谱柱，使样本更适用于RRLC-MS检测系统。
(2)样本检测：本发明拟对沉淀蛋白后的健康组、初诊组与治疗组患者血清进行LC-MS/MS一级全扫描和二级碎片全扫描，获得氨基酸组学研究的相关数据。利用LC-MS/MS中信息依赖的数据采集(Information Dependent Acquisition,IDA)功能，设定不同碰撞能量(CE)实验(CE＝20，35，50)，获得用于代谢物结构鉴定的不同碰撞能量下相关代谢物的MS/MS谱，初诊指为经过治疗的人员，治疗组指给予保肝药治疗后的人员。①样本检测的实验仪器与试剂UltiMate 3000UPLC系统(Thermo Scientific，Dionex，USA)，配有双三元液相色谱梯度泵系统(包含在线脱气单元)，柱温箱，DAD紫外检测器及Chromeleon色谱系统控制软件；Q EXACTIVE四级杆-轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Scientific,USA)，配有ESI源及Xcalibur数据系统；Waters ACQUITY UPLC HSS T3-C18色谱柱(10cm×2.1mm,1.8μm)。SAVANT SPD121P SpeedVac离心浓缩仪(Thermo Scientific,USA)；Captiva 96孔过滤板-0.2μm(Agilent Technologies)乙睛、甲醇和甲酸：色谱纯(Merck公司，Darmstadt，Germany)，实验用水：娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。②色谱质谱条件及样品分析色谱条件：A超纯水(含0.01％甲酸)，B乙腈；梯度洗脱：0-9min，2-60％B；9-18min，60％B；18-20min，60-100％B。柱温：50℃；流速：0.25mL/min，进样量5μL。质谱条件：全扫描；离子化方式：加热ESI源HESI；喷雾电压：3500V(+)/3300(-)；鞘气：647.5psi(+)/98psi(-)；辅助气：148.82psi(+)/0psi(-)；离子传输管温度：320℃；质量扫描范围为m/z 100-1000，分辨率70000FWHM，使用气体均为氮气，数据采集软件使用Xcalibur数据系统。被测样品通过正、负离子模式的UPLC-MS谱分析后，利用信息依赖的数据采集(Information DependentAcquisition,IDA)功能，获得相关代谢物的MS/MS谱。碰撞能量(CE)设定为30eV或10eV。正离子模式选用背景离子邻苯二甲酸酯类物质的相关离子(m/z 149.0233，m/z 279.1591，m/z391.2843)进行自动校正。
3多变量数据分析：通过数据预处理与多变量数据统计方法对获得的LC-MS/MS数据进行分析，寻找与疾病相关的生物标志物。“组学”数据分析方法主要由数据的预处理、模式识别以及差异代谢物的提取三个部分组成。
(1)数据的预处理：拟选取R命令将原始数据转化为符合模式识别模型的数据形式，通过该命令的设置删除若干同位素离子与加合离子，该方法提高了海量数据的预处理效果，并统计各样本中提取峰的数目，最终获得包括保留时间(Retention time)和质荷比(m/z)及其峰面积的二维数据阵。
(2)模式识别分析：本部分拟对获得的原始数据阵进行正交信号校正偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)模式识别分析，发挥OPLS-DA在寻找生物标志物过程中具有解释充分、可视化、准确判别等优势，通过模型建立获得的Q2Y、R2(Y)等参数，结合得分图中各类样本的分组聚类趋势初步验证模型的可靠性，进一步使用置换验证方法(permutationvalidation test)避免模型的过度拟合，保证模型的有效性。
(3)差异代谢物的确定：利用代谢物对分组情况贡献程度的列表(VIP list)，结合载荷图(S-plot图)中标注具有分组贡献的代谢物，挑选出贡献较为突出的差异变量；经过jack-knifed置信区间对差异变量的可靠性进行验证；使用原始变量轮廓图删除两组强度严重重叠即不可靠的变量，初步确定对疾病组与健康组分组有贡献且可靠的变量。进一步对差异变量进行均值t-检验，筛选出在两组间具有明显差异的变量，确定差异代谢物即可能生物标志物的分子离子。
4生物标志物结构解析方法：利用同位素丰度比法推测合理的代谢物分子组成，通过精确质量数缩小获得可能分子式的范围，通过代谢物结构的质谱裂解特征与高分辨MS/MS谱，初步鉴定标志物的结构。同时，针对血清中难于鉴定的未知或微量代谢物，通过代谢途径中的偏相关性分析，基于紧密相关性确定结构类似的代谢物，从而提供更多有益的结构信息，并验证已鉴定标志物结构的正确性。
5疗效评价相关生物标志物的挖掘：应用优化的自编Microsoft Visual basic程序，设定质荷比与保留时间的偏差值，对健康者、药物性肝损伤初诊患者以及治疗后转归患者获得的相关的生物标志物进行共性与特异性比较，寻找用于临床DILI疗效评价的可能生物标志物，并通过已鉴定结构代谢物在不同组别血清中的浓度趋势对代谢物的合理性进行确定。
四、结果
1、已收集临床药物性肝损伤患者的血清样本
以表达肝脏状态的酶学指标及临床病历诊断为依据，严格执行入组标准与排除标准，收集了21例健康者与24例药物性肝损伤(6例抗肿瘤药物、4例中药、13例降脂药及1例抗菌药物)初诊患者及治疗后转归的血清样本，病例的临床诊断的相关信息如Table 2-1所示。
表2-1.药物性肝损伤临床患者血清样本的病例信息
2、已建立适用于人血清样本的RRLC-MS代谢组学检测方法
优化正、负离子检测模式的ESI-RRLC-MS方法，针对健康患者血清样本进行检测并获得相应的总离子流色谱图(TIC，total ion chromatography)，如图2A、2B、2C和2D所示。生物样本中众多代谢物得到了很好的分离，保留时间在30min以内，适合于大样本检测的分析要求。从同一样本的正、负离子检测的TIC图可以初步看出两种离子检测模式的互补性，结果表明该方法适合于代谢组学对于代谢物全面性、完整性的要求。
优化并建立R命令的数据转换方法，通过该命令的设置可删除若干同位素离子与加合离子，同时可统计各样本中提取峰的数目，该方法提高了海量数据的预处理效果，具体命令的格式如下：
通过对上述21例健康者、24例药物性肝损伤(6例抗肿瘤药物、4例中药、13例降脂药及1例抗菌药物)血清样本进行RRLC-(±)ESIMS分析，利用数据格式转换软件、峰识别软件及提取任意质量色谱峰来验证转化结果的方法，最终获得包括保留时间(Retentiontime)和质荷比(m/z)及其峰面积的二维数据阵，其中在血清样本的RRLC-(+)ESIMS数据中获得了678个变量，在RRLC-(-)ESIMS数据中获得927个变量。
(2)RRLC-MS数据可靠性评价方法
本研究将QC样本作为实际样本插入至检测序列中，通过对QC数据的PCA分析，以PCA得分图来监测样品LC-MS分析过程中方法的稳定性。如图3A、3B、3C、3D所示，在分析测试前进行同一QC样本连续6针的进样可以平衡分析系统，保证系统的适应性，同时，研究结果显示本实验的分析系统稳定，数据可靠。
(3)多变量统计分析
①健康者、药物性肝损伤初诊患者与治疗后转归患者的分组聚类趋势
在正、负离子检测模式下，分别对21例健康者血清样本、24例药物性肝损伤(6例抗肿瘤药物、4例中药、13例降脂药及1例抗菌药物)与23例药物性肝损伤治疗后转归患者的血清样本进行RRLC-ESIMS分析，将获得的谱图数据通过R命令进行数据预处理。进一步将正、负离子模式下获得的两个数据矩阵分别输入SIMCA-P软件(version 12.0,Umetrics AB,Sweden)进行正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Projections to LatentStructures Discriminant Analysis,OPLS-DA)分析，其得分图如图4A和4B所示，所有样本显现出清晰的分组，健康者(◆表示)→药物性肝损伤初诊患者(■表示)→转归患者(●表示)有逐渐递进的聚类趋势。健康者与药物性肝损伤初诊患者可清晰分为离散的两组，转归患者处于健康者与初诊患者之间，并向健康组靠近。上述聚类趋势可真实表达样本信息，与肝脏酶学指标及临床诊断相一致，提示本实验的生物样本符合后续代谢组学深入挖掘相关生物标志物的要求。
②健康者与药物性肝损伤初诊患者血清的多变量分析
开展21例健康者与24例药物性肝损伤初诊病例血清样本的代谢组学数据处理，寻找并挖掘用于DILI早期发现的可能生物标志物。首先，进行健康者与药物性肝损伤初诊病例的OPLS-DA分析，并使用偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares-DiscriminantAnalysis,PLS-DA)模型进行置换验证(permutation test)，从而避免相应模式的PLS-DA过度拟合，确保数据模型模型的可靠性。模型有效性的标准为：Q2Y大于50％被认为是有效的模型，Q2Y大于90％被认为是出色的模型；R2(Y)与Q2Y之间的差值一般不超过0.2～0.3，置换验证结果中R2Y(绿色三角)与真实模型的R2Y值共同构成的回归线截距≤0.3～0.4)；经100次建模获得的Q2Y(蓝色方块)与真实模型Q2Y值共同构成的回归线截距应≤0.05。
正离子检测模式下血清样本的OPLS-DA结果见图5A，该模型含有1个预测成分和1个正交成分，交叉验证显示预测能力Q2Y＝0.706，46％的变量[R2(X)]可用于解释79.5％的组间差异[R2(Y)]。负离子检测模式下血清样本的OPLS-DA结果见图5B，该模型含有1个预测成分和1个正交成分，交叉验证显示预测能力Q2Y＝0.83，45.8％的变量[R2(X)]可用于解释88％的组间差异[R2(Y)]。置换验证结果中R2Y(绿色三角)与真实模型的R2Y值共同构成的回归线截距分别为0.186，在0.3～0.4之间，并且经100次建模获得的Q2Y(蓝色方块)与真实模型的Q2Y值共同构成的回归线截距应≤0.05，如图6A、6B、6C、6D所示。以上结果表明：在正、负离子检测模式下，血清样本的多变量数据模型符合参数标准，可有效、可靠地应用于可能生物标志物的筛选。
寻找可能生物标志物的步骤为：结合OPLS-DA模型中变量的VIP值(VariableImportance on Projection)，S-plot载荷图，带jack-knifed置信区间的载荷图(Loadingplot with jack-knifed confidence intervals)和原始变量轮廓图(raw data plot)对差异变量进行筛选和可靠性验证。图7A、7B为正、负离子检测模式下，健康者和肝损伤患者代谢组学分析中血清代谢轮廓的S-plot载荷图，图中远离聚集中心的红色标注为对分组有贡献的差异变量。
如图8A、8B所示，应用jack-knifed置信区间验证并确定对药物性肝损伤组初诊病例与健康组分组有贡献且可靠的变量，删除不可靠的变量。最后，通过原始变量轮廓图验证剩余的差异变量是否可靠。正、负离子检测模式下的血清样本分析，分别获得78和63个比较可靠的变量，可作为对药物性肝损伤初诊患者与健康患者分组有贡献的差异变量。
对上述差异变量在健康组和药物性肝损伤组的检测强度进行均值t-检验，删除两组间没有显著性差异(p>0.05)的变量。归纳上述结果，从血清的正、负离子检测模式RRLC-(±)ESIMS谱中，分别获得78和46个在两组间具有显著性差异的变量(p<0.05)。分别有4个和3个变量被确认是碱金属加合离子、同位素离子或碎片离子。此外，有3个代谢物在正、负离子检测模式中均被检测到，通过上述数据处理及分析，在健康者与药物性肝损伤初诊患者的血清分析中共获得114个可能生物标志物，其中有38个代谢物在两组间的差异非常显著(p<0.001)。
③药物性肝损伤初诊患者与治疗后转归患者血清的多变量分析
采用上述代谢组学多变量分析的方法对药物性肝损伤初诊患者与治疗后转归患者血清进行多变量分析，寻找与疗效评价相关的可能生物标志物。
正离子检测模式下，血清样本的OPLS-DA结果见图9A，该模型含有1个预测成分和1个正交成分，交叉验证显示预测能力Q2Y＝0.62，36.9％的变量[R2(X)]可用于解释72.5％的组间差异[R2(Y)]。负离子检测模式下，血清样本的OPLS-DA结果见图9B，该模型含有1个预测成分和1个正交成分，交叉验证显示预测能力Q2Y＝0.609，38.5％的变量[R2(X)]可用于解释70.8％的组间差异[R2(Y)]。置换验证结果中R2Y(绿色三角)与真实模型的R2Y值共同构成的回归线截距分别为0.331与0.4，经100次建模获得的Q2Y(蓝色方块)与真实模型的Q2Y值共同构成的回归线截距应≤0.05，如图10A、10B、10C、10D所示。以上结果表明：正、负离子检测模式下，DILI治疗前后患者血清样本的多变量数据模型符合参数标准，可有效、可靠地用于可能生物标志物的筛选。
结合OPLS-DA模型中变量的VIP值(Variable Importance on Projection)，S-plot载荷图，带jack-knifed置信区间的载荷图(Loading plot with jack-knifedconfidence intervals)(图11A、11B所示)以及原始变量轮廓图(raw data plot)对差异变量进行筛选和可靠性验证。对上述差异变量在药物性肝损伤初诊患者与治疗后转归患者血清的检测强度进行了均值t-检验，删除两组间没有显著性差异(p>0.05)的变量。从血清的正、负离子检测模式RRLC-(±)ESIMS谱中，分别获得13和41个在两组间具有显著性差异的变量(p<0.05)。
(4)疗效评价相关生物标志物的挖掘
应用优化的自编Microsoft Visual basic程序，如图12所示，设定质荷比与保留时间的偏差值，对健康者、药物性肝损伤初诊患者以及治疗后转归患者获得的相关的生物标志物进行共有及特有性比较。在正、负离子检测模式下，分别获得7个和12个共有的可能生物标志物，其中有1个为正负检测模式下均能检测到的，因此共发现18个用于临床DILI疗效评价的可能生物标志物，代谢物的具体信息详见图13A、13B，后续研究将对相应化学结构鉴定及生物学意义进行深入探讨。
(5)可能生物标志物的结构解析
本研究采取的结构解析步骤主要包括：(1)确定可能生物标志物的[M+H]+或[M-H]–离子；(2)参考“黄金规则”(golden rules)，利用同位素丰度比法推断分子组成，缩小精确质量数相应可能分子式的范围；(3)通过高分辨MS、MS/MS谱分析、网上数据库检索结合代谢物结构的质谱裂解特征，推断可能生物标志物的可能结构；(4)利用在代谢途径上有较紧密联系的代谢物之间具有相关性且结构类似的特点，引入偏相关性分析的概念，对于难以鉴定结构的代谢物提供有益信息，并验证代谢物结构的鉴定结果；(5)将鉴定的代谢物结构与标准品的LC-MS谱以及MS/MS谱对照，最终确定可能生物标志物的结构。例如对氨基酸类代谢物所掌握的规律为：在(+)ESI-MS/MS谱中，大多数氨基酸(除色氨酸、赖氨酸和精氨酸以外)的基峰均为发生中性丢失(CO+H2O)后产生的特异亚胺离子。此外，还将相继丢失NH3和H2O产生一系列离子，以及亚胺离子进一步丢失NH3产生的相关离子。通过上述方法，已鉴定出两个可能生物标志物的结构，包括苯丙氨酸和二甲基鸟苷，如Table 2-2所示。
Table 2-2.LC-MS/MS data of the potential biomarkers related to liverinjury and their identification results
通过已鉴定结构代谢物在健康组、DILI初诊患者与治疗后转归患者血清中的浓度趋势对代谢物的合理性进行确定，苯丙氨酸(mz166.0862,rt 395.3070)在疾病组的浓度低于健康组，随着治疗转归逐渐恢复或高于健康组的浓度水平。二甲基鸟苷(mz 312.1301,rt186.9570)在疾病组的浓度高于健康组，随着治疗后的转归，其浓度水平接近于健康组的状态。两个已鉴定可能生物标志物的浓度变化如图14A、14B所示。
(6)不同类型药物引发肝损伤相关标志物特异性的初步探索
将不同药物引起肝损伤的患者血清进行分类，分别建立抗肿瘤药物、中药与降脂药引发损伤病例与健康组的OPLS-DA模型，如图15所示，DILI患者与健康者可明显分类，但不同药物类型的损伤病例之间有部分交叉，说明各致病药物引起的DILI有差异。为寻找各致病药物DILI之间的特异性可能生物标志物，对上述不同DILI患者与健康者代谢组学模型获得的差异代谢物进行比较。结果显示，各类型药物相关代谢组学模型可靠，并且各疾病组与健康组能够很好的分类，上述模型可用于寻找与肿瘤药物、中药及他汀类药物DILI相关的可能生物标志物，详见图16A、16B、图17A、17B、图18A、18B。
应用优化的自编Microsoft Visual basic程序，设定质荷比与保留时间的偏差值，对上述降脂药、抗肿瘤药及中药引发DILI影响力较大、分组贡献值排名前20位可能生物标志物进行比较，获得不同药物引发DILI的共有或特异性生物标志物。正离子检测模式下，三种药物共有的肝损伤相关生物标志物2个，中药与降脂药共有的生物标志物2个，抗肿瘤与降脂药共有的生物标志物1个，其余为特异性可能生物标志物。负离子检测模式下，三种药物共有的肝损伤相关生物标志物1个，中药与抗肿瘤药共有的生物标志物3个，中药与降脂药共有的生物标志物1个，抗肿瘤与降脂药共有的生物标志物1个，其余为特异性可能生物标志物，在今后的研究中将继续探索可能生物标志物的结构鉴定与生物学意义的阐述。
结果表明，不同致病药物导致DILI的生物样本所含有的代谢物信息有所不同，可为寻找DILI相关的生物标志物提供线索。另外，后续的研究不仅要关注普遍意义的药物性肝损伤生物标志物，十分有必要重点探索不同类型药物引发损伤相关的特异性生物标志物，从而为DILI的类别性诊断提供依据。
实施例2
苯丙氨酸的诊断敏感性和特异性评价
本实施例中，提供健康志愿者与药物性肝损伤患者血清氨基酸含量变化，如下表所示，
表3.健康志愿者及药物性肝损伤患者血清氨基酸含量变化(μmol/L)
compared with healthy group，*P<0.05，**P<0.01。
采用ROC曲线对潜在药物性肝损伤生物标志物苯丙氨酸的临床诊断性能进行评价。ROC曲线下面积(AUC)可反应诊断指标区分阳性和阴性诊断能力的大小。AUC值越大，则表示诊断准确性越高，通常认为当0.5<AUC<0.7时，诊断价值较低；在0.7<AUC<0.9时，诊断价值一般；当AUC≥0.9时，诊断价值较高。
将健康志愿者组及药物性肝损伤患者初诊组中苯丙氨酸浓度输入SPSS16.0软件中进行ROC分析，如图19所示，得到苯丙氨酸ROC曲线下面积为0.909，结果表明其作为药物性肝损伤潜在生物标志物具有较高的诊断价值。
实施例3
本实施例提供用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物，所述生物标志物包括：苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸和天门冬氨酸。
实施例4
本实施例提供所述的生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法，包括如下步骤：检测人体血清中的所述生物标志物的浓度，若该人体内苯丙氨酸的浓度高于正常水平的41％以上、酪氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、谷氨酸的浓度高于正常水平的65％以上、鸟氨酸的浓度高于正常水平的30％以上，半胱氨酸的浓度高于正常水平的43％以上，异亮氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、赖氨酸的浓度高于正常水平的28％以上、丝氨酸的浓度高于正常水平的18％以上，β-丙氨酸的浓度高于正常水平的46％以上，该人体内牛磺酸的浓度低于正常水平的13％以上，且天门冬氨酸的浓度高于正常水平的27％以上，认为该人体存在药物性肝损伤。
表4各氨基酸在各人群的浓度(μmol/L)
与健康组相比，*P<0.05，**P<0.01。
健康组为健康人群；
初诊组为确认为药物性肝损伤的患者，未进行药物性肝损伤相关治疗；
治疗组为确认为药物性肝损伤的患者，给予保肝药治疗；
转归组为确认为药物性肝损伤的患者，给予保肝药治疗后药物性肝损伤发生好转；
实施例5
本实施例提供所述的生物标志物用于早期发现与预警肝损伤的方法，包括如下步骤：检测人体血清中的所述生物标志物的浓度，若该人体内苯丙氨酸的浓度高于正常水平的41％以上、酪氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、谷氨酸的浓度高于正常水平的65％以上、鸟氨酸的浓度高于正常水平的30％以上，半胱氨酸的浓度高于正常水平的43％以上，异亮氨酸的浓度高于正常水平的19％以上、赖氨酸的浓度高于正常水平的28％以上、丝氨酸的浓度高于正常水平的18％以上，β-丙氨酸的浓度高于正常水平的46％以上，该人体内牛磺酸的浓度低于正常水平的13％以上，且天门冬氨酸的浓度高于正常水平的27％以上，认为该人体存在药物性肝损伤。
还包括：提供一纯化装置，所述纯化装置用于在检测血清中的所述生物标志物的浓度之前纯化血清，所述纯化装置包括：多级过滤器1，其呈螺旋形，所述多级过滤器内沿竖直方向依次设置有的第一过滤膜101、第二过滤膜102和第三过滤膜103，彼此相邻的过滤膜之间的间隔为至少3cm，所述第一过滤膜的孔径为1μm，所述第二过滤膜的孔径为0.5μm，所述第三过滤膜的孔径为0.3μm；导引部2，其包括第一圆柱体和第一锥形部，所述第一圆柱体的下端与所述多级过滤器的进样口连通，所述第一锥形部的直径由上到下逐渐减小，所述第一锥形部的下端与所述第一圆柱体的上端连通；导流部3，其包括第二圆柱体和第二锥形部，所述第二圆柱体的上部与所述多级过滤器的出样口连通，所述第二圆柱体的下部与所述第二锥形部的上端连通，所述第二锥形部的直径由上到下逐渐减小，且所述第二锥形部的直径最小处小于1cm；制冷部4，其套设于所述导引部和多级过滤器的外部，所述制冷部包括彼此连接的第一柱状冰袋和第二柱状冰袋，所述导引部位于所述第一柱状冰袋的中央空腔内，所述多级过滤器位于所述第二柱状冰袋的中央空腔内。本发明的纯化装置通过三级过滤再次纯化分离的血清样本，并且，将多级过滤器设计为螺旋形，以在有限的空间内提供较长的过滤通道，同时，本发明中设置有导流部，便于将待纯化的血清导流如过滤器中，设置有导引部将纯化后的血清样本直接导流入所需要的容器中，比如Epp管中，以方便使用。同时，还在导引部和多级过滤器的外部设置有制冷部，以便于能够在过滤中更好地保存血清样本，以提高血清样本的纯度和贮存良好性，便于后期检测。
实施例6
本发明还提供所述的生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用。
高灵敏度、高通量液相色谱串联质谱法定量患者血清的氨基酸试剂盒的制备，包括如下步骤：(1)生物标志物(异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、牛磺酸、酪氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸与β-丙氨酸)储备液、生物标志物母液、标准曲线样本、质控样本的配制；(2)样本沉淀试剂的配制；(3)内标液正亮氨酸与正缬氨酸的配制；(5)流动相调节液甲酸的配制。生物标志物母液包括：浓度为10mg·ml-1的苯丙氨酸、10mg·ml-1酪氨酸、10mg·ml-1谷氨酸、10mg·ml-1鸟氨酸、10mg·ml-1半胱氨酸、10mg·ml-1异亮氨酸、10mg·ml-1赖氨酸、10mg·ml-1丝氨酸、10mg·ml-1β-丙氨酸、10mg·ml-1牛磺酸和10mg·ml-1天门冬氨酸；所述生物标志物储备液包括：浓度为1mg·ml-1的苯丙氨酸、1mg·ml-1酪氨酸、1mg·ml-1谷氨酸、1mg·ml-1鸟氨酸、1mg·ml-1半胱氨酸、1mg·ml-1异亮氨酸、1mg·ml-1赖氨酸、1mg·ml-1丝氨酸、1mg·ml-1β-丙氨酸、1mg·ml-1牛磺酸和1mg·ml-1天门冬氨酸。上述溶液作用为：(1)由母液稀释为低、中、高浓度的储备液，储备液浓度按照标准曲线的范围而定，以考察检测分析方法的稳定性。(2)由母液制备标准曲线的工作液，该标准曲线用于氨基酸生物标志物的定量。
患者血清的氨基酸定量检测方法，包括如下步骤：
(1)患者血清样本预处理：血清于4℃条件下融化，涡旋混匀，通过乙腈等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，加入内标液，涡旋混匀，高速离心，取上清液。
(2)液相分离：
a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；
b.流动相：乙腈；甲醇；乙酸铵；甲酸铵；等度或梯度洗脱；控制流速。其所使用的流动相为：乙腈；甲醇；乙酸铵；甲酸铵；反相色谱等度或梯度分离。
(3)质谱测定：电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (1)
1.生物标志物在制备肝损伤诊断试剂盒中的应用，其特征在于，肝损伤诊断试剂盒包括生物标志物母液和生物标志物储备液，所述生物标志物母液包括：浓度为10mg ml-1的苯丙氨酸、10mg ml-1 酪氨酸、10mg ml-1 谷氨酸、10mg ml-1 鸟氨酸、10mg ml-1 半胱氨酸、10mgml-1 异亮氨酸、10mg ml-1 赖氨酸、10mg ml-1 丝氨酸、10mg ml-1 β-丙氨酸、10mg ml-1 牛磺酸和10mg ml-1 天门冬氨酸；
所述生物标志物储备液包括：浓度为1mg ml-1的苯丙氨酸、1mg ml-1 酪氨酸、1mg ml-1谷氨酸、1mg ml-1鸟氨酸、1mg ml-1半胱氨酸、1mg ml-1 异亮氨酸、1mg ml-1 赖氨酸、1mg ml-1丝氨酸、1mg ml-1 β-丙氨酸、1mg ml-1牛磺酸和1mgml-1 天门冬氨酸。
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