CN111999403A - 一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统、血清标志物筛选方法、肺损伤作用机制研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学诊断数学建模技术领域，具体涉及一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统、血清标志物筛选方法、肺损伤作用机制研究方法。本发明基于LC‑MS构建血清代谢组学分析模型得PLS‑DA模型，通过代谢组学研究方法筛选获得9种具有导致瓦斯爆炸肺损伤作用的特异性生物标记物，有效提高了煤矿全瓦斯爆炸致伤人群诊断和治疗的效率，具有重要的临床价值和社会意义，便于推广应用。通过BioNovoGene公司标准品以及HMDB，massbank，Metlin和KEGG数据库比实现瓦斯爆炸肺损伤作用机制的识别及高通量分析，从整体水平上综合分析评估瓦斯爆炸肺损伤机制，为煤矿瓦斯爆炸肺损伤的代谢组学及作用机制的阐明提供指导和预测性研究。

Description

一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统、血清标志物筛选方法、肺损伤 作用机制研究方法

技术领域

本发明涉及医学诊断数学建模技术领域，具体涉及一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统、血清标志物筛选方法、肺损伤作用机制研究方法。

背景技术

瓦斯的主要气体成分是烷烃，其中甲烷占绝大多数，另有少量的乙烷、丙烷和丁烷，此外还含有硫化氢、二氧化碳、氮气和水蒸气以及微量的惰性气体等。瓦斯浓度在5％-15％、空气中氧浓度不低于12％、有明火的情况下可引发瓦斯爆炸。我国是煤炭大国，煤炭产量约占世界总产量的50％左右。煤炭近几十年来在我国的消费比重均在70％左右，预计到2030年，煤炭作为一次能源的消费占比仍将保持在总能源消费的50％左右。我国95％的煤炭生产依靠井工开采，瓦斯突出和煤尘突出的问题时常发生，瓦斯爆炸的隐患依然存在。瓦斯爆炸肺损伤已成为严重影响经济可持续发展和社会和谐稳定的重大公共卫生问题。据统计，2000-2012年，我国煤矿事故占工矿企业一次死亡10人以上重特大事故的73.4-7.5％。建国以来全国煤矿共发生25起死亡百人以上的特大事故，其中瓦斯爆炸22起，占总数的88％。在我国煤矿重特大事故构成中，瓦斯爆炸事故无论是事故起数、死亡人数还是经济损失一直高居各类灾害之首。河南省是我国煤炭产量过亿的八大省份之一，据统计，2005-2014年煤矿事故起数及死亡人数仅次于陕西省居于第二位；2000年1月～2018年5月，河南省共发生130起瓦斯事故，造成1122人死亡。瓦斯爆炸导致人员伤亡已引起各国的高度重视，但到目前为止，报道最多的均为死亡统计，受伤人数底数不清。瓦斯爆炸高死亡率和高致残率给我国尤其是陕西省、河南省等造成了巨大的疾病负担和经济负担，已经成为严重的公共卫生问题，亟待解决。

瓦斯爆炸肺损伤的病因复杂，目前认为瓦斯爆炸主要有两种类型的肺损伤，①冲击波造成的肺爆震伤(blast lung injury)：瓦斯爆炸时会释放巨大的能量，借助于介质(空气)迅速形成高压，在煤矿井下产生10个以上大气压，造成强大的冲击波向四周播散，其速度可达2000m/s，能绕过障碍物，对人体形成冲击伤。冲击波在有气体-液体界面的、充满空气的肺泡上皮细胞和脆弱的血管结构中传播，肺部特别容易受到伤害，因此肺组织是冲击波作用的主要靶器官。②瓦斯爆炸产生的巨大热量造成的肺吸入性损伤。瓦斯爆炸实际上是甲烷和空气中的氧进行的一种自加速反应，紧跟冲击波之后的剧烈化学反应产生火焰峰面，其温度可高达2150-2650℃。矿工吸入高温火焰可产生吸入性肺损伤。当瓦斯爆炸后井下通风中断，矿工吸入高热空气和含炽热的炭颗粒及大量有害化学物质的烟雾，呼吸系统受热力和烟雾的双重损伤，往往损伤程度较严重，同时吸入损伤除气道的局部损伤外，还会迅速影响呼吸功能，甚至并发呼吸功能衰竭。因此，瓦斯爆炸肺损伤机制的早期识别和阐明对降低其死亡率和致残率显得尤为重要。

代谢组学是一门定量测量生物系统对病理生理刺激或扰动的整体动态代谢反应的多功能学科。它可用于阐明生物对疾病或环境变化的动态反应。超高效液相色谱(UPLC)与质谱(MS)联用技术以其高分辨率、高灵敏度、快速分离等优点在代谢组学中得到了广泛的应用。为了降低质谱的复杂性、简化数据解释和筛选潜在的生物标记物，研究人员在代谢组学研究中使用了多变量统计方法，如主成分分析(PCA)和部分最小二乘判别分析(PLS-DA)。代谢组学研究重点一直是内源性分子含量的变化，它反映了生物体的病理状态及其在外界刺激下的反应。生物体内的内源性代谢物对瓦斯爆炸有反应，代谢组学方法可以准确地表征这种反应。损伤在整体代谢水平上的发生发展机制可以进一步明确。通过代谢组学鉴定这些标志物对于瓦斯爆炸肺损伤的早期诊断、疗效评价和预后至关重要。

瓦斯爆炸肺损伤是一种典型的环境影响的损伤疾病，其损伤通常表现为机体整体的代谢紊乱，因此，代谢组学技术和方法非常适合于瓦斯爆炸肺损伤的研究。但是目前为止国内外尚未有使用代谢组学方法研究瓦斯爆炸肺损伤机制的报导，因此需开发一种基于代谢组学的模型技术识别瓦斯爆炸肺损伤机制的研究方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种瓦斯爆炸肺损伤血清标志物的筛选方法，基于LC-MS血清代谢组学模型分析，识别9种瓦斯爆炸肺损伤生物标志物。

本发明的目的之二在于提供一种瓦斯爆炸肺损伤作用机制研究方法，基于LC-MS血清代谢组学模型分析，识别瓦斯爆炸肺损伤生物标志物，通过血清代谢物情况能够识别瓦斯爆炸肺损伤的作用机制。

同时，本发明还在于提供一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统，由本发明血清标志物筛选和肺损伤作用机制研究过程中形成的血清代谢组学模型作为判断模块，对瓦斯爆炸肺损伤概率进行诊断，能够对瓦斯爆炸肺损伤人群进行损伤早期、初步诊断和临床干预，能够有效降低受伤人群的死亡率和致残率，便于推广应用。

一种瓦斯爆炸血清标志物筛选方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)实验分组：将大鼠分为以参与巷道环境下瓦斯爆炸的肺损伤模型组，普通环境饲养的无创大鼠对照组；

(2)收集对照无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清样本进行LC-MS检测；

(3)将样本采用LC-MS血清代谢组学技术进行分析，得对照无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本的原始代谢指纹图谱，图谱与处理得到用于统计分析的二维矩阵，其中每行为样本，每列为代谢物，矩阵中值为相应的代谢物浓度；

(4)将步骤(3)的二维矩阵依次进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，得PLS-DA模型，对得到的PLS-DA模型进行验证，无过拟合危险，则所得PLS-DA模型即为评估瓦斯爆炸肺损伤机制用的血清代谢组学分析模型；

(5)用步骤(4)的模型进行数据处理，分析对照无创组与肺损伤模型组血清代谢物，采用t检验来表达其差异性(P<0.05)，VIP值在1.5以上、t检验P值在0.05以下的候选代谢产物被认为是肺损伤模型生物标记物，进一步分析确定生物标志物的结构。

进一步的，步骤(1)中巷道环境为中国煤炭科工集团重庆研究院有限公司的大型煤矿瓦斯爆炸试验巷道和爆炸测试系统模拟真实瓦斯爆炸巷道环境，巷道直径3m，长度800米。

进一步的，步骤(5)中根据生物标记物的分子量，采用MassLynx XS分析元素组成，确定分子式，通过联机数据库比较质量数、分子式与质量碎裂信息，确定生物标记物的结构；确定的生物标志物为：L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、2-氨基己二酸、L-组氨酸、胆酸、乌头酸、柠檬酸。

进一步的，步骤(1)中所述参与巷道环境下瓦斯爆炸的肺损伤模型组是将大鼠放置在距离瓦斯爆炸源160米处的近距离点；距离瓦斯爆炸源240米处的远距离点造成的不同程度肺损伤而得到的。

进一步的，步骤(4)中通过将二维矩阵导入SIMCA-P14.0软件进行成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。

进一步的，步骤(3)中LC-MS检测分析模式为正负离子切换模式，分别获得对照组无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本正离子模式下的原始代谢指纹图谱、负离子模式下的原始代谢指纹图谱；分别按照步骤(3)和步骤(4)进行PCA和PLS-DA统计分析；

获得正离子模式：对照组和160米组：PLS-DA模型的R2Y＝0.99和Q2＝-0.1；对照组和240米组：R2Y＝0.94和Q2＝0.02；

负离子模式：对照组和160米组：PLS-DA模型的R2Y＝0.95和Q2＝-0.23；对照组和240米组：R2Y＝0.97和Q2＝-0.15。

进一步的，步骤(1)中无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤大鼠均为成年SD大鼠；无创大鼠血清样本8个，瓦斯爆炸不同程度肺损伤血清样本各8个。

进一步的，步骤(2)中每6个待分析样本加入一个质量控制样本，用于实时监测分析样本从进样前处理到分析过程中的质量控制情况；质量控制样本为无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本按照1:1的体积比混合得到的血清样本。

进一步的，步骤(2)中还包括对待测血清样本进行前处理后再进行LC-MS检测，其中前处理的具体方法包括以下操作步骤：

①将所有样本在4℃下融化；

②自每个样本中取200μL于1.5mL离心管中；

③每个离心管加入800μL甲醇，振荡60s，充分混匀；

④在12000RPM 4℃离心10min，取全部上清液，转移至新的1.5mL离心管中,真空浓缩干燥；

⑤300μL 80％甲醇复溶，上清液使用0.22μm膜过滤，得到待测样本；

⑥自每个待测样本各取20μL混合成质量控制样本。

进一步的，步骤(2)中LC-MS检测分析条件为：用系统Thermo Ultimate 3000系统匹配ACQUITY

HSS T3色谱柱，使用

HSS T3 1.8μm(2.1×150mm)色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样2μL进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；负离子5mM甲酸胺水(C)-乙腈(D)；梯度洗脱程序为0～1min，2％B/D；1～9min，2％～50％B/D；9～14min，50％～98％B/D；14～15min，98％B/D；15～15.5min，98％～2％B/D；15.5～17min，2％B/D；

质谱检测使用Thermo Q Exactive Focus，电喷雾离子源，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.80kV，负离子喷雾电压为2.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb；毛细管温度325℃，以分辨率70 000进行全扫描，扫描范围81～1000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

进一步的，步骤(3)中图谱预处理的方法为：用Proteowizard软件将获得的原始代谢指纹图谱转换为mzXML数据文件，然后将mzXML数据文件使用R(v3.3.2)XCMS语言软件包进行包括保留时间校正、峰识别、峰匹配和峰对齐的预处理操作，得到可用于统计分析的二维矩阵，矩阵中的每行为分析样本或待检血清样本，每列为代谢物信息。

一种瓦斯爆炸肺损伤作用机制研究方法，包括将上述筛选的血清标志物导入BioNovoGene公司标准品以及HMDB，massbank，Metlin和KEGG数据库构建分析损伤相关代谢通路，得到关键性代谢途径表征瓦斯爆炸肺损伤作用机制。结果显示，瓦斯爆炸致肺损伤作用的关键通路与柠檬酸循环、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢苯丙氨酸代谢、氨基酸代谢等通路密切有关，进一步表明瓦斯爆炸致肺损伤作用的关键通路与能量代谢、氨基酸代谢等通路密切有关，与疾病大鼠体重、呼吸功能和肺脏组织病理观察等宏观指标研究结果相符。

一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统，包括数据接收模块、数据分析模块和结果判断模块；其中数据接收模块用于接收待诊断血清样本的LC-MS检测分析数据；数据分析模块用于对接收的LC-MS检测分析数据按照上述构建的PLS-DA模型分析处理；结果判定模块用于接收数据分析模块输出的结果判定存在瓦斯爆炸肺损伤的概率。

具体的瓦斯爆炸肺损伤风险诊断的具体方法包括，将LC-MS检测分析的待检血清样本的代谢物信息导入构建的PLS-DA分析模型中，通过分析可以获得瓦斯爆炸肺损伤大鼠的预测概率(大于50％即为阳性)，从而通过人体代谢情况判定瓦斯爆炸肺损伤风险。在实际应用中，如果待检血清样本代谢物信息位于模型瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清样本组区域(即阳性区域，即预测概率大于50％)，则表示具有瓦斯爆炸肺损伤危险，需要进行进一步的诊断和检测；如果待检血清样本代谢物信息位于模型对照无创大鼠血清样本组区域(即阴性区域，预测概率小于50％)，则表示不具有瓦斯爆炸肺损伤危险，不需要进行进一步的检查。

发明的有益效果是：

1、本发明通过UPLC--MS和统计模式识别方法获得血清代谢组学分析模型，该模型可以作为煤矿井下作业人群瓦斯爆炸肺损伤临床诊治的模型，达到对瓦斯爆炸肺损伤进行临床治疗和干预的目的。

2、本发明血清代谢组学分析模型和分析血清代谢组学的方法是基于真实巷道环境下瓦斯爆炸肺损伤大鼠的血清样本得到的，相比于基于激波管模型下大鼠的血清样本得到的模型，本发明血清代谢组学情况与要评估的瓦斯爆炸肺损伤的血清代谢组学情况匹配度更高，更适合瓦斯爆炸肺损伤的早期诊断和干预治疗。并且通过对建模方法的优化，本发明模型灵敏度高，特异性好，能很好的识别瓦斯爆炸肺损伤的生物标志物，非常适合临床诊断和治疗中的推广和应用。

3、本发明基于UPLC-MS技术和代谢组学研究方法，对真实巷道环境下瓦斯爆炸肺损伤大鼠的血清代谢物进行检测，通过代谢组学研究方法寻找和筛选差异代谢物，获得9种具有致肺损伤作用机制的特异性生物标志物，利用不同爆炸距离点规律变化实现对作用机制的识别及高通量分析；通过HMDB，massbank，Metlin和KEGG数据库构建对差异代谢物进行通路分析，可从整体水平综合评价瓦斯爆炸肺损伤作用机制，快速、便捷的识别出瓦斯爆炸肺损伤的损伤原因，准确度高，缩小了瓦斯爆炸肺损伤患者的检测范围。

4、本发明中分析血清代谢组学时仅需采集血清，无创、花费低，有效提高了瓦斯爆炸肺损伤患者的诊治的效率，大大降低了检查成本，有效避免了部分人群承受治疗前的不必要痛苦，具有重要的经济和社会效益，便于临床上推广应用。此外，本发明方法的提出还有利于简便的发现瓦斯爆炸潜在受损伤患者，有利于损伤的早发现、早治疗，具有很高的科研和医学价值。

附图说明

图1为瓦斯爆炸后无创对照组和肺损伤组大鼠肺组织外观(A，B和C)和肺组织干湿比(D)变化；(A)：Control，对照组；(B)：160m，近距离瓦斯爆炸肺损伤组；(C)：240m，远距离瓦斯爆炸肺损伤组；数据以平均值±标准差(n＝8)；

图2为瓦斯爆炸后无创对照组和肺损伤组大鼠肺组织病理变化，HE染色，放大倍数，200×；(A)：Control，对照组；(B)：160m，近距离瓦斯爆炸肺损伤组；(C)：240m，远距离瓦斯爆炸肺损伤组；

图3为本发明具体实施例方式中血清样本LC-MS检测流程示意图；

图4为LC-MS检测总离子流图(左上：测试标准品正离子质谱图；右上：样品正离子谱图；左下：测试标准品负离子质谱图；右下：样品负离子谱图)。

图5为血清代谢组学检测的质量控制图；正负离子模式下血清样品(绿圈)和质控样品(红圈)的二维主成分分析(PCA)评分图和QA结果；QC(质量控制，A和C)；QA(质量保证，B和D)；RSD：相对标准偏差；B和D：横轴为代谢物所占百分比，纵轴为代谢物在QC样本中的peaks％值；

图6为基于UPLC-MS代谢组学用于瓦斯爆炸肺损伤诊断的PCA模型的得分图。A，B：正离子模式；C，D：负离子模式。Control：(对照组，红圆，筛查阴性，表示无创大鼠血清样本)；J160：(近距离肺冲击伤组，蓝色方块，筛查阳性，表示瓦斯爆炸肺损伤大血清样本)；Y240：(远距离肺冲击伤组，黄色三角形，筛查阳性，表示瓦斯爆炸肺损伤大血清样本)。PCA：主成分分析。每个数据点代表一个主题。

图7为无创对照组和肺损伤组大鼠血清正离子模式下PLS-DA得分图和PLS-DA的排列检验。A，B：对照组和近距离组；C，D：对照组和远距离组。对照组：(对照组，红圆)；J160：(近距离组，蓝色方块)；CY240：(远距离组，黄色三角)。PLS-DA：偏最小二乘判别分析；每个数据点代表一个主题，其中R2Y值表示模型的拟合优度，Q2值表示模型的可预测性；

图8为无创对照组和肺损伤组大鼠血清负离子模式下PLS-DA得分图和PLS-DA的排列检验；A and B：对照组和近距离组；C and D：对照组和远距离组；对照组：(对照组，红圆)；J160：(近距离组，蓝色方块)；CY240：(远距离组，黄色三角)；PLS-DA：偏最小二乘判别分析；每个数据点代表一个主题，其中R2Y值表示模型的拟合优度，Q2值表示模型的可预测性；

图9为基于UPLC-MS代谢组学用于瓦斯爆炸肺损伤诊断的系统树图；正离子模式：A，Control：对照组，红色；J160：近距离组，蓝色；B：Control：对照组，红色；CY240：远距离组，黄色三角。负离子模式：C，Control：对照组，红色；J160：近距离组，蓝色；D：Control：对照组，红色；CY240：远距离组，黄色三角；

图10为基于UPLC-MS代谢组学识别出的瓦斯爆炸肺损伤生物标志物统计柱状图；A-I：Control：对照组，红色；J160：近距离组，蓝色；J-R：Control：对照组，红色；CY240：远距离组，黄色。A和J：2-aminoadipic acid，2-氨基己二酸；B和K：aconitic acid，乌头酸；C和L：cholic acid，胆酸；D和M：Citric acid，柠檬酸；E和N：L-alanin，L-丙氨酸；F和O：L-histidine，L-组氨酸；G和P：L-lysine，L-赖氨酸；H和Q：L-methionine，L-甲硫氨酸；I和R：L-threonine，L-苏氨酸；

图11为基于UPLC-MS代谢组学识别出的瓦斯爆炸肺损伤生物标志物结构图；A：2-aminoadipic acid，2-氨基己二酸；B:aconitic acid，乌头酸；C：cholic acid，胆酸；D：Citric acid，柠檬酸；E：L-alanine，L-丙氨酸；F：L-histidine，G：L-lysine，L-赖氨酸；H：L-methionine，L-甲硫氨酸；I：L-threonine，L-苏氨酸；

图12为基于UPLC-MS代谢组学用于瓦斯爆炸肺损伤诊断的代谢通路影响图；横轴：Pathway Impact：通路影响值；纵轴：-log(p)：假阳性矫正后p值；

具体实施方式：

下面，通过以下具体实施方式对本发明进行进一步的解释，并对本发明优点进行进一步的证明，但并不局限于此。

1、研究对象

本研究采用真实巷道环境下瓦斯爆炸的大鼠的血清和肺组织样本作为瓦斯爆炸肺损伤样本；并随机分组方式选取无创无损伤的大鼠作为对照样本。

本研究共检测24例，其中参与瓦斯爆炸具有瓦斯爆炸肺损伤特征的阳性大鼠共16例，不参与爆炸的无创阴性对照大鼠共8例；体重在两组间差异没有统计学意义，具有可比性。

2、瓦斯爆炸对肺损伤大鼠体重、呼吸功能及肺脏组织的形态病理学影响

2.1巷道参数和固定装置：瓦斯爆炸前，根据瓦斯爆炸巷道环境，以及爆炸测试系统进行笼具固定和爆炸参数设置。

2.2动物分组及处理：选择健康的SD大鼠24只SPF级，雄性，6～8周龄，体重(200±10)g，由第三军医大学第三附属医院野战外科研究所提供(SCXK(渝)2017-0006)，常规饲养于陆军军医大学预防医学院毒理学研究所动物房。利用中国煤炭科工集团重庆研究院有限公司的大型煤矿瓦斯爆炸试验巷道和爆炸测试系统模拟真实瓦斯爆炸巷道环境，巷道直径3m，长度800米。将24只SD大鼠进食普通基础饲料，适应性喂养1周后，按体重大小随机分为3组：包括①正常对照组、②近距离组(160m)、③远距离组(240m)，每组8只。其中②③组大鼠与麻醉状态下均匀放入巷道中固定爆炸装置笼子内爆炸致伤，大鼠肺部朝向冲击波方向摆放，笼子分别置于距离爆炸点封膜处160m、240m处，共16只；而①组作为正常对照组大鼠不参与爆炸，共8只。爆炸结束后通过排风系统对巷道进行排风，排风20-30分钟后，在合理防护情况下，迅速进入巷道将动物取出置于巷道外常氧环境，观察并记录大体伤情，及时转运至实验室。

2.3动物实验及样本收集：将各组大鼠在48h时进行呼吸功能监测，评价肺损伤模型的成功率；同时于爆炸7天后，用乌拉坦麻醉处死。迅速取出24只大鼠肺组织，观察各组大鼠肺损伤情况；取右肺上叶固定在4％多聚甲醛中，用HE染色法进行组织学检查。每周称取大鼠体重观察体重变化，如下表1所示：

表1

组别	爆炸前	爆炸后7天
			对照组	337.00±26.54	340.36±29.41
近距离组	330.23±27.51	298.51±25.30*
			远距离组	339.17±27.58	312.42±26.97*

2.4肺呼吸功能指标的监测：采用BUXCO小动物肺功能仪进行操作。实验前调整仪器各项参数，在瓦斯爆炸后48h将各组动物置于暗箱内，不限制动物活动。所有大鼠均放置于舱内10分钟，待大鼠适应舱内环境并安静呼吸后，再测量10分钟。经过10分钟的数据收集、统计分析获得进行肺功能指标，包括呼吸频率(f)，潮气量(TVb)，每分通气量(MVb)，1/2潮气量呼气流量(EF50)，最大吸气流量(PIFb)，呼吸间歇(PAU)，增强呼吸间歇(Penh)。如下表2所示：

表2

2.5各实验组大鼠体重、肺组织大体观察和肺组织病理学观察：实验后不同暴露组大鼠体重显著下降，以近距离组最明显(见表1)。不瓦斯爆炸48h后取出肺组织进行大体观察，不同暴露组肺组织出现明显的冲击伤比如充血、水肿等(如图1)。爆炸48h后不同距离组大鼠在瓦斯爆炸显示充血和水肿，中性粒细胞渗入肺泡壁，毛细血管充血，大量红细胞被肺泡间质，肺泡腔红细胞和淡粉色水肿液，局灶性大出血更为明显。(如图2)。实验结果表明瓦斯爆炸对肺组织有损伤作用。

3、LC-MS的血清代谢组学检测

分别采集瓦斯爆炸肺损伤大鼠样本和对照无创大鼠样本的血清，作为损伤血清样本和对照血清样本，所有采集的血清样本离心后放于-80℃冰箱内保存，使用超高效液相色谱-质谱联用仪(Thermo Ultimate3000系统，Thermo)和Bravo自动标本预处理系统(Agilent，USA)进行代谢组学检测：样本质检，预实验以及正式检测实验，获得样本的包含色谱和质谱信息的原始代谢指纹图谱。

使用的设备、试剂信息如下表3、表4和表5所示：

表3代谢组学检测的主要试剂

表4代谢物提取仪器和设备

表5代谢组学检测仪器LC-MS

3.2血清样本预处理

血清样本预处理前，将所有肺损伤大鼠血清样本、无创大鼠血清样本和质量控制样品(QC)进行随机编号，以肺损伤大鼠血清样本、无创大鼠血清样本作为分析样本，每隔6个分析样本加入一个QC样品。QC样品是将同一肺损伤大鼠血清样本和同一无创大鼠血清样本进行混合，并均匀地分成60份。肺损伤大鼠血清样本、无创大鼠血清样本和QC样品均进行预处理，提取步骤如下：

(1)将所有样本在4℃下融化；

(2)自每个样本中取200μL于1.5mL离心管中；

(3)每个离心管加入800μL甲醇，振荡60s，充分混匀；

(4)在12 000RPM 4℃离心10min，取上清液，转移至新1.5mL离心管中，真空浓缩干燥；

(5)300μL 80％甲醇复溶，上清液使用0.22μm膜过滤，得到待测样本；

(6)自每个待测样本各取20μL混合成QC样本；(QC：quality control，用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误)；

(7)用剩余待测样本进行LC-MS检测。

3.3血清UPLC-QTOF/MS检测

色谱条件：仪器采用Thermo Ultimate 3000，使用

HSS T3 1.8μm(2.1×150mm)色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样2μL进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；负离子5mM甲酸胺水(C)-乙腈(D)。梯度洗脱程序为0～1min，2％B/D；1～9min，2％～50％B/D；9～14min，50％～98％B/D；14～15min，98％B/D；15～15.5min，98％～2％ B/D；15.5～17min，2％B/D。

质谱条件：仪器使用Thermo Q Exactive Focus，电喷雾离子源(ESI)，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.80kV，负离子喷雾电压为2.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb。毛细管温度325℃，以分辨率70 000进行全扫描，扫描范围81～1 000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

3.4预实验检测结果

仪器状态(用标准品检查)

槲皮苷分子量：448.1006；正离子模式分子量误差：[7ppm]；负离子模式分子量误差：[7ppm]。

样品质量

响应：[>108]；液相稳定性：[良好]。

预实验结论

仪器状态级别为[B/B]，样品质量级别为[A/A]，可以开展数据分析。

(标准品质量、样品质量、液相稳定性判断标准见表6)

表6仪器状态、样品质量、液相稳定性主要判断标准

3.5血清UPLC-MS检测进样顺序流程如图3所示；

3.6LC-MS实验质量控制

在血清样品进行代谢组学检测时，将制备的QC样品按每6个分析样本安排1个QC的顺序均匀地插入分析样本中，从而实时监测从样本前处理到样本检测过程中的质量控制情况。

所得原始代谢指纹图谱经XCMS图谱预处理后，计算每个代谢物在QC样本中的％RSD值(变异系数)，并且以％RSD值为纵轴，以保留时间为横轴画图(如图5)，图中的圆点代表代谢物。可以从图中看出绝大多数代谢物的％RSD值控制在30％以下，说明样本前处理到样本品检测过程中的质量控制情况良好，所获得的代谢组学数据真实可信。

3.7代谢组学数据处理和分析

将LC-MS系统血清正离子ESI+和负离子ESI-检测获得原始代谢指纹图谱数据通过用Proteowizard软件将获得的原始代谢指纹图谱转换为mzXML数据文件，然后将mzXML数据文件使用R(v3.3.2)XCMS语言软件包进行数据预处理(包括保留时间校正、峰识别、峰匹配和峰对齐)，获得物质的保留时间和峰面积数据文件，得到可用于统计分析的二维矩阵，矩阵中的每行为分析样本或待检血清样本，每列为代谢物信息。XCMS图谱预处理后得到可用于统计分析的二维矩阵，其中每行为样本(观测)，每列为代谢物(变量)，矩阵中值为相应的代谢物浓度。并且每个代谢物峰使用保留时间(retention time，RT)和质荷比(mass-to-charge ratio，m/z)定性。然后该二维矩阵使用R软件包R(v3.3.2)XCMS进行代谢物峰标识(包括同位素峰、加合物和碎片离子)。统计分析前对样本进行标准化处理，待分析保留时间范围设定为0～18min。总离子流图比较采用上述方法检测了测试标准品、血清样品样本。图4显示了LC-MS检测总离子流图，(左上：测试标准品正离子质谱图；右上：样品正离子谱图；左下：测试标准品负离子质谱图；右下：样品负离子谱图)。结果显示，通过UPLC-MS图谱很难发现内源成分中的差异代谢产物，因此需要采用多变量统计分析方法进一步确定它们之间的差异。

3.8基于PCA的代谢轮廓预分析

对对照组样本和瓦斯爆炸肺损伤样本使用无监督分析方法即主成分分析(principal component analysis，PCA)来观察组间初步的分类趋势和离群点，见图6。图中QC标本的重复性可表明LC-MS实验质量控制良好。从图5还可以看出，筛查阳性(即瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清样本)和筛查阴性(即对照无创大鼠血清样本)间具有一定的分类趋势，但分离不彻底，需要采用有监督学习方法实现进一步的分类。

3.9基于PLS-DA的代谢轮廓分析

为尽量消除组内差距引起的偏差，获得较为明显的分组趋势，进一步针对训练样本使用有监督分析方法即偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminantanalysis，PLS-DA)显示阳性大鼠和阴性大鼠的代谢轮廓的差异和分类趋势。如图7、图8所示，肺损伤大鼠阳性组和阴性组间具有代谢模式差异和明显的组间分类趋势，其建模的R2Y＝0.99和Q2＝-0.1，对照组和160米组；R2Y＝0.94和Q2＝0.02，对照组和240米组(正离子模式，图7)和(R2Y＝0.95和Q2＝-0.23，对照组和160米组；R2Y＝0.97和Q2＝-0.15，对照组和240米组)(负离子模式，图8)。从图7和图8可以看出，相较于完全健康的大鼠阴性组，瓦斯爆炸肺损伤大鼠阳性出现了明显的代谢扰动，从而具有了明显的组间分类趋势。

3.10生物标记物的寻找与鉴定

对无创对照正常组与肺损伤模型组大鼠之间的差异进行统计学分析，取正常组与肺损伤模型组大鼠的血清样本按照3.2下血清样品制备方法制备，采用UPLC-MS正、负离子模式检测，记录色谱图。所得的保留时间和峰面积数据矩阵利用Proteowizard软件进行峰检测、匹配及峰对齐处理。所有数据，包括检测质量、保留时间和每个色谱中洗脱的峰的强度，都归一化为每个色谱中总离子强度，以获得代谢物的相对强度。将得到的三维数据、峰数(保留时间和m/z对)、样品名称和归一化离子强度导入SIMCA-P 14.0进行无监督PCA(如图6)和有监督PLS-DA(如图7和图8)。通过R2Y和Q2对PLS-DA模型进行了评价和测试，R2Y表示模型对Y变量的可解释性，Q2表示模型的可预测性。基于PLS-DA分析的S-plot和VIP值用于识别和揭示负责识别组间分离的不同代谢物，结果显示正负离子模式下不同组间呈现较好的分离(图9)。采用t检验来表达其差异性(P<0.05)。VIP值在1.5以上、t检验P值在0.05以下的候选代谢产物被认为是肺损伤模型生物标记物(图10)。根据生物标记物的分子量，采用MassLynx XS分析元素组成，确定分子式，通过联机数据库比较质量数、分子式与质量碎裂信息，确定生物标记物的结构(如图11)。

具体检索策略如下：首先，通过第一级质谱测定质谱的精确质量比，提取化合物的总离子流程图，确定保留时间，提取相应的质谱图；用Finder公式计算化合物的元素组成，观察二能级质谱的碎裂信息，在以下数据库中搜索：HMDB、METLIN、KEGG结合化合物的化学键断裂规律，确定生物标记物的结构，最终鉴定生物标记物。本研究鉴定出9种代谢物与肺损伤相关的生物标志物，如下表7所示：

表7

3.11瓦斯爆炸肺损伤相关代谢通路分析

为了探索瓦斯爆炸肺损伤引起的代谢通路的变化，以及给予对这些代谢通路的影响，将血清样品筛选出的差异代谢物导入MetPA在线分析软件中进行代谢通路分析。通过代谢通路分析后所得影响值(impact)，当影响值大于0.09时，则该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响。结果显示：将肺损伤9个生物标记物输入在线MetaboAnalyst、KEGG数据库，构建分析疾病相关代谢通路，得到相关代谢路径，结果见表8和图12。研究表明：真实巷道环境下瓦斯爆炸致肺损伤作用的关键通路主要与柠檬酸循环、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢等通路相关，并对模型主要代谢标志物表达异常有显著的影响。这些化合物在代谢通路中受到扰动，从而揭示了瓦斯爆炸肺损伤的病理基础。

表8

3.12结论

由以上验证可以看出，只有通过本发明方法构建的模型才能具有很好的预测效果。本发明所得PLS-DA模型无过拟合危险，且具有明显的组间分类趋势，通过血清代谢情况能够很好的将对照无创大鼠血清和瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清区分开来，灵敏度和特异度高，可以用于瓦斯爆炸肺损伤的早期诊断和治疗。

在采用本发明模型进行瓦斯爆炸肺损伤早期诊断和治疗应用时，步骤如下：

(1)采集待检血清，离心后采用上述3.2步骤(1)-(7)对血清进行预处理，以备进样检测；

(2)将预处理后待检血清样本按照上述2和3的步骤进行LC-MS检测，得原始代谢指纹图谱；

(3)将原始代谢指纹图谱按上述步骤3方法进行图谱预处理，得到该待检血清的代谢物信息；

(4)将该代谢物信息导入PLS-DA模型中，可以获得早期诊断和治疗的预测概率(大于50％即为阳性)，从而通过人体代谢情况判定早期诊断和治疗风险。在实际应用中，如果待检血清样本的代谢物信息位于模型的损伤血清样本组区域(即阳性区域，即预测概率大于50％)，则表示该人具有瓦斯爆炸肺损伤危险，需要进行进一步的临床检测和确认；如果待检血清样本的代谢物信息位于模型的无创大鼠血清样本组区域(即阴性区域，预测概率小于50％)，则表示该人不具有瓦斯爆炸肺损伤的危险，不需要进行进一步的检查。除此之外，为了加快筛查效率，可以同时采集多个大鼠的血清样本，并进行编号，将多个样本一次性进行LC-MS检测、图谱预处理和数据导入。

综合上述，本发明构建的PLS-DA模型能够通过人体代谢情况判定瓦斯爆炸引起肺损伤的概率，加快临床筛查效率，能够及时进行干预性治疗，降低肺损伤死亡率。同时本发明瓦斯爆炸肺损伤大鼠代谢组学研究表明，疾病大鼠体内能量代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等微观指标代谢异常，这与疾病大鼠体重、呼吸功能和肺脏组织病理观察等宏观指标研究结果相符。瓦斯爆炸肺损伤作用的关键通路主要与柠檬酸循环、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢苯丙氨酸代谢、氨基酸代谢等通路相关，识别的9种生物标志物在代谢通路中受到扰动，从而揭示了肺损伤的病理基础，揭示了瓦斯爆炸肺损伤发生和作用机制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种瓦斯爆炸血清标志物筛选方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)实验分组：将大鼠分为以参与巷道环境下瓦斯爆炸的肺损伤模型组，普通环境饲养的无创大鼠对照组；

(2)收集对照无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤大鼠血清样本进行LC-MS检测；

(3)将样本采用LC-MS血清代谢组学技术进行分析，得对照无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本的原始代谢指纹图谱，图谱与处理得到用于统计分析的二维矩阵，其中每行为样本，每列为代谢物，矩阵中值为相应的代谢物浓度；

(4)将步骤(3)的二维矩阵依次进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，得PLS-DA模型，对得到的PLS-DA模型进行验证，无过拟合危险，则所得PLS-DA模型即为评估瓦斯爆炸肺损伤机制用的血清代谢组学分析模型；

(5)用步骤(4)的模型进行数据处理，分析对照无创组与肺损伤模型组血清代谢物，采用t检验来表达其差异性(P<0.05)，VIP值在1.5以上、t检验P值在0.05以下的候选代谢产物被认为是肺损伤模型生物标记物，进一步分析确定生物标志物的结构。

2.如权利要求1所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(5)中根据生物标记物的分子量，采用MassLynx XS分析元素组成，确定分子式，通过联机数据库比较质量数、分子式与质量碎裂信息，确定生物标记物的结构；确定的生物标志物为：L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、2-氨基己二酸、L-组氨酸、胆酸、乌头酸、柠檬酸。

3.如权利要求1所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述参与巷道环境下瓦斯爆炸的肺损伤模型组是将大鼠放置在距离瓦斯爆炸源160米处的近距离点；距离瓦斯爆炸源240米处的远距离点造成的不同程度肺损伤而得到的；

步骤(1)中无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤大鼠均为成年SD大鼠；无创大鼠血清样本8个，瓦斯爆炸不同程度肺损伤血清样本各8个；

步骤(2)中每6个待分析样本加入一个质量控制样本，用于实时监测分析样本从进样前处理到分析过程中的质量控制情况；质量控制样本为无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本按照1:1的体积比混合得到的血清样本。

4.如权利要求1～3所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(4)中通过将二维矩阵导入SIMCA-P 14.0软件进行成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。

5.如权利要求3所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(3)中LC-MS检测分析模式为正负离子切换模式，分别获得对照组无创大鼠和瓦斯爆炸肺损伤血清样本正离子模式下的原始代谢指纹图谱、负离子模式下的原始代谢指纹图谱；分别按照步骤(3)和步骤(4)进行PCA和PLS-DA统计分析；

获得正离子模式：对照组和160米组：PLS-DA模型的R2Y＝0.99和Q2＝-0.1；对照组和240米组：R2Y＝0.94和Q2＝0.02；

负离子模式：对照组和160米组：PLS-DA模型的R2Y＝0.95和Q2＝-0.23；对照组和240米组：R2Y＝0.97和Q2＝-0.15。

6.如权利要求5所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(2)中还包括对待测血清样本进行前处理后再进行LC-MS检测，其中前处理的具体方法包括以下操作步骤：

①将所有样本在4℃下融化；

②自每个样本中取200μL于1.5mL离心管中；

③每个离心管加入800μL甲醇，振荡60s，充分混匀；

④在12000RPM 4℃离心10min，取全部上清液，转移至新的1.5mL离心管中,真空浓缩干燥；

⑤300μL80％甲醇复溶，上清液使用0.22μm膜过滤，得到待测样本；

⑥自每个待测样本各取20μL混合成质量控制样本。

7.如权利要求6所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(2)中LC-MS检测分析条件为：用系统Thermo Ultimate 3000系统匹配ACQUITY

HSS T3色谱柱，使用ACQUITY

HSS T3 1.8μm(2.1×150mm)色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱温，进样2μL进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；负离子5mM甲酸胺水(C)-乙腈(D)；梯度洗脱程序为0～1min，2％B/D；1～9min，2％～50％B/D；9～14min，50％～98％B/D；14～15min，98％B/D；15～15.5min，98％～2％B/D；15.5～17min，2％B/D；

质谱检测使用Thermo Q Exactive Focus，电喷雾离子源，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.80kV，负离子喷雾电压为2.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb；毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81～1000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

8.如权利要求1～3任一项所述的瓦斯爆炸肺损伤血清标志物筛选方法，其特征在于，步骤(3)中图谱预处理的方法为：用Proteowizard软件将获得的原始代谢指纹图谱转换为mzXML数据文件，然后将mzXML数据文件使用R(v3.3.2)XCMS语言软件包进行包括保留时间校正、峰识别、峰匹配和峰对齐的预处理操作，得到可用于统计分析的二维矩阵，矩阵中的每行为分析样本或待检血清样本，每列为代谢物信息。

9.一种瓦斯爆炸肺损伤作用机制研究方法，其特征在于，包括将如权利要求2所述方法筛选的血清标志物导入BioNovoGene公司标准品以及HMDB，massbank，Metlin和KEGG数据库构建分析损伤相关代谢通路，得到关键性代谢途径表征瓦斯爆炸肺损伤作用机制。

10.一种瓦斯爆炸肺损伤诊断系统，其特征在于，包括数据接收模块、数据分析模块和结果判断模块；其中数据接收模块用于接收待诊断血清样本的LC-MS检测分析数据；数据分析模块用于对接收的LC-MS检测分析数据按照如权利要求5构建的PLS-DA模型分析处理；结果判定模块用于接收数据分析模块输出的结果判定存在瓦斯爆炸肺损伤的概率。

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