ES2490165T3 - Método que facilita el diagnóstico y tratamiento del asma y cáncer de pulmón - Google Patents

Método que facilita el diagnóstico y tratamiento del asma y cáncer de pulmón Download PDF

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Abstract

Un método que facilita el diagnóstico de las patologías del asma y/o el cáncer de pulmón en pacientes que se encuentran en una etapa temprana de la enfermedad, que consiste en determinar la concentración de proteína específica de BAC04615 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERM (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente y comparar los datos de concentración con los obtenidos de las poblaciones con cáncer de pulmón y/o las poblaciones con asma, a fin de verificar o descartar la existencia de las patologías en cuestión.

Description

Método que facilita el diagnóstico y tratamiento del asma y cáncer de pulmón
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención, definida en las reivindicaciones, se refiere en general a métodos que facilitan el diagnóstico de patologías del tejido pulmonar humano. Más concretamente, la presente invención se refiere a métodos que facilitan el diagnóstico del cáncer pulmonar no microcítico y el asma, utilizando la cromatografía líquidaespectrometría de masas para identificar proteínas presentes en sueros humanos que, cuando se alteran en términos de intensidad relativa de expresión en el suero humano de las mismas proteínas que se encuentran en una población normal, son indicativas de patologías asociadas con el tejido pulmonar humano y el sistema respiratorio humano.
Al identificar las proteínas asociadas con estas patologías, determinar las identidades de expresión representativas y comparar estas intensidades de expresión con las intensidades de expresión presentes en el suero de un paciente, resulta posible detectar la presencia de patologías en una fase temprana de su progresión a través de un simple análisis de sangre y diferenciar entre las diferentes patologías.
Descripción de la técnica relacionada
Las patologías del sistema respiratorio, como el asma y el cáncer de pulmón, afectan a millones de estadounidenses. En efecto, la American Lung Association afirma que casi 20 millones de estadounidenses padecen asma. Según estimaciones de la American Cancer Society, solo en el año 2007 se detectaron 229.400 nuevos casos de cáncer del sistema respiratorio y 164.840 muertes producidas por esta enfermedad. Mientras que la tasa de supervivencia a los cinco años en los casos de cáncer detectados mientras se encuentra localizado es del 46%, esta tasa de supervivencia en los pacientes con cáncer de pulmón es tan solo del 13%. Por otra parte, solo el 16% de los cánceres de pulmón se descubren antes de que la enfermedad se haya propagado. En general, los cánceres de pulmón se clasifican en dos categorías principales en función de la patología de las células cancerosas. Cada una de estas categorías se designa por los tipos de células que han sufrido una transformación para convertirse en cancerosas. El cáncer microcítico procede de las células pequeñas del tejido pulmonar humano, mientras que, por lo general, el cáncer no microcítico abarca todos los cánceres de pulmón que no son de células pequeñas. Los cánceres de pulmón no microcíticos se incluyen en un mismo grupo porque, por lo general, se aplica el mismo tratamiento a todos los cánceres de este tipo. En conjunto, los cánceres de pulmón no microcíticos (o NSCLC, por sus siglas en inglés) representan alrededor del 75% de todos los cánceres de pulmón.
Un importante factor para la reducción de la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer de pulmón es el hecho de que resulta difícil diagnosticarlo en una fase temprana. Los métodos actuales para diagnosticar el cáncer de pulmón o identificar su existencia en el ser humano se limitan a los rayos X, el TAC y otras pruebas similares de los pulmones, para determinar físicamente la presencia o ausencia de un tumor. Por tanto, a menudo el diagnóstico del cáncer de pulmón se realiza únicamente en respuesta a unos síntomas que se han manifestado durante un periodo de tiempo significativo y después de que la enfermedad haya estado presente en el ser humano el tiempo suficiente para producir una masa físicamente detectable.
De un modo similar, los métodos actuales para detectar el asma se realizan típicamente mucho después de la aparición de síntomas como sibilancias recurrentes, tos y opresión en el pecho. 10métodos actuales para detectar el asma se limitan típicamente a pruebas pulmonares funcionales como la espirometría o las pruebas de provocación. Por otra parte, a menudo el médico encarga estas pruebas junto con muchas otras a fin de descartar otras patologías o enfermedades tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquitis, neumonía e insuficiencia cardíaca congestiva.
Hasta la fecha no existe en la técnica un método sencillo y fiable para diagnosticar patologías del tejido pulmonar humano en una fase temprana de su evolución. Asimismo, en la actualidad no existe ningún análisis de sangre disponible que sea capaz de indicar la presencia de una patología concreta del tejido pulmonar. Así pues, resulta recomendable desarrollar un método para determinar la existencia de cánceres de pulmón en una fase temprana de su progresión. Asimismo, resulta recomendable desarrollar un método para diagnosticar el asma y el cáncer de pulmón microcítico y para diferenciar estas patologías entre sí, así como de otras enfermedades pulmonares, tales como infecciones, tan pronto como se manifiesten los síntomas. Resulta asimismo recomendable identificar proteínas específicas presentes en la sangre humana, que, cuando sufren alteraciones en términos de las intensidades de expresión relativas, sean indicativas de la presencia de cáncer de pulmón microcítico y/o asma.
"Wagner, et al., 2003 ("Protocols for disease classification from mass spectrometry data," Proteomics, 3:1692-1698), describe una investigación orientada a seleccionar biomarcadores proteicos utilizados para diferenciar a los pacientes con cáncer de pulmón de los individuos sanos. Este artículo trata sobre pasos concretos para seleccionar biomarcadores adecuados y muestra los resultados para cuatro biomarcadores proteicos seleccionados utilizando el método. Las cuatro proteínas (identificadas en la Tabla 6 de Wagner, et al.) no incluyen los biomarcadores proteicos identificados por los presentes inventores."
Breve resumen de la invención
La invención, en su forma más amplia, se define por las reivindicaciones independientes 1 y 3:
1. Un método que facilita el diagnóstico de las patologías del asma y/o el cáncer de pulmón en pacientes que se encuentran en una etapa temprana de la enfermedad, que consiste en determinar la concentración de proteína específica de BAC04615 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERM (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente y comparar los datos de concentración con los obtenidos de las poblaciones con cáncer de pulmón y/o las poblaciones con asma, a fin de verificar o descartar la existencia de las patologías en cuestión.
3. Un método para evaluar la respuesta de un paciente a intervenciones terapéuticas que consisten en determinar la concentración de proteína específica BAC04615 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERIVI (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente, cuando el paciente padece asma o cáncer de pulmón.
Las realizaciones preferibles se definen en las reivindicaciones dependientes 2 y 4.
Otros aspectos de la presente divulgación
La presente divulgación ofrece un método novedoso para identificar proteínas presentes en el suero humano que se expresan de forma diferenciada entre los individuos sanos y los pacientes que se sabe que padecen cáncer no microcítico y asma, diagnosticado por un médico, utilizando una espectrometría de masas con ionización por electronebulización acoplada a cromatografía líquida (LC-ESIMS, por sus siglas en inglés). Se realizó una selección de 30 proteínas indicativas de cáncer de pulmón no microcítico y/o asma comparando los datos de la espectrometría de masas, en concreto la masa de los péptidos y las indicaciones gráficas de las intensidades de las proteínas expresadas en el tiempo en una única dimensión. Se compararon miles de proteínas y esto dio como resultado la selección de once proteínas que se expresaron con unas intensidades sustancialmente diferenciadas entre las poblaciones de individuos que no padecen ninguna patología del tejido pulmonar, las poblaciones de individuos que padecen asma, diagnosticado por un médico, y las poblaciones de individuos que padecen cáncer de pulmón no microcítico, diagnosticado por un médico.
Concretamente, los sueros se obtuvieron de una "población normal", una "población con asma" y una "población con cáncer de pulmón". Para los fines del presente, el término "población normal" define de los individuos que se sabe que no padecen asma ni cáncer de pulmón. Para los fines del presente, el término "población con asma" define a los individuos que se sabe que padecen asma y en los que esta patología ha sido diagnosticada por un médico. Para los fines del presente, el término "población con cáncer de pulmón" define a los individuos que se sabe que padecen cáncer de pulmón no microcítico y en los que esta patología ha sido diagnosticada por un médico.
Después de haber obtenido los sueros de la población normal, la población con asma y la población con cáncer de pulmón, cada una de las muestras de suero se dividió en partes alícuotas y se expuso a un agente digestivo o proteasa, concretamente tripsina, para digerir las proteínas presentes en las muestras de suero y convertirlas en péptidos o clivajes predecibles y definidos. Los péptidos creados por la acción enzimática de la tripsina, normalmente conocidos como péptidos trípticos, se separaron de la materia insoluble digerida por la tripsina, sometiendo las muestras a centrifugación para precipitar la materia insoluble. A continuación se sometió la solución supernatante que contenía los péptidos trípticos a cromatografía líquida capilar para realizar la separación temporoespacial de los péptidos trípticos.
Después estos péptidos trípticos se sometieron a LC-ESIMS. Cada péptido se fue separando haciéndolo pasar por una columna de fluido hidrófobo, concretamente agua, acetonitrilo con un contenido del 0,1% en volumen de ácido fórmico en una columna cromatográfica que contenía una fase estacionaria de material de empaquetamiento Supelcosil ABZ + 5 urn, con una longitud de lecho de 18 cm y un diámetro interior de 0,375 mm. Los péptidos separados son transportados por un efluente de la columna. La columna tiene un extremo desde el que los péptidos separados se someten a electronebulización mediante aplicación de alto voltaje al extremo de la columna que tiene un sesgo positivo con respecto a la tierra, formando un haz de pequeñas gotas cargadas que se aceleran hacia la entrada de la LC-ESIMS por la fuerza del campo eléctrico aplicado. La nebulización resultante formada consistía en pequeñas gotas de solvente que contenían los péptidos trípticos disueltos. Las pequeñas gotas se separaron del solvente haciendo pasar por una región de presión atmosférica la fuente de electronebulización y, a continuación, por una entrada capilar calentada de la LC-ESIMS.
La separación del solvente de las pequeñas gotas provocó la deposición de iones de carga positiva, más típicamente hidrógeno (H+) sobre los péptidos, dotando de carga a los péptidos. Estos péptidos cargados en la fase
gaseosa se describen en la técnica como "iones pseudomoleculares". Los iones pseudomoleculares se atraen a través de diversos potenciales eléctricos hacia el analizador de masas de la LC-ESIMS, donde son separados en el espacio y el tiempo en función del ratio de masa:carga. Una vez separados en función del ratio masa:carga, los iones pseudomoleculares se dirigen mediante gradientes del campo eléctrico adicionales hacia un detector de la LC-ESIMS, donde el haz de iones pseudomoleculares se convierte en impulsos eléctricos que son registrados por los dispositivos de registro de datos.
De este modo, los péptidos presentes en los trípticos digeridos pasaron al analizador de masas de la LC-ESIMS, donde se midieron los pesos moleculares de cada péptido, produciendo espectros de masas de tiempo incrementado que se adquieren repetidamente durante la totalidad del tiempo que los péptidos de la muestra salen por la columna. Por lo general, los resultados de los espectros de masas son ilustraciones gráficas de los péptidos encontrados por la LC-ESIMS, donde el eje X es la medida del ratio masa:carga y el eje Y es la intensidad de la señal del péptido. Estos espectros de masas se pueden combinar después en el tiempo, en una visualización tridimensional en la que el eje X es el tiempo de la separación cromatográfica, el eje Z es el eje de la masa del espectro de masas y el eje Y es la intensidad de las señales de los espectros de masas, que es proporcional a la cantidad de union pseudomolecular dado detectado por la LC-ESIMS.
A continuación, se realizó un análisis comparativo para contrastar los resultados de los espectros de masas de cada muestra analizada de la población con asma y la población con cáncer de pulmón con los de cada muestra analizada de la población normal. Cada señal ("máxima") de un ion pseudomolecular de un péptido tríptico asociada con una proteína identificada putativa detectada en la LC-ESIMS se comparó en la población con asma, la población con cáncer de pulmón y la población normal. Se consideraron no significativos y, por tanto, se descartaron aquellos péptidos con unas intensidades máximas de espectros de masas que indicaban que las cantidades de los péptidos no presentaban una alteración sustancial al comparar la población con asma o la población con cáncer de pulmón con la población normal. Por lo general, los criterios de exclusión utilizados implicaban la comparación de las intensidades máximas de los péptidos de al menos la mitad de los péptidos característicos identificados para una proteína dada en al menos diez conjuntos de datos obtenidos del análisis de sueros de pacientes individuales de cada patología. Si la intensidad de la mayoría de los máximos de los péptidos obtenidos de una proteína dada presentaban una intensidad al menos diez veces superior en el 80% de los conjuntos de datos de los sueros, la proteína se clasificaba como regulada de forma diferenciada entre las dos clases patológicas.
Como resultado del análisis comparativo, se determinó que once proteínas se expresan constantemente de forma diferenciada entre la población con asma, la población con cáncer de pulmón y la población normal. Las once proteínas se identificaron por referencia a bases de datos o bibliotecas de proteínas y péptidos conocidas. Algunos ejemplos de estas bases de datos incluyen Entrez Protein mantenida por el National Center for Biotechnology Information ("NCBlnr"), ExPASy mantenida por el Swiss Bioinformatics Institute ("SwissProt"), y la Mass Spectral Database ("MSDB") del Medical Research Council Clinical Science Center del Imperial College of London.
Los resultados de los espectros de masas de cada muestra de la población normal, la población con cáncer de pulmón y la población con asma se introdujeron en un motor de búsqueda conocido llamado Mascot. Mascot es un motor de búsqueda conocido en la técnica que emplea los datos de la espectrometría de masas para identificar proteínas de cuatro importantes bases de datos de secuencias, concretamente las bases de datos MSDB, NCBInr, SwissProt y dbEST. Se introdujeron los parámetros y criterios de búsqueda en el programa Mascot y se procesó cada una de las muestras con este programa.A continuación, el programa Mascot procesó los péptidos introducidos con las bases de datos de secuencias, comparando las masas e intensidades máximas de cada péptido con las masas e intensidades máximas de las proteínas y péptidos conocidos. El programa produjo una lista de candidatas de posibles coincidencias, normalmente denominadas "coincidencias significativas" para cada péptido procesado.
El programa Mascot determina las coincidencias significativas asignando una puntuación denominada "puntuación Mowse" para cada muestra analizada. La puntuación Mowse es un algoritmo donde la puntuación es -10*LOGio(P), donde P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento aleatorio, que se correlaciona con un valor p de significación donde p es inferior a 0,05, que es el estándar generalmente aceptado en la comunidad científica. Por lo general, unas puntuaciones Mowse de aproximadamente 55 a 66 o superiores se consideran significativas. El nivel de significación varía en cierta medida debido a consideraciones de búsqueda y a parámetros de las bases de datos específicos. Se obtuvieron coincidencias significativas para cada péptido procesado, lo que dio como resultado una lista de proteínas candidatas.
A continuación se contrastan los péptidos con las proteínas de las coincidencias significativas para determinar la identidad de los péptidos procesados con el programa Mascot. Se realizó un análisis manual de cada péptido identificado con el programa Mascot y de cada proteína de las coincidencias significativas. Se excluyeron las coincidencias de intensidad máxima que se determinó que eran resultado del "ruido" químico o electrónico. Los datos de los resultados de los espectros de masas se contrastaron con las coincidencias significativas para confirmar los datos brutos, las identidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos.
A continuación se realizó una búsqueda inversa para añadir péptidos a la lista de candidatos que podrían haber sido omitidos por la búsqueda automática a través del programa Mascot. Los péptidos adicionales se identificaron seleccionando la "mejor coincidencia", es decir la proteína individual que coincidía de forma sustancial con cada
parámetro del péptido comparado, realizando una digestión con silicio donde los péptidos trípticos y sus respectivas masas moleculares se calculan basándose en la secuencia genética o de aminoácidos conocida de la proteína. Estas masas estimadas de los péptidos se comparan entonces con los datos de espectros de masas en bruto y cualesquiera máximos identificados se examinan y cualifican tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, todos los péptidos, incluyendo aquellos identificados automáticamente por Mascot y aquellos identificados mediante examen manual, se introducen en la lista de masas utilizada por Mascot. La coincidencia refinada se utiliza después para obtener la puntuación Mowse refinada, tal como se debate a continuación.
Como resultado del proceso de identificación, las once proteínas que se determinó que se expresaban de forma significativamente diferenciada entre la población con asma, la población con cáncer de pulmón y la población normal se identificaron como BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, proteína 4 que contiene el dominio FERM, forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445, sintaxina 11, AAK13083, y AAK130490. BAC04615, Q6NSC8, CAF 17350, Q6ZUD4, Q8N7P1 son proteínas identificadas resultantes de esfuerzos de secuenciación genética. La proteína 4 que contiene el dominio FERM se sabe que participa en el anclaje a la membrana de la proteína intracitoplásmica. La forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 es un proteasoma conocido. La sintaxina 11 es activa en la respuesta inmune celular. BAC04615, AAK13083, y AAK130490 son proteínas asociadas con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
Breve descripción de las ilustraciones
La Fig. 1 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína BAC04615;
La Fig. 2 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína Q6NSC8;
La Fig. 3 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína CAF17350;
La Fig. 4 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína Q6ZUD4;
La Fig. 5 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína Q8N7P1;
La Fig. 6 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína CAC69571;
La Fig. 7 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína 4 que contiene el dominio FERM;
La Fig. 8 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445;
La Fig. 9 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para la proteína sintaxina 11;
La Fig. 10 divulga una tabla que muestra los resultados del algoritmo Mowse y coincidencias significativas para las proteínas de AAK13083 y AAK13049;
Descripción detallada de la invención
La presente invención, en su forma más amplia, se define en las reivindicaciones independientes 1 y 3:
1. Un método que facilita el diagnóstico de las patologías del asma y/o el cáncer de pulmón en pacientes que se encuentran en una etapa temprana de la enfermedad, que consiste en determinar la concentración de proteína específica de BAC0461 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERM (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente y comparar los datos de concentración con los obtenidos de las poblaciones con cáncer de pulmón y/o las poblaciones con asma, a fin de verificar o descartar la existencia de las patologías en cuestión.
3. Un método para evaluar la respuesta de un paciente a intervenciones terapéuticas que consisten en determinar la concentración de proteína específica de BAC0461 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERIVI (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente, cuando el paciente padece asma o cáncer de pulmón.
Las realizaciones preferibles se definen en las reivindicaciones dependientes 2 y 4.
La presente especificación proporciona un método para identificar e identifica proteínas presentes en el suero humano, que se expresan de forma diferenciada entre los individuos sanos y en los individuos que se sabe que padecen cáncer de pulmón no microcítico y asma, diagnosticados por un médico, utilizando espectrometría de masas con ionización por electronebulización acoplada a cromatografía líquida. Al determinar las proteínas que se expresan de forma sustancial y constantemente diferenciada entre las poblaciones que no padecen ninguna patología de tejido pulmonar humano, las poblaciones a las que se les ha diagnosticado asma y las poblaciones a las que se les ha diagnosticado cáncer de pulmón no microcítico, y al obtener la identidad de estas proteínas, resulta posible identificar la presencia de la patología en un paciente a través de análisis de sangre en los que se identifiquen las mismas proteínas y se cuantifiquen los niveles de expresión de estas proteínas, a fin de identificar y diagnosticar el asma o cáncer de pulmón no microcítico en una fase mucho más temprana de la progresión de las respectivas enfermedades.
Se tomaron muestras de sangre humana a los voluntarios. Se recogieron treinta muestras de individuos que se sabe que no padecen cáncer de pulmón no microcítico ni asma. Los individuos que se sabe que no padecen cáncer de pulmón no microcítico ni asma comprenden y se denominan en el presente "población normal". Por otra parte, para los fines del presente, el término "cáncer de pulmón" describe los cánceres de pulmón no microcíticos. Se recogieron veintiocho muestras de individuos que se sabe que padecen asma, con el diagnóstico confirmado por un médico. Los individuos que se sabe que padecen asma comprenden y se denominan en el presente la "población con asma". Se recogieron treinta muestras de sangre de individuos que se sabe que padecen cáncer de pulmón no microcítico, con el diagnóstico confirmado por un médico. Los individuos que se sabe que padecen asma comprenden y se denominan en el presente la "población con cáncer de pulmón". Por lo general, para los fines del presente, los términos "cáncer de pulmón" o "cánceres de pulmón" se refieren a los cánceres de pulmón no microcíticos. Por último, se recogieron setenta y una muestras de individuos que se sabe que corren el riesgo de padecer cáncer de pulmón debido a su historial de tabaquismo, confirmado por un médico. Estas setenta y una muestras están siendo objeto de la investigación y experimentación en la actualidad y, por consiguiente, no se comentan en el presente.
Se tomaron muestras de sangre a los voluntarios de conformidad con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Revisión (IRB, por sus siglas en inglés), tras la firma de un consentimiento informado, utilizando técnicas estándar de venopunción con tubos de vidrio estériles de tapón rojo para suero de 10 ml BD Vacutainer©. Las muestras de sangre se dejaron reposar a temperatura ambiente durante treinta minutos para permitir la coagulación de la sangre. A continuación se centrifugaron en una centrifugadora de sobremesa estándar a 2.000 rpm a temperatura ambiente durante diez minutos, para separar el suero de las muestras de sangre. Se retiró el suero de cada muestra vertiéndolo en tubos secundarios. Los tubos secundarios se enfriaron previamente con hielo para garantizar la integridad de cada muestra de suero, limitando la degradación resultante de la proteolisis y la desnaturalización. Se recogieron las muestras de suero de cada muestra recogida y se dividieron en partes alícuotas de 1,0 ml en tubos Cryovial previamente enfriados con hielo. Las partes alícuotas de las muestras de suero se almacenaron a una temperatura no superior a ochenta grados Celsius bajo cero (-80°C). El tiempo de procesamiento no fue superior a una hora desde el momento de la flebotomía hasta su almacenamiento a -80°C.
Se seleccionaron aleatoriamente entre ocho y diez muestras de suero de cada una de las poblaciones (normal, con asma y con cáncer de pulmón) para su análisis. Cada una de las muestras de suero de cada población se trató con un agente digestivo o proteasa, en este caso tripsina. La tripsina fue la proteasa utilizada y resulta recomendable su utilización debido a su capacidad para realizar clivajes altamente específicos y altamente predecibles, debido al hecho de que se sabe que la tripsina cliva las cadenas peptídicas en el extremo carboxilo de la lisina y arginina, salvo cuando hay una prolina presente inmediatamente después de la lisina o arginina. A pesar de que se utilizó tripsina, resulta posible utilizar otras proteasas o agentes digestivos. Resulta recomendable utilizar una proteasa, o mezcla de proteasas, que permitan un clivaje al menos tan específico como la tripsina.
Los péptidos trípticos, que son los péptidos que deja la tripsina tras el clivaje, se separan después de la materia insoluble sometiendo las muestras a centrifugado y a una cromatografía líquida capilar, con un gradiente de acetonitrilo acuoso con un 0,1% de ácido fórmico utilizando una columna 0.375 X 180 mm Supelcosil ABZ+ en un sistema de HPLC capilar Eksigent 2D para conseguir la resolución cromatográfica de los péptidos trípticos generados. Esta separación de los péptidos es necesaria porque el proceso de ionización por electronebulización está sujeto a una co-supresión de iones, donde los iones de un tipo que tienen una mayor afinidad por el protón suprimirá la formación de iones que tienen afinidades inferiores por el protón si se extraen simultáneamente del emisor de electronebulización, que en este caso es coterminal con el extremo de la columna de HPLC.
Esta metodología permite la separación del mayor número de péptidos producidos en las digestiones de trípticos y contribuye a minimizar los problemas de co-supresión, maximizando así las oportunidades de formación de cosupresión de iones pseudomoleculares y, por tanto, el muestreo de iones. Los péptidos trípticos de cada muestra se sometieron a continuación a una LC-ESIMS. La LC-ESIMS separó cada péptido de cada muestra con el tiempo, pasando los péptidos de cada muestra a través de una columna de un sistema de solventes compuesto por agua, acetonitrilo y ácido fórmico, tal y como se ha descrito anteriormente.
A continuación, los péptidos fueron nebulizados con una fuente de ionización por electronebulización para ionizar los péptidos y producir los iones pseudomoleculares de los péptidos, tal como se ha descrito anteriormente. A
continuación, los péptidos pasaron por un analizador de masas de la LC-ESIMS, donde se midieron las masas moleculares de cada uno de los iones pseudomoleculares de los péptidos. Después de someterse a la LC-ESIMS, se produjeron resultados de los espectros de masas de los péptidos presentes en cada muestra a partir de los datos de los espectros de masas, concretamente de las intensidades de los pesos moleculares y del tiempo de elución de los péptidos de una columna cromatográfica. Por lo general, los resultados de los espectros de masas son ilustraciones gráficas de las señales de los iones pseudomoleculares de los péptidos registradas por la LC-ESIMS, donde el eje X es la medida del ratio masa:carga, mientras que el eje Y es la intensidad de la señal de los iones pseudomoleculares. A continuación, estos datos se procesan con un sistema de software que controla la LC-ESIMS y captura y almacena los datos resultantes.
Después de obtener los datos de los espectros de masas y de generar los correspondientes resultados, se realizó un análisis comparativo en el que se generaron los resultados de los espectros de masas de cada muestra de suero testada con la LC-ESIMS para cada población, tanto dentro de las poblaciones con la misma patología como entre las poblaciones con distintas patologías (en adelante, intrapatológica e interpatológicamente). Se compararon los picos de los espectros de masas entre cada muestra testada de la población normal. A continuación, se compararon los picos de los espectros de masas entre cada muestra testada de la población con asma y la población con cáncer de pulmón. Una vez realizadas las comparaciones intrapatológicas, se realizaron comparaciones interpatológicas, en las que los resultados de los espectros de masas para cada muestra testada en la LC-ESIMS para la población con asma se compararon con cada muestra testada de la población normal. De igual modo, los resultados de los espectros de masas de cada muestra testada en la LC-ESIMS para la población con cáncer de pulmón se compararon con cada muestra testada de la población normal.
Se consideraron no significativos y, por tanto, se descartaron aquellos péptidos con unos resultados de espectros de masas que indicaban que las intensidades de los péptidos se expresaban de forma diferenciada de forma inconstante intrapatológicamente o que no presentaban una alteración sustancial (una variación de la intensidad inferior a 10 x) cuando se comparaba la población con asma o la población con cáncer con la población normal. Por lo general, los criterios de exclusión utilizados implicaban la comparación las intensidades peptídicas máximas para al menos la mitad de los péptidos característicos identificados para una proteína dada en al menos diez conjuntos de datos obtenidos del análisis de los sueros de pacientes individuales de cada patología. Si la intensidad de la mayoría de los máximos peptídicos obtenidos de una proteína dada era al menos 10 veces superior para el 80% de los conjuntos de los datos de los sueros, la proteína se clasificaba como regulada de forma diferenciada entre las dos clases patológicas.
Sin embargo, se desconocía la identidad de las proteínas que daban lugar a los péptidos que se observó que estaban regulados de forma diferenciada, por lo que fue necesario identificarlas. Para realizar la identificación de las proteínas, se compararon las intensidades de la señal de los iones pseudomoleculares de los péptidos entre las bases de datos conocidas que contienen bibliotecas de proteínas y péptidos conocidos y de proteínas y péptidos sospechados.
Los resultados de los espectros de masas de los trípticos digeridos de cada muestra de la población normal, la población con cáncer y la población con asma se introdujeron en un motor de búsqueda conocido denominado Mascot. Mascot es un motor de búsqueda conocido en la técnica, que utiliza los datos de la espectrometría de masas para identificar proteínas de cuatro importantes bases de datos de secuencias, concretamente las bases de datos MSDB, NCBlnr, SwissProt y dbEST. Estas bases de datos contienen información sobre todas las secuencias conocidas y todas las proteínas putativas, basándose en la observación de las regiones de inicio de la transcripción de proteínas características obtenidas de las secuencias genéticas. La precisión y redundancia de estas bases de datos se comprueba continuamente y están sujetas a una adición constante, a medida que se identifican y publican nuevas secuencias genéticas y proteínas en la literatura de patentes y científica.
Como resultado del análisis comparativo, se determinó que once proteínas se expresan constantemente de forma diferenciada entre la población con asma, la población con cáncer de pulmón y la población normal. Se introdujeron parámetros y criterios de búsqueda en el programa Mascot y los datos de los espectros de masas de los resultados de los espectros de masas de cada población se procesaron en el mencionado programa. Los datos de los espectros de masas introducidos en el programa Mascot fueron los de todas las muestras de cada patología. A continuación, el programa Mascot procesó los datos espectrales de los péptidos introducidos con las bases de datos de secuencias, comparando las masas e intensidades máximas de cada péptido con las masas e intensidades máximas de las proteínas y péptidos conocidos. Mascot produjo un resultado de la búsqueda que proporcionó una lista de candidatos de posibles coincidencias de identificación de proteínas, normalmente conocidas como "coincidencias significativas" para cada muestra analizada.
El programa Mascot determina las coincidencias significativas asignando una puntuación denominada "puntuación Mowse" para cada muestra analizada. La puntuación Mowse es un algoritmo donde la puntuación es -10*LOGio(P), donde P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento aleatorio, que se correlaciona con un valor p de significación donde p es inferior a 0,05, que es el estándar generalmente aceptado en la comunidad científica. Por lo general, unas puntuaciones Mowse de aproximadamente 55 a 66 o superiores se consideran significativas. El nivel de significación varía en cierta medida debido a consideraciones de búsqueda y a parámetros de las bases de datos específicos. Se obtuvieron coincidencias significativas para cada péptido procesado, lo que dio como resultado una lista de proteínas candidatas.
A continuación, se realizó un análisis comparativo, comparando los resultados de los espectros de masas de cada muestra analizada de la población con asma y la población con cáncer de pulmón con los de cada muestra analizada de la población normal. La señal (máxima) de los iones pseudomoleculares de cada péptido tríptico asociada con una proteína identificada putativa que se detectó en la LC-ESIMS se comparó en la población con asma, la población con cáncer y la población normal. Los péptidos con intensidades máximas de los espectros de masas que indicaban que las cantidades de péptido no se encontraban sustancialmente alteradas al comparar la población con asma o la población con cáncer de pulmón con la población normal se consideraron no significativos y se excluyeron. Por lo general, los criterios de exclusión utilizados implicaban la comparación de las intensidades peptídicas máximas para al menos la mitad de los péptidos característicos identificados para una proteína dada en al menos diez conjuntos de datos obtenidos del análisis de los sueros de pacientes individuales de cada patología. Si la intensidad de la mayoría de los máximos de los péptidos obtenidos de una proteína determinada presentaban una intensidad al menos 10 veces superior en el 80% de los conjuntos de datos de los sueros, la proteína se clasificó como regulada de forma diferenciada entre las dos clases patológicas.
Los datos de los resultados de los espectros de masas se contrastaron con las coincidencias significativas para confirmar los datos brutos, las identidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. A continuación se realizó una búsqueda inversa para añadir péptidos a la lista de candidatos que podrían haber sido omitidos por la búsqueda automática a través del programa Mascot. Los péptidos adicionales se identificaron seleccionando la "mejor coincidencia", es decir la proteína individual que coincidía de forma sustancial con cada parámetro del péptido comparado, realizando una digestión con silicio donde los péptidos trípticos y sus respectivas masas moleculares se calculan basándose en la secuencia genética o de aminoácidos conocida de la proteína. Estas masas estimadas de los péptidos se comparan entonces con los datos de espectros de masas en bruto y cualesquiera máximos identificados se examinan y cualifican tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, todos los péptidos, incluyendo aquellos identificados automáticamente por Mascot y aquellos identificados mediante examen manual, se introducen en la lista de masas utilizada por Mascot. La coincidencia refinada se utiliza después para obtener la puntuación Mowse refinada, tal como se presenta a continuación.
Con respecto a las Fig. 1 a 10, los resultados de la búsqueda de Mascot se muestran para cada proteína identificada y expresada de forma diferenciada entre la población con cáncer de pulmón o la población con asma en comparación con la población normal. En cada caso, se introdujeron los parámetros y criterios de búsqueda, y se estableció un máximo para la puntuación Mowse en términos de aceptabilidad y significación. Con respecto a la Fig. 1, se muestra el resultado de una búsqueda con Mascot para la proteína BAC04615. La base de datos seleccionada para la búsqueda fue NCBInr 10 y la taxonomía de las muestras introducida en el programa Mascot se estableció como Homo sapiens 12. El máximo de la puntuación Mowse en términos de significación se estableció en un valor Mowse de 66 o superior 14. Como resultado de la búsqueda de Mascot, se obtuvo una puntuación máxima de 121, tal como indica el gráfico de la puntuación Mowse 18, donde el eje Y del gráfico indica el número de proteínas identificadas que tienen una puntuación Mowse concreta.
Con respecto también a la Fig. 1, la puntuación Mowse más alta de ciento veintiuno se otorgó a gi/21755032, tal como indica la fila 20. Una puntuación Mowse de 121 es altamente significativa, lo que quiere decir que existe una probabilidad muy baja de que la coincidencia sea aleatoria. De hecho, tal como se indica en la columna 28, la expectativa de que esta coincidencia se pueda producir de forma aleatoria se indica por el programa Mascot como 1,7 X10-07 . Sin embargo, las proteínas indicadas en las filas 22, 24 y 26 también obtuvieron unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que estas tres proteínas también son coincidencias significativas. A continuación se realizó el análisis manual, donde se excluyeron los datos no significativos o ruido, y se contrastaron los datos en bruto, las intensidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. Como resultado del análisis manual, la probabilidad de que las proteínas indicadas en las filas 22, 24 y 26 sean coincidencias significativas se redujo de forma notable y, por tanto, las proteínas indicadas en estas filas se excluyeron de las coincidencias. La proteína indicada en la fila 20, gi/21 755032, se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 1. El número de proteína indicado en la fila 20, gi/21755032, donde el número gi (en ocasiones escrito "GI") es simplemente una serie de dígitos que se asignan consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por NCBI. gi/21755032 corresponde a la proteína BAC04615.
Con respecto a la Fig. 2, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína Q6NSC8. El umbral de la puntuación Mowse de significación 29 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse máxima de ciento diecisiete, tal como indica la barra de puntuación Mowse 36 del gráfico de la puntuación Mowse 30. La proteína identificada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 36 es Q6NSC8, tal como se indica en la fila 32. Tal como se muestra en la Fig.2, la parte sombreada 34 del gráfico de la puntuación Mowse 30 indica proteínas que fueron registradas, pero que se situaron por debajo del umbral de significación y que, por tanto, no fueron consideradas.
Con respecto a la Fig. 3, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína CAF17350. El umbralde la puntuación Mowse de significación 38 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse de ciento cincuenta y dos, tal como indica la barra de puntuación Mowse 42 del gráfico de la puntuación Mowse 40. La proteína identificada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 42 es
CAF17350, tal como se indica en la fila 46. Tal como se muestra en la Fig.3, la parte sombreada 44 del gráfico de la puntuación Mowse 40 indica proteínas que fueron registradas, pero que se situaron por debajo del umbral de significación y que, por tanto, no fueron consideradas.
Con respecto a la Fig. 4, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína Q6ZUD4. El umbralde la puntuación Mowse de significación 48 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse de doscientos veinte, tal como indica la barra de puntuación Mowse 52 del gráfico de la puntuación Mowse 50. La proteína identificada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 52 es Q6ZUD4, tal como se indica en la fila 56. Tal como se muestra en la Fig.4, la parte sombreada 54 del gráfico de la puntuación Mowse 50 indica proteínas que fueron registradas, pero que se situaron por debajo del umbral de significación y que, por tanto, no fueron consideradas.
Con respecto a la Fig. 5, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína Q8N7P1.El umbralde la puntuación Mowse de significación 58 se estableció como el valor Mowse de sesenta y seis, y se obtuvo una puntuación Mowse de setenta y cuatro, tal como indica la barra de puntuación Mowse 62 del gráfico de la puntuación Mowse 60. La proteína identificada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 62 es gi/71682143, tal como se indica en la fila 64. De forma similar a lo que ocurre en la Fig. 1, gi/71682143 se corresponde con la proteína Q8N7PI. Las proteínas indicadas en las filas 66 y 68 también presentaban unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que también son coincidencias significativas. A continuación se realizó el análisis manual, donde se excluyeron los datos no significativos o ruido, y se contrastaron los datos en bruto, las intensidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. Como resultado del análisis manual, la probabilidad de que las proteínas indicadas en las filas 66 y 68 sean coincidencias significativas se redujo de forma notable y, por tanto, las proteínas indicadas en estas filas se excluyeron de las coincidencias. Q8N7PI se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 5. La indicación en 70 de la proteína Q8NB22 se debe a que es la misma proteína que Q8N7P1.
Con respecto a la Fig. 6, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína CAC69571.El umbralde la puntuación Mowse de significación 72 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse de ciento setenta y uno, tal como indica la barra de puntuación Mowse 76 del gráfico de la puntuación Mowse 74. La proteína indicada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 76 es CAC69571, tal como se indica en la fila 78. Las proteínas indicadas en las filas 80, 82, 84 y 86 también presentaban unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que estas cuatro proteínas también son coincidencias significativas.A continuación se realizó el análisis manual, donde se excluyeron los datos no significativos o ruido, y se contrastaron los datos en bruto, las intensidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. Como resultado del análisis manual, la probabilidad de que las proteínas indicadas en las filas 80, 82, 84 y 86 sean coincidencias significativas se redujo de forma notable y, por tanto, las proteínas indicadas en estas filas se excluyeron de las coincidencias. CAC69571 se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 6.
Con respecto a la Fig. 7, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína 4 que contiene el dominio FERM 4. El umbralde la puntuación Mowse de significación 88 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse de trescientos treinta y cinco, tal como indica la barra de puntuación Mowse 92 del gráfico de la puntuación Mowse 90. La proteína indicada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 92 es la proteína 4 que contiene el dominio FERM 4, tal como se indica en la fila 98. Las proteínas indicadas en las filas 100, 102, 104, 106 y 108 también presentaban unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que estas cinco proteínas también son coincidencias significativas. A continuación se realizó el análisis manual, donde se excluyeron los datos no significativos o ruido, y se contrastaron los datos en bruto, las intensidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. Como resultado del análisis manual, la probabilidad de que las proteínas indicadas en las filas 100, 102, 104, 106 y 108 sean coincidencias significativas se redujo de forma notable y, por tanto, las proteínas indicadas en estas filas se excluyeron de las coincidencias. La proteína 4 que contiene el dominio FERM 4 se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 7.
Con respecto a la Fig. 8, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 ("JCC1445"). El umbralde la puntuación Mowse de significación 110 se estableció como el valor Mowse de sesenta y seis, y se obtuvo una puntuación Mowse de ciento veintitrés, tal como indica la barra de puntuación Mowse 114 del gráfico de la puntuación Mowse 112. La proteína identificada que se correlacionaba con la barra de puntuación Mowse 114 es gi/4506179, tal como se indica en la fila 116. gi/4506179 se corresponde con la proteína JCC1445. Las proteínas indicadas en las filas 118, 120, 122, 124, 126 y 128 también presentaban unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que estas seis proteínas también son coincidencias significativas. A continuación se realizó el análisis manual, donde se excluyeron los datos no significativos o ruido, y se contrastaron los datos en bruto, las intensidades máximas, las multiplicidades de carga, la distribución de isótopos y los estados de carga de los flancos. Como resultado del análisis manual, la probabilidad de que las proteínas indicadas en las filas 118, 120, 122, 124, 126 y 128 sean coincidencias significativas se redujo de forma notable y, por tanto, las proteínas indicadas en estas filas se excluyeron de las
coincidencias. JCC1445 se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 8.
Con respecto a la Fig. 9, se divulga el resultado de la búsqueda de Mascot para la proteína sintaxina 11. El umbral de la puntuación Mowse de significación 130 se estableció como el valor Mowse de sesenta y seis, y se obtuvo en dos ocasiones una puntuación Mowse de ciento veintisiete, tal como indican las barras de puntuación Mowse 134 y las filas 136 y 138. Se obtuvo una tercera puntuación Mowse de 95 para la sintaxina 11, tal como se indica en la fila 140.La sintaxina 11 se identificó como la proteína indicada por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 9.
Con respecto a la Fig. 10, se divulgan los resultados de la búsqueda de Mascot para las proteínas AAK13083 y AAK13049. El umbral de la puntuación Mowse de significación 142 se estableció como el valor Mowse de sesenta y cuatro, y se obtuvo una puntuación Mowse de doscientos setenta y tres con la proteína Q5VY82, tal como indica la fila 148 y la barra de puntuación Mowse 146. Las proteínas indicadas en las filas 150, 152 y 154 también presentaban unas puntuaciones Mowse muy elevadas, lo que indica que estas tres proteínas también son coincidencias significativas. Sin embargo, como resultado del análisis manual realizado, las proteínas indicadas en las filas 150 y 154 se eliminaron como coincidencias probables. Q5VY82 se está sometiendo a nuevos trabajos de investigación y experimentación para determinar si se expresa de forma significativamente diferenciada. AAK13049, indicada en la fila 152, y AAK13083 fueron ambas identificadas comolas proteínas indicadas por los datos de espectros de masas introducidos en el programa Mascot en la Fig. 10.
Las Fig. 1 a 10 divulgan análisis de datos que se realizaron para identificar las once proteínas que se expresan de forma diferenciada en la población con asma y/o la población con cáncer de pulmón en comparación con la población normal. El proceso descrito en el presente, tal como se indica en las Fig. 1 a 10, se realizó para cada una de las once proteínas, para la población con asma, la población normal y la población con cáncer de pulmón.
Como resultado del proceso de identificación, las once proteínas que se determinó que se expresaban de forma significativamente diferenciada entre la población con asma, la población con cáncer de pulmón y la población normal se identificaron como BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, proteína 4 que contiene el dominio FERM, forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445, sintaxina 11, AAK13083, y AAK130490. BAC04615, Q6NSC8, CAF 17350, Q6ZUD4, Q8N7P1 son proteínas identificadas resultantes de esfuerzos de secuenciación genética. La proteína 4 que contiene el dominio FERM se sabe que participa en el anclaje a la membrana de la proteína intracitoplásmica. La forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 es un proteasoma conocido.La sintaxina 11 es activa en la respuesta inmune celular.BAC04615, AAK13083, y AAK130490 son proteínas asociadas con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
Habiendo identificado once proteínas específicas que se expresan de forma constantemente diferenciada en los pacientes con asma y cáncer de pulmón, resulta posible diagnosticar estas patologías en una fase de su progresión temprana, sometiendo las proteínas BAC04615, Q6NSC8, CAF17350, Q6ZUD4, Q8N7P1, CAC69571, proteína 4 que contiene el dominio FERM, forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445, sintaxina 11, AAK13083, y AAK130490 del suero de un paciente a la LC-ESIMS, obteniendo los datos de espectros de masas de estas proteínas, y comparando estos datos con los datos de espectros de masas de la población normal. Se puede realizar otro análisis comparando los datos de espectros de masas con los de la población con cáncer de pulmón y/o asma, para verificar o descartar la presencia de las patologías dadas.
Por supuesto, el análisis se podría extrapolar a muchas otras técnicas en las que las que se pueden determinar las concentraciones de proteínas específicas, incluyendo, a título meramente enunciativo, las siguientes:radioinmunoensayo, inmunoensayo absorbente vinculado a enzimas, cromatografía líquida de alta resolución con radiométrica, detección espectrométrica mediante absorbancia de luz ultravioleta o visible, análisis cuantitativo y cualitativo por espectrometría de masas, inmunoensayo western-blot, electroforesis en gel unidimensional o bidimensional con visualización cuantitativa mediante detección de núcleos o sondas radiactivas, detección basada en anticuerpos con fotometría de absorción o fluorescencia, cuantificación por luminiscencia de cualesquiera de una serie de sistemas reporteros quimioluminiscentes, ensayos enzimáticos, inmunoprecipitación o inmunoensayos de captura, o cualesquiera de una serie de inmunoensayos en fase sólida y líquida.
Además de determinar la existencia de cáncer de pulmón o asma en una fase temprana de la enfermedad, las proteínas identificadas en el presente como indicativas de estas patologías se podrían utilizar y aplicar de formas relacionadas para el objetivo del tratamiento del cáncer de pulmón y/o del asma. Por ejemplo, se pueden desarrollar anticuerpos que se unan a estas proteínas. Los anticuerpos se podrían juntar en un grupo de biomarcadores donde cualquiera de los anticuerpos o todos ellos se unirían en un grupo o kit basado en un único gránulo para un inmunoensayo de los gránulos. A continuación, las proteínas se podrían someter a un inmunoensayo multiplexado utilizando tecnologías basadas en gránulos, como las tecnologías xMAP de Luminex, y cuantificarse. Asimismo, se podrían emplear ensayos no basados en gránulos para cuantificar los niveles de expresión de las proteínas. Al cuantificar los niveles de expresión de las proteínas, los resultados cuantificables se pueden comparar con los niveles de expresión de la población normal, la población con asma y/o la población con cáncer de pulmón para verificar o descartar la presencia de cáncer de pulmón o asma en el paciente.
Las proteínas se podrían utilizar y aplicar también en el campo farmacológico, para evaluar la respuesta de un paciente a intervenciones terapéuticas tales como el tratamiento con fármacos, la radiación/quimioterapia o el tratamiento quirúrgico. Por otra parte, se podrían utilizar kits para medir proteínas individuales o un grupo de proteínas para el análisis rutinario de un paciente diseñado para controlar el estado de salud de un paciente que corre un mayor riesgo de padecer las patologías, como fumadores, o aquellos con un historial familiar de estas patologías.
Por último, en el presente se recoge el Listado de secuencias de aminoácidos de cada una de las once proteínas, que queda específicamente incorporado al presente por referencia. En el Listado de secuencias, la secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 1 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína BAC04615. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína Q6NSC8. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 3 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína CAF17350. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína Q6ZUD4. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 5 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína 4 que contiene el dominio PERM. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína AKK13083. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína Q8N7P1. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína CAC69571. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 9 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma JCC1445. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína sintaxina 11. La secuencia de aminoácidos divulgada en la SEC. ID. Nº: 11 es la secuencia de aminoácidos primaria conocida en la fecha de presentación de la presente solicitud para la proteína AKK13049.
Las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente y en el Listado de secuencias son las secuencias de aminoácidos primarias conocidas en la fecha de presentación de la presente solicitud. Es necesario tener en cuenta que en el futuro se podrían introducir modificaciones en las secuencias que se recogen en el Listado de secuencias de las proteínas. Por ejemplo, es posible que se descubran modificaciones postraduccionales que varíen con el procesamiento de las proteínas incluidas en el listado o que se formen aductos funcionales de las proteínas en algún punto de su función en el organismo.Por otra parte, el Listado de secuencias puede verse alterado por diferencias de uniones o por el descubrimiento de proteínas de la misma familia que las mencionadas que estén estrechamente relacionadas desde un punto de vista estructural. Por otra parte, los fragmentos proteolíticos en todas sus permutaciones derivadas del procesamiento o la degradación de las proteínas incluidas en la lista podrían generar fragmentos de marcadores utilizables de todas las formas en las que se podrían explotar las proteínas matrices en el campo de la medicina y la farmacología. Estas modificaciones se contemplan e incluyen en el ámbito de aplicación de la invención divulgada en el presente, sin que supongan una desviación con respecto a dicho ámbito de aplicación.
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<210> 1
<211> 319
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 2
<211> 57
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<210> 7
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 8
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 9
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 10
<211> 287
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 11
<211> 244
<212> PRT
<213> Homo sapiens

Claims (4)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método que facilita el diagnóstico de las patologías del asma y/o el cáncer de pulmón en pacientes que se encuentran en una etapa temprana de la enfermedad, que consiste en determinar la concentración de proteína 5 específica de BAC04615 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERM (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente y comparar los datos de concentración con los
    10 obtenidos de las poblaciones con cáncer de pulmón y/o las poblaciones con asma, a fin de verificar o descartar la existencia de las patologías en cuestión.
  2. 2. El método de la reivindicación 1 donde las concentraciones de proteínas específicas se determinan obteniendo los datos de los espectros de masas, radioinmunoensayo, inmunoensayo absorbente vinculado a enzimas, cromatografía líquida de alta resolución con radiométrica, detección espectrométrica mediante absorbancia de luz 15 ultravioleta o visible, análisis cuantitativo y cualitativo por espectrometría de masas, inmunoensayo western-blot, electroforesis en gel unidimensional o bidimensional con visualización cuantitativa mediante detección de núcleos o sondas radiactivas, detección basada en anticuerpos con fotometría de absorción o fluorescencia, cuantificación por luminiscencia de cualesquiera de una serie de sistemas reporteros quimioluminiscentes, ensayos enzimáticos, inmunoprecipitación o inmunoensayos de captura, o cualesquiera de una serie de inmunoensayos en fase sólida y
    20 líquida.
  3. 3. Un método para evaluar la respuesta de un paciente a intervenciones terapéuticas que consisten en determinar la concentración de proteína específica de BAC04615 (SEC. ID. Nº: 1), y opcionalmente una o más de las proteínas de Q6NSC8 (SEC. ID. Nº: 2), CAF17350 (SEC. ID. Nº: 3), Q6ZUD4 (SEC. ID. Nº: 4), Q8N7P1 (SEC. ID. Nº: 7), CAC69571 (SEC. ID. Nº: 8), proteína 4 que contiene el dominio FERM (SEC. ID. Nº: 5), forma de unión larga de C2
    25 de la cadena del complejo de endopeptidasa del proteasoma de JCC1445 (SEC. ID. Nº: 9), sintaxina 11 (SEC. ID. Nº: 10), AAK13083 (SEC. ID. Nº: 6), y AAK13049 (SEC. ID. Nº: 11) en el suero de un paciente, cuando el paciente padece asma o cáncer de pulmón.
  4. 4. El método de la reivindicación 3, donde la intervención terapéutica es un tratamiento con fármacos, radiación/quimioterapia o tratamiento quirúrgico.
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