CN117969641A

CN117969641A - 用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN117969641A
Application number: CN202410251485.5A
Authority: CN
Inventors: 刘玉峰; 陈恩奇; 赵�卓; 刘畅; 白静; 范笑荧
Original assignee: Liaoning University
Current assignee: Liaoning University
Priority date: 2024-03-06
Filing date: 2024-03-06
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明公开一种用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物及其应用。所述血浆生物标志物包括精氨酸、鸟氨酸和丙氨酸中的一种或二种或三种，Arg和Arg/Orn代谢物是诊断乳腺肿瘤的指标成分；丙氨酸是早期乳腺癌的生物标志物；鸟氨酸是晚期乳腺癌的生物标志物。本发明的生物标志物组合灵敏度高，特异性好，对诊断乳腺癌具有深远的前景。本发明通过上述生物标志物建立数据模型，此模型可用于评估乳腺癌风险。

Description

用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及癌症诊断检测试剂技术领域，具体涉及一种用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物及其在制备试剂盒中的应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤之一，也是癌症患者死亡的主要原因。近年来，全世界范围内乳腺癌的发病率仍呈逐年上升趋势，现已跃居女性恶性肿瘤发病率第一位。良性肿瘤时的诊断可显著提高乳腺癌治愈率。然而，众多良性肿瘤患者并无明显症状，而常规的超声检查、钼靶筛查等方法很容易导致早期筛查出现假阴性、假阳性率的风险。因此，仍迫切需要开发可用于诊断的高灵敏度乳腺癌筛查方法。

代谢组学是研究生物体小分子参与代谢反应的学科。目前，代谢组学广泛应用于各种癌症的差异标志物筛选和代谢途径确认。代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分，涉及生命科学、分析科学以及统计学等多方面的知识，目前已经在很多领域都有极为重要的作用，在新药研发、药物毒理研究和安全性评价、临床病理生理研究、疾病的早期诊断、个性化治疗等众多领域得到广泛应用并取得科研成果。

代谢组学分析所使用的技术主要是质谱(MS)和核磁共振(NMR)。MS包括液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)和串联质谱(MS/MS)。虽然LC-MS和GC-MS由于组合色谱而具有高灵敏度和更高的分离效率，可以快速分离化合物；但是样品处理过程较为复杂，检测成本较高，因此LC-MS和GC-MS不适合临床疾病检测。MS/MS因其快速、灵敏、选择性强等优点被广泛应用于遗传代谢疾病的筛查和诊断。MS/MS的成本更低，样品处理过程更简单，可将生物样品吸附在滤纸上。多项研究表明氨基酸和酰基肉碱与乳腺癌的发生、疾病进展和预后相关。此外，MS/MS可以在疾病筛查过程中检测数十种氨基酸和酰基肉碱，同时保持高特异性。因此，MS/MS可以考虑用于乳腺癌的临床早期筛查和疾病过程监测。

血常规是诊断疾病常用的检查手段之一，主要观察红细胞、白细胞和血小板数量变化和形态分布来判断疾病。通过血常规检查能知道身体是否有感染和贫血，也能了解是否有血液系统性疾病，从侧面反映出骨髓造血功能。血常规不仅是医学检验的三大常规项之一，还是体检、门诊以及住院治疗时的定期检查项目，在医学检验中具有重要的地位和作用。但是血常规只是检查血液，通过白细胞、血小板和红细胞反映血液情况。不能检查出实体肿瘤，当前医院确定是否是癌症，需要进一步进行检查。

血浆分析是临床上常用的一种疾病诊断方法，因其简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用。近年来，针对乳腺癌标志物的研究很多，也筛选出了很多的标志物，但其中大多数标志物仍缺少特异性以及灵敏度，而且很少会有研究对所筛选出的标志物进行验证，因为验证的时间成本和经济成本非常高，所以无法保证结果的准确性。

由此可见，为了提高乳腺癌早期诊断率和判断疾病的进程，迫切需要研究开发准确率更高、灵敏度和特异性更强的标志物。利用血常规抽取的血液，采用MS/MS技术的血浆代谢标志物不仅在诊断便捷性、经济性和微创性方面优势明显，也对于乳腺癌的诊断和预后具有巨大的临床潜力，同时也为临床上癌症的检测提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳腺癌生物标志物及其应用。本发明的生物标志物组合灵敏度高，特异性好，对估测乳腺癌风险具有深远的前景。

本发明采用的技术方案是：一种用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物，所述血浆生物标志物包括精氨酸(Arg)、鸟氨酸(Orn)和丙氨酸(Ala)中的一种或二种或三种。

进一步的，所述血浆生物标志物包括精氨酸与鸟氨酸的质量含量比值(Arg/Orn代谢物)。

进一步的，所述血浆生物标志物来源于血浆。

进一步的，精氨酸及精氨酸与鸟氨酸的质量含量比值为乳腺肿瘤指标成分；丙氨酸为早期乳腺癌生物标志物；鸟氨酸为晚期乳腺癌生物标志物。

本发明提供的血浆生物标志物在制备用于辅助诊断或预防乳腺癌的检测试剂中的应用。

本发明提供的血浆生物标志物在制备用于辅助诊断或预防乳腺癌的试剂盒中的应用。

进一步的，所述试剂盒包括用于检测所述血浆生物标志物的物质和所述血浆生物标志物的标准品。

进一步的，通过基于串联质谱分析的血液靶向代谢组学方法测定血液中所述血浆生物标志物的水平。

本发明的有益效果是：

乳腺癌通常在晚期才会被诊断出来，此时死亡率很高，治疗方法也变得更加复杂和昂贵。研究表明，乳腺癌早期治愈率高达90％以上。早期筛查对于乳腺癌的发展最为重要。因此，为患者制定具有成本效益的筛查计划是有意义的。在乳腺癌的恶性转化过程中，细胞和组织的代谢发生改变。代谢组学应用于代谢物的临床检查，因为它可以在进行高灵敏度筛查的同时提供疾病的过程。因此，有必要对乳腺癌患者的代谢物进行筛查。本发明提供了一种乳腺癌生物标志物。本发明所述生物标志物能够用于建立基于此生物标志物的数据模型，通过提取检测对象的血液样本，基于靶向代谢组学方法的MS/MS进行血浆代谢物的检测，通过对数据进行代谢组学的分析，对乳腺癌进行辅助诊断，灵敏度高，特异性好，且非侵入性方式易得到人们的接受，有利于乳腺癌早筛理念的推广。

附图说明

图1是本发明所测得NI、BT和I-III期BC患者数据的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的得分图。

图2是本发明所测得BCI vs.BCIIA和BCIIA vs.BCIIB的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的得分图。

图3是ROC曲线基于逻辑回归模型。

图4是本发明制备的基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库的代谢途径示意图。

具体实施方式

本发明提供了一组乳腺癌生物标志物，包括Arg和Arg/Orn代谢物是诊断乳腺肿瘤的指标成分；Ala是早期乳腺癌的生物标志物；Orn是晚期乳腺癌的生物标志物。本发明的生物标志物组合灵敏度高，特异性好，对估测乳腺癌风险具有深远的前景。

本发明还提供了一种乳腺癌生物标志物的筛选方法，本发明具体通过提取检测对象的血液样本，基于靶向代谢组学方法的MS/MS进行血浆代谢物的研究，然后对数据进行代谢组学的分析。

本发明还提供了上述技术方案所述乳腺癌生物标志物在血常规检测中的应用。利用血常规采取的血液，以上述技术方案所述乳腺癌生物标志物为指标，基于靶向代谢组学方法的MS/MS进行血浆代谢物的研究，为乳腺癌临床诊断提供了新的思路。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种乳腺癌血浆生物标志物及其筛选方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

一、实验样本

本研究遵循赫尔辛基宣言，所有参与者均自愿参与本研究并签署同意书。研究中纳入的所有病例年龄在17岁至75岁之间，且彼此之间没有关联。本研究聚集了6个队列的327名受试者进行血浆代谢物检测。所有参与者(包括68名正常人[NI]、68名良性肿瘤患者[BT]、50名I期乳腺癌患者[BCI]、50名IIA期乳腺癌患者[BCIIA]、50名IIB期乳腺癌患者[BCIIB]，以及41名III期乳腺癌患者[BCIII])于2017年10月至2021年10月期间收集标本，根据比例随机分为训练集和验证集。

训练集样本：包括48名NI、48名BT、35名BCI、35名BCIIA、35名BCIIB和29名BCIII，平均年龄为49岁(17-75岁)。

验证集样本：包括20名NI、20名BT、15名BCI、15名BCIIA、15名BCIIB和12名BCIII，平均年龄为48岁(17-75岁)。用于评估训练集构建模型的适用性。

主要试剂：以下实施例中用作MS/MS分析内标的8种标记肉碱(货号：NSK-A)和12种稳定同位素标记氨基酸(货号：NSK-B)购自Cambridge Isotope实验室(美国马萨诸塞州安多弗)。QC氨基酸和肉碱的混合标准品购自Chromsystems(Grafelfing，德国)。对于实施例中所用的各种试剂及操作，除另有说明外，均为本领域常规的试剂和操作。

二、实验方法

1、生物标本制备

本发明从参与者手指穿刺处采集空腹干血斑(DBS)标本，常温干燥，4℃保存。从DBS样本中穿孔一个3毫米直径的圆盘(约3.2μL全血)，然后进入96孔样本板。同时，将100μL工作液加入96孔板中。常温下轻摇96孔样品板20min，离心2min(4℃，1500r/min)。用新的96孔板收集滤液。将两个低水平和两个高水平质量控制(QC)样本溶液随机分配到四个空白孔中作为真实样本进行QC分析。代谢组学分析前，用100μL流动相溶液溶解衍生物。目标代谢物由23个氨基酸、35个酰基肉碱和34个可能具有生物学意义的比例组成(表1)。

表1.测量的代谢物包括23种氨基酸和35种酰基肉碱

2、串联质谱法(MS/MS)

使用AB SCIEX 4000QTrap系统通过MS/MS进行目标代谢组学分析。该设备采用正电喷雾电离源模式。对于每次分析进样体积为20μL。配制80％ACN水溶液作为流动相。分析方法为梯度洗脱，初始流速0.2mL/min。质谱离子的喷雾电压为4.5kV。1和2离子源气体的压力为35psi。气幕气压设置为20psi。辅助气体温度保持在350℃。Analyst v1.6.0软件(ABSciex)用于样本数据收集。根据不同同位素标准，采用ChemoView 2.0.2软件(AB，SCIEX，USA)完成单一代谢物的定量，并计算相应的代谢物比例。

3、代谢组学统计分析

由R函数“prcomp”执行。然后建立正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型以清晰地显示组间样本的差异。根据OPLS-DA模型中投影(VIP)值中的变量重要性定义潜在差异代谢物。应用二元逻辑回归分析来构建差异化模型。进行受试者工作特征(ROC)曲线评估整体预测能力，并通过曲线下面积(AUC)值进一步分析差异代谢物。最后，基于MetaboAnalyst5.0平台，进行差异代谢物的代谢通路分析，绘制出各差异代谢物显着影响的通路。然后，通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路数据库绘制差异代谢物代谢图。

三、结果

1、患者和临床特征

本发明总共纳入了327名受试者。本发明共检测到了23个氨基酸、35个酰基肉碱和34个可能具有生物学意义的比率(表2)。基于MS/MS的靶向代谢组学用于交叉比较不同组别并研究乳腺肿瘤的生物标记物。

表2.两组不同组别代谢物水平比较

为了计算p值，采用了Mann–Whitney U检验。应用标准的Benjamini Hochberg方法来控制多重假设检验的错误发现率(FDR)。

2、BC形成过程的代谢特征

为了进一步监测发生发展过程中的代谢变化，本发明对NI、BT和I-III期BC患者进行了代谢组学分析。

图1中：(A)NI vs.BT模型参数为：R²Y＝0.866，Q²＝0.751。每个红点代表一名良性肿瘤患者患者，而每个蓝色三角形代表一名健康个体；(B)BT vs.BCI模型参数为：R²Y＝0.84，Q²＝0.732。每个红点代表一名I期乳腺癌患者，每个蓝色三角形代表一名良性肿瘤患者；(C)NI vs.BCI模型参数为：R²Y＝0.853，Q²＝0.781。每个红点代表一名I期乳腺癌患者，而每个蓝色三角形代表一名健康个体；(D)NI vs.BCIIA模型参数为：R²Y＝0.829，Q²＝0.695。每个红点代表一名IIA期乳腺癌患者，而每个蓝色三角形代表一名健康个体；(E)NIvs.BCIIB模型参数为：R²＝0.886，Q²＝0.677。每个红点代表一名IIB期乳腺癌患者，而每个蓝色三角形代表一名健康个体；(F)NI vs.BCIII模型参数为：R²＝0.851，Q²＝0.59。每个红点代表一名III期乳腺癌患者，而每个蓝色三角形代表一名健康个体。

由图1说明，所有OPLS-DA模型具有良好的分离效果。对于这些OPLS-DA模型，各组的R²和Q²值均大于0.5，表明构建的OPLS-DA模型具有可靠性，保证了分析结果的准确性。这些发现表明，患者的血浆代谢物在BC发展过程中正在发生变化。根据VIP>1、FDR<0.05、倍数变化>1.5或<0.5三个标准，筛选出Arg、Glu、Orn、C4DC和C16-OH等20个差异代谢物和10个比例(表3)。

表3.研究对象的基线特征

数值以平均值±标准偏差表示。^aP<0.05,^bP<0.01.*

一般来说，癌症形成和恶化的过程通常伴随着更多的代谢差异。为了评估不同时期可能的代谢变化，所以对BC患者进行分期，并招募良性乳腺癌患者进行代谢组学研究。在本发明中，与NI相比，患有BT的女性Arg和Arg/Orn水平较低，但与BCI患者相比则升高。NI和BCI结果的交叉比较表明，Arg水平没有显着影响。这些结果意味着Arg和Arg/Orn的水平可能是监测乳腺肿瘤形成的重要标志物。

研究结果表明，Ala是BC早期的生物标志物。据观察，丙氨酸是通过转氨酶从谷氨酰胺衍生的氮合成的。在静止状态下，Gln消耗减少，导致Ala合成减少。此外，Ala的过度表达可能与“Warburg效应”有关。癌细胞更喜欢通过糖酵解而不是线粒体的氧化磷酸化来产生ATP，从而释放大量乳酸，导致癌细胞中丙氨酸浓度较高。与其他研究一样，本发明观察到BCI患者与NI受试者相比丙氨酸水平显着升高。

根据表2差异代谢物的变化，Orn为晚期BC的差异代谢物。NI和BC之间关系的生物学作用机制仍不确定。如图4所示，Orn是尿素循环中必需的氨基酸，通过Glu与三羧酸(TCA)循环相连。Orn由精氨酸酶1(ARG1)直接产生，并通过脱羧酶(ODC)产生多胺。其它研究表明BC患者中ARG1过度表达，BC末期患者血浆中的ARG1活性要高得多。所以Orn高水平促进BC恶化可能与ARG1过度表达有关。

3、判别模型的建立和验证

为了对比差异代谢物，本发明为每个交叉比较构建了逻辑回归模型分析和ROC曲线分析。图3为NI vs.BT(A)、BT vs.BCI(B)、NI vs.BCI(C)、NI vs.BCIIA(D)、NI vs.BCIIB(E)、NI vs.BCIII(F)之间逻辑回归模型分析差异代谢物组合诊断的ROC曲线。AUC分别为0.62、0.663、0.69、0.807、0.65、0.692。交叉比较ROC结果表明差异代谢物的AUC大于0.6。因此，认为差异代谢物是可信的。

结果：通过显著的多变量分析，在总共七次交叉比较中，二十种代谢物和十种比率显示出显着差异。在这些代谢物中，发现精氨酸(Arg)和Arg/Orn代谢物是诊断乳腺肿瘤的指标成分；丙氨酸(Ala)是早期癌症的生物标志物；鸟氨酸(Orn)是晚期乳腺癌的生物标志物。

上述实施例为本发明较佳得实施方式，但本发明的实际实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物，其特征在于，所述血浆生物标志物包括精氨酸、鸟氨酸和丙氨酸中的一种或二种或三种。

2.根据权利要求1所述的血浆生物标志物，其特征在于，所述血浆生物标志物包括精氨酸与鸟氨酸的质量含量比值。

3.根据权利要求1所述的血浆生物标志物，其特征在于，所述血浆生物标志物来源于血浆。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种用于辅助诊断或预防乳腺癌的血浆生物标志物，其特征在于，精氨酸及精氨酸与鸟氨酸的质量含量比值为乳腺肿瘤指标成分；丙氨酸为早期乳腺癌生物标志物；鸟氨酸为晚期乳腺癌生物标志物。

5.权利要求1或2或3所述的血浆生物标志物在制备用于辅助诊断或预防乳腺癌的检测试剂中的应用。

6.权利要求1或2或3所述的血浆生物标志物在制备用于辅助诊断或预防乳腺癌的试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测所述血浆生物标志物的物质和所述血浆生物标志物的标准品。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过基于串联质谱分析的血液靶向代谢组学方法测定血液中所述血浆生物标志物的水平。