CN109596748B - 一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，其特征在于,具体步骤如下所示:S1、1:1的选取试验组和对照组；S2、定期收集待测样本；S3、处理S2所述的样本，进行UPLC‑Q‑TOF/MS分离分析；S4、对S3获得的UPLC‑Q‑TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集；S5、根据S4获得的数据集构建偏最小二乘法判别分析模型；S6、根据S5构件的模型构建S‑PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件，筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物。通过该方法能够预测甘地胶囊治疗糖尿病肾病的药理机制。

Description

一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法
技术领域
本发明涉及检测领域，特别涉及一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的新方法。
背景技术
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的典型并发症之一。糖尿病肾病也是导致肾衰竭常见的原因之一，其早期特征为间歇性微量白蛋白尿，逐渐进展为持续性微量白蛋白尿、显性白蛋白尿，伴随尿白蛋白/肌酐比值增加，最终导致肾衰竭。在糖尿病肾病的早期阶段，严格控制血糖及血压可预防或延缓糖尿病肾病的进展。在临床治疗中，控制代谢异常和血流动力学异常是治疗的主要方式，除此之外缺乏特异性的治疗药物。
甘地胶囊是由黄芪、山茱萸、地黄、益母草、余甘子、槐花、黄芩、僵蚕等八种中草药组成。经多次反复论证，临床验证显示甘地胶囊可用于治疗糖尿病血管病变，尤其是在微血管病变(糖尿病肾病、糖尿病眼底病变等)方面有良好的治疗作用。
但甘地胶囊指标成分繁多复杂，目前针对该药的成分及作用机制尚无系统深入的研究。到目前为止，甘地胶囊主要成分不明，口服后吸收入血的成分与患者的代谢产物目前尚无报导。明确在甘地胶囊治疗下糖尿病肾病患者代谢产物的变化情况是深入研究其治疗作用的基石。基于此情况，能够用于检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法急待研究。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种能够用于检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法。
本发明提供的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，其特征在于,具体步骤如下所示:
S1、1:1的选取试验组和对照组；
该试验组指服用甘地胶囊的病患；
该对照组指未服用甘地胶囊的病患。
S2、定期收集待测样本；
两组的病患均采用同样的检测周期进行样本的收集。
S3、处理S2上述的样本，进行UPLC-Q-TOF/MS分离分析；
S4、对S3获得的UPLC-Q-TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集；
该代谢轮廓分析指在特定代谢过程中对结构相似或性质相关的预设代谢物采用针对性的分析技术进行定量测定，如：某一类结构相似、性质相关的化合物等。
具体步骤为：
S4-1.对数据进行非线性校正和归一化，保留那些在QC样品中RSD小于X％(X％可以自定义，如30％)的变量；
该数据在进行S4-1之前，还可使用软件Masshunter内置的数据分析模块将仪器专用格式的LC-MS数据转换为mzData格式；
S4-2.将每个样品的LC-MS数据被标准化为每个样品的所有峰面积之和，获得一个新的数据集。该步骤可通过将数据导入MATLAB 7.0软件(The MathWorks，Inc.)等来实现。
S5、根据S4获得的数据集(采用使用分析软件SIMCA-P 11.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)等方式)构建偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型；
S6、根据S5构建的模型中S-PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件，筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物。该步骤可采用分析软件SIMCA-P11.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)来实现。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即上述OPLS-DA模型的多元统计性能参数为R2X＝0.599，R2Y＝0.921，Q2＝0.745。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、上述待测样本为血样、尿样。根据检测对象的差异还可以为其他样本。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、上述处理S2样本的方法为：将甲醇添加到样本中，混合均匀后离心分离，取出上清液待测。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、上述甲醇与血样或尿样的体积比为4-8:1。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、上述UPLC-Q-TOF/MS分离分析的参数如下所示：
色谱的流动相的组成为：B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱设置如下：0-2min:3％B，2-11min:3％-15％B,11-16min:15％-30％B，16-18min:30％-95％B,18-19.5min:95％B,19.5-20min:95％-3％；
之后平衡4min；
流速400μL/min，进样量4μL；
飞行质谱采用ESI源，参数设置为正离子模式；
毛细管电压：3500V；干燥气体流速：11L/min；喷雾气压：45psig；干燥气温度：350℃；碎裂电压：120V；质量范围：m/z 50-1000；MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、运用Student's T-test统计分析方法(如：采用SPSS软件等进行计算)，判断差异代谢物是否具有统计学意义。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、上述代谢产物主要为脂质类代谢物和氨基酸类代谢物。
进一步地，本发明涉及的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，还具有这样的特点：即、能够将其应用于检测其他药物治疗后的代谢产物。
本发明的作用与效果：
本发明在甘地胶囊临床疗效、体内外化学成分明确的基础上，采用UPLC-QTOF-MS的方法检测了甘地胶囊给药组和对照组病人血清和尿液的代谢轮廓变化，并采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选了甘地胶囊治疗N个月后患者血清和尿液代谢标志物发生的变化。
结果表明，UPLC-MS血清数据集含有579个峰，尿液的数据集则含有998个峰。在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据数据中分别筛选到18个和20个代谢物作为潜在生物标志物，其中血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物，还包含嘌呤、肌酐和等，尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。
附图说明
图1、典型的病人血清UPLC-Q-TOF/MS总离子流色谱图；
其中：(A)为空白组(B)为甘地胶囊给药6个月组。
图2、典型的病人尿液UPLC-Q-TOF/MS总离子流色谱图；
其中：(A)为空白组(B)为甘地胶囊给药6个月组。
图3、基于UHPLC-Q-TOF/MS数据的空白组(浅色)和甘地胶囊6个月给药组(深黑色)血清样本的OPLS-DA得分图(A)和S-plot图(B)。
图4、基于UHPLC-Q-TOF/MS数据的空白组(浅色)和甘地胶囊6个月给药组(深黑色)的尿液样本OPLS-DA得分图(A)和S-plot图(B)。
具体实施方式
一、试剂与化学物质
高效液相色谱级的甲酸购买于Fluka公司。甲酸铵购自SigmaAldrich公司(StLouis,MO,USA)。高效液相色谱级的乙腈购买于Merck公司(Darmstadt,Germany)。蒸馏水来自本实验室的Milli-Q超纯水系统(Millipore,Bedford,MA,USA)。其它常用化学试剂均为分析纯。
二、标本的收集和制备
本研究经第二军医大学医学伦理委员会批准并且坚持《赫尔辛基宣言》原则，受试者都签署了书面知情同意书并表示愿意参与。受试者入组标准：18-65岁，依从性好，临床诊断为早期糖尿病肾病(Ⅲ期)患者。
排除标准：Ⅰ型糖尿病患者；妊娠期及哺乳期妇女或有生育计划者；怀疑或确有酒精、药物滥用病史，或者根据研究者的判断，易造成失访的患者；3个月内参加过其它临床试验者；很难控制的高血压，或继发性高血压患者。
共计纳入符合要求的糖尿病肾病患者20人，采用开放、随机对照的研究方法，将受试者按照1:1的比例分配至甘地胶囊组(试验组)和空白组(对照组)。研究时间为6个月。患者在治疗期间采用糖尿病肾病饮食，每日口服格列美脲。在此基础上进行如下处理：
试验组：糖尿病肾病患者加服甘地胶囊，每日3次，每次3粒，连续使用6个月。
对照组：糖尿病肾病患者加服空白胶囊，每日2次，每次1包，连续使用6个月。每2月采集一次患者24h尿以及血样，进行代谢产物检测实验。
将400μL甲醇添加到100μL血清或24h尿样本中，经涡旋30秒，在4℃14000g离心5分钟。取出4μL上清液转移至自动进样瓶中进行UPLC-Q-TOF/MS分离分析。
三、仪器设备
生物超净工作台BCM-1000A型(苏州安泰空气技术有限公司)，全自动酶标仪ELX800型(美国Bio-TEK公司)，数显恒温水浴锅HH.2型(国华电器有限公司)，漩涡混合仪XW-80A型(海门贝尔仪器制造有限公司)，高速低温离心机5417R型(德国Effendorf公司)，制冰机(日本SANYO公司)，移液器(德国Effendorf公司)，Agilent 1290Infinity LC系统串联Agilent 6530Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight四极杆-飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)
四、数据采集和处理
使用Acquity UPLC BEH C18column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,)色谱柱进行色谱分析。流动相的组成为：B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱设置如下：0-2min:3％B，2-11min:3％-15％B,11-16min:15％-30％B，16-18min:30％-95％B,18-19.5min:95％B,19.5-20min:95％-3％；之后平衡4min；流速400μL/min，进样量4μL；飞行质谱采用ESI源，参数设置为正离子模式；代谢产物数据采集使用Agilent 6530Accurate-Mass Q-TOF-MS串联四极杆-飞行时间质谱仪，采用ESI源，参数设置为正离子模式。毛细管电压：3500V；干燥气体流速：11L/min；喷雾气压：45psig；干燥气温度：350℃；碎裂电压：120V；质量范围：m/z 50-1000。MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV。
五、分析与结果
1.患者血清和尿液代谢轮廓
选定空白组和甘地胶囊给药后6个月患者的血清和尿液样本进行代谢轮廓分析。典型的空白组和给药6个月组的血清UPLC-Q-TOF/MS图谱如图1所示、尿液UPLC-Q-TOF/MS图谱如图2所示。
通过MassHunter软件将与LC-MS数据转换成NetCDF和mzData格式。接下来，用XCMS软件对数据进一步的处理。XCMS软件主要功能是对数据进行非线性校正和归一化。参数设置如下:半最大全宽度(FWHM)＝10，带宽(bw)＝10和信噪比(snthresh)＝5，其他参数均为默认值。采用代谢组学公认的80％规则，保留那些在QC样品中RSD小于30％的变量，把这些数据导入MATLAB 7.0软件，根据总峰面积进行归一化校正。最后，将处理完成后的数据整合，获得一个新的数据集，并进行多元统计分析。
数据集具有较高的峰容量，经筛选，其中，UPLC-MS血清数据集含有579个峰，尿液的数据集则含有998个峰。
2.采用偏最小二乘法判别分析
偏最小二乘判别分析(Partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)是一种有监督的多元统计方法，采用SIMCA-P软件13.0版本进行分析，为了减少单位误差，数据会先经过log变换。通过分析OPLS-DA模型的Loading图和得分图，结合重要性参数VIP>1且P值小于0.05的筛选条件，筛选出两组之间区分能力最强的潜在代谢标志物。
评价模型质量主要采用以下三个参数(R2X,R2Y和Q2Y)，通过默认的leave-one-out过程来计算。R2X和R2Y是用于评价拟合优度的，Q2Y是用来评估模型可预测性的。
在本实施例中，为了获得可以将两组区分的特征性离子，如图3所示，多元统计性能参数为R2X＝0.599，R2Y＝0.921，Q2＝0.745。表明两个模型都具备高度有效的预测能力。空白组和甘地胶囊给药6个月组数据集构建的OPLS-DA模型的分类特异性也达到了100％，敏感性达到了100％。
根据OPLS-DA模型的S-plot载荷图(图3及图4)以及VIP的分值，筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物。
在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据中分别找到18个和19个代谢生物标志物，如下表1所示。
表1 UPLC-Q-TOF/MS分析鉴别的主要血清差异标志物
Figure GDA0001982967470000081
Figure GDA0001982967470000091
如上表所示，血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物，还包含嘌呤、肌酐。尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。
3.统计分析
将代谢物的相对离子强度导入到SPSS软件进行t检验分析，比较不同处理组之间的差异代谢物是否具有统计学意义，结果表明所有差异代谢物的P值均小于0.05，证明用我们的方法鉴定差异代谢生物标志物的准确性。
六.结果分析
本实施例将UPLC-Q-TOF/MS分析方法与多元统计分析方法(OPLS-DA)相结合，研究甘地胶囊给药组与对照组之间的代谢生物标志物差异，发现了39个潜在代谢生物标志物。这些标志物的变化与相应代谢通路的关系密切，包括了脂类代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢等。
糖尿病引发的慢性炎症可通过多种途径导致肾损伤，导致机体出现明显的氧化应激，并产生大量ROS，ROS可损害血管壁导致血管炎症。此外，CRP也能直接诱导内皮细胞产生血浆纤溶酶原激活物抑制物-1(Pal-1)mRNA和Pal-1蛋白的表达，并使其活性增加，加重了肾脏损害。通过合成黏附分子及单核细胞趋化蛋白-1，促进白细胞合成释放超氧化物和蛋白水解酶，引起肾脏组织损伤，在临床上表现为蛋白尿和脂质代谢紊乱。
磷脂类代谢紊乱是糖尿病肾病的发病的关键因素，磷脂是生物膜的主要结构组成部分，它含有多种脂肪酸成分，如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰亚胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇(PS)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(sphingom-yelin,SM)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)。除了此结构作用外，PC参与血管中乳化中性脂肪和胆固醇沉积的过程，可改善智力，激活细胞。此外，它们的新陈代谢与许多疾病密切相关，如阿尔茨海默氏症、肥胖和癌症等。由于这些重要的生物功能，PC在许多领域得到了越来越多的关注。大量研究表明，脂质代谢紊乱与II型糖尿病和糖尿病肾病直接相关。在一些疾病模型中，PC分子已成为II型糖尿病和糖尿病肾病具有重要调节或调节表达作用的生物标志物。
在甘地胶囊的干预下，LysoPC(18:2(9Z,12Z))、PC(0:0/18:0)、LysoPE(20:0/0:0)、PI(22:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、PC(18:2(2E,4E)/0:0)等磷脂类成分的相对含量显著降低，这提示我们，甘地胶囊能通过干预磷脂代谢，抑制磷脂的分解和代谢，对糖尿病肾病的发展起到调节作用。许多研究表明LysoPC含量的改变与细胞凋亡的生理变化相关，包括线粒体功能障碍和氧化应激，然而，具体的机制还不清楚，仍需要进一步研究甘地胶囊和LysoPC变化之间的关系。
此外，本实施例的研究结果显示，与对照组相比，甘地胶囊给药组中尿酸、次黄嘌呤和嘌呤等代谢物的水平显著降低。尿酸是由嘌呤代谢产生的，因此我们的研究结果表明，黄嘌呤氧化酶的激活与微蛋白尿的形成密切相关。在糖尿病肾病患者中，嘌呤代谢与蛋白尿密切相关，这表明在病程发展过程中，嘌呤代谢出现紊乱现象。尿酸、马尿酸、次黄嘌呤都是从嘌呤代谢中生成的产物，两种关键的嘌呤分解代谢(黄嘌呤和次黄嘌呤)是由黄嘌呤氧化酶(XO)，以及活性氧作用生成的。
本实施例的作用和效果
在本实施例中，采用UPLC-Q-TOF/MS的方法检测了甘地胶囊给药组和对照组病人血清和尿液的代谢轮廓变化，并采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选了甘地胶囊治疗6个月后患者血清和尿液代谢标志物发生的变化。
结果表明，UPLC-MS血清数据集含有579个峰，尿液的数据集则含有998个峰。数据的统计性能参数为R2X＝0.599，R2Y＝0.921，Q2＝0.745，这些参数表明这两个模型都具有高度的有效预测能力。我们在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据中分别筛选到18个和20个代谢物作为潜在生物标志物，其中血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物，还包含嘌呤、肌酐等，尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。
本方法作为检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，发现在服用甘地胶囊两个疗程后，机体的嘌呤代谢、磷脂代谢、氨基酸代谢得到了显著的改善。而这与甘地胶囊临床研究的结果是一致的，即降低了24h尿微量白蛋白。通过该方法的检测分析，我们发现了甘地胶囊对糖尿病肾病患者代谢水平的影响和调控作用，为甘地胶囊深入的药理学研究和组方的优化提供依据。

Claims (3)

1.一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，其特征在于,具体步骤如下所示:
S1、1:1的选取试验组和对照组；
S2、定期收集待测样本；
S3、处理S2所述的样本，进行UPLC-Q-TOF/MS分离分析；
S4、对S3获得的UPLC-Q-TOF/MS图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集；
S5、根据S4获得的数据集构建偏最小二乘法判别分析模型；
S6、根据S5构建的模型构建S-PLOT载荷图和计算VIP分值，同时获得相应的P值，以VIP值大于1.0且P值小于0.05为条件，筛选出能够区分空白组和甘地胶囊给药组的代谢标志物；
所述模型的多元统计性能参数为R2X＝0.599，R2Y＝0.921，Q2＝0.745；
所述待测样本为血清；
处理S2样本的方法为：将甲醇添加到样本中，混合均匀后离心分离，取出上清液待测；
所述UPLC-Q-TOF/MS分离分析的参数如下所示：
色谱的流动相的组成为：B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱设置如下：0-2min:3％B，2-11min:3％-15％B,11-16min:15％-30％B，16-18min:30％-95％B,18-19.5min:95％B,19.5-20min:95％-3％；之后平衡4min；流速400μL/min，进样量4μL；
飞行质谱采用ESI源，参数设置为正离子模式；
毛细管电压：3500V；干燥气体流速：11L/min；喷雾气压：45psig；干燥气温度：350℃；碎裂电压：120V；质量范围：m/z 50-1000；MS/MS二级质谱分析时碰撞能量设定为10-30eV；
所述代谢标志物为：
Hypoxanthine，LysoPC(18:2(9Z,12Z))，PC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0)，Acetylcarnitine，PC(0:0/18:0)，LysoPC(16:0)，Acoric acid，PC(18:1(11Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))，PC(18:2(9Z,12Z)/16:0)，PC(18:1(9Z)/16:0)，PC(0:0/18:1(9E))，C17Sphinganine，PC(0:0/18:1(9Z))，LysoPE(20:0/0:0)，Creatinine，PC(O-16:0/0:0)，PI(22:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))，PC(18:2(2E,4E)/0:0)。
2.如权利要求1所述的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，其特征在于：
所述甲醇与血样的体积比为4-8：1。
3.如权利要求1所述的一种检测甘地胶囊治疗糖尿病肾病患者代谢产物的方法，其特征在于：
进行Student's T-test统计分析方法，判断差异代谢物是否具有统计学意义。
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