CN110568196A - 尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物及其应用。具体地，相对正常健康人对照，低级别胶质瘤患者尿液中的代谢标志物鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺‑氧‑硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3‑葡糖苷酸和天门冬氨酰‑亮氨酸含量升高，2‑羟基‑皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。因此，所述低级别胶质瘤相关的代谢标志物的鉴定试剂可用于制备用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品，所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的；所述产品优选用于低级别胶质瘤的早期诊断。

Description

尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物及其应用。
背景技术
中国卫生部2013年最新年鉴表明，全国每年有超过30万患者死于脑部肿瘤。美国脑肿瘤登记中心2018年的报告(Q.T.Ostrom,et al.,CBTRUS Statistical Report:Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the UnitedStates in 2011-2015.Neuro Oncol 20(2018)iv1-iv86)指出，胶质瘤(glioma)作为脑部最常见的原发性恶性肿瘤，占所有原发性脑恶性肿瘤的81％，恶性程度高，治疗效果差。经过标准的手术、放疗及化疗之后，胶质母细胞瘤(glioblastoma,缩写GBM)病人中位生存期仅为14.6个月(R.Stupp,et al.,Radiotherapy plus concomitant and adjuvanttemozolomide for glioblastoma.N Engl J Med,352(2005),987-996)。这不仅给患者身体造成巨大痛苦，而且给患者及其家属带来心理上的沉重负担。此外，胶质瘤本身对脑功能造成的损害以及手术治疗所导致的致残率也很高。因此，该疾病给国家医疗资源以及社会保障体系带来很大的负担。
在病理上，世界卫生组织将将胶质瘤分为I、II、III、IV级。I级胶质瘤为良性肿瘤，好发于儿童，以手术治疗为主；III级及IV级胶质瘤为恶性脑肿瘤，好发于中老年，需要手术、放疗及化疗等综合治疗；II级胶质瘤为低级别胶质瘤，包括少枝细胞瘤和星形细胞瘤，其介于良性与恶性之间，好发于中青年，社会危害性较大。
早期发现并及时手术治疗能延长恶性胶质瘤病人生存预后，甚至能治愈部分病人，故胶质瘤早期诊断具有至关重要的作用。然而，胶质瘤起病隐匿，缺乏特异性早期症状，这导致发现时往往已是肿瘤病程后期，此时肿瘤较大，侵袭性强，手术治疗效果往往不佳。利用各种组学方法在体液中筛选并鉴定胶质瘤早期诊断标志物是目前胶质瘤早诊研究常规策略(M.Touat,et al.,Emerging circulating biomarkers in glioblastoma:promises and challenges.Expert Rev Mol Diagn,15(2015),1311-1323)。
代谢组学方法是通过核磁共振波谱法和质谱法在一个生物样品内发现全套小分子代谢物的研究方法。因此，利用质谱技术，通过代谢组学方法在生物样品中筛选出能较好区分正常人和低级别胶质瘤患者的代谢标志物将有利于低级别胶质瘤患者的早期诊断和治疗。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明基于质谱技术，通过代谢组学方法在尿液中筛选出一组能较好地区分正常健康人(对照)和低级别胶质瘤患者的代谢标志物，其中正常健康人对照是指未患有低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)及其他疾病的健康个体。
本发明一方面提供了尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物的鉴定试剂在制备用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品中的应用，其中所述代谢标志物为以下任意一种或多种的组合：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮；其中相对正常健康人对照，低级别胶质瘤患者尿液中的鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述代谢标志物为由以下七种物质组成的代谢物组合：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮。
如本发明所用，术语“诊断”是指相比正常健康人对照，根据受试者尿液中所述代谢标志物的变化来判断其患低级别胶质瘤的风险或严重程度；术语“预后”是指相比治疗以前，根据患者尿液中所述代谢标志物的变化来判断其低级别胶质瘤治疗的有效性。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述低级别胶质瘤诊断的过程包括以下步骤：
1)获得受试者的尿液样本；
2)任选地，从尿液样本中提取代谢物；
3)确定受试者尿液样本中所述代谢标志物的含量水平。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述低级别胶质瘤诊断为早期诊断。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述受试者是人。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品为试剂盒或芯片。
优选地，使用质谱方法确定所述代谢标志物的含量水平，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括所述代谢物提取，蛋白去除。在一个具体的实施方案中，用2倍体积乙腈提取尿液样本中的代谢物，同时去除蛋白。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的。在一个具体的实施方案中，质谱全扫描模式是同时采集质量范围100m/z到1000m/z内的所有小分子一级信息，通过多元统计分析筛选差异代谢物，进一步对差异代谢物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图，最终确定差异分子。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述质谱鉴定是一级全扫描模式联合靶向二级分析。在一个具体的实施方案中，首先通过一级全扫描检测尿液中代谢组，多元统计分析筛选出潜在标志物，然后对潜在标志物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图进一步确定潜在标志物。在一个具体的实施方案中，采用标志物一级谱峰面积进行定量。
本发明另一个方面还提供了用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品，其包含以下任意一种或多种尿液中代谢标志物的鉴定试剂：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮；其中相对正常健康人对照，低级别胶质瘤患者尿液中的鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述产品包含以下七种尿液中代谢标志物的鉴定试剂：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述低级别胶质瘤诊断为早期诊断。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述低级别胶质瘤诊断的过程包括以下步骤：
1)获得受试者的尿液样本，
2)任选地，从尿液样本中提取代谢物，
3)确定受试者尿液样本中所述代谢标志物的含量水平。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述低级别胶质瘤诊断是早期诊断。
基于上述七种尿液中代谢物的定量检测方法，可以结合标准品用其进行人群中这七种代谢物基线的建立，从而基于正常健康人对照的所述尿液中代谢物含量范围，对低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)患者进行早期诊断。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述产品为试剂盒或芯片。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂。
进一步地，在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的。
在本发明上述用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品的一些实施方案中，所述质谱鉴定是一级全扫描模式联合靶向二级分析。在一个具体实施方案中，首先通过一级全扫描检测尿液中代谢组，多元统计分析筛选出潜在标志物，对潜在标志物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图确定潜在标志物。在一个具体实施方案中，采用标志物一级谱峰面积进行定量。
有益效果
本发明人经研究发现，相对正常健康人对照，低级别胶质瘤患者尿液中的代谢标志物鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。因此，所述低级别胶质瘤相关的代谢标志物的鉴定试剂可用于制备用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品，其中所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的；本发明通过质谱鉴定技术检测受试者尿液中所述代谢标志物的含量相对于正常人的变化，具有较高的灵敏度和特异性，从而有助于低级别胶质瘤的早期诊断和治疗。
附图说明
图1所示为低级别胶质瘤组(Low-grade)和对照组(Normal)尿液中代谢谱PCA分类散点图。其中横坐标t[1]是第一主成分，纵坐标t[2]是第二主成分。
图2所示为低级别胶质瘤组(Low-grade)和对照组(Normal)尿液中代谢谱OPLS-DA分类散点图。其中t[1]对to[1]的散点图是X空间中的一个窗口，在这个窗口中，两类观测的分离发生在水平方向t[1]。垂直方向to[1]表示组内样本的差异。
图3所示为七种代谢物组合预测实验组样本的ROC曲线。
图4所示为七种代谢物组合区分验证组低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)样本的ROC曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：尿液中低级别胶质瘤相关代谢物的筛选和鉴定
我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测尿液中代谢物，通过多元统计分析筛选与低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)相关的代谢物。代谢标志物的鉴定是采用二级靶向分析方法，通过对二级碎片的匹配或者解析进行。
材料与试剂
1)仪器：Waters H-class液相色谱仪(waters公司)LTQ-Orbitrapvelos pro质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。
2)主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；C18反相色谱柱(3.0mm×100mm,C18,1.7μm,Waters公司)。
3)样本：45例低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)患者和65例年龄、性别匹配的正常对照组的尿液，来自北京天坛医院。
1.1人尿液样品的收集
收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。
1.2代谢物提取
取200ul尿液上清，加200ul乙腈，涡旋，4度静置30min，14000g离心10min，取上清，离心浓缩，用200ul 2％乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10ul进样。
1.3液相分析
Waters H-class高效液相色谱仪
色谱柱：waters BEH C18(3.0X100mm,1.7um)，柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈；分析梯度为：0-1min，2％B；1-8min，2％-98％B；8-8.1min，98％-100％B；8.1-12min，100％B；12-12.1min，100％-2％B；12.1-17min，2％B；流速为0.5ml/min；进样体积为10μl。
1.4质谱分析
UPLC质谱串联LTQ-Orbitrapvelos(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA,USA)质谱，采用电喷雾(electrospray)离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45和10任意单位(arbitrary units)；质谱扫描范围为100-1000m/z；电喷雾电压(sprayvoltages)设为4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000；二级分辨率为15000。
1.5质谱数据分析
由UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0,Nonlinear Dynamics,UK)进行处理。该软件可自动完成峰对齐、峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。
获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 14.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)早期潜在标志物。
对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD(High collision dissociation)碎裂方式，根据具体代谢物选择20、40、60eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB(HUMAN METABOLOME DATABASE)数据库，确定差异代谢物结构。
1.6尿液中代谢组区分低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)和对照组
非监督PCA得分图显示(图1)低级别胶质瘤(Low-grade)组和对照组(Normal)在纵轴方向呈现出一定的区分度，低级别胶质瘤(Low-grade)样本主要聚集在上面，正常健康对照(Normal)样本主要在下面。进一步采用监督OPLS-DA构建模型，两组区分度更加明显(图2)，主要沿横轴区分，低级别胶质瘤(Low-grade)样本主要聚集在右侧，正常健康对照(Normal)样本主要在左侧。基于筛选出的39个差异代谢物，我们采用逻辑回归算法优化模型，最后得到七个差异明显的代谢物：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸含量、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮。
如以下表1中所示，相对正常健康人对照(Normal)，在低级别胶质瘤(Low-grade)疾病组尿液中鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。
进一步地，采用以上样本中七种代谢物组合对低级别胶质瘤进行预测，结果如以下表2所示：(Training/Discovery)的曲线下面积(Area under the curve,AUC)值为0.937，灵敏度(sensitivity)及特异性(specificity)分别为0.856和0.840；十倍交叉验证的AUC值为0.892(图3)，灵敏度及特异性分别为0.831和0.800。可见，七种代谢物联合预测低级别胶质瘤的效果明显优于单个代谢物的预测效果。
表1：七种代谢物单独应用于低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)早期诊断的效果
注：在变化倍数的数值中，负值表示相对于正常健康对照(Normal)组在低级别胶质瘤(Low-grade)疾病组下调，反之，正值表示上调。
表2：七种代谢物组合预测低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)的灵敏度和特异性
AUC 灵敏度 特异性
Training/Discovery 0.937(0.923～0.950) 0.856(0.828～0.885) 0.840(0.804～0.875)
十倍交叉验证 0.892(0.830～0.954) 0.831(0.831～0.922) 0.800(0.683～0.917)
我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测另外22例低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)患者和34例正常人的尿液中代谢物，提取表2中七种代谢物，采用ROC曲线评估七种代谢物对低级别胶质瘤(少枝细胞瘤、星形细胞瘤)的预测效果。结果显示，七种代谢物组合预测的AUC值为0.981(图4)，预测效果良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.尿液中低级别胶质瘤相关的代谢标志物的鉴定试剂在制备用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品中的应用，其特征在于，所述代谢标志物为以下任意一种或多种的组合：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮；其中相对正常健康人对照，低级别胶质瘤患者尿液中的鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述代谢标志物为由以下七种物质组成的代谢物组合：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述低级别胶质瘤诊断的过程包括以下步骤：
1)获得受试者的尿液样本；
2)任选地，从尿液样本中提取代谢物；
3)确定受试者尿液样本中所述代谢标志物的含量水平。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的。
6.用于低级别胶质瘤诊断和/或预后的产品，其特征在于，包含以下任意一种或多种尿液中代谢标志物的鉴定试剂：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮；其中相对正常健康人对照，鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸和天门冬氨酰-亮氨酸含量升高，2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮含量降低。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，包含以下七种尿液中代谢标志物的鉴定试剂：鹅去氧胆酸硫酸盐、酪胺-氧-硫酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸3-葡糖苷酸、天门冬氨酰-亮氨酸、2-羟基-皮脂酸乙酯、脱氧胆酸甘氨酸偶联物和葡糖苷酸睾酮。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述低级别胶质瘤诊断的过程包括以下步骤：
1)获得受试者的尿液样本；
2)任选地，从尿液样本中提取代谢物；
3)确定受试者尿液样本中所述代谢标志物的含量水平。
9.如权利要求6-8中任一项所述的产品，其特征在于，所述鉴定试剂为所述代谢标志物的质谱鉴定试剂。
10.如权利要求9所述的产品，其特征在于，所述质谱鉴定是在质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定下使用的。
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