CN110568115B

CN110568115B - 尿液中的代谢标志物及其在胶质瘤早期诊断中的用途

Info

Publication number: CN110568115B
Application number: CN201910826210.9A
Authority: CN
Inventors: 张力伟; 季楠; 张扬; 王燚; 李春朝
Original assignee: Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2019-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: CN110568115A

Abstract

本发明涉及尿液中的代谢标志物及其在胶质瘤早期诊断中的用途。具体而言，本发明涉及选自以下的代谢物的鉴定试剂在制备用于胶质瘤IDH基因突变诊断的试剂中的用途：11‑氧‑雄甾酮‑葡糖苷酸、1,2‑脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7‑羟基甲氨蝶呤及其组合。这四种代谢物单独或组合使用对于胶质瘤IDH基因突变的早期诊断具有较好的临床应用前景。

Description

尿液中的代谢标志物及其在胶质瘤早期诊断中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及尿液中胶质瘤IDH基因突变的代谢标志物及其在早期诊断中的用途。

背景技术

卫生部2013年最新年鉴表明，我国每年有超过30万患者死于脑部肿瘤。胶质瘤作为脑部最常见的原发性恶性肿瘤，占所有原发性脑恶性肿瘤的81％(2018年美国脑肿瘤登记中心报告，CBTRUS)[1]。

胶质瘤的恶性程度高，治疗效果差。经过标准的手术、放疗及化疗之后，胶质母细胞瘤患者中位生存期仅为14.6个月[2]。这不仅给患者身体造成巨大痛苦，而且给患者及其家属带来心理上的沉重负担。此外，胶质瘤本身对脑功能造成的损害以及手术治疗所导致的致残率也很高。因此该疾病给国家医疗资源以及社会保障体系带来很大的负担。

按肿瘤细胞的形态学划分，脑胶质瘤根据其肿瘤细胞形态学进行如下主要分类：星形细胞瘤、少枝细胞瘤、室管膜瘤、混合胶质瘤(例如少枝—星形细胞瘤)。

按肿瘤细胞的恶性程度划分(例如，世界卫生组织WHO制定的分级系统)，将脑胶质瘤分为1级(恶性程度最低、预后最好)到4级(恶性程度最高、预后最差)：低级别胶质瘤(WHO1-2级)；高级别胶质瘤(WHO 3-4级)。

按肿瘤所处的位置划分，脑胶质瘤也分为：幕上胶质瘤、幕下胶质瘤、桥脑胶质瘤。

早期发现胶质瘤并及时手术治疗，能延长恶性胶质瘤患者生存预后，甚至能治愈部分患者，故胶质瘤早期诊断具有至关重要的作用。然而，胶质瘤起病隐匿，缺乏特异性早期症状，这导致发现时往往已是肿瘤病程后期，此时肿瘤较大，侵袭性强，手术治疗效果往往不佳。

学术论文(基于代谢组学平台的胶质瘤患者血浆代谢标志物研究，2016)中报道，收集健康志愿者和胶质瘤患者术前清晨空腹血液并收集血浆，建立高效液相色谱分析胶质瘤血浆样品中游离氨基酸的代谢靶标，测定氨基酸代谢谱。

然而，本领域的上述方法需对患者进行介入性操作，比如抽取血液，有些甚至需要穿刺以获取脑脊液。

IDH基因突变是胶质瘤早期和关键突变，IDH突变和野生型胶质瘤患者预后存在显著差别，具有IDH突变的胶质瘤病人生存预后明显好于IDH野生型胶质瘤病人[3]。目前IDH基因突变诊断主要通过对手术标本进行基因测序获得。采用无创的方法检测IDH基因突变，对胶质母细胞瘤早期诊断、预后判断和治疗选择具有重要意义。

IDH突变无创诊断研究目前主要集中在两个方向：一是基于核磁共振的影像学方法来判断IDH突变胶质瘤影像组学特征[4]或检测IDH突变特异性代谢产物2-HG[5]；二是基于质谱技术检测患者体液中2-HG[6]。

鉴于此，本领域仍需要便于操作(例如，能无创地收集患者样本)且较好区分基因突变型和野生型的胶质瘤患者的早期代谢标志物。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，一方面提供了代谢物(尤其是尿液中的代谢物)作为标记物用于鉴定胶质瘤受试者中是否存在IDH基因突变的用途。

根据另一些实施方案，提供了代谢物(尤其是尿液中的代谢物)作为标记物用于预后胶质瘤受试者生存的用途。

根据本公开的一些实施方案，提供了代谢物的定量试剂在制备用于鉴定胶质瘤受试者中IDH基因突变的装置中的用途，其中所述代谢物选自以下的一种或组合：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤。

根据本公开的一些实施方案，提供了代谢物的定量试剂在制备用于预后胶质瘤的装置中的用途，其中所述代谢物选自以下的一种或组合：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤。

在本申请的上下文中，“定量试剂”无论如何不能解释为狭义的液体/固定形式的试剂；其含义应当根据所用的定量方法而定，只要能够从样本中识别出靶标并对其定量的成分(或手段)都落入该含义范畴。例如，当采用免疫学方法(如，ELISA、磁颗粒、胶体金、放射免疫等)时，基于抗原-抗体之间的特异性识别，对待检测的靶标进行定量时，抗体或抗原结合片段则视为定量试剂；当采用质谱方法时，定量试剂包含质谱鉴定靶标所用的定量参数。

在本申请上下文中，胶质瘤选自：WHO II级胶质瘤、WHO III级胶质瘤。

在一些实施方案中，所述代谢物是所述受试者尿液中的代谢物。

在一些实施方案中，所述受试者是人。

在具体的实施方案中，相较于对照，选自以下的代谢物的水平降低，指示所述受试者携带IDH基因突变：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤、及其组合。

在本申请中，应当理解“指示所述受试者携带IDH基因突变”是指待测受试者携带基因突变；或者，也可以指待测受试者携带基因突变的概率(可能性/倾向性)在统计学上显著高于对照。“指示所述受试者携带IDH基因突变”不应理解为特定的受试个体势必携带该基因突变，这是因为临床领域中所采用的所有检测标记物(或诊断标记物或预后/预测标记物)都是建立在统计学范畴之上的，理论上不存在100％区分患者和健康人的标记物(指标)。

本领域的技术人员知晓，多文献报道携带IDH基因突变(尤其是R132H)的胶质瘤患者，比携带野生型IDH基因的患者具有更好的生存预后(更长的生存期)。鉴于此，能够预期相较于对照，选自以下的代谢物的水平降低，指示所述受试者预后良好：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤、及其组合。同理，“指示所述受试者预后良好”不应理解为特定的受试个体势必具有更好的生存预后，而是指预后良好的概率(可能性/倾向性)在统计学上显著高于携带野生型IDH基因的对照患者。

在具体的实施方案中，任何检测和/或定量小分子代谢物的试剂都可用于本申请的技术方案。例如，但不限于采用质谱鉴定手段。再比如，也可以采用气相色谱等方式定性/定量小分子代谢物；但是质谱鉴定更适合高通量检测方式。质谱全扫描模式是同时采集质量范围100m/z到1000m/z内的所有小分子一级信息，通过多元统计分析筛选差异代谢物，进一步对差异代谢物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图，最终确定差异分子。

在具体的实施方案中，所述鉴定采用质谱全扫描模式筛选联合二级靶向鉴定模式。技术人员理解，根据质谱仪的具体类型，可以自行调整仪器的鉴定模式。

根据一些实施方案中，提供一种用于预后胶质瘤的装置，其中所述装置包含选自以下的代谢物的定量试剂：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤、及其组合。

根据一些实施方案中，提供一种用于鉴定胶质瘤受试者中是否存在IDH基因突变的装置，其中所述装置包含选自以下的代谢物的定量试剂：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸、1,2-脱氢毛菜碱、蒿甲醚、7-羟基甲氨蝶呤、及其组合。

在一些实施方案中，所述装置呈现为(但不限于)试剂盒或芯片的形式，任何未来的形式均涵盖在此范围内。

在具体的实施方案中，所述定量试剂是质谱鉴定试剂(也涉及质谱鉴定靶标所用的定量参数)。

另一方面，提供了一种用于诊断胶质瘤受试者IDH基因突变的方法，包括步骤：

1)获得受试者的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中提取代谢物，

3)确定受试者尿液样本中选自以下的代谢物的含量水平：

11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸，1,2-脱氢毛菜碱，蒿甲醚，7-羟基甲氨蝶呤及其组合。

在具体的实施方案中，使用质谱方法确定含量水平。

当采用质谱方法确定代谢物水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括代谢物提取，蛋白去除。在具体的实施方案中，用2倍体积乙腈提取尿液样本中的代谢物，同时去除蛋白。

在具体的实施方案中，所述质谱方法是一级全扫描模式联合靶向二级分析。具体地，首先通过一级全扫描检测尿液代谢组，多元统计分析筛选出潜在标志物，对潜在标志物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图确定潜在标志物。采用标志物一级谱峰面积进行定量。

基于尿液上述四种代谢物的定量检测方法，可以结合参考物质用其进行人群中这四种代谢物基线的建立，可以基于胶质瘤IDH基因未突变人群的含量范围，对胶质瘤IDH基因突变患者进行早期鉴定。

附图说明

图1：胶质瘤IDH基因突变组(MU)和对照组(WT)的尿液代谢谱PCA分类图。

图2：胶质瘤IDH基因突变组(MU)和对照组(WT)的尿液代谢谱OPLS-DA分类图。

图3：四种代谢物组合使用时，预测胶质瘤IDH基因突变的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。然而，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测尿液中代谢物，通过多元统计分析筛选与胶质瘤IDH基因突变相关的代谢物。标志物的鉴定是采用二级靶向分析方法，通过对二级碎片的匹配或者解析进行。

1.材料与试剂

1.1仪器：Waters H-class液相色谱仪(waters公司)LTQ-Orbitrapvelos pro质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。

1.2主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；C18反相色谱柱(3.0mm×100mm，C18，1.7μm，Waters公司)。

1.3样本：61例II或III级别胶质瘤IDH基因突变患者的尿液和10例IDH基因未突变的对照组的尿液，来自北京天坛医院。

1.4患者的入选原则：

已接受手术治疗；诊断为II或III级胶质瘤；基因诊断是IDH突变或非突变患者；排除高血压、糖尿病等系统性疾病；尿常规检查无异常。

2.人尿液样品的收集

收集空腹晨尿，5000g的转速离心30min，去除沉淀。

3.代谢物提取

取200μl尿液上清，加200μl乙腈，涡旋，4℃静置30min，14000g离心10min，取上清，离心浓缩，用200μl的2％乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10μl进样。

4.液相分析

色谱柱：waters BEH C18(3.0X100mm，1.7um)，柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈；

分析梯度为：

0-1min，2％B；

1-8min，2％B-98％B；

8-8.1min，98％B-100％B；

8.1-12min，100％B；

12-12.1min，100％-2％B；

12.1-17min，2％B；

流速为0.5ml/min；进样体积为10μl。

5.质谱分析

UPLC质谱串联LTQ-Orbitrapvelos(Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA，USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45个任意单位(arbitrary units)和10个任意单位；质谱扫描范围为100–1000m/z；电喷雾电压设为4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000；二级分辨率为15000。

6.质谱数据分析

由UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0，Nonlinear Dynamics，UK)进行处理。该软件可自动完成峰比对，峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。

获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P 14.0(Umetrics AB，Umea，Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为胶质瘤(尤其是II和III级)IDH基因突变早期潜在标志物。

对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD(High collision dissociation)碎裂方式，根据具体代谢物选择20、40、60eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB(HUMAN METABOLOME DATABASE)数据库，确定差异代谢物结构。

7.结果

尿液代谢组能够区分胶质瘤IDH基因突变和对照组

非监督PCA得分图显示(图1)胶质瘤IDH基因突变组和对照组呈现出一定的区分度。进一步采用监督OPLS-DA构建模型，两组区分度更加明显(图2)。

筛选出差异代谢物23个。研究显示，多个代谢物联合应用可以更好的预测疾病的发生。在此，本发明人采用逻辑回归算方法对差异代谢物进行模型优化，最后得出4个代谢物：11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸，1,2-脱氢毛菜碱，蒿甲醚，7-羟基甲氨蝶呤。

当4个代谢物联合应用时，可以达到较好的区分效果，对以上样本组区分的AUC值为0.875；十倍交叉验证的AUC值为0.79(图3)；灵敏度及特异性见表1。

上述结果表明4个代谢物联合应用时的效果更好，能够统计学上显著地将携带IDH基因突变的II/III级胶质瘤受试者和不携带IDH基因突变(即野生型)的II/III级胶质瘤受试者区分开，从而实现对IDH基因突变的鉴定。

表1.四种代谢物联合鉴定胶质瘤IDH基因突变的灵敏度和特异性

	AUC	灵敏度	特异性
				训练组/发现组	0.875(0.841～0.910)	0.800(0.717～0.883)	0.787(0.753～0.821)
10-倍交叉验证	0.790(0.648～0.932)	0.800(0.800～1.000<sup>)</sup>	0.754(0.646～0.862)

表2.四种代谢物联合进行胶质瘤IDH基因突变的早期鉴定

参考文献

[1]Q.T.Ostrom等人CBTRUS Statistical Report：Primary Brain and OtherCentral Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2011-2015.NeuroOncol 20(2018)iv1-iv86.

[2]R.Stupp等人Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomidefor glioblastoma.N Engl J Med352(2005)987-996.

[3]P.J.Killela等人Mutations in IDH1，IDH2，and in the TERT promoterdefine clinically distinct subgroups of adult malignant gliomas.Oncotarget 5(2014)1515-1525.

[4]B.Zhang等人Multimodal MRI features predict isocitratedehydrogenase genotype in high-grade gliomas.NeuroOncol 19(2017)109-117.

[5]A.Tietze等人Noninvasive assessment of isocitrate dehvdrogenasemutation status in cerebral gliomas by magnetic resonance spectroscopy in aclinical setting.J Neurosurg 128(2018)391-398.

[6]A.T.Fathi等人Elevation of Urinary 2-Hydroxyglutarate in IDH-MutantGlioma.Oncologist 21(2016)214-219。

Claims

1.尿液中11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸的定量试剂在制备用于鉴定胶质瘤受试者中IDH基因突变的装置中的用途；所述胶质瘤是WHO II级胶质瘤或WHO III级胶质瘤；所述受试者是人。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述IDH基因突变是R132H突变。

3.根据权利要求1所述的用途，其中：

相较于对照，11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸的水平降低，指示所述受试者携带IDH基因突变；

所述对照是不携带IDH基因突变的胶质瘤受试者。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述定量试剂是质谱鉴定试剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述鉴定采用质谱全扫描模式筛选和二级靶向鉴定模式。

6.尿液中11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸的定量试剂在制备用于预后胶质瘤受试者的装置中的用途；所述胶质瘤是WHO II级胶质瘤或WHO III级胶质瘤；所述预后是指预后受试者的生存；所述受试者是人。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述定量试剂是质谱鉴定试剂。

8.根据权利要求6所述的用途，其中：

相较于对照，11-氧-雄甾酮-葡糖苷酸的水平降低，指示所述受试者预后良好的概率高；

所述对照是不携带IDH基因突变的胶质瘤受试者。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述IDH基因突变是R132H突变。