CN115902223A - 蛋白生物标志物在胃癌诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤学领域。具体而言，本发明涉及蛋白生物标志物在胃癌诊断中的应用，所述蛋白生物标志物选自GSTP1、COL15A1、VMO1和ANGPTL2中的一种或两种以上的组合。本发明的生物标志物可灵敏、准确地诊断胃癌。

Description

蛋白生物标志物在胃癌诊断中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学领域。具体而言，本发明涉及蛋白生物标志物在胃癌诊断及预后疗效评价中的应用。

背景技术

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第五大最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第四大原因(PMID:33538338)。其恶性程度高，预后差，严重威胁人类的健康。早期胃癌的5年生存率可以达到90％，而中晚期胃癌术后5年生存率仅30％左右。胃癌的早发现、早诊断和早治疗是有效改善胃癌预后、降低病死率的关键。

胃癌的早期诊断目前主要依赖于胃镜检查和活检组织的病理学诊断，操作过程复杂且侵入性的操作给受检者带来较大痛苦，因而限制了其在大规模社区人群中的筛查和早期诊断中的应用。

血清学标志物具有微创性的特点，在胃癌筛查与早期诊断中的应用较为广泛。但传统的血清标志物如癌胚抗原(CEA)、糖链抗原72-4(CA72-4)、糖类抗原19-9(CA19-9)和糖类抗原125(CA125)，在胃癌诊早诊应用中的敏感性和特异性十分有限，例如在在Ⅰ期胃癌中，这些传统标志物的阳性率低于20％，在Ⅲ～Ⅳ期胃癌中阳性率更是低于40％。因此，目前迫切需要一种可靠、无创的胃癌生物标志物早期检测方法。

发明内容

基于新的研究发现，本发明提供了检测蛋白生物标志物的试剂用于制备胃癌诊断和预后治疗效果评价试剂盒、试纸或芯片的应用，所述蛋白生物标志物选自GSTP1、COL15A1、VMO1、和ANGPTL2中的一种或两种以上的组合。

在具体实施方式中，所述诊断是指胃癌患者的早期诊断。相较于健康对照，选自所述蛋白生物标志物的水平提高指示患有胃癌。

具体方案中，所述预后是指胃癌患者的疗效评估。相较于治疗前，选自所述所述蛋白生物标志物的水平下调指示治疗的有效性。

适用于本发明的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、探针或引物。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本发明对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本发明。

可选的，所述试剂盒、试纸或芯片的检测体液样品选自血液、血清、血浆、尿液和唾液。优选地，所述体液样品是尿液。

利用本发明的试剂盒、试纸或芯片确定受试者是否患有或有风险患有胃癌时，首先检测来自受试者的液体样品中生物标志物的水平，所述生物标志物选自GSTP1、COL15A1、VMO1和ANGPTL2中的一种或两种以上的组合；之后将所述水平与参考值比较。

应理解所述的“水平”包括所述生物标志物的绝对量、相对量或浓度以及与其相关或可以从其衍生的任何值或参数。所述的“比较”通常指对应参数或值的比较，例如将绝对量与绝对参考量比较，而将浓度与参考浓度比较，或者将获自样品中生物标志物的强度信号与获自参考样品的相同类型的强度信号比较。比较可以手动或计算机辅助进行。获自个体或患者的样品中生物标志物的测量的或检测的水平和参考水平的值可以例如彼此比较，并且所述比较可以通过执行用于比较的算法的计算机程序自动进行。

所述的“参考值”指允许区分处于患有胃癌风险中或不处于这样的风险中的对象的值，例如允许区分健康对照和胃癌患者的值。参考值可以是预先测定的，并设定以满足在例如特异性和/或灵敏性方面的常规要求。

基于本发明中给出的教导，获得这样的参考值在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以对代表性群体测定本发明所述的生物标志物的水平，并通过合适的统计学方法(例如中值、平均值、分位数、PLS-DA、逻辑回归方法、随机森林分类或者其他给出阈值的方法)计算参考值。阈值应当考虑诊断和预后测试的灵敏性和特异性的希望的临床设定。在一个实施方案中，参考值可以在患有胃癌的患者的一种或多种参考样品中测定。在另一个实施方案中，参考值可以在来自不处于胃癌风险中的受试者(例如健康对照)的一种或多种参考样品中测定。

在某些实施方案中，所述参考值代表未患胃癌的健康人群的体液样品中该生物标志物的水平。在某些实施方案中，测定的水平高于参考值的话，则判断所述受试者患有胃癌。相较于治疗前，选自所述所述蛋白生物标志物的水平下调指示治疗的有效性。

附图说明

图1为偏最小二乘法判别分析结果，其中，GC-pre：胃癌术前；GC-post：胃癌术后一周。

图2为PRM质控样本相关性分析热图，其中，QC：质控样本。

图3为PRM靶向定量蛋白质组学数据散点图，其中，“*”代表p<0.05；“**”代表p<0.01；“***”代表p<0.001；“****”代表p<0.0001；图3A为GSTP1在不同组中的PRM蛋白表达散点图；图3B为GSTP1在不同组中的PRM蛋白表达散点图；图3C为VMO1在不同组中的PRM蛋白表达散点图；图3D为ANGPTL2在不同组中的PRM蛋白表达散点图。

图4为PRM靶向定量蛋白质组学中GC组候选蛋白以及组合标志物的ROC曲线，其中，ROC：受试者工作特征曲线。

图5为PRM靶向定量蛋白质组学中(GC&GC-pre)组候选蛋白以及组合标志物的ROC曲线，其中，GC&GC-pre:胃癌和胃癌术前组。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的肿瘤学、分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中，所述GSTP1为人谷胱甘肽S转移酶P1(Glutathione S-transferase P，P09211)；所述COL15A1为人XV型胶原蛋白α1链(Torsin-1A-interacting protein 1,P39059)；所述VMO1为人卵黄膜外层蛋白1同源物(Vitelline membrane outer layerprotein 1homolog，Q7Z5L0)；所述ANGPTL2为人血管生成素样蛋白2(Angiopoietin-related protein 2，Q9UKU9)，均记载在www.uniprot.org数据库中。

本文中，为了最大程度减少不同患者尿液中混杂因素的影响，在发现组采用同一患者手术前后自身对照的样本策略，通过数据非依赖采集(Data independentacquisition,DIA)非靶向蛋白质组学技术，对比胃癌患者手术前和手术后一周的尿蛋白质组变化，并筛选出两组间的显著性差异蛋白。在验证组，发明人通过平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)靶向蛋白组组学技术，对新纳入的胃癌组、健康对照组和发现组的尿液进行全面的蛋白质组学对比分析，来寻找用于诊断胃癌的潜在生物标志物。

以下实施例所有尿液样本来自空军军医大学第一附属医院的住院病人，样本采集和使用经医院伦理委员会批准，胃癌患者纳入标准是内窥镜活检组织学经过至少两位资深病理专家诊断为腺癌，在研究前均未进行胃癌手术、化疗、放疗等治疗，且所有患者无肿瘤转移或其他肿瘤病史。健康受试者的入组标准为年度体检中没有肿瘤且既往无肿瘤病史及其他严重疾病。

实施例1：尿蛋白标志物的初步筛选

利用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS/MS)，通过(Data independent acquisition,DIA)定量蛋白质组学方法，检测胃癌患者手术前后的尿液蛋白质组，并筛选胃癌术后下调相关蛋白质。

以下实施例中的质谱定量试验，均在样本采集中间穿插HeLa标准品进行质谱数据的质量控制，并加入iRT标记肽进行保留时间的控制。

1.材料与试剂

1)仪器：Easy-nLC 1200(Thermo Scientific公司)；Orbitrap QExactive HF质谱仪(Thermo Scientific公司)。

2)主要试剂：乙腈(Merk公司)；预柱(75μm×2cm,C18，3μm，Thermo Scientific公司)，分析柱(75μm×25cm,C18，2μm，Thermo Scientific公司)；；iST 96X试剂盒(PreOmics公司)。

3)样本：28例胃癌患者手术前和手术后一周的尿液样本。

2.实验方法

2.1尿液样本的收集与肽段样本的制备

(1)收集胃癌患者手术前和手术后一周晨起的空腹中段尿液；样本1000g，4℃离心10min，取上清装入新的离心管中，进行12000g，4℃离心10min，两次离心后去掉沉淀，上清液分装至Eppendorf@1.5mL离心管中；

(2)步骤(1)中的56份样品各取300μl于Eppendorf@2.0mL离心管中，加入5倍体积-20℃预冷的丙酮，混合均匀后置于-20℃过夜沉淀；

(3)完成步骤(2)后，4℃条件下，12000g离心30min弃掉上清液，后续操作参照Preomics公司iST 96X试剂盒优化后的步骤进行；

(4)步骤(3)中加入50μl LYSE试剂溶解蛋白质沉淀，涡旋混匀95℃，1000rpm加热10min；

(5)将步骤(4)加热的样品冷却至室温，加入50μl配制好的DIGEST，37℃，500rpm酶解2h；

(6)步骤(5)酶解结束后加入100μl STOP溶液，室温500rpm震荡1min终止酶解反应；

(7)使用试剂盒配置的ADAPTER，将CARTRIDGE安装在1.5离心管上并做好标记，将步骤(6)酶解液瞬时离心后转移至连接好的CARTRIDGE中，3800g离心1min；

(8)步骤(7)中分别加入200μl WASH0，WASH1和WASH2，依次3800g离心1min，弃去废液；

(9)使用ADAPTER将CARTRIDGE安装在新的1.5ml离心管中，加入100μl ELUTE，3800g离心1min，洗脱肽段，重复操作一次并将两次的洗脱液合并；

(10)取步骤(9)收集的洗脱液置于离心浓缩仪中真空抽干，得到抽干的肽段样品于-80℃保存。

2.2 DDA谱图库的建立

2.2.1 DDA样本的制备

利用56个样品的混合肽段进行液相分离，合并组分后构建谱图库。混合肽段首先用高pH反相色谱柱(4.6mm×250mm,Xbridge C18,3mm)进行预分离，多肽的洗脱液梯度为3％～95％缓冲液B(B相：80％ACN中加20mM甲酸铵，氨水调节至pH＝10)，流速为1mL/min，洗脱时间为66min；每分钟收集一个馏分，最后合并为18个馏分，抽干后溶解于0.1％甲酸水溶液；然后对分级的l8个组分、用于质量控制的HeLa标准品、及56个独立样本分别加入iRT(Biognosys)进行保留时间的统一。

2.2.2 DDA质谱采集与分析

(1)对18个分级样品进行数据依赖性采集(Data dependent acquisition,DDA)模式的质谱鉴定，DDA模式质谱鉴定的方法为：将5μl样本通过Thermo EASY-nLC 1200液相系统分离，流动相由0.1％甲酸水溶液(A)和含0.1％甲酸的80％乙腈溶液(B)组成，流速为0.35μL/min，洗脱时间为120min；洗脱下的肽段用Orbitrap Q Exactive HF质谱仪进行分析，获得Raw文件；一级质谱的数据采集范围为350-1500m/z，分辨率为60,000。二级扫描的分辨率为15,000，HCD碰撞能量为27％；

(2)随后将Raw文件通过Spectronaut 15(Biognosys)软件合并搜库分析，采用软件默认的参数建库。序列数据库采用序列数据库采用UniProt Proteome人类蛋白质组数据库(2020/02)；设置Trypsin酶解；根据母离子和碎片离子的信息及其精确保留时间设定好需要鉴定样本的数据依赖采集(DIA)的可变窗口和质谱方法，对样本进行质谱鉴定。

2.3 DIA数据采集与分析

(1)DIA模式的质谱鉴定的方法为：在与DDA同样的液相系统参数条件下，设定60个可变窗口，一级质谱采集的扫描范围是350-1250m/z，分辨率为120,000。二级扫描的分辨率为30,000，HCD碰撞能量为27％；

(2)采用Spectronaut15软件默认参数进行DIA数据分析；基于分级样本的建库结果，将56个样品和质量控制样本Raw件的导入软件后进行蛋白的数据检索分析；根据iRT肽段，软件将根据iRT校准和梯度稳定性动态地确定理想的提取窗口，Spectronaut进行自动校正，采用局部归一化策略进行数据归一化处理，小于1％ FDR的前3个肽段的峰面积的平均值用来进行蛋白group的定量，对软件导出的定量结果，剔除样本中缺失数据超过50％的蛋白质，随后再对剩余蛋白进行缺失值的填充，最后对填充后的定量数据进行Log2转化。

(3)两组间定量结果的统计分析采用双尾配对t检验计算p值；依据蛋白质定量水平，当差异倍数(FC)＞1.5或FC＜0.67，且经统计p值<0.05时，视为差异表达蛋白。

3.结果

在母离子和蛋白鉴定FDR<1％的条件下，且样本中缺失值超过50％的蛋白质进行剔除后，共定量到1667个蛋白质；采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)构建模型(图1),胃癌术前组(GC-pre)和胃癌术后组(GC-post)可以明显被区分；将p<0.05，FC＞1.5或＜0.67确定为差异蛋白，共筛选出差异蛋白479个，其中术后下调的蛋白质有182个；对所有术后下调差异蛋白通过文献查阅和功能分析，最后筛选出54个潜在的生物标志物用于后续的PRM验证分析。

实施例2：候选尿蛋白标志物的分析验证

利用平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)靶向定量蛋白组学技术，对新纳入的胃癌组(GC)、健康对照组(HC)以及DIA发现组中的尿液样本，进行54个蛋白PRM靶向验证分析。

以下实施例中的质谱定量试验，均在样本采集中间穿插混合样本(QualityControl,QC)进行质谱数据的质量控制，并加入iRT标记肽进行保留时间的控制。

1.材料与试剂

1)仪器：Easy-nLC 1200(Thermo Scientific公司)；Orbitrap QExactive HF质谱仪(Thermo Scientific公司)。

2)主要试剂：乙腈(Merk公司)；预柱(75μm×2cm,C18，3μm，Thermo Scientific公司)，分析柱(75μm×25cm,C18，2μm，Thermo Scientific公司)；；iST 96X试剂盒(PreOmics公司)。

3)样本：17例胃癌患者与17例性别年龄匹配的健康对照、56份发现组中的尿液样本。

2.实验方法

2.1尿液样本的收集与肽段样本的制备

同DIA发现组中的方法。

2.2 PRM样品的采集

将2.1制备好的90份尿液样品依次进行scheduled PRM模式分析，PRM与DIA样品采集使用相同的质谱仪、色谱柱和液相分离条件。

质谱参数：MS全扫描参数分辨率为60,000(at m/z 200)，扫描范围为350-1200m/z，AGC设置为3E6，最大离子注入时间为20ms；二级质谱扫描的分辨率30,000(at m/z 200)，AGC设置为2E5，最大离子注入时间为50ms，NCE为27％。将目的肽段的质荷比和保留时间信息(见下表1)导入指定列表(Inclusion List)中。

表1 54个蛋白对应111个肽段的质荷比、电荷以及保留时间信息

2.3 PRM数据分析

采用SpectrDive 10.8默认参数进行PRM数据分析；目标蛋白序列表和PRM采集的所有原始数据导入到SpectrDive软件中，软件可以根据iRT肽段自动进行保留时间和质量窗口的校准，确定理想的提取窗口，并进行自动峰提取和定量分析。

肽段鉴定的可信度卡值FDR为1％；肽段鉴定的结果会进一步手动校验，以确保谱图的匹配和提取窗口的准确性，肽段母离子的定量值采用对应样本的总离子流(Totalionic chromatography,TIC)信号强度值进行归一化处理，以消除上样量不均一所带来的误差，TIC信号由Peaks studio10.6软件进行提取，每个precursor所有碎片离子的信号加和，用来计算内源性肽段信号，对目标肽段进行定量分析，筛选不同组之间的差异蛋白，进一步与DIA筛选结果进行比较。

2.4统计分析

对于PRM数据，P<0.05且FC>1.5或<0.67的蛋白质被认为差异表达蛋白。两组间定量资料的统计分析采用配对t检验，采用Kruskal-Wallis单因素方差检验用于3组或以上的统计比较，这些分析由GraphPad Prism 8.3进行统计；通过MedCalc 20软件绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)，并生成ROC曲线下面积(AUC)值，p值<0.05定义为统计学意义；皮尔逊相关系数热图的分析使用R包“pheatmap”实现；韦恩(Venn)图的绘制由R包“ggVennDiagram”实现。

3.结果

3.1 PRM质控分析

共采用14个混合样本作为QC样本，以监控检测实验过程中系统的稳定性；如图2所示，每对QC样品定量之间的平均皮尔逊相关系数为0.95，表明系统维持稳定状态且样本重复性较好。

3.2 PRM验证结果

3.2.1配对t检验结果

通过PRM质谱技术，验证了发现组中28对胃癌患者术前(GC-pre)和术后一周(GC-post)的尿液样本，根据肽段在两组表达量的平均值之比计算FC值，并通过配对t检验分别计算GC-pre和GC-post两组之间每个肽段的P值；GC-pre和GC-post组共定量到108个肽段，对应53个蛋白，其中91％肽段对应50个蛋白的变化趋势与DIA结果一致；另外有73％的肽段对应44个蛋白不仅与DIA变化趋势一致且FC和P值符合差异蛋白的标准。

在PRM验证阶段，还纳入了17对性别与年龄匹配的胃癌(GC)和健康对照(HC)组，根据肽段在两组表达量的平均值之比计算FC值，并通过配对t检验分别计算GC和HC两组之间每个肽段的P值；GC和HC组共定量到110个肽段，对应54个蛋白，其中48％肽段对应34个蛋白的变化趋势与DIA结果一致；另外有8个肽段对应7个蛋白不仅与DIA变化趋势一致且FC和P值符合差异蛋白的标准。

两次实验中变化趋势与DIA一致且具有统计学意义的肽段，共有6个肽段对应5个蛋白；综合整体结果来看，这6个肽段定量结果的稳定性较高，在QC样本中重复性较好并且在两次实验中的定量结果高度一致。

3.2.2 Kruskal-Wallis单因素方差检验

对验证出可信度较高的5个蛋白进行PRM表达量的分析，并通过Kruskal-Wallis单因素方差检验分别计算5个蛋白在HC、GC、GC-pre和GC-post各组间的P值，根据肽段在各组表达量的平均值之比计算FC值。

蛋白GSTP1、COL15A1、VMO1和ANGPTL2在两次PRM结果和DIA结果中显示出高度一致性，通过将4组PRM靶向定量蛋白组学数据两两比对发现，如图3所示，GSTP1在GC vs HC组、GC-pre vs GC-post组、GC vs GC-post组中均显著性上调，在GC-pre vs HC组中有上调趋势，但无显著性差异(图3A)；COL15A1在GC vs HC组、GC-pre vs GC-post组、GC-pre vs HC组中均显著性上调，在GC vs GC-post组中有上调趋势，但无显著性差异(图3B)；VMO1和ANGPTL2在GC vs HC组、GC-pre vs GC-post组、GC vs GC-post组、GC-pre vs HC均显著性上调(图3C和D)；另外，这4种蛋白在GC vs GC-pre组、HC vs GC-post组均呈现不显著性。

通过两种检验计算后，在组别1[GC vs HC]和组别2[GC-pre vs GC-post]共同上调且P<0.05的显著性差异蛋白及对应肽段见表2。

表2 4个在胃癌组和胃癌术前组显著上调的蛋白及对应肽段

3.3 ROC曲线分析

为了进一步对筛选出的差异蛋白进行诊断效率的评估，对筛选出的候选蛋白进行了ROC曲线分析；在分析中，本发明首先对GC vs HC组中上调5个蛋白进行单独分析；其次，将GC和GC-pre组合并为一个组，统称为GC&GC-pre，共同与HC组的数据做进一步分析。

3.3.1胃癌与健康对照组中的ROC曲线分析

在GC vs HC组结果中，ROC曲线结果显示，与HC组相比，GC组中GSTP1、COL15A1、VMO1、ANGPTL2蛋白的AUC值均大于0.70且具有显著性差异，其中VMO1的诊断效能最高，AUC为0.820，灵敏度(Sensitivity)为88.24％，特异性(Specificity)为76.47％；将蛋白GSTP1、COL15A1、VMO1、ANGPTL2的组合称为Combined，进行了ROC曲线分析，见图4和表3，其AUC为0.931，高于单独生物标志物的AUC结果，敏感性为94.12％，特异性为76.47％。

表3:PRM靶向定量蛋白质组学中GC组候选蛋白以及组合标志物的ROC曲线分析。

3.3.2胃癌和胃癌术前组与健康对照组中的ROC曲线分析

在(GC&GC-pre)vs HC组结果中，ROC曲线结果显示，与HC组相比，TG组中蛋白GSTP1、COL15A1、VMO1、ANGPTL2的AUC值大于0.70且具有显著性差异，其中COL15A1的诊断效能最高，AUC为0.795，灵敏度为64.44％，特异性为94.12％；将GSTP1、COL15A1、VMO1、ANGPTL2蛋白的组合称为Combined，进行了ROC曲线分析，见图5和表4，其AUC为0.850，高于单独生物标志物的AUC结果，敏感性为82.22％，特异性为82.35％；综合两种分组结果，蛋白GSTP1、COL15A1、VMO1、ANGPTL2具有较好的AUC值，且这四个蛋白的组合呈现出更优的诊断效能。

表4 PRM靶向定量蛋白质组学中(GC&GC-pre)组候选蛋白以及组合标志物的ROC曲线分析

基于上述研究可知，4种蛋白可以作为区分胃癌患者和正常人的尿液诊断标志物，具有较高的灵敏度和特异度；且4种蛋白组合具有更优的诊断效能，更高的灵敏度和特异度。

Claims (6)

1.检测蛋白生物标志物的试剂用于制备胃癌诊断和预后治疗效果评价试剂盒、试纸或芯片的应用，所述蛋白生物标志物选自GSTP1、COL15A1、VMO1和ANGPTL2中的一种或两种以上的组合。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，相较于健康对照，选自所述蛋白生物标志物的水平提高指示患有胃癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，相较于治疗前，选自所述所述蛋白生物标志物的水平下调指示治疗的有效性。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒、试纸或芯片的检测体液样品选自尿液。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒、试纸或芯片的参考值代表健康人群的体液样品中所述蛋白生物标志物的水平。

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