CN113484518B - 一种区分肺部疾病的诊断生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种专属强、准确性高、稳定性好的肺癌诊断生物标志物以及试剂盒，该生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸，能有效降低在临床中由于误诊而带来的不可逆伤害，并对肺癌患者进行提早治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物领域，特别涉及的是一种区分肺部疾病的诊断生物标志物。
背景技术
肺癌（Lung Cancer，LC）是一种发生于呼吸系统的恶性肿瘤，也是近半个世纪以来世界上最常见的导致死亡的癌症。根据世界卫生组织（WHO）2018年发布的全球癌症统计数据报告显示，全球一年有 180 余万人死于 LC，死亡率居世界首位，约占全世界的 19.4%。由于肺癌早期发病隐匿，临床症状缺乏特异性，难以与其他肺部疾病区 分开来，大部分患者确诊时已属晚期，严重影响了患者的预后和治疗。肺癌和不典型肺结核（tuberculosis，TB）拥有相似的临床症状和检查表现，而且二者在 影像学中常存在“异病同影”的现象，有的 TB 病灶酷似癌症，在我国的一些非专业性肿瘤医院，肺癌LC 的误诊事件时有发生，这种情况给临床医生的诊断增加了困难。18F-FDG-PET/CT 进行分子/原子成像已被公认为是检测、识别和分期 LC的重要工具，已经在临床上广泛应用，但此影像学检查不仅价格昂贵，首先很难做到大范围的普及，其次在不典型性肺结核TB 和 肺癌LC 高发的流行地区，还具有相当高的假阳性。目前，临床诊断 LC 的黄金标准仍然是组织活检病理检查，但此类检查属于有创检查且所切除的组织不具有重复使用性，对中老年人有一定的风险。 因此，临床上需要有安全和早期的诊断方法，以适用于各类人群。
近年来，寻找有效的肿瘤标 志物已成为恶性肿瘤临床诊断的研究热点。目前被发现有效且已经广泛应用到临床中的肿瘤标志物有：癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白 19 片段（Cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1）和神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE），但这些标志物缺乏准确度，限制了肿瘤标志物在肺癌 LC 早期诊断发挥其实用性。
代谢物能更详细地反映人体的生理功能和疾病的病理特征。代谢组学是分析正常人群和患病人群之间的差异代谢物的有力工具。利用代谢组学技术寻找代谢生物标记物，并将其作为补充诊断是检测疾病发作的有效方法，可以为临床诊断提供新的选择，同时代谢组学技术还可以监测这些关键生物分子在患者体内响应的变化。这种采用代谢标志物作为临床诊断 的非侵入性无创检查方法已被广泛应用于胰腺癌、卵巢癌的肿瘤标志物识别中，对建立LC的早期诊断方法具有重要的参考价值。本研究的目的就是通过对LC患者非靶向代谢组学分析，进一步发现具有显著性差异的代谢标志物，再通过靶向代谢组学对其进行定量分析，找到可以真正应用于临床的数据支持，结合临床影像对疾病进行准确判断。
CN108931587A公开了一种定量检测NSCLC的诊断生物标志物的方法，确认12个磷脂酰胆碱为NSCLC诊断生物标志物，其中饱和和单不饱和磷脂酰胆碱PC(15:0/18:1)、PC(18:0/16:0) 和PC(18:0/20:1)的含量在NSCLC中显着增加，多不饱和磷脂酰胆碱和PC(17:2/2: 0)、PC(18:4/3:0)，PC(15:0/18:2)，PC(16:0/18:2)、PC(17:0/18:2)，PC(18:2/18:2)、PC (16:0/20:3)，PC(15:0/22:6)和PC(24:4/17:2)的含量显著降低。CN107589194A也公开了一种肺癌早期诊断用小分子标志物及在诊断方面的应用，磷脂酰肌醇(20:4/0:0)单个用于诊断肺癌与非肺癌的AUC为0.858，具有中等的准确性；血清棕榈酰乙醇胺、磷脂酰肌醇(20:4/0:0)和柠苹酸联合用于诊断肺癌与非肺癌的AUC为0.965。CN107589263A公开了一种预示肺癌淋巴结转移的小分子标志物及在诊断方面的应用，以血清中的磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸作为组合标志物，血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单个用于预示肺癌淋巴结转移时具有中等的准确性，血清溶血磷脂酰胆碱(18:1)或苯丙氨酸单个用于预示肺癌淋巴结转移时具有较低的准确性。可见目前临床开发的肺癌小分子生物诊断标志物主要以磷脂类为主，而且仅用苯丙氨酸作为标志并无显著的准确性。
发明内容
本发明的目的正是在于克服现有技术的不足，提供了一种专属强、准确性高、稳定性好的肺癌诊断生物标志物以及试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种用于诊断区分肺癌和肺结核的生物标志物，所述生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸。
所述生物标志物进一步包括L-苯丙氨酸及苯丙氨酰苯丙氨酸，优选为L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的组合。
本发明还提供一种用于肺癌检测或肺癌风险评估的试剂盒，所述试剂盒包括苯丙氨酰苯丙氨酸。所述试剂盒包括苯丙氨酰苯丙氨酸和L-苯丙氨酸。
本发明还提供一种医药应用，生物标志物在制备诊断区分肺癌和肺结核、或肺癌检测或肺癌风险评估的试剂盒或者检测工具中的应用，所述生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸。进一步优选所述生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸和L-苯丙氨酸。
所述肺癌为早期肺癌，优选所述肺癌为非小细胞肺癌、小细胞肺癌。非小细胞癌选自鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。
所述肺结核为不典型肺结核（TB）。
代谢标志物能够特异性表达于癌症患者的血液中，并且代谢标志物的异常变化往往可能早于临床症状的发生和影像学表现。在当前的临床诊断中，肺癌尚无特异性标志物可作为确诊依据。
本发明旨在找到可区分肺癌（LC）与其他易误诊肺部疾病的关键生物标志物辅助临床诊断，以避免临床医生在确诊LC时受到其他因素的干扰而误诊，从而避免患者进行不必要的治疗，增加患者的医疗负担。本发明描述了在一个独立中心的肺癌（LC）、不典型肺结核（TB）患者的全面代谢组学评估，分为三个阶段收集受试者样本，即发现阶段、验证阶段和测试阶段。本实验基于UPLC-Q-TOF/MS技术的非靶向代谢组学研究初步探究了LC和TB患者样本中的小分子代谢物，通过代谢表型发现了LC和TB之间代谢模式的显著差异。在发现集中寻找并在验证集中验证，最终筛选出二者间具有显著性变化的8个代谢标志物。其中，L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸在LC和TB中趋势相反，二者均在LC中呈上升趋势，在TB中呈下降趋势。因此，我们认为这两个物质是用来鉴别LC和TB的理想生物标志物。在发现集和验证集中，苯丙氨酰苯丙氨酸的AUC曲线下面积分别为0.8887及0.8149，来对肺癌及肺结核进行区分，L-苯丙氨酸的AUC曲线下面积分别为0.8615及0.5889。通过二元逻辑回归模型，物苯丙氨酰苯丙氨酸为最优的诊断标志物。经过靶向代谢组学进行的定量分析结果表明，苯丙氨酰苯丙氨酸在肺结核患者中呈现下降趋势，变化倍数为0.78；在肺癌患者中呈现上升趋势，变化倍数为2.92。最终经SVM支持向量机模型分析该联合建模准确率为87.18%，模型预测率为77.19%，说明这种代谢生物标志物为LC和其他肺部疾病之间的区别提供了极好的预测价值。
因此，本发明的生物标志物或试剂盒能有效降低在临床中由于误诊而带来的不可逆伤害，并对肺癌患者进行提早治疗。
附图说明：
图1：样本分组图
图2 QC 样品正离子模式下的 BPI图
图3 火山分析图（a: LC vs. NC; b: TB vs. NC; c: LC vs. TB；LC：肺癌；TB，肺结核；NC：健康对照）
图4 TB、LC及NC组的多元统计分析（A: TB vs LC vs NC PCA分析;B: TB、LC、NCPLS-DA分析;C: TB vs. NC PLS-DA分析，R2X=0.157, R2Y=0.916, Q2=0.692;D: LC vs NCPLS-DA分析，R2X=0.163, R2Y=0.772, Q2=0.567;E: TB vs LC PLS-DA分析，R2X=0.138, R2Y=0.893, Q2=0.751;F-H:三组置换检验；LC：肺癌；TB，肺结核；NC：健康对照）
图5 主要涉及的代谢通路 其中a为苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成；b为苯丙氨酸代谢；c为卟啉和叶绿素代谢；d为甘油磷脂代谢
图6 生物标志物的热图分析（A、B：发现集；C、D：验证集）
图7 发现集ROC曲线结果 （A: L-苯丙氨酸，B: 苯丙酰胺苯丙氨酸）
图8 验证集ROC曲线结果（A: L-苯丙氨酸，B: 苯丙酰胺苯丙氨酸）
图9 L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸组合验证集ROC曲线
图10 测试集进样结果图（A，Phe-Phe标准品；B，血样中Phe-Phe峰；C，LB标准品；D：血样中LB峰。Phe-Phe，苯丙氨酰苯丙氨酸；LB，L-苯丙氨酸）
图11 L-苯丙氨酸（A）及苯丙氨酰苯丙氨酸(B)在各组间的含量
图12 苯丙氨酰苯丙氨酸SVM模型预测结果
图13 L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸组合的SVM模型预测结果
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
研究对象包括肺癌患者、肺结核患者及健康对照组，其中肺癌（LC）患者（n=262）、肺结核（TB）患者（n=148）、对照组（NC）(n=218)，根据医院的医疗档案确认没有恶性疾病。
纳入标准为：（1）符合肺结核、肺癌的相关诊断标准且确诊者。肺癌（LC）的诊断是通过病理活检或由专门解读放射和临床肺癌（LC）数据的临床医生确认的，并据第七版肿瘤、淋巴结和转移分类进行临床分期，均为原发性肺癌；肺结核患者痰检查结果呈阳性（痰涂片或者痰培养物），同时胸部X线或CT扫描显示肺结核证据。（2）年龄在18-80岁，性别不限；（3）意识清晰。
排除标准为：（1）其他代谢性疾病、血液病和癌症;（2）严重感染;（3）严重的心、脑血管、肝肾功能障碍。
将整体样本细分为训练队列、验证队列和测试队列，262名肺癌患者中的55名、148名肺结核患者中的30名，以及218名健康对照组中的35名被随机分配到训练队列中；剩余部分的88名肺癌患者、63名肺结核患者和63名健康对照组被随机分配到验证队列；余下的119名肺癌患者、55名肺结核患者和120名健康对照组被列入测试队列。具体分组参见附图1。
实验例2
非靶向代谢组学研究
样品处理
将冻存于-80℃冰箱的样本置于4℃冰箱中完全融化，取80μL血清样本与乙腈以1：3的体积比混合，涡旋1min后冰水浴超声10min，再在4℃以13000r/min 的转速离心15min，取200μL上清液进行代谢组学分析。训练集和验证集所得提取物用于以正模式运行的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS / MS）分析。另外，每个血清样本各吸取10μL于离心管中，混合涡旋1min，制成质量控制样品（QC）样本，质量控制样品（QC）包含了所有样品的生物学信息，可反映整体样品的状况，用于方法学考察，与样本采用相同的前处理方法。
质谱分析条件
采用电喷雾电离源（ESI 源），在正离子电离模式下进行质谱检测分析。毛细管电压2.0kV，电离源温度100℃，干燥气体流速10mL/min，去溶剂流速600L/D，去溶剂温度450℃，锥空气流速：50 L/D，四极杆扫描范围m/z 50-1000。
色谱分析条件
本实验运用 Waters ACQUITY UPLC（Waters 公司，美国）进行代谢组学研究。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm, 1.7μm, Waters 公司，米尔福德，美国)。柱温：45℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。流动相组成：A: 0.1% 甲酸水和 B: 0.1% 的甲酸乙腈。洗脱梯度为：0-0.5min，1%B；0.5-2min，1%-50%B；2-9min，50%-99%B；9-10min，99%B；10-10.5min，99%-1%B；10.5-12min，1%B。
方法学考察
仪器精密度试验：取同一QC样品溶液，连续进样6次，数据导出为峰面积，80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD <30%的特征占70%以上。
方法精密度试验：平行制备6份QC样品，连续进样分析，数据导出为峰面积，80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD <30%的特征占70%以上。
样品稳定性试验：取同一QC样品溶液，分别在整个进样过程中穿插6个时间点进样分析，数据导出为峰面积，80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD <30%的特征占70%以上。
数据分析
利用UPLC-Q-TOF/MS技术对NC组、TB组和LC组的临床血清样本进行代谢组学轮廓分析；液质采集的数据经过数据处理系统Masslynx软件（软件参数设置如下：质量数误差为0.01da；保留时间误差为0.5min），得到的每个离子强度标准化到总离子数，形成的数据包括保留时间、m/z值和峰面积。采用80%原则对液质采集数据进行修约，之后数据导入SIMCA-P14.0统计软件（Umetrics公司，瑞典）进行多元统计分析。建立无监督主成分分析（PCA）和有监督模式的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，以找出潜在的判别变量。PCA模型用于剔除离群样本，根据PLS-DA模型中代谢离子的变量投影重要性参数( Vari able importancein the projection，VIP) ＞1，同时利用T检验筛选出P<0.05的物质作为差异性小分子代谢物。利用m/z值通过HMDB(http://www.hmdb.ca/)进行检索，根据碎片信息等初步筛选出差异性小分子代谢物。
靶向代谢组学研究
样品处理
将冻存于-80℃冰箱的测试集样本置于4℃冰箱中完全融化，吸取样本5μL置于EP管中, 加入995μL甲醇, 涡旋1min, 静置5min, 以13000r/min的转速离心10min, 取上清液, 以备进样分析。取称定好的待测物混合液加入适量甲醇稀释250, 100, 50, 25, 10,5, 2.5, 1, 0.5ng/ml系列溶液作为标准品溶液。
质谱分析条件
Source Voltages (ES+3.00KV)； Source Temperature: 400 ℃；Gas Flow:700L/Hr；Cone: 50 L/Hr。两个物质的具体离子对及质谱信息见表1。
色谱分析条件
本实验运用UPLC(I-Class)-MS(XEXO TQD)进行定量分析。色谱柱选用WatersACQUITY UPLC BEH-C18（2.1*100mm, 1.7μm）。柱温为35℃，样品室温度为4℃。流动相组成为：A: 0.1%甲酸水；B: 0.1%甲酸乙腈，流速为0.3mL/min，进样量为1μL。具体洗脱梯度为：0-1min，5%B；1-2.3min，5-15%B；2.3-3min，15-100%B；3-4.5min，100%B；4.5-5min，100-5%B；5-7min，5%B。
方法学考察
每天进行随行标曲检测，确定线性，同时检测最低定量限。
实验结果
非靶向代谢组学方法学考察结果
本研究采用 QC 样品对仪器精密度、方法精密度和样品稳定性进行考察，在方法学考察合格的情况下进行分析样品的数据采集。血清样品正离子模式下的
BPI图，如附图2所示。
仪器精密度试验：取同一QC样品溶液，连续进样6次，数据导出为峰面积， 80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD <30%的占86.27%>80%，表明仪器精密度良好。
方法精密度试验：平行制备6份QC样品，连续进样分析，数据导出为峰面积，80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD <30%的占80.88%>80%，表明样品制备准确。
样品稳定性试验：取同一QC样品溶液，分别在0，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23h进样分析，数据导出为峰面积，80%修约，缺失值填充后，计算各离子特征的RSD值，RSD<30%的特征占73.88%>70%，表明在分析期间样本能保持性质稳定。
方法学验证结果证明仪器精密度，方法重复性和样品稳定性均符合代谢组学研究的要求。
代谢全局分析
首先用Origin2019通过火山图进行代谢组学全局分析，有利于描述物质的整体情况。以log2foldchange为横坐标，pvalue（取-log10）为纵坐标建立火山图，将阈值设定为1.2。每个点代表一个物质，纵坐标越大，表示pvalue越小即越显著，横坐标越靠近两侧，物质上调或下调幅度越大，结果如附图3所示。
其中火山地图分析(A: LC vs NC;B: TB vs NC;C: LC vs TB，图中灰色点表示疾病组与健康组相比没有明显变化;红点表示疾病组与健康组相比明显上调;绿色的点表示疾病组与健康组相比明显下调。
多元统计分析结果
在本实验中，针对UPLC-Q-TOF/MS采集的血清样品信息，采用多变量模式识别方法对数据进行处理，使用SIMCA-P对实验所得的复杂数据通过降维处理进行多元统计分析。首先，分别对LC组、NC组和TB组正离子模式下的数据进行无监督模式的PCA模型分析，PCA用于判断样本的分离情况以及剔除离群样本，之后通过PLS-DA确定组别间的差异代谢。如图附4所示，可以观察到LC及TB组均与对照组在散点图上呈现明显的分类聚集，说明疾病组的代谢模式与对照组有较大差异，LC和TB的患者血清中内源性代谢物均发生了显著异常变化。PLS-DA模型的效果评价标准是根据R2Y值和Q2值建立的，组别之间的显著性差异越大，则R2Y值和Q2值越趋近于1。在本研究的模型中，TB与LC组的R2X=0.138，R2Y=0.893，Q2=0.751；TB与NC组的R2X=0.157，R2Y=0.916，Q2=0.692；LC与NC组的R2X=0.163，R2Y=0.772，Q2=0.567，以上结果表明该实验建立的预测模型具有良好的拟合性，预测结果稳定可靠。在本研究中，不论是NC-TB组，NC-LC组，还是LC-TB组，均显示出当前建立的PLS-DA模型未发生过拟合现象，故该模型具有可靠性和预测性。附图4中A：TB vs LC vs NC PCA分析；B：TB vs LC vs NCPLS-DA分析；C：TB vsNC PLS-DA分析，R2X=0.157，R2Y=0.916，Q2=0.692；D：LC vs NC PLS-DA分析，R2X=0.163，R2Y=0.772，Q2=0.567；E：TB vs LC PLS-DA分析，R2X=0.138，R2Y=0.893，Q2=0.751；F-H：三组置换检验。
基于PLS-DA模型给出的结果，以VIP>1为标准筛选出符合要求且对分类TB和LC有显著贡献的代谢物。随后对这些标志物应用SPSS 14.0进行正态性检验与方差齐性检验，根据检验结果分类用近似t检验进行显著性检验，得到显著性变化（P<0.05）的与疾病相关的差异性标志物。利用差异性代谢物的m/z值，在HMDB数据库中筛选并查找比对差异性代谢物，之后根据LC-MS/MS图谱、代谢物数据库信息以及搜索汇集文献中提供的二级离子碎片信息对所发现的差异性代谢物进行鉴定确认。经过上述分析发现并经过验证集的验证，最终确定30个生物标志物，具体结果参见表2。MetPA分析结果如附图5所示，主要涉及卟啉和叶绿素代谢、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代谢等。
实验例3 生物标志物的分析
聚类分析
为了更加直观具象的观察生物标志物在不同组中的相对水平变化，我们对验证出的LC和TB共同显著变化的8个生物标志物采用分层聚类分析法—热图进行分析。如附图6所示，横轴代表样本信息，纵轴代表生物标志物，色块的颜色反映出变量值的大小，含量越高，色块颜色越深。左侧垂直轴的分叉越近，表明这些物质的相似度越高，即这些代谢产物有可能来自同种物质。从附图6中可以看出，这些代谢物在LC组中和TB组的含量有显著差异，其中L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）及苯丙氨酰苯丙氨酸（Phenylalanylphenylalanine）与健康组比较，在肺癌组中呈现明显的上升趋势，在肺结核组中呈现明显的下降趋势。在验证集中，二者均与发现集变化趋势一致。将变化趋势相反的2个代谢物L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）及苯丙氨酰苯丙氨酸（Phenylalanylphenylalanine）作为鉴别TB和LC的关键标志物来进行进一步的分析。
临床表现评价
运用graphpad软件对上述筛选物质L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）及苯丙氨酰苯丙氨酸（Phenylalanylphenylalanine）的诊断能力进行判断与验证，进行了ROC曲线分析。图中以Sensitivity（灵敏度）为纵坐标，1- Specificity（特异性）为横坐标，可直观的观察出标志物的灵敏度和特异性之间的关系；标志物的诊断效能则通过各曲线所对应的曲线下面积（Area under the curve，AUC）来判断。 LC和TB中所筛选出的2个生物标志物的代谢物信息分别用于建立ROC曲线和二元逻辑回归模型，得到每个标志物的AUC值。结果如附图7、8所示，左图可以看到Cut-off value值，作为临床分界点，该值代表可以将两组样本中大多数的患者分类诊断的情况。每个物质的AUC＞0.5，说明本实验筛选的标志物具有诊断意义。结合发现集及验证集的结果可以看出，苯丙氨酰苯丙氨酸在发现集中的AUC曲线下面积为0.8887（95% CI 0.8064- 0.9710，p<0.001），灵敏度为85.45%，特异性为84%；在验证集中的AUC曲线下面积为0.8149（95% CI 0.7419-0.8878，p<0.001），灵敏度为73.26%，特异性为78.43%，苯丙氨酰苯丙氨酸具有显著的诊断意义。L-苯丙氨酸在发现集中的AUC曲线下面积为0.8615（95% CI 0.7771-0.9459，p<0.001），灵敏度为81.48%，特异性为88%；在验证集中的AUC曲线下面积为0.5889（95% CI 0.4927-0.6851，p=0.50），灵敏度为19.77%，特异性为98.04%。综合以上数据分析，苯丙氨酰苯丙氨酸相比L-苯丙氨酸更具有显著的诊断意义，但L-苯丙氨酸同样具有诊断意义。
采用上述方法进一步验证苯丙氨酰苯丙氨酸与L-苯丙氨酸组合标志物的诊断意义，运用SPSS软件对上述筛选物质的诊断能力进行判断与验证，进行了ROC曲线分析。结果如附图9所示，验证集的结果可以看出，苯丙氨酰苯丙氨酸与L-苯丙氨酸联合的模型AUC曲线下面积为0.822>0.7，二者联合诊断具有较大意义。
实验例4 测试集分析结果：
为了更准确的分析标志物在血液中的含量及在组间的变化趋势，我们在测试阶段对294例患者进行了特异性和灵敏度更高的靶向代谢组学定量分析，受试者包括55名TB患者、119名LC患者及120名健康对照组。
标准品及血清样本进样结果如附图10所示，Phe-Phe的最低定量限LLOQ为0.5 ng/mL，L-苯丙氨酸的最低定量限为2.0 ng/mL。标准曲线分析结果见表3。标志物在各组间的含量见表3、4和图11所示。
实验例5基于机器学习对标志物深度分析
为了探究此标志物的可靠性本研究同时建立了支持向量机预测模型来判断预测的准确度。将样品分为2组：LC分为“1”组，TB分为“0”组。以每组样本中的血样含量作为支持向量机的输入变量，验证标记的准确性和特异性。将测试集中三分之二的样本作为模型的训练集，剩下的三分之一作为测试集，以确定模型的预测准确度。以苯丙氨酰苯丙氨酸为单独标志物，以及以L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的组合标志物分别验证。
以苯丙氨酰苯丙氨酸为单独标志物中，支持向量机模型参数如附图12所示，根据所建立的模型，所建模型的准确度可达87.18%，表明所建模型稳定可靠。测试集结果显示预测率达到了77.19%，表明该模型具有较高的预测精度较好的预测能力。
以L-苯丙氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸组合标志物，支持向量机模型参数如图13所示，根据所建立的模型，所建模型的准确度可达90.60%，表明所建模型稳定可靠。测试集结果显示预测率达到了82.46%，表明该模型相比单独采用苯丙氨酰苯丙氨酸为标志物，具有更高的稳定性及准确度。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (5)
1.生物标志物在制备诊断区分肺癌和肺结核、或肺癌检测或肺癌风险评估的试剂盒或者检测工具中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸。
2.生物标志物在制备诊断区分肺癌和肺结核、或肺癌检测或肺癌风险评估的试剂盒或者检测工具中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括苯丙氨酰苯丙氨酸和L-苯丙氨酸。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的应用，其特征在于，所述肺癌为肺癌早期。
4.根据权利要求1-2任意一项所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞癌、小细胞肺癌，所述非小细胞癌选自鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。
5.根据权利要求1-2任意一项所述的应用，其特征在于，所述肺结核为不典型肺结核。
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