CN109946390B

CN109946390B - 一种肺癌诊断标志物组合及应用

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Publication number: CN109946390B
Application number: CN201711382382.9A
Authority: CN
Inventors: 吴谦
Original assignee: Shanghai Institute Of Biomedical Technology
Current assignee: Shanghai Institute Of Biomedical Technology
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CN109946390A

Abstract

本发明公开了一种适合于肺癌早期筛查诊断的诊断标志物组合，包括下述14种血清(或血浆)代谢物辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3‑羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3‑羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3‑羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3‑羟基油酸(FA(18:1(OH)))中的一种或几种。采用本发明所述诊断标志物可构建诊断模型，该模型灵敏度高，特异性好，可用于肺癌的早期筛查和诊断，具有良好的临床使用和推广价值。

Description

一种肺癌诊断标志物组合及应用

技术领域

本发明涉及化学分析及临床医学领域。具体涉及一种肺癌诊断标志物，以该诊断标志物构建的诊断模型及在肺癌筛查诊断中的应用。

背景技术

肺癌是严重危害人类生命健康的重大疾病，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位。由于早期肺癌患者常无特殊症状，临床就诊的肺癌患者多数处于中晚期，其5年生存率仅为10-15％。而早期肺癌患者经手术切除后5年生存率可达70％以上，I期肺癌5年生存率更高达92％。但迄今临床尚缺乏肺癌高危人群早期筛查诊断有效可靠的方法，影像学、痰细胞学和支气管镜检查等对早期肺癌诊断均缺乏足够的特异性和敏感性。组织活检病理学诊断虽具有较高的灵敏度和特异度，但存在微小病灶准确定位困难、极具创伤性常伴发并发症等问题，使得该方法很难大规模推广应用到肺癌高危人群的早期筛查和诊断。因此，寻找特异性和敏感性高、价格便宜、无创安全易于推广的诊断方法，对肺癌高危人群进行有效的早期筛查，进而提高肺癌患者的早期诊断率，是提高肺癌患者的生存率和改善预后的关键。

肿瘤标记物检测只需取用少量血清或尿液等体液标本，具有创伤小、安全方便等优点，是目前恶性肿瘤高危人群大规模筛查的理想手段。现有肿瘤标记物如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、癌抗原-125(CA125)、胃泌素释放肽前体(ProGRP)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、组织多肽抗原(TPA)等在肺癌临床辅助诊断、疗效评估、预后判断和复发监测具有一定的判别价值，但上述标记物单独应用或联合应用时均存在灵敏度和特异度等问题，无法及时发现早期无症状的肺癌患者。因此，筛选鉴定特异性强、灵敏度高的血清代谢物诊断标志物，建立一种早期肺癌筛查诊断模型，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明克服现有技术的上述缺陷，提供了一种肺癌诊断标志物组合，及其在肺癌早期筛查诊断中的应用。

实现本发明的具体技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种适用于肺癌筛查诊断的诊断标志物组合，包括：辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(AcylcarnitineC10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))中的一种或多种的组合。当使用两种或者两种以上标志物组合作为诊断标志物时，诊断的效果会优于单一的代谢物作为诊断标志物的效果。

进一步地，上述诊断标志物可以为下述5种代谢物中的两种或两种以上的组合，辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；

或下述5种代谢物中的两种或两种以上的组合，溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；

或下述4种代谢物中的两种或两种以上的组合，3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))。

另一方面，本发明还提供了检测上述诊断标志物组合的试剂在制备用于肺癌诊断及早期筛查的体外诊断产品中的应用。

其中，所述体外诊断试剂包括特异性检测如上所述诊断标志物组合的水平的试剂。

其中，所述体外诊断产品包括检测试剂盒。

另一方面，本发明还提供了一种筛选肺癌诊断标志物的方法，包括以下步骤：

步骤1，收集肺癌患者和健康人群血清(或血浆)样本，其中肺癌患者包括肺腺癌患者和/或肺鳞癌患者。

步骤2，采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的血清(或血浆)样本进行分析，得到各血清(或血浆)样本的原始质谱数据。

步骤3，使用代谢组学处理软件(如R语言中XCMS软件包等)对原始质谱数据进行预处理，得到包含质荷比、保留时间和质谱峰强度/峰面积等代谢物信息的二维矩阵，用于下一步统计分析。

步骤4，将步骤3中得到的二维矩阵依次进行主成分分析(PCA)和正交-偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，得到多维统计分析OPLS-DA模型。

步骤5，在多维统计分析OPLS-DA模型的变量权重值(VIP)大于1及单维统计分析(如t检验)的P值小于0.05的选择标准下，得到初步差异代谢物；

步骤6，在步骤5得到的初步差异代谢物的基础上，结合初步差异代谢物的一级质谱信息、准分子离子信息、加合峰信息和同位素分布，计算差异代谢物的分子量和分子式，考察代谢物的二级质谱信息，与数据库上的比对确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认。

步骤7，对经确定的差异性代谢物进行受试者工作特征曲线(ROC)分析，选取曲线下面积(AUC)大于0.80的作为候选代谢标志物。对进一步对候选代谢标志物应用逻辑回归模型进行验证。

另一方面，本发明还提供了一种基于色谱-质谱检测数据判断肺癌诊断标志物诊断率水平的模型，首先，分别基于上述5种酰基肉碱(辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2))、5种溶血磷脂(溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5)))、和4种脂肪酸代谢物(3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH))))，根据健康对照组和肺癌组数据建立了判别健康对照组和肺癌组的模型I、模型II和模型III，回归方程如式1、式2和式3所示：

模型I

X1＝3.757-0.281*A–0.8*B+0.389*C–0.507*D+0.25*E

Prob1＝1/(1+e^-X1)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式1)

模型II

X2＝-8.663+0.413*F+0.051*G+0.115*H+0.051*I+0.764*J

Prob2＝1/(1+e^-X2)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式2)

模型III

X3＝6.334-0.388*K–1.756*L–0.839*M–0.589*N

Prob3＝1/(1+e^-X3)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式3)

其中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N分别为辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))根据上述测试方法得到的质谱检测值(采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的血清(或血浆)样本进行分析，得到血清(或血浆)样本的原始质谱检测值)，并按总峰面积为10000进行归一化处理得到的数值。Prob1、Prob2和Prob3表示判断为肺癌的概率，截点值(Cutoff)＝0.5，即当Prob1或Prob2或Prob3值大于0.5时，判断所述受试者患有肺癌。

进一步地，基于上述14种代谢物，根据健康对照组和肺癌组数据建立了判别健康对照组和肺癌组的模型IV，回归方程如式4所示：

模型IV

X4＝-3.51-1.158*A-1.676*B+1.329*C–2.407*D+3.488*E–0.224*F+0.796*G+1.159*H+0.022*I+0.367*J–0.36*K–2.211*L+1.823*M–2.649*N

Prob4＝1/(1+e^-X4)(截点值(Cutoff)＝0.5)(式4)

其中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N分别为辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))根据上述测试方法得到的质谱检测值(采用液相色谱-质谱联用代谢组学方法对采集的血清(或血浆)样本进行分析，得到血清(或血浆)样本的原始质谱检测值)，并按总峰面积为10000进行归一化处理得到的数值。Prob4表示判断为肺癌的概率，截点值(Cutoff)＝0.5，即当Prob4值大于0.5时，判断所述受试者患有肺癌。

相对于现有技术，本发明首次提出辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(AcylcarnitineC12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3--羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))这14种差异性代谢物及其组合作为肺癌诊断标记物的应用，该诊断标记物及其组合具有较高的灵敏度和特异性，可用于区分肺癌患者与健康对照，用于肺癌的诊断、筛查和早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果。

附图说明

图1.肺癌患者(▲)和健康对照(■)血清样品质谱数据的PCA得分图：(A)正离子模式；(B)负离子模式。

图2.肺癌患者(▲)和健康对照(■)血清样品质谱数据的OPLS-DA得分图：(A)正离子模式；(B)负离子模式；及模型对应的响应排序检验：(C)正离子模式；(D)负离子模式。

图3.AUC值前5位的血清酰基肉碱的箱形图及其拟合综合变量的ROC分析。

图4.AUC值前5位的血清溶血磷脂的箱形图及其拟合综合变量的ROC分析。

图5.AUC值前4位的血清脂肪酸的箱形图及其拟合综合变量的ROC分析。

图6.本发明实施例的肺癌样本的14种血清联合标志物分析预测肺癌的ROC曲线图。

图7.本发明实施例中各组合标志物在试验中判别肺癌组和健康对照组的诊断结果图。其中Prob1为采用辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(Acylcarnitine C10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)组合标志物，判别肺癌患者组和健康对照组的概率；Prob2为采用溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))组合标志物，判别肺癌患者组和健康对照组的概率；Prob3为采用3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))组合标志物，判别肺癌患者组和健康对照组的概率；Prob4为采用辛酰肉碱(Acylcarnitine C8)，癸烯酰肉碱(AcylcarnitineC10:1)，癸酰肉碱(Acylcarnitine C10)，月桂酰肉碱(Acylcarnitine C12)，肉豆蔻双烯酰肉碱(Acylcarnitine C14:2)；溶血磷脂酰乙醇胺(16:0)(LPE(16:0))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:4)(LPE(20:4))，溶血磷脂酰乙醇胺(20:3)(LPE(20:3))，溶血磷脂酰胆碱(20:3/0:0)(LPC(20:3/0:0))，溶血磷脂酰胆碱(0:0/22:5)(LPC(0:0/22:5))；3-羟基月桂烯酸(FA(12:1(OH)))，3-羟基肉豆蔻双烯酸(FA(14:2(OH)))，3-羟基亚油酸(FA(18:2(OH)))，3-羟基油酸(FA(18:1(OH)))组合标志物，判别肺癌患者组和健康对照组的概率。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域专业人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下将结合附图对本发明的实施例做具体阐释。本发明的实施例应用色谱质谱联用技术，检测血清或者血浆样本的代谢物，确定肺癌的诊断标记物。

1、研究对象

所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署了知情同意书。从肺癌样本库里筛选31例肺癌患者，及与其年龄性别比对应的25例健康志愿者的血清样本。肺癌患者按类型分包括22例肺腺癌病人和9例肺鳞癌病人，通过病理检查确诊，术前采集血清样本。由于在所建的肺癌样本库里真正的按TNM分期为I期的患者较少，因此本发明所述的早期仅仅是按肿瘤原发灶T进行分期的T1期，即对应直径≤3cm的肿瘤，但根据TNM分期分别确诊为I期至III期肺癌，其中I期，II期，III期肺癌分别为15，8，8例。

2、血清样本的LC-MS代谢组学检测

2.1仪器、材料与试剂

maXis UHR-TOF超高分辨四极杆-飞行时间质谱仪(BrukerDaltonics，Bremen，Germany)；Paradigm MDLC高效液相色谱仪(MichromBioresources，Auburn，CA，USA)，配备HTC PAL自动进样器(CTCAnalytics AG，Zingen，Switzerland)，Auto Science AT-330柱温箱(天津奥特赛恩斯仪器)；VIBRAX VXR旋涡混合器(IKA，德国)；AL204电子天平(METTLERTOLEDO)，IEC MicroCL17R微量冷冻高速离心机(Thermo Scientific，USA)。

甲酸、甲酸钠(色谱纯，CNW,Germany)；乙酸铵(LC-MS级，CNW,Germany)；甲醇、乙腈(色谱纯，Merck,Germany)；纯水由Nanopure纯化系统(Barnstead,USA)制备。内标2-氯苯丙氨酸(L-2-chlorophenylalanine)购自上海瀛正科技(Intechem.)。内标十七碳酸(Heptadecanoic acid)购自西格玛公司(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)。

2.2血清样本预处理

待测样品：配制含5μg/mL 2-氯苯丙氨酸、5μg/mL十七碳酸的甲醇/乙腈(1:1，v/v)溶液，并预冷至4℃。将血清从-80℃冰箱中取出，置于冰浴上缓慢升温，待融化后取50μL血清，加入200μL预冷含双内标的甲醇/乙腈(1:1，v/v)，涡旋2min，4℃下12000rpm离心15min。将上清移至进样瓶，4℃保存待测。

质控样本(QC)：选取所有健康对照组的血清样品，解冻后从每份样品中取50μL混合后得到混合血清样本。取50μL混合血清，同本节(2.2待测样品)所述方法处理。色谱条件优化及系统方法学验证，均采用“QC”样品，并按照上述实验血清预处理步骤进行处理。

2.3液相色谱-质谱联用仪检测

色谱条件：色谱柱，XBridge BEH C₁₈柱(2.1×150mm，3.5μm)及C₁₈保护柱(2.1×10mm，3.5μm，Waters，USA)；柱温，40℃；流速，0.2mL/min；进样体积，10μL；流动相，A为水(含0.1％甲酸，2％乙腈)，B为乙腈(含0.1％甲酸，2％水)；梯度洗脱(0.01-1min为10％B，1-6min流动相B从10％线性增加至50％，6-22min流动相B从50％线性增加至100％，22-26min为100％B，26-26.1min流动相B从100％迅速降低到10％，26.1-33min流动相B保持10％。

质谱条件：ESI源(正负离子模式)；雾化气、碰撞气为氮气；毛细管电压为4500V(ESI+)，3500V(ESI-)；EndPlate Offset，-500V；干燥气流速，6.0L/min，干燥气温度，200℃；雾化气压力，0.8bar；扫描质量范围50-1000m/z。质量校正液，1mM甲酸钠溶液，用含0.2％甲酸的异丙醇-水(50:50，v/v)溶液配制。MS/MS实验部分，采用自动MS/MS模式，碰撞电压范围为20-35eV。

3、分析结果

原始数据由micrOTOFcontrol工作站(BrukerDaltonics，Bremen，Germany)获得。使用DataAnalysis V3.3软件(BrukerDaltonics)将原始数据转换成NetCDF格式。然后使用R语言的XCMS软件包对NetCDF格式的数据进行导入预处理，预处理包括保留时间校正、峰识别、峰对齐、滤噪、重叠峰解析、填补空缺峰等预处理。最后输出由质荷比(m/z)、保留时间(RT)和质谱峰强度/峰面积组成的二维矩阵。保留时间范围0.5-26min；质量数范围50-600Da(正离子模式)和50-700Da(负离子模式)，保留时间偏差0.5min。上述二维矩阵进一步采用峰面积总和(10000)进行归一化处理。

采用无监督的主成分分析(PCA)来考察样本的总体分布情况，正离子和负离子模式下均能观察到肺癌组和健康对照组血清代谢谱有较明显的分离趋势(图1)。

然后采用有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)来区分肺癌组和健康对照组间的代谢轮廓差异；如图2所示，正离子和负离子模式下，肺癌组和健康对照组间均具有显著的代谢差异和组间分类趋势。正离子模式下模型的R2X＝0.367，R2Y＝0.878，Q2Y＝0.789；负离子模式下模型的R2X＝0.119，R2Y＝0.802，Q2Y＝0.732。

OPLS-DA分析中，首先选取变量权重值(VIP)大于1的变量，然后进一步采用student's t检验，筛选有显著性差异(p<0.05)的变量(初步差异代谢物)。通过精确质量以及同位素比例，使用DataAnalysis软件的SmartFormula功能计算得到初步差异代谢物(候选代谢物)的元素组成，然后通过在线人类代谢物数据库(http://www.hmdb.ca)和METLIN(http://metlin.scripps.edu)初步确认差异代谢物的结构式。然后考察这些代谢物的MS/MS谱图，通过二级质谱图与数据库上的比对进一步确定其结构，部分代谢物进一步采用标准品进行确认。

根据上述步骤筛选出51个在肺癌患者组与健康对照组中有明显差异的血清代谢物(表1)，包括肉碱(carnitine)及9种酰基肉碱(acylcarnitine)、22种溶血磷脂(lysophospholipid)、9种脂肪酸(fatty acid,FA)、3种类固醇(steroid)、3种胆汁酸(bileacid)以及4种其他代谢物。其中，酰基肉碱在正离子模式下有检出，大部分溶血磷脂在正负离子模式下均有检出，脂肪酸在负离子模式下有检出，类固醇和胆汁酸在负离子模式下有检出。22种溶血磷脂包括12种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和10种溶血磷脂酰胆碱(LPC)。3种胆汁酸包括甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、以及甘氨胆酸(GCA)。其他代谢物包括尿酸(Uric acid)、马尿酸(Hippuric acid)、和苯乙酰谷氨酰胺(phenylacetylglutamine，PAGN)等。

表1.肺癌患者组和健康对照组的血清差异代谢物

进一步对上述51个血清差异代谢物进行ROC分析，根据曲线下面积(AUC)的大小，确定哪些关键差异代谢物变量可以成为潜在的肺癌血清诊断标志物。单个差异代谢物的AUC值列于表1中，从每一类代谢物中选取AUC值最高的前几种代谢物进行组合，采用逻辑回归算法(logistic regression)拟合为一个综合变量(multivariable)，计算该综合变量的AUC值；如表2所示，选取AUC值最高的5种酰基肉碱(正离子模式)、5种溶血磷脂(正离子模式)以及4种脂肪酸(负离子模式)，分别进行回归拟合。为了考察这些关键差异代谢物对于早期诊断的意义，进一步统计了它们在I，II，III期肺癌血清样本中的相对浓度。

表2.AUC值最高的血清差异代谢物及其组合

根据上述筛选方法，确定的14种候选血清诊断标志物，其通用名(Common Name)分别为：Acylcarnitine C8，Acylcarnitine C10:1，Acylcarnitine C10，AcylcarnitineC12，Acylcarnitine C14:2；LPE(16:0)，LPE(20:4)，LPE(20:3)，LPC(20:3/0:0)，LPC(0:0/22:5)；FA(12:1(OH))，FA(14:2(OH))，FA(18:2(OH))，FA(18:1(OH))。其中，AcylcarnitineC8的中文译名为辛酰肉碱，Acylcarnitine C10:1的中文译名为癸烯酰肉碱，Acylcarnitine C10的中文译名为癸酰肉碱，Acylcarnitine C12的中文译名为月桂酰肉碱，Acylcarnitine C14:2的中文译名为肉豆蔻双烯酰肉碱；其中LPE的中文译名为溶血磷脂酰乙醇胺，LPC的中文译名为溶血磷脂酰胆碱；其中FA(12:1(OH))具体为3-羟基月桂烯酸，FA(14:2(OH))具体为3-羟基肉豆蔻双烯酸，FA(18:2(OH))具体为3-羟基亚油酸，FA(18:1(OH))具体为3-羟基油酸。

图3为上述5种酰基肉碱的箱型图和拟合后的ROC曲线，其AUC值为0.911(灵敏度87.1％，特异度92.0％)。图4为上述5种溶血磷脂的箱型图和拟合后的ROC曲线，其AUC值为0.924(灵敏度80.6％，特异度96.0％)。图5为上述4种脂肪酸的箱型图和拟合后的ROC曲线，其AUC值为0.965(灵敏度96.8％，特异度92.0％)。上述3类代谢物组合的综合代谢物变量ROC曲线的AUC值都大于0.9，可见其均具有较高的诊断准确性。从上述各箱型图中可以明显看出，上述14种血清代谢标志物大部分在I期肺癌血清样品中已经有了显著变化，这对于肺癌的早期诊断是非常有意义的。图6为上述14种代谢物(包括5种酰基肉碱，5种溶血磷脂和4种脂肪酸)拟合后的ROC曲线，其AUC值为0.987(灵敏度96.8％，特异度96.0％)，AUC值和特异性有进一步的提高。

同时，根据各血清代谢标志物的相对含量计算对应的回归方程式(式1-4)中，计算出概率，概率值及分布见图7。采用的截点值为0.5，即概率大于0.5则认为是阳性结果。模型I在区分肺癌患者组和健康对照组时，其正确诊断率均为83.9％(47/56)；模型II在区分肺癌患者组和健康对照组时，其正确诊断率均为85.7％(48/56)；模型III在区分肺癌患者组和健康对照组时，其正确诊断率均为91.1％(51/56)；模型IV在区分肺癌患者组和健康对照组时，其正确诊断率均为96.4％(54/56)。可见上述3类代谢物组合(模型I、模型II和模型III)在单独用于区分肺癌患者组和健康对照组时，具有较高的正确诊断率。将上述3类代谢物共14种代谢物综合用于区分肺癌患者组和健康对照组，具有更高的正确诊断率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种适用于肺癌诊断的诊断标志组合物，其特征在于，其包括溶血磷脂酰乙醇胺（16:0），溶血磷脂酰乙醇胺（20:4），溶血磷脂酰乙醇胺（20:3），溶血磷脂酰胆碱（20:3/0:0），溶血磷脂酰胆碱（0:0/22:5）的组合；或，

包括3-羟基月桂烯酸，3-羟基肉豆蔻双烯酸，3-羟基亚油酸，3-羟基油酸的组合；或，

包括辛酰肉碱，癸烯酰肉碱，癸酰肉碱，月桂酰肉碱，肉豆蔻双烯酰肉碱，溶血磷脂酰乙醇胺（16:0），溶血磷脂酰乙醇胺（20:4），溶血磷脂酰乙醇胺（20:3），溶血磷脂酰胆碱（20:3/0:0），溶血磷脂酰胆碱（0:0/22:5），3-羟基月桂烯酸，3-羟基肉豆蔻双烯酸，3-羟基亚油酸，3-羟基油酸的组合。

2.如权利要求1所述的肺癌诊断的诊断标志组合物在制备用于肺癌诊断及早期筛查的体外诊断产品中的应用。

3.检测如权利要求1所述的肺癌诊断的诊断标志组合物的试剂在制备用于肺癌诊断及早期筛查的体外诊断产品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述体外诊断产品包括特异性检测所述肺癌诊断标志物组合的水平的试剂。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述体外诊断产品包括检测试剂盒。