CN112763640B - 单增李斯特菌四种血清型差异代谢物鉴别新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及共计23个用于鉴别1/2a、1/2b、1/2c和4b四种血清型单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)的差异代谢物。本发明还涉及针对四组血清型别的Lm两两之间的多元统计分析方法，包括偏最小二乘‑判别分析(Partial Least Squares‑Discriminant Analysis,PLS‑DA)和正交偏最小二乘‑判别分析(Orthogonal Partial Least Squares‑Discriminant Anal‑ysis,OPLS‑DA),结合基于OPLS‑DA的各代谢物变量权重值(Variable Impor‑tant in Projection,VIP)对Lm进行分类判别，所述方法包括菌株培养、菌株淬灭、代谢产物提取及浓缩、代谢产物衍生化、GC‑MS检测。使用本发明对四种血清型单增李斯特菌代谢组学鉴定方法，过程操作简单、便捷，鉴别效率高，灵敏度高，重现性好，可实现对4种血清学单增李斯特菌的高效、准确的鉴别。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于鉴别4种血清型Lm的23个差异代谢物，包括4b血清型菌株与其余3种血清型菌种区分的19种差异代谢物、1/2b血清型菌株同其余3种血清型菌株区分的3种差异代谢物、1/2c血清型菌株同其余3种血清型菌株区分的1种差异代谢物。本发明还涉及菌株培养方法、淬灭方法，代谢产物的提取浓缩方法，代谢产物的衍生化方法和GC-MS方法，以及用于鉴别4种血清学Lm的两两之间的PLS-DA和OPLS-DA多元统计分析方法。
背景技术
代谢组学(metabonomics)作为继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门复杂学科，涵盖了生物学、物理学及分析化学等多领域学科知识，并作为相关领域的研究热点在近期被广泛关注。代谢组学的概念由英国Nicholson研究组提出，认为生物体在受到环境或其 他因素的扰动或刺激后，如环境条件变化或特定基因突变等，其代谢产物种类或数量也会随时间而产生变化，代谢组学被解释为通过代谢产物变化特征来研究代谢途径的一种技术。随着代谢组学的迅猛发展，该技术目前多被理解为使用现代化的仪器联用技术如LC-MS、GC-MS及CE-MS等分析机体在特定环境或处理下整体代谢产物的变化情况，并在后续处理中利用具有针对性的多元统计分析方法对机体的整体生物学功能状况进行分析。
GC-MS是开发最早的色谱联用仪器，集合了气相色谱和质谱的优点，自1957首次实现以来，得到了极大的发展。GC-MS技术有灵敏度高、分离效率高、易用、耐用、成本低、分析速度快和鉴别能力强、可同时完成待测组分的分离和鉴定等特点，是许多有机化合物常规检测的强有力工具，在环境监测、食品质检、医学检验等诸多领域中起着十分重要的作用。
DIA即独立数据采集(Data Independent Acquisition，DIA)，本发明采用GC-MS方法，对Lm的胞内总代谢产物进行MS-DIAL定性分析，可以同时获取所有前体的所有片段离子，从而增加可观测分子的覆盖范围，减少假阴性的识别。并使用PLC-DA和OPLS-DA多元统计分析方法对4种血清型Lm的两两之间的差异代谢物进行分析判别。使用本发明的四种血清型单增李斯特菌代谢组学鉴定方法，过程操作简单、便捷，鉴别效率高，灵敏度高，重现性好，可实现对4种血清学单增李斯特菌的高效、准确的鉴别。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供共计23个用于鉴别1/2a、1/2b、1/2c和4b四种血清型单增李斯特菌的差异代谢物。
本发明的第二个目的在于，提供菌株培养方法、淬灭方法，代谢产物的提取浓缩方法，代谢产物的衍生化方法和GC-MS方法。
本发明的第三个目的在于，提供用于鉴别4种血清型Lm的两两之间的PLC-DA和OPLS-DA多元统计分析方法。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
(1) 菌株培养：取冻存Lm菌种遵循无菌操作流程，在生物安全柜中打开菌种保存管，用无菌枪头扎取菌种保藏磁珠接种至5 mL脑心浸液肉汤(Brain Heart InfusionBroth,BHI)液体培养基中， 37 ℃下培养16-18 h，获得菌株稳定培养物，即菌株复苏。取复苏菌液200 μL接种至20 mL BHI液体培养基中，37 ℃下培养16-18 h，即菌株的二次活化传代培养，保证菌株处于最佳的生长状态。
(2) 菌株淬灭：取二次活化菌液5 mL，迅速加入到 15 mL淬灭试剂中(60 %甲醇预冷至-40 ℃)，快速涡旋混匀，-20 ℃条件下8000×g离心5 min，弃去上清液，残余上清液用吸水纸去除，菌体沉淀用于提取胞内代谢产物。菌株淬灭通过极环境如低温等，使菌株快速失活并抑制酶促反应，使得菌株胞内代谢产物能尽可能完整的保留下来。
(3)代谢产物提取及浓缩：向菌体沉淀加入1 mL的50 %冷甲醇(预冷至-40 ℃)重悬，再加入2 mL氯仿(预冷至-40 ℃)，涡旋30 s混匀，置于-40 ℃提取1 h，每15 min涡旋30s，提取结束后离心收集上清液至玻璃小瓶中(8000×g，5 min，-20 ℃)，并向剩余样品中继续添加1mL的50 %冷甲醇(预冷至-40 ℃)，涡旋30s混匀，离心后合并上清(8000×g，5min，-20 ℃)，向上清液中添加4倍体积的超纯水，并置于-80 ℃预冻1.5 h，使用真空冷冻干燥机在-60 ℃条件下进行冷冻干燥，冻干样品-80 ℃保存直到分析。
(4)代谢产物衍生化：向玻璃衍生小瓶中加入100 μL的20 mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡30 s，于 37 ℃肟化反应90 min。取出后加入100 μL的BSTFA(含1 % TMCS)的衍生试剂,于70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min，离心取上清(5000×g，5min)进行GC-MS的代谢组学分析。
(5)GC-MS检测：毛细管色谱柱为HP-5 ms (30m×0.25mm×0.25 μm)。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃ ，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气(纯度大于99.999%作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10℃/min的速度升至290 ℃，并维持9 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-550(m/z)。
(6)MS-DIAL的定性分析：独立数据采集(Data Independent Acquisition，DIA)方法可以同时获取所有前体的所有片段离子，从而增加可观测分子的覆盖范围，减少假阴性的识别。MS-DIAL是基于DIA模式小分子质量反卷积和定量分析，将GC-MS的原始数据(D格式)转换为分析基本 文件cdf格式以便快速检索数据，之后导入MSDIAL软件进行预处理，通过分析两个连续的数据轴，有效地发现前体离子峰，MS2Dec算法用于提取色谱中的“模型峰”，去除背景噪声，通过保留时间，精确分子质量，与公共数据库匹配相似度实现化合物的定性。MS-DIA同时也实现了非目标代谢组学所需的额外功能，如峰对齐、滤波和缺失值插值等，代谢物定性基于Fiehn数据库。
(7)多元统计分析：数据矩阵导入SIMCA软件包 (version 14.0, Umetrics, Umeå, Sweden)，先采用无监督的主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异。
(8)血清型鉴别：采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢产物。OPLS-DA分析中，结合权利要求1中的差异代谢物，使用VIP值来鉴别单增李斯特菌的血清型别。OPLS-DA分析中，通过VIP值来鉴别Lm的血清型，以OPLS-DA模型第一主成分的VIP值大于1以及t检验P值小于0.05为判定标准，4b血清型菌株分别同1/2a、1/2b、1/2c血清型菌株的OPLS-DA分析，存在的异性代谢产物共19个，这些特征代谢物主要涉及能量代谢、糖代谢、脂肪酸代谢(表1)。同理，1/2a血清型菌株同其余3种血清型菌株相比无存在的异性代谢产物； 1/2b血清型菌株分别同1/2a、1/2c及4b血清型菌株相比存在3个异性代谢产物(表2)；1/2c血清型菌株分别同1/2a、1/2b及4b血清型菌株相比存在1个异性代谢产物(表3)，根据表中各差异代谢物进行判断Lm的血清型别。
使用本发明的四种血清型单增李斯特菌代谢组学鉴定方法，过程操作简单、便捷，鉴别效率高，灵敏度高，重现性好，可实现对4种血清学单增李斯特菌的高效、准确的鉴别。
附图说明
图1 1/2a血清型与1/2b血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图2 1/2a血清型与1/2c血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图3 1/2b血清型与1/2c血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图4 1/2a血清型与4b血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图5 1/2b血清型与4b血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图6 1/2c血清型与4b血清型 Lm组间比较PLS-DA得分图
图7 1/2a血清型与1/2b血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
图8 1/2a血清型与1/2c血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
图9 1/2b血清型与1/2c血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
图10 1/2a血清型与4b血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
图11 1/2b血清型与4b血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
图12 1/2c血清型与4b血清型 Lm组间比较OPLS-DA得分图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的幅图，对本发明实施例中的技术方案进行具体的描述。
实施例中，本实施例以30株Lm食品样品分离株及11株Lm标准菌株为研究对象，对其进行代谢物的提取及浓缩处理，代谢产物的衍生化处理及GC-MS的检测方法。4种血清型单增李斯特菌的鉴别新方法的步骤如下。
一、实验试剂和仪器
(1)主要试剂：
脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion Broth,BHI)、脑心浸液琼脂(Brain HeartInfusion Broth Agar, BHIA)购自北京陆桥技术有限公司；NaCl、吡啶购自国药合计屯化学试剂有限公司；甲醇购自霍尼韦尔贸易(上海)有限公司；氯仿购自北京化工厂；甲氧胺盐酸盐购自上海提坦科技有限公司；BSTFA+1%TMCS购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
(2)主要仪器：
高压灭菌锅( GI80TW)购自致微(厦门)仪器有限公司；生化培养箱(BD 115)购自德国Binder公司；冷冻离心机(Biofuge Stratos)购自购自北京昊诺斯科技有限公司；生物安全柜(NU-425)购自美国NuAire公司；真空冷冻干燥机(2KBTES)购自美国Virtis公司；恒温水浴锅(wnb 14)购自北京天林恒泰科技有限公司；超低温冰箱(8920)购自赛默飞世尔(中国)有限公司；GC-MS联用仪(7890A-5975C)购自安捷伦科技有限公司。
二、实验步骤：
(1) 菌株培养：取待鉴别Lm菌种遵循无菌操作流程，在生物安全柜中接种至20 mLBHI液体培养基中，37 ℃下培养16-18 h。
(2) 菌株淬灭：取(1)中菌液5 mL，迅速加入到 15 mL淬灭试剂中(60 %甲醇预冷至-40 ℃)，快速涡旋混匀，-20 ℃条件下8000×g离心5 min，弃去上清液，残余上清液用吸水纸去除，菌体沉淀用于提取胞内代谢产物。
(3)代谢产物提取及浓缩：向菌体沉淀加入1 mL的50 %冷甲醇(预冷至-40 ℃)重悬，再加入2 mL氯仿(预冷至-40 ℃)，涡旋30 s混匀，置于-40 ℃提取1 h，每15 min涡旋30s，提取结束后离心收集上清液至玻璃小瓶中(8000×g，5 min，-20 ℃)，并向剩余样品中继续添加1mL的50 %冷甲醇(预冷至-40 ℃)，涡旋30s混匀，离心后合并上清(8000×g，5min，-20 ℃)，向上清液中添加4倍体积的超纯水，并置于-80 ℃预冻1.5 h，使用真空冷冻干燥机在-60 ℃条件下进行冷冻干燥，冻干样品-80 ℃保存至分析。
(4)代谢产物衍生化：向玻璃衍生小瓶中加入100 μL的20 mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡30 s，于 37 ℃肟化反应90 min。取出后加入100 μL的BSTFA(含1 % TMCS)的衍生试剂,于70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min，离心取上清(5000×g，5min)进行GC-MS的代谢组学分析。
(5)GC-MS检测：毛细管色谱柱为HP-5 ms (30m×0.25mm×0.25 μm)。仪器参数设定为：进样口温度280 ℃ ，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气(纯度大于99.999 %作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min的速度升至290 ℃，并维持9 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-550(m/z)。
(6)基于Fiehn数据库，通过搜库结果中与公共数据库匹配相似度来对待鉴别Lm菌株胞内代谢产物进行定性。
(7)对待鉴别Lm菌株分别与4种血清型中寻找到的共计23种差异代谢物差异代谢物质进行PLS-DA和OPLS-DA多元统计分析，根据PLS-DA和OPLS-DA得分图及VIP值来判断鉴别待检菌株的血清型别。
表1：
表1 4b血清型Lm同1/2a、1/2b、1/2c血清型Lm相比差异代谢物
注：VIP：变量权重值，来自OPLS-DA模型；P-value：t检验结果，p < 0.05表示显著差异；Log2(FC)：代谢物在两组样本中平均表达量的比值，正值表示上调，负值表示下调。表2、表3同此注
表2：
表2 1/2b血清型Lm同1/2a、1/2c、4b血清型Lm相比差异代谢物
表3：
表3 1/2c血清型Lm同1/2a、1/2b、4b血清型Lm相比差异代谢物
Claims (6)
1.一种基于代谢组学筛选4种单增李斯特菌血清型差异代谢物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌株培养：取冻存Lm菌种遵循无菌操作流程，在生物安全柜中用无菌枪头扎取菌种保藏磁珠接种，37℃下培养16-18h，获得菌株稳定培养物，即菌株复苏；取复苏菌液接种至BHI液体培养基中，37℃下培养16-18h，即菌株的二次活化传代培养，保证菌株处于最佳的生长状态；
(2)菌株淬灭：取二次活化菌液迅速加入到淬灭试剂中，快速涡旋混匀，-20℃条件下8000×g离心5min，弃去上清液，残余上清液用吸水纸去除，菌体沉淀用于提取胞内代谢产物；
(3)代谢产物提取及浓缩：向菌体沉淀加入50％冷甲醇重悬，再加入氯仿，涡旋混匀，置于-40℃提取，每15min涡旋30s，提取结束后离心收集上清液至玻璃小瓶中，并向剩余样品中继续添加1mL的50％冷甲醇，涡旋混匀，离心后合并上清，向上清液中添加4倍体积的超纯水，并置于-80℃预冻，使用真空冷冻干燥机在-60℃条件下进行冷冻干燥，冻干样品-80℃保存直到分析；
(4)代谢产物衍生化：向玻璃衍生小瓶中加入甲氧胺盐酸吡啶溶液，强烈震荡，于37℃肟化反应；取出后加入含1％TMCS的BSTFA衍生试剂，于70℃反应；取出样本，室温放置30min，离心取上清，进行GC-MS的代谢组学分析；
(5)GC-MS检测：毛细管色谱柱为HP-5ms；仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，纯度大于99.999％的高纯氦气作为载气，不分流进样；升温程序为：初始温度80℃，维持2min，10℃/min的速度升至290℃，并维持9min；采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-550m/z；
(6)MS-DIAL的定性分析：MS-DIAL是基于DIA模式小分子质量反卷积和定量分析，通过分析两个连续的数据轴，有效地发现前体离子峰，MS2Dec算法用于提取色谱中的“模型峰”，去除背景噪声，通过保留时间，精确分子质量，与公共数据库匹配相似度实现化合物的定性；同时也实现了非目标代谢组学所需的额外功能，所述额外功能为峰对齐、滤波和缺失值插值，代谢物定性基于Fiehn数据库；
(7)多元统计分析：先采用无监督的主成分分析来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析及正交偏最小二乘法分析来区分各组间代谢轮廓的总体差异；
(8)筛选差异代谢物：采用多维分析和单维分析相结合的办法，来筛选组间差异代谢物，所述差异代谢物如表1至表3所示；
表14b血清型Lm同1/2a、1/2b、1/2c血清型Lm相比差异代谢物
表21/2b血清型Lm同1/2a、1/2c、4b血清型Lm相比差异代谢物
表31/2c血清型Lm同1/2a、1/2b、4b血清型Lm相比差异代谢物
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中菌株淬灭中，所述淬灭试剂为60％甲醇，60％甲醇须提前预冷至-40℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(3)代谢物提取及浓缩中，50％甲醇、氯仿预冷至-40℃；离心条件为8000×g，5min，-20℃；在-60℃真空冷冻干燥机冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(4)代谢产物衍生化中，37℃肟化反应90min；70℃衍生化反应60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(6)MS-DIAL对导入数据进行峰检测，峰识别，MS2Dec反卷积，定性，峰对齐，滤波，缺失值插值一系列处理，代谢物定性基于Fiehn数据库。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(7)多元统计分析和步骤(8)筛选差异代谢物中，是4种血清型别Lm的6组两两之间比较。
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