CN105004825A - 一种基于成骨细胞细胞组织gc/ms代谢组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于成骨细胞代谢物的GC/MS代谢组学分析方法，包括：收集正常成骨细胞和过氧化氢干预后的成骨细胞样本，经过处理后气相色谱分离，并采用质谱检测分析。进行GC/MS检测分析后提取仪器原始数据，获得信噪比较低、可用于统计分析的数据，通过主成分分析以及偏最小二乘法分析数据，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些代谢物进行初步鉴定。本发明方法可以全面、综合、有效地体现正常成骨细胞和过氧化氢造模细胞的代谢产物的变异状况，为骨质疏松症的早期诊断和预后提供有利的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于成骨细胞细胞组织GC/MS代谢组学分析方法，具体涉及一种采用GC/MS全扫描模式分析法分析正常成骨细胞和过氧化氢诱导成骨细胞中代谢物的方法。
背景技术
骨质疏松症是一种严重危害人类健康甚至生命的疾病。世界卫生组织的统计表明，目前在世界常见多发疾病中，骨质疏松症的发病率已经跃居第7位，世界患者总数超过2亿人，每年治疗以及住院费用高达250亿美元。在我国，据流行病学调查报告，50-60岁人群发病率为21％，60-70岁人群发病率为58％，70-80岁人群发病率则为100％。特别是绝经后妇女，骨质疏松症和骨折病发症的发病率更高，男女比例约为1:8。骨质疏松症按其成因可以分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。其中，原发性骨质疏松症患者在骨质疏松症患者中占有较大的比例。而原发性骨质疏松症又可以分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型为女性绝经后骨质疏松症，快速的骨丢失主要为松质骨特别是脊柱和桡骨远端。Ⅱ型为老年退化性骨质疏松症，骨矿含量与基质等比例减少，骨重建处于负平衡状态。
原发性骨质疏松症以骨量减少、骨组织显微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少；皮质骨多孔、变薄)为特征，最终导致骨的脆性增高及骨折危险性增加，是一种全身性骨病。由此可见，骨质疏松症的发生是一个渐进而长期的过程，而骨折只是其最严重的后果之一。骨质疏松症以BMD(骨密度)值作为参考。但目前骨质疏松症诊断标准在制定原则和方法上尚不统一，故至今未有完善确定的骨质疏松症诊断方法。BMD值实时反映骨状况，其足够低时患者已然发生骨折，故临床上需要一种及时而有效的诊断骨质疏松症的方法。
正常骨组织主要是骨吸收和骨形成达到平衡。当骨吸收大于骨形成时，骨密度就会下降。由于骨骼仅有有限的几种方式来对不利的刺激产生反应，骨吸收可能成为骨骼对各种骨代谢和钙代谢紊乱最终的普遍反应，因此骨形成和骨吸收在骨质疏松症发病机制中起到了重要的作用。而在各种类型的骨质疏松的发病过程中都伴随着氧化应激水平的升高，故而本专利利用过氧化氢干预正常骨细胞，以造成骨质疏松症细胞模型。
代谢组学是对某一生物或细胞所有低相对分子质量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后又一系统生物学的重要组成部分。生物体是一个完整的系统，机体组织及其调控水平相互关联和相互依赖并受环境等外界因素的影响，生命活动的任何变化均可以引起生物体代谢物的变化。代谢组学通过分析生物体液和组织的代谢产物研究生化类型体系和生物整体的调控特点。其优点如下：基因以及蛋白的微小变化会在代谢物水平得到放大；代谢物种类远少于基因和蛋白质数目；检测方法采取人体液组织，是无创伤的。通过代谢组学研究可以发现生物体在各种内外环境变化后的应答情况，也可以区分同种不同个体之间的差异。
目前代谢组学研究中数据采集最常用的分析技术包括核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)，并且多种分析技术联用进行代谢组学研究已成为当今的研究趋势。气相色谱(GC)是一项成熟的分析技术，GC的高效分离结合MS的结构鉴定功能，使GC-MS具有高精密度、灵敏度及耐用性，成为代谢组学研究的重要平台之一。
本发明拟以正常成骨细胞和过氧化氢干预的成骨细胞代谢物为研究对象，采用气相质谱联用建立其代谢指纹图谱，并结合主成分分析进行模式识别，通过对比正常成骨细胞和过氧化氢干预的成骨细胞的代谢组学，将二者很好的区分开，病识图从中发现一些潜在的特征代谢标志物，以期建立一个统一标准的诊断方法，为骨质疏松症的临床诊断提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中上述缺陷，提供一种基于成骨细胞代谢 物的GC/MS代谢组学分析方法，包括：收集正常成骨细胞和过氧化氢干预后的成骨细胞样本，经过处理后气相色谱分离，并采用质谱检测分析。进行GC/MS检测分析后提取仪器原始数据，获得信噪比较低、可用于统计分析的数据，通过主成分分析以及偏最小二乘法分析数据，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些代谢物进行初步鉴定。本发明方法可以全面、综合、有效地体现正常成骨细胞和过氧化氢造模细胞的代谢产物的变异状况，为骨质疏松症的早期诊断和预后提供有利的技术支持。
本发明的解决上述技术问题的方案是：一种基于正常成骨细胞和过氧化氢诱导成骨细胞中代谢物的方法，包括：
(1)样品制备：培养正常成骨细胞并用过氧化氢干预；经处理后准备进行GC/MS检测分析；
(2)GC/MS检测分析：将细胞样本采用GC/MS检测分析；
(3)数据分析：提取仪器原始数据，获得信噪比较低、可用于统计分析的数据，通过主成分分析以及偏最小二乘法分析数据，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些代谢物进行初步鉴定。
优选的，所述步骤(1)中处理方法为：正常培养成骨细胞，以及用H2O2干预成骨细胞，吸出培养基，再用生理盐水清洗后用细胞破碎仪破碎。取破碎后液体，加入肉豆蔻酸-d27作为内标。涡旋震荡5min，冷冻离心后取上清旋转蒸发仪完全挥干。挥干后的样品加入甲氧胺吡啶，涡旋震荡后，于37℃孵育16h，加入MSTFA+TMS后涡旋震荡5min，37℃孵育1h。加入肉豆蔻甲酯作为外标后涡旋震荡5min，冷冻离心10min后取上清60ul转入进样小瓶。
优选的，步骤(2)中GC/MS检测分析的仪器分析平台为Agilent 78905975C GC/MS，分离色谱柱为J&W，121-5522，325℃，20m×180μm×0.18μm。气体流速为1ml/min。升温程序为：初始温度70℃，保持2min后，20℃/min升至300℃，保持6min。模式为恒压、不分流模式。进样量为0.5μl。
优选的，步骤(2)中质谱条件为：离子源电压和电流分别为70eV， 3.0mA。质谱数据采集范围m/z为50～550，采集频率为2.91spectra/s。溶剂延迟300s。采集模式为全扫描模式。
优选的，步骤(3)中提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据为：采用Agilent ChemStation工作站采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。
优选的，步骤(3)中建立多维统计模型具体为：采用Agilent ChemStation工作站采集总离子流图(TIC)，提取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后再EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括观察量(样本)、其代谢物和其积分面积。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P(版本12.0)中分别进行主成分分析(PCA)，偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法分析(OPLS)并且按照PLS-DA的VIP值挖掘差异代谢物质。
本发明的创新点在于样本的选择(成骨细胞)，样本的前处理以及GC/MS的升温程序和质谱条件。就样本选择来说，以往普遍选择人体样本，如血清、尿液等，鲜少有选择细胞作为代谢组学样本。而细胞是人体代谢的基本单位，监测其代谢水平的波动有重要意义。由于样本选择较为新颖，关于样本前处理的文献非常稀少。经过数次摸索，本发明最终确定了成熟的适用于细胞样本的前处理方法(能完全释又不破坏胞内代谢物，且将其代谢物衍生化为可气化物质)。本发明的第二个创新点是检测器的选择，GC/MS。以往普遍选择LC/MS，NMR等，由于GC/MS对于样本的挑剔(必须可气化)导致GC/MS的应用范围较窄。本发明经过数百次的条件摸索，成功确定了GC/MS升温程序和质谱条件，最大化检测出胞内代谢物(一千多种)。经过数据处理、NISTSerch以及离子碎片比对，成功鉴定出差异化合物。
附图说明
图1为全扫描模式下样本的总离子流图(横坐标—保留时间，纵坐标—峰强)；
图2为正常成骨细胞的TIC；
图3为过氧化氢干预的成骨细胞的TIC；
图4为两组样本的PCA得分图；
图5为两组样本的PLS-DA得分图；
图6为两组样本的OPLS得分图。
具体实施方式
下面结合实例进一步描述本发明
一、数据信息及分析内容
1.1样本基本信息
正常成骨细胞6组(control组)，过氧化氢干预24h的成骨细胞6组(disease组)，共12组。
1.2样本制备
H2O2干预成骨细胞，以及正常培养的成骨细胞，吸出培养基后用生理盐水清洗后用细胞破碎仪破碎。取破碎后液体，加入内标。涡旋震荡5min，冷冻离心后取上清旋转蒸发仪完全挥干。挥干后的样品加入甲氧胺吡啶，涡旋震荡后，于37℃孵育16h，加入MSTFA+TMS后涡旋震荡5min，37℃孵育1h。加入外标后涡旋震荡5min，冷冻离心10min后取上清60μl转入进样小瓶。
1.3GC/MS分析
本实验的仪器分析平台为Agilent 78905975C GC/MS，分离色谱柱为J&W，121-5522，325℃，20m×180um×0.18um。气体流速为1ml/min。升温程序为：初始温度70℃，保持2min后，20℃/min升至300℃，保持6min。模式为恒压、不分流模式。进样量为0.5μl。
质谱条件：离子源电压和电流分别为70eV，3.0mA。质谱数据采集范围m/z为50～550，采集频率为2.91spectra/s。溶剂延迟300s。采集模式为全扫描模式。
1.4数据分析内容
(1)提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数 据；
(2)通过建立多维统计模型可视化的显示两组之间的代谢谱差异；
(3)获得两组之间的差异性代谢物，并对这些物质进行初步鉴定。
二、数据分析结果
2.1原始色谱图检查
首先采用Agilent Chemstation工作站采集总离子流图(TIC)进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，直观地判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，即稳定性和重复性的考察，如图1所示。
从图一中多样本重叠的谱图效果看，仪器的状态良好，并且得到的谱峰数据比较可靠，可以进一步多元统计分析。在此我们也从各组样本中随机抽取一个样本的TIC图罗列，如图2、图3。
2.2数据处理
采用Agilent ChemStation工作站采集总离子流图(TIC)，提取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后再EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括观察量(样本)、其代谢物和其积分面积。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P(版本12.0)中分别进行主成分分析(PCA)，偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法分析(OPLS)并且按照PLS-DA的VIP值挖掘差异代谢物质。
2.3两组样本整体分析
对样本进行主成分分析能从总体上反应各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。在Simca-P软件中，数据均采用默认的UV格式化(Unit Variance Scaling)和平均中心化(Mean-Centered)处理，一伙的更加可靠且更加直观的结果。软件进行自动化模型拟合分析，获得能得到最可靠数学模型的主成分数目。
2.3.1主成分分析(PCA)
主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。对两组样本进行GC/MS分析后得到的数据进行PCA分析，共获得2个主成分(PC)， R2X＝0.526。一般来说，R2X值大于0.4就表示该模型可靠，因此本项目建立的模型可以应用于可视化观察2组之间的代谢谱图差异。PCA得分图(Scores Plot)如图4，模式下PCA得分图均可以看出大部分样本都在95％的置信区间，并且control组处于左方，disease组处于右方。
2.3.2正交最小二乘分析(OPLS)
进一步采用有监督模式方法OPLS进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率，一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。结果得到1个主成分和1个正交成分，R2Y＝0.975，Q2＝0.86，其得分图如图6所示。
通过OPLS分析，得分图的效果上看，两组样本能够很好的分离，并且control组的样本处于主成分1(PC1)的左侧，而disease组样本处于主成分1(PC1)的右侧，
2.3.3最小二乘判别分析(PLS-DA)
通过主成分分析后，经过评估，同时为了确保数据的原始性，本模型不需要剔除任何样本，所以进一步采用有监督模式方法PLS-DA进行建模分析，模型的参数R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测率。一般来说此参数大于0.4即表明此模型可靠。结果得到3个主成分，R2Y＝0.995，Q2＝0.925，PLS-DA得分图如图5所示。下一节我们将根据此模型的Variable Importance List所给出的值，结合t-test寻找两组之间的显著差异具有重要贡献的变量(代谢物)，并对这些变量进行定性。
2.3.4两种之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定
本项目采用PLS-DA模型的VIP(Variance Importance in the Projection)值(阈值大于1)并结合t检验(t-test)的p值(阈值0.05)。差异性代谢物的定性方法为：比对NISTMS Search 2.0数据库进行鉴定(比较质谱的碎片离子的质荷比m/z)。差异性代谢物数据如表1所示。
表1.Disease组与Control组的差异性代谢物
| 9.945 | 甘氨酸 | 1.70227 | 0.00000026 | -1.565038 |
| 9.945 | 苯二酚 | 1.43407 | 0.00131286 | -0.832484 |
| 11.513 | 丙氨酸 | 1.36874 | 0.00388140 | -1.899833 |
| 11.896 | 3-氨基-2-甲基-丙酸 | 1.06409 | 0.03996086 | -3.758316 |
| 12.726 | 5-羟基乙酸 | 1.19245 | 0.02654768 | -1.012329 |
| 13.069 | 2,3,4-三羟基丁酸 | 1.29392 | 0.00668394 | -0.966794 |
| 13.149 | 肌酸苷 | 1.30829 | 0.00583317 | -1.104632 |
| 15.232 | 核糖醇 | 1.29049 | 0.00748466 | -0.739018 |
| 15.301 | 1-丙烯-1,2,3-三羧酸 | 1.42896 | 0.00144749 | -1.488252 |
| 16.405 | 3-羟基苯基丙酸 | 1.3268 | 0.00493476 | -1.382015 |
| 16.399 | 阿洛酮糖 | 1.06089 | 0.04900299 | 1.695350 |
| 16.399 | 木糖 | 1.56765 | 0.00010559 | 2.647051 |
| 17.08 | 甘露糖酸 | 1.13672 | 0.02671107 | 0.594165 |
| 17.08 | 果糖 | 1.1367 | 0.02671490 | 0.594181 |
| 17.08 | 呋喃阿洛糖 | 1.1367 | 0.02671490 | 0.594181 |
| 17.08 | 葡萄糖 | 1.65336 | 0.00000746 | 0.345784 |
| 17.08 | 赖氨酸 | 1.65336 | 0.00000746 | 0.345784 |
| 17.08 | 甘露糖酸 | 1.65336 | 0.00000746 | 0.345784 |
| 17.263 | 甘露醇 | 1.49404 | 0.00052822 | 0.231303 |
| 17.481 | 葡萄糖酸 | 1.17642 | 0.01983862 | -1.335457 |
| 18.202 | 棕榈酸 | 1.24456 | 0.01267718 | -0.247808 |
| 18.27 | 半乳糖二酸 | 1.4793 | 0.00063446 | -3.835521 |
| 18.86 | 肌醇 | 1.21099 | 0.01714691 | -0.219813 |
| 19.031 | 尿酸 | 1.67371 | 0.00000239 | -0.803191 |
| 19.106 | 十七烷酸 | 1.25243 | 0.01124271 | -0.246426 |
| 19.3 | 甘露糖酸 | 1.65408 | 0.00000540 | -0.807298 |
| 20.004 | 硬脂酸 | 1.21933 | 0.01555642 | -0.239150 |
| 20.611 | 5-甲基脲苷 | 1.69613 | 0.00000062 | -0.941899 |
| 20.948 | 脲苷 | 1.25405 | 0.00936237 | -3.425683 |
| 22.155 | 羟基脯氨酸二肽 | 1.68946 | 0.00000107 | -0.925479 |
| 24.032 | 甘露二糖 | 1.03862 | 0.04731274 | 1.244924 |
| 24.461 | 麦芽糖 | 1.16497 | 0.02018617 | -0.694829 |
| 27.528 | 半乳糖苷 | 1.4567 | 0.00119705 | -0.254726 |
| 30.452 | 胆固醇 | 1.54806 | 0.00017890 | -0.365447 |
*disease组与control组均值之比的对数值(以2为底)，正号表示disease组相对于control组上升，符号表示下降。
三、分析结果讨论
本发明采用GC/MS仪器对成骨细胞代谢物进行代谢组学全谱分析。采用所 有样本中这些物质的峰的响应强度数据进行PCA分析。PCA成功地对所有组样本进行建模，control、disease两组存在差异。
在此基础上，我们对各组样本进行有监督模式统计分析，包括PLS-DA及OPLS，采用PLS-DA的VIP值并结合t检验获得差异性表达代谢物。差异性代谢物及其变化关系初步显示，其差异性代谢产物主要归属小分子有机酸、氨基酸类、糖类以及醇类等物质。实际应用中可以根据这些代谢物的生化途径归属并结合已有的基因和蛋白质知识结构建立代谢网络。也可以根据说明书附图提供的原始数据绘图，说明书附图也提供了分析报告中的所有图片的原始文件。实际应用中可以根据需要进行后期总结、加工。总之，基因GC/MS的样本的代谢组学的PCA和差异性代谢物及其相对定量(变化)信息将为从代谢通路及其变化关系的角度阐明生物学变化提供强有力的数据支撑。
本发明说明书未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于成骨细胞细胞组织GC/MS代谢组学分析方法，其特征在于，包括：
（1）样品制备：培养正常成骨细胞并用过氧化氢干预，经处理后准备进行GC/MS检测分析；
（2）GC/MS检测分析：将细胞样本经过衍生化处理后采用GC/MS检测分析；
（3）数据分析：提取仪器原始数据，获得信噪比较低、可用于统计分析的数据，通过主成分分析以及偏最小二乘法分析数据，获得两组之间的差异性代谢物，并对这些代谢物进行初步鉴定。
2.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中处理方法为：正常培养成骨细胞，以及用H2O2干预成骨细胞，吸出培养基，用生理盐水清洗后用细胞破碎仪破碎；取破碎后液体，加入肉豆蔻酸-d27作为内标；涡旋震荡5min，冷冻离心后取上清旋转蒸发仪完全挥干；挥干后的样品加入甲氧胺吡啶，涡旋震荡后，于37℃孵育16h，加入MSTFA+TMS后涡旋震荡5min，37℃孵育1h；加入肉豆蔻甲酯作为外标后涡旋震荡5min，冷冻离心10min后取上清60ul转入进样小瓶。
3.根据权利要求2所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中冷冻离心条件为20000rpm，4℃，10min。
4.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（2）中GC/MS检测分析的仪器分析平台为Agilent 7890 5975C GC/MS，分离色谱柱为J&W，121-5522，325℃，20mí180μmí0.18μm，气体流速为1ml/min；升温程序为：初始温度70℃，保持2min后，20℃/min升至300℃，保持6min；模式为恒压、不分流模式，进样量为0.5μl。
5.根据权利要求1或4所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（2）中质谱条件为：离子源电压和电流分别为70eV，3.0mA。
6.质谱数据采集范围m/z为50~550，采集频率为2.91spectra/s，溶剂延迟300s，采集模式为全扫描模式。
7.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取并对齐仪器原始数据，获得无噪音干扰、可用于统计分析的数据为：采用Agilent ChemStation 工作站采集总离子流图（TIC）进行可视化检查，通过多个样本图谱的重叠，判断仪器在分析样本时是否符合代谢组学分析要求，进行稳定性和重复性的考察。
8.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取原始数据信号后进行解卷积分析，定性代谢物并进行积分，最后再EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括观察量（样本）、其代谢物和其积分面积；将编辑后的数据矩阵导入Simca-P(版本12.0)中分别进行主成分分析(PCA)，偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，正交偏最小二乘法分析（OPLS）并且按照PLS-DA的VIP值挖掘差异代谢物质。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |