CN102100706A - 一种应用代谢组学对中成药质量评价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种应用代谢组学对中成药质量评价的方法。该方法包括以下步骤：1)根据中药的适应证，建立相应的动物模型并进行筛选；2)取中药各样品，并采用相应的给药途径对疾病模型动物进行干预；3)收集相应的生物样本，获取其代谢指纹图谱；4)对正常组和疾病模型组的代谢指纹进行模式识别，获取代谢标志物组；5)计算代谢标志物组在不同给药组中与正常组的相似度，或对差异性内源代谢物做PLS回归分析，考察药物治疗对内源性代谢的影响；6)根据相似度计算结果或PLS回归分析结果，评价各药物的优劣，越趋近于正常对照组说明其疗效越好。

Description

一种应用代谢组学对中成药质量评价的方法

技术领域

本发明属中药质量控制和评价方法，特别是采用生物指纹控制和评价中药质量，主要采用代谢组学相关技术和策略进行研究。

背景技术

中医药是中华民族的瑰宝，被称为中国古代的第五大发明。中药以其丰富的资源、独特的疗效、毒副作用少等特点，已引起世界各国的普遍关注。当今世界，随着“回归自然”思潮的兴起，寻找天然药物的呼声目渐高涨，面对医疗模式的转变，面对传统医药国际市场的竞争，面对加入WTO后知识产权的保护，中药的发展面临着良好的机遇和严峻的挑战。中药质量控制与保障是中药现代化、产业化及国际化的核心问题，中药的质量不可控、安全不可靠一直是其走向世界的“瓶颈”。与国际制药大国水平相比，我国绝大多数中药产品的生产工艺仍十分落后，对制药过程参数缺乏合理控制，不同厂家的同一产品或同一厂家不同批次的产品存在较大差异，这种状况已直接成为我国绝大部分中药迄今未能走出国门的一个重要原因。为保证中药产品的安全性、有效性和稳定均一性，当前急需发展先进的中药质量分析检测技术，完善中药材、提取物、中成药质量标准，建立符合中医药特点的现代质量控制体系，攻克中药质量分析与评价难题。

现行中药质量控制的基本模式是参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式建立的，化学定性鉴别与指标成分检测是其主要内容。对于中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，检测任何一种活性成分均不能体现其整体疗效，这是中药与化学药品质量标准的根本区别。目前这种质控模式既难以有效地监控中药质量，也不能评价中药质量，更难以反映其安全性和有效性。如冬虫夏草测定腺苷含量、板蓝根检测精氨酸的存在，而腺苷和精氨酸既不是其主要有效成分，也不是其专属性成分，检测它们对其中药质量控制几乎没有实际意义。即使是检测有效成分，往往量效关系不明显，也难以实现对其中药质量进行有效的控制和评价。另外一个主流的质量控制方法：考虑到中药的多成分和整体作用，应用化学指纹图谱的方法，控制中药直接提取物中的尽量多的成分。对于中药而言，其疗效既不是单一活性成分的作用，也不是多种成分活性的简单相加，而是多个功能组分的整体表现，是多成分、多靶点协同作用的结果。中药化学指纹图谱虽然考虑了尽可能多的成分，对保证产品质量一致性和稳定性具有一定的促进作用，但同样难以反映其安全性和有效性，成分与药效之间的关联性在现阶段还没有得到有效的表达。另外，中药化学指纹图谱只是中药部分成分的“化学条形码”，不能对所有成分进行全面控制，有相当一部分药物成分难以用常规的色谱或光谱方法检识，化学指纹图谱的重复性、专属性和代表性等尚需深入研究。

因此，现有的中药质量控制模式虽然为保障中药及其产品的有效、安全和质量的稳定可控发挥了重要的作用，但还不足以说明中药的整体作用和作用的多成分、多靶点协同特点。有必要重新审视和明确中药质量控制和评价的目标与策略、模式与方法，有必要建立一套既能保证“稳定可控”，又能直接关切“安全有效”的新型中药质量控制管理方法体系。

中药生物指纹图谱学是从分子水平上研究中药作用的本质特征，研究化学成分和药理作用、药效活性的相关性。代谢组学作为一门新发展的技术，它是通过考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一种技术。代谢组是基因-蛋白-代谢产物这样一个生命活动链的终点集合体，所反应的就是疾病、中药对生命体作用所产生效应的最终结果和表现，这与中医中药的哲学思想十分吻合。任何外源物质、病理生理变化或遗传变异的作用都会反映到各种生物学途径上，对内源代谢物质的稳态平衡产生干扰，从而使内源代谢物中的各种物质的浓度和比例发生变化。因此，应用代谢组学方法可从整体上对中药的毒性、疗效和作用机理进行评价，也可用于中药的质量控制。

发明内容

本发明提供了一种采用代谢指纹图谱控制和评价中成药质量的方法，该方法主要包括以下步骤：

1)根据中药的主要适应证，筛选建立相应的动物(细胞)模型；

2)根据中药的传统用药方法制备各样品，并采用相应的给药途径对动物(细胞)模型进行干预；

3)收集相应的生物样本，获取其代谢指纹图谱；

4)对正常组和模型组的代谢指纹进行模式识别，获取差异性内源代谢物(代谢标志物组)；

5)计算代谢标志物组在不同给药组中与正常组的相似度，或对差异性内源代谢物做PLS回归分析，考察药物治疗对内源性代谢的影响；

6)根据相似度计算结果或PLS分析结果，评价各样品的优劣。

合理的动物模型是中药药效和质量评价研究中的核心问题，这也是采用代谢组学技术控制中药质量的基础。因此首先要选择更符合中医理论的动物模型。“辨证”是中医理论的灵魂，离开了辩证，中医的实质性东西也就荡然无存了。对中医“证”的现代研究早有探索，到目前为止，已经取得了不少成果，但中医证候模型造模方法以及证候模型指标，与中医证型的吻合性以及其临床实用价值，距离中医理论尚有不小的距离。代谢组学作为一种系统方法，能在鉴别和确证药理和疾病模型上发挥重要作用。成功的疾病治疗必须使代谢网络中紊乱的部分恢复正常。基于以上认识，首先采用药物反证法，根据中药的适应证，从代谢组学角度筛选合适的疾病动物模型。在此基础上，找出代谢相关的病变标志物，进一步考察中药对模型动物作用后代谢标志物组的变化，利用其与正常动物的比较通过相似度计算或PLS分析来评价中药质量。

本发明中各中药样品的制备方法需与传统的用药方式相一致，动物用药剂量根据人的标准剂量进行换算，并采用传统的给药途径对动物模型进行干预。

本发明中的生物样本主要包括血、尿、组织等样本。代谢指纹图谱的获取可采用液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用、核磁共振波谱等相关分离分析技术。

本发明中差异性内源代谢生物标志物的获取是通过对正常组和疾病动物模型组的代谢指纹进行模式识别，可采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法(PLS-DA)等方法。差异性内源代谢生物标志物的获取方法包括a：对检测到的内源化合物进行t检验，选取所有p＜0.001的化合物作为差异性内源代谢物；或b：计算Fisher权重，优先选取权重大的变量(fisher值＞1)作为差异性内源代谢物；或c：在PCA或PLS分析对分类贡献最大的一组变量作为差异性内源代谢物。

本发明以相似度计算或PLS分析结果作为质量评价的依据。由于治疗的目的是使疾病动物恢复到正常状态，所以，相似度是以正常组中的代谢标志物组的含量作为基准进行计算的，不同给药的疾病动物模型组与正常组的相似度计算可采用相关系数、相合系数(Congruence Coefficient)等。

根据相似度计算的结果，评价各中药药品的质量，相似度越高，说明疾病动物经过中药的作用越接近于正常动物，表示中药的质量越好。根据相似度计算结果，可规定一个范围作为质量标准。PLS分析以正常组作为0(或1)，模型组作为1(或0)，根据计算所得各给药组的回归结果，评价各中药药品的质量，越接近正常组质量越好，也可规定一个范围作为质量标准。

本发明具有如下优点：该方法采用生物指纹控制和评价中药的质量，因其直接与中药的药效相关联，故既能保证其内在质量的稳定可控，又确保了中药的安全有效，与传统的化学指纹或含量测定的方法相比，更具科学性和合理性。

附图说明

图1肾上腺皮质激素型肾阴虚模型各组样本的PCA得分图；

图2甲状腺素肾阴虚模型各组样本的PCA得分图；

图3热性中药型肾阴虚模型各组样本的代谢组学分析PCA得分图；

图4正常组和模型组的代谢组学分析PCA得分图；

图5正常组和模型组的代谢组学分析PCA载荷图。

具体实施方式

实施例六味地黄丸的质量控制和评价方法

1.肾阴虚动物模型的筛选

六味地黄丸由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓六味中药组成，为滋阴补肾的经典名方。因此我们首先要建立和优化更符合中医理论的肾阴虚动物模型。目前最常用的肾阴虚动物模型有甲状腺素型肾阴虚模型、肾上腺皮质激素型肾阴虚模型、热性中药型肾阴虚模型三种。

成功的疾病治疗必须使代谢网络中的缺陷部分正常化，同时又不得干扰其它维持健康所必须的代谢途径的调控。六味地黄丸历经上千年的临床验证，滋补肾阴疗效显著，被誉为补肾阴之祖，中医治疗肾阴虚证首选六味地黄丸而疗效显著，反之，运用六味地黄丸取得良好临床疗效的就是肾阴虚证，这已经在行内获共识。因此可以首先采用经典药物反证法，用代谢组学方法筛选和评价动物模型。

以对六味地黄丸纠正肾阴虚模型指标的观察，来判断哪种肾阴虚模型更符合临床实际，具体的讲就是通过代谢组学考察各种肾阴虚动物模型中的生物标志物，通过六味地黄丸对生物标志物的调控来综合评价动物模型与肾阴虚证候的符合程度，再利用优化了的肾阴虚动物模型反过来去指导和评价各品牌六味地黄丸的质量优劣。

1)肾上腺皮质激素型肾阴虚模型  造模方法：取SD大鼠，体重200±10g，随机分成3组(正常组、模型组、六味地黄丸给药组)。正常组每天上午按1.5mg/100g体重腹腔注射给予生理盐水(NS)，下午按2ml/100g体重灌胃给纯水，共4天。模型组每天上午按1.5mg/100 g体重腹腔注射给予氢化可的松，容量为1ml/100g；每天下午按2ml/100 g灌胃给纯水，共4天。六味地黄丸给药组每天上午按1.5mg/100g体重腹腔注射给予氢化可的松，容量为1ml/100g，每天下午灌服六味地黄丸溶液1.3g/100g，容量为2ml/100g，共4天。收集各组尿样，待测。

2)甲状腺素肾阴虚模型造模方法：取SD大鼠，体重200±10g，随机分成3组(正常组、模型组、六味地黄丸给药组)。正常组每天上午按1ml/100g体重每只灌胃给纯水，每天下午按1ml/100g体重每只灌胃给纯水，共21天。甲状腺片造模组每天上午按甲状腺片1.25mg/100g体重灌胃给药，容量为1ml/100g，每天下午按1ml/100g体重每只灌胃给纯水，共21天。六味地黄丸给药组每天上午按甲状腺片1.25mg/100g灌胃给药，容量为1ml/100g，每天下午灌胃给予六味地黄丸1.3g/100g体重，容量为1ml/100g，共21天。收集各组尿样，待测。

3)热性中药型肾阴虚模型  造模方法：取SD大鼠，体重200±10g，随机分成3组(正常组、模型组、六味地黄丸给药组)。正常组每天上午按2ml每只灌胃给纯水，每天下午按2ml每只灌胃给纯水，共28天。模型组每天上午按10g/kg灌胃给予附子、干姜、肉桂按1∶1∶1的比例水煎液，每天下午按2ml每只灌胃给纯水，共28天。六味地黄丸给药组每天上午按10g/kg灌胃给予附子、干姜、肉桂按1∶1∶1的比例水煎液，容量为1ml/100g，每天下午灌胃给予六味地黄丸1.3g/100g体重，容量为1ml/100g，共28天。收集各组尿样，待测。

尿样采用超快液相色谱-高分辨飞行时间质谱进行测定获取其代谢指纹图谱，各肾阴虚模型的样品采用SIMCA-P软件进行PCA分析，各组样本的得分图见图1～3。虽然氢考肾阴虚模型与阴虚证临床表现有部分相同之处，并有人将肾上腺皮质激素造模法作为肾阴虚证造模的常用方法之一，应用于中医药的开发研究，但由于肾阴虚一般是慢性长期的虚损性疾病，其阴虚证候的形成是多因素、长时间作用的结果，而氢考肾阴虚模型的造模时间较短，是一种急性损伤，氢考肾阴虚模型与肾阴虚临床辨证相去较远，从代谢组学的角度来看，其生物标志物基本未得到修复，该模型不适合于肾阴虚的研究。

甲亢肾阴虚模型与肾阴虚证候具有一定的符合度，由于甲亢肾阴虚模型造模时间较长，符合中医肾阴虚证属慢性虚损性证候的特征，并且出现的烦躁等症状能够被六味地黄丸快速纠正。因此，从实验结果中动物的一般情况看，甲亢肾阴虚模型较符合肾阴虚的临床实际，代谢组学的研究结果也证实了这一点。

采用热性中药给药后获取的肾阴虚模型，由于造模时间较长，采用中药造模条件又相对温和，六味地黄丸干预后能够修复绝大多数指标，从PCA结果来看，六味地黄丸给药组几乎接近于正常组，该模型在这三个模型中为最佳。因此，选取热性中药型肾阴虚模型作为质量控制和评价用动物模型。

2.样品的制备和给药

取市售的3个厂家(A、B、C)的六味地黄丸(浓缩丸)做为质量评价用样品。六味地黄丸(浓缩丸)为口服使用，故动物实验中样品的制备采用以下方法：将六味地黄丸粉碎，加水混悬制成相当于原生药1.3g/1ml。造模方法：取SD大鼠，体重200±10g，随机分成5组(正常组、模型组、A厂家六味地黄丸给药组、B厂家六味地黄丸给药组、C厂家六味地黄丸给药组)。正常组每天上午按2ml每只灌胃给纯水，每天下午按2ml每只灌胃给纯水，共28天。模型组每天上午按10g/kg灌胃给予附子、干姜、肉桂按1∶1∶1的比例水煎液，每天下午按2ml每只灌胃给纯水，共28天。各六味地黄丸给药组每天上午按10g/kg灌胃给予附子、干姜、肉桂按1∶1∶1的比例水煎液，容量为1ml/100g，每天下午灌胃给予六味地黄丸1.3g/100g体重，容量为1ml/100g，共28天。收集各组尿样，待测。

3.代谢指纹图谱的获取

将以上各组尿样用去离子水稀释3倍，0.45μm微孔滤膜过滤后作为分析样品，采用超快液相色谱-高分辨飞行时间质谱进行测定。仪器及条件：Shimadzu FPLC-ESI-IT-TOF液相色谱一质谱联用仪及工作站；色谱柱为C18柱(5μm，2.1mm×150mm)；流动相为二元梯度系统，其中溶剂A为水，溶剂B为乙腈，梯度洗脱程序为0～30min，2％B～40％B；自动进样2μL。质谱条件：ESI离子源；扫描范围m/z100～800；接口电压4.5kV；IT真空1.2×10^-2Pa，TOF真空1.2×10^-4Pa；仪器温度40℃；雾化气N₂流速1.5L/min；干燥气N₂压力0.2MPa；CDL和加热块温度200℃；阳极电压4.5kV；阴极电压-3.5kV；离子累积时间20msec。

4.差异性内源代谢物的获取

通过对比疾病模型组和正常对照组的代谢谱，结合多种数据分析方法获得差异性内源代谢物。可有以下3种方法：

1)将3选取模型组和正常对照组间存在显著性差异的代谢物(t检验结果p＜0.001)作为差异性内源代谢物，共37个。37个化合物分别标记为M208T747，M245T68，M207T803，M206T804，M131T803，M301T842，M389T833，M382T372，M254T164，M151T453，M144T256，M226T453，M189T35，M257T925，M207T486，M237T1053，M336T842，M319T181，M364T1074，M256T928，M243T864，M206T485，M255T929，M360T581，M363T1075，M146T753，M195T226，M181T389，M188T530，M248T624，M231T183，M304T93，M142T181，M281T873，M224T480，M302T734，M274T1062。

2)将3计算各化合物的Fisher权重，优先选取权重大的变量作为差异性内源代谢物。权重最大的37个化合物标记为M208T747，M245T68，M207T803，M206T804，M131T803，M301T842，M389T833，M382T372，M254T164，M151T453，M144T256，M226T453，M189T35，M257T925，M207T486，M237T1053，M336T842，M319T181，M364T1074，M256T928，M243T864，M206T485，M255T929，M360T581，M146T753，M195T226，M231T183，M304T93，M281T873，M224T480，M248T1139，M255T1067，M240T94，M167T220，M256T1072，M302T734，M248T624。

3)将3正常组和模型组代谢组数据做PCA(也可用PLS-DA)分析，得分图见图4，在Loading plot中选取对分类最大贡献的一组变量作为差异性内源代谢物，见图5。37个化合物分别标记为M208T747，M245T68，M207T803，M206T804，M131T803，M301T842，M389T833，M382T372，M254T164，M151T453，M144T256，M226T453，M189T35，M257T925，M207T486，M237T1053，M336T842，M319T181，M364T1074，M256T928，M243T864，M206T485，M255T929，M360T581，M363T1075，M146T753，M195T226，M181T389，M248T624，M231T183，M304T93，M142T181，M281T873，M224T480，M302T734，M248T1139，M449T803。

三种方法由于计算方法不同，得出的差异性内源代谢物略有差异，其中1)、2)基本一致，3)存在较大差异(考虑了峰强度等其他因素的影响)，但其标志物的变化影响趋于一致，均可使用。

5.基于差异性内源代谢物计算相似度

1)相似度计算

以正常组中选取的生物标志物均值作为基准，计算各给药组中生物标志物与正常组的相似度，基于相合系数方法的计算结果如表1；基于相关系数方法的计算结果如表2。

表1  以相合系数计算的相似度结果

分组	相合系数计算结果	X±SD
			厂家A厂家B厂家C模型组	0.95 0.94 0.94 0.96 0.960.91 0.92 0.96 0.95 0.960.89 0.80 0.90 0.92 0.910.81 0.85 0.85 0.85 0.86	0.95±0.010.94±0.020.89±0.050.84±0.02

表2  以相关系数计算的相似度结果

分组	相关系数计算结果	X±SD
			厂家A厂家B厂家C模型组	0.91 0.86 0.89 0.92 0.920.83 0.83 0.92 0.89 0.910.79 0.64 0.81 0.84 0.830.67 0.74 0.73 0.74 0.75	0.90±0.020.87±0.040.78±0.080.73±0.03

2)以差异性内源代谢物做变量，采用模型组和正常对照组样品进行PLS分析建模，通过建立的模型对各组的代谢组学分析结果进行回归分析，结果见表3。

表3  PLS分析结果

分组	PLS回归结果	X±SD
			正常组厂家A厂家B厂家C模型组	-0.08 0.10  -0.03 0.03  0.010.02  0.16  0.14  -0.08 0.11-0.29 -0.25 0.01  -0.11 -0.060.72  0.86  0.93  0.82  0.860.89  1.00  1.04  1.00  1.03	0.00±0.070.07±0.10-0.14±0.130.84±0.081.00±0.06

6.根据相似度结果或PLS分析结果，评价各药物的优劣

从相似度计算结果或PLS分析结果可以看出，模型组与正常组中代谢标志物组含量差异较大，服用了六味地黄丸后，疾病组的代谢指纹向着正常组移动，表明在六味地黄丸的干预下，疾病动物从疾病状态向着正常状态调节，体现了各厂家的六味地黄丸均具有治疗作用。计算结果越接近于正常组，表明治疗效果越好，该产品的质量也就越佳。因此，三种计算方法均可得出一致的结论：3个厂家六味地黄丸的质量优劣依次为厂家A优于厂家B优于厂家C。与相似度比较，PLS分析可以给出更为显著的差异。

Claims (6)

1.一种应用代谢组学对中成药质量评价的方法，其特征是：采用代谢组学分析方法，通过对疾病相关生物标志物组在不同给药组群间的变化来评价中药的质量。

2.如权利要求1所述的中成药质量评价的方法，其特征是：包含以下步骤：

1)

A.根据已知中成药的主要适应证，以正常动物或细胞作为正常组，以带有相应适应证的动物或细胞作为模型组，以带有相应适应证的动物或细胞给药作为治疗组，治疗组按中成药的有效剂量和相应的给药途径给药；

根据形成适应证的不同原因，确定模型组和治疗组的个数，并按所形成适应证的不同原因分类；

B.收集各组中动物或细胞的血浆、尿液或细胞组织，对其成份进行分析，获取其代谢指纹图谱；采用模式识别技术比较治疗组与正常组和模型组代谢指纹图谱的相似性；

C.以治疗组接近正常组或远离模型组的程度，确认已知中成药对于治疗组中的动物或细胞是否有效，并确定其所形成适应证原因的分类；选定有效类别治疗组的动物或细胞模型，备用；

2)

A.取待测的中成药样品，并采用相应的给药途径对上述步骤1)C中选定的动物或细胞模型进行给药治疗，测试组；

B.收集给药治疗动物或细胞的血浆、尿液或细胞组织，对其成份进行分析，获取测试组代谢指纹图谱；

3)

A.对步骤1)中的正常组和选定的模型的代谢指纹图谱进行模式识别，获取差异性内源代谢物，构成代谢标志物组；对代谢标志物组做PLS回归分析，建立回归模型；

B.计算代谢标志物组在步骤2)测试组中与正常组的相似度，或根据A的回归模型对测试组做PLS回归分析，考察药物治疗对内源性代谢的影响；

C.根据B中的相似度计算结果或PLS回归分析结果，以测试组接近正常组或远离模型组的程度，评价各药物的优劣。

3.如权利要求2所述的中成药质量评价的方法，其特征是：所述对其成份进行分析的方式为液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用、或核磁共振波谱。

4.如权利要求2所述的中成药质量评价的方法，其特征是：所述的模式识别可采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法(PLS)或分级聚类(HCA)。

5.如权利要求2所述的中成药质量控制和评价方法，其特征是：所述代谢标志物组的获取方法，主要包括a：对检测到的变量进行t检验，选取所有p＜0.001的化合物作为代谢标志物组；或b：计算Fisher权重，优先选取权重大的变量作为代谢标志物组；或c：采用主成分分析法(PCA)或偏最小二乘法(PLS)的模式识别，在PCA(PLS)分析中选取对分类贡献最大的一组变量作为代谢标志物组。

6.如权利要求2所述的中成药质量评价的方法，其特征是：所述PLS回归分析是以选取的代谢标志物组作为变量，计算疾病动物给药组中和正常组中代谢标志物组的相似度，评价中药的质量。

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