CN108918726B - 地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及LC‑MS的非靶向代谢组学方法发现地黄根三个不同发育阶段的差异代谢物,是通过不同代谢产物的变化积累模式来显示地黄根的发育和品质。本发明包括以下步骤:1.3个发育阶段地黄材料收集;2.质量控制(QC)样品的制备;3.LC/MS分析;4.数据预处理和统计分析;5.鉴定差异代谢物。本发明方法的优点在于通过基于LC‑MS的非靶向代谢组学方法预先鉴定了434种差异代谢物,其中有281个代谢物在三个比较分析组(ER/TR,TR/MR和ER/MR)中是不重复的。这些特定的代谢产物可能成为质量评估和确定收获期的潜在指标,显示了这种方法的高效性。差异代谢物为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息,这可能在医学的进一步应用中具有实际用途。
Description
技术领域
本发明涉及地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法
熟地黄是一种药用重要的多年生草本植物,它的根含有丰富的生物活性化合物,因此,用于治疗发烧,神经疾病,糖尿病和高血压;能够加强肝功能;增强造血功能和免疫防御;也是传统中药的滋补成分。
地黄根中的化合物具有很高的经济价值,部分原因是因为它们具有显着的药效,所以被广泛研究了很长时间。以前对地黄化学物质的研究包括环烯醚萜苷、紫罗酮苷、苯乙醇糖苷和其他几种成分的分离和鉴定。此外,地黄中的越来越多的新化合物被分离和鉴定。现在,我们已经知道地黄含有超过140种单体化合物,如单萜类,苯乙醇苷和三萜。
在中华人民共和国药典中,梓醇和毛蕊花糖苷这两种化合物被用作地黄的指标组分。毛蕊花苷具有抗氧化,抗炎,抗肿瘤,创伤愈合,神经保护等人体健康的药理活性。梓醇在许多疾病(包括肾病,神经退行性疾病和糖尿病)的治疗中发挥重要作用。然而,只有这些发现的化合物是不够的,因为地黄具有非常复杂的化合物成分,尚未被新技术探索。植物代谢组由超过20万个控制植物发育的代谢物组成,甚至在拟南芥中也含有约5000种代谢物。近年来,为了更好地了解地黄块根的形成和发育过程,挖掘与生物活性成分相关的基因,建立根中生物活性成分的生物合成途径,应用了多种“组学”的方法。
代谢组学是一个新兴的“模仿”研究领域,专门研究在活体内发现的小分子代谢物的近似全球分析,可以同时检测许多内源性代谢物,从而对代谢谱进行系统描述。代谢组学已成功应用于食品和茶叶的研究,熟地黄的研究,生理机制和生物标志物的发现。非靶向分析是液相色谱-质谱(LC-MS)为基础的代谢组学研究中最常用的策略。使用高分辨率质谱仪,非目标分析可以以非偏见的方式检测许多代谢物,并提供准确的质量估算用于促进化合物鉴定。所以,本研究通过基于LC-MS的非靶向代谢组学方法,结合多变量分析比较,对三个发展阶段的地黄根进行了新型代谢概况分析,来鉴别目前存在的差异代谢产物,揭示差异代谢产物的变化模式如何促进块根的发育。为块根发育的分子基础的提供了宝贵见解,并为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息,这可能在医学的进一步应用中具有实际用途。
发明内容
本发明提供了一种高效的,新型的,准确的基于LC-MS的非靶向代谢组学方法,预先鉴定了地黄根中的434种差异代谢物,其中有281个代谢物在三个比较分析组(ER/TR,TR/MR和 ER/MR)中是不重复的。
本发明的具体操作,包括以下步骤:
所述3个发育阶段地黄材料收集:
在河南温县种植的“金九(03-2)”品种地黄作为试验材料。分别在2016年5月20日,8 月20日和11月10日分别收集其伸长(E),膨胀或增厚(T)和成熟(M)3个发育阶段的根。将这些样品标记为伸长根(ER),扩大或增厚根(TR)和成熟根(MR)。
所述质量控制(QC)样品的制备:
将精确称重的100mg样品转移到1.5mL Eppendorf管中,向其中加入两个小钢球。在每个样品中加入20μL内标的甲醇、水(1/1,v/v)和1mL甲醇与水的混合物(7/3,v/v),将所有样品放置-80℃至2分钟。然后将样品在60Hz下研磨2分钟,涡旋运动2分钟,并在环境温度下超声30分钟,并在4℃下放置10分钟。样品在14000rpm和4℃下离心10分钟。使用晶体注射器收集来自每个管的随后的上清液(500μL),然后通过0.22μM的过滤器过滤并转移到LC 小瓶中,将其储存在-80℃随后进行LC-MS分析。质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品。
所述LC/MS分析:
UHPLC系统,与LTQ OrbitrapMS(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)偶联的 Ultimate 3000-Velos Pro,用于执行和分析ESI正离子和负离子模式中的代谢谱。在前一种模式中,代谢物的分离是在2.1×100mm ACQUITYTM1.7μmBEH C8色谱柱上进行的,流动相含有0.1%甲酸(A)和乙腈(B)的水。线性洗脱梯度程序如下:5%B保持1.0分钟,线性增加至100%B 24 分钟,然后保持4分钟,100-5%B保持28.0至28.1分钟,5%B持续28.1至30分钟。每个运行时间持续30分钟。在负离子模式下,代谢物分离在2.1×100mmACQUITYTM1.8μmHSS T3柱上进行,流动相含有6.5mM碳酸氢铵水溶液(C)和6.5mM碳酸氢铵在95%甲醇中和水(D)。线性洗脱梯度程序为5%D保持1.0min,然后线性增加至100%D18min,保持4min,100-5%D 保持22.0至22.1min,5%D保持22.1至25.0分钟。每个运行时间持续25分钟。
流速设定为0.35mL/min,柱温保持在50℃,注射量为5μL。质谱检测设定如下:正离子和负离子模式的毛细管温度分别为350℃和360℃,相应的喷雾电压为3.5kV和3.0kV。质量扫描范围为50至1000m/z。MS的分辨率设置为30000.在整个分析过程中定期注射QC(每10个样品一次),以提供一组可重复性的可靠的评估数据。
所述数据预处理和统计分析:
从UHPLC-LTQ Orbitrap获得的质谱数据在XCMS软件中进行分析,该软件产生了与保留时间、精确质量数和色谱相关的特征矩阵。两组中至少有80%的变量被提取出来。保留QC样品中相对标准偏差(RSD)小于30%的变量,进行进一步的多元数据分析,这些分析对于长时间的UHPLC-LTQ 分析足够稳定。从数据集中删除内部峰。使用Microsoft Excel 2007软件(Microsoft, Washington,USA)将所得数据标准化为每个样品的总峰面积。
将主成分分析(PCA),偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 结果导入SIMCA(v14.0,Umetrics,Umea,Sweden)DA)中进行。Hotelling的T2区域(在模型的分数图中显示为椭圆)定义了建模变化的95%置信区间。模型的质量由R2X或R2Y和Q2术语的值来描述。R2X或R2Y被定义为由模型解释的数据中的方差的比例,因此表示拟合的优度。 Q2被定义为由模型预测的数据中的方差比例,因此表示通过交叉验证程序计算的可预测性。在 SIMCA中进行默认的七轮交叉验证,以确定主要组件的最佳数量,并避免模型过度拟合数据。 OPLS-DA模型也通过置换分析(n=200次运行)进行验证。
所述鉴定差异代谢物:
差异代谢物的选择基于从OPLS-DA模型获得的统计上显著的VIP阈值(投影变量影响)和归一化峰面积的双尾Student's t-检验的P值的组合。我们使用由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司合作开发的代谢组学研究中小分子识别一步法解决方案。由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司共同编制的参考资料数据库,以及HMDB在线数据库(http://www.hmdb.ca/ spectra/ms/search)和 METLIN(https://metlin.scripps.edu/)。HMDB数据库搜索的质量公差设置为0.005Da。自行构建的代谢物LC-MS/MS鉴定系统是鉴定化合物的有效技术。
本发明的有益技术效果体现在以下几个方面:
(1)、本发明通过基于LC-MS的非靶向代谢组学的方法,结合多变量分析比较,对三个发展阶段的地黄根进行了新型代谢概况分析。已经预先鉴定了434种差异代谢物,显示了这种方法的高效性。
(2)、本发明所运用的非靶向分析技术,是以液相色谱-质谱(LC-MS)为基础的代谢组学研究中最常用的策略。使用高分辨率质谱仪,非目标分析可以以非偏见的方式检测许多代谢物,并提供准确的质量估算用于促进化合物鉴定,使结果更加稳定可靠。
(3)、本发明揭示了差异代谢产物的变化促进了地黄块根的发育。
(4)、本发明通过非靶向的基于LC-MS的代谢组学方法分析来自不同发育阶段的地黄根的代谢组,作为多变量分析的一部分,将PCA,PLS-DA和OPLS-DA模型拟合到结果数据中。通过将这些分析与单变量分析相结合,预先确定了三个根比较组中的差异代谢物,证明地黄的发育和品质与这些差异物有关。
(5)、本发明为地黄块根发育的分子基础的提供了宝贵见解,并为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息,这可能在医学的进一步应用中具有实际用途。
(6)、本发明还揭示了地黄根的发育是一个复杂的过程,涉及许多途径、酶和差异代谢物。此外,这些预先确定的差异代谢物所提供的有价值的信息,可用于地黄以后的比较分析中。
(7)、本发明提供的代谢组学方法,除了可以应用于地黄种质的分子生物学研究之外,也可以应用于其它物种的研究。
表1三个比较组(ER/TR,TR/MR和ER/MR)中281个不重复代谢物
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步地描述。
实施例
本研究通过基于LC-MS的非靶向代谢组学方法,结合多变量分析比较,对三个发展阶段的地黄根进行了新型代谢概况分析,鉴别目前存在的差异代谢产物,揭示差异代谢产物的变化模式如何促进块根的发育。
取河南温县种植的“金九(03-2)”品种不同发育阶段的根作为试验材料。将3个发育时期的根标记为伸长根(ER),扩大或增厚根(TR)和成熟根(MR)。使用基于质谱的非靶向代谢组学方法对地黄根发育的三个阶段进行定性分析和差异代谢物的相对定量分析。其次,使用多变量、单变量分析,材料数据库和代谢物的LC-MS/MS鉴定系统,预先鉴定差异代谢物。在任何两组之间预先确定了434个发生的非重复性差异代谢物。其中有281个代谢物在三个比较分析组(ER /TR,TR/MR和ER/MR)中是不重复的。由于434个差异代谢物分布在这三个比较群体中,表明地黄根的所有发育阶段都具有一些药用和营养价值的代谢物。然而不同代谢物的量在对比组中不同,这表明根的药用和营养价值取决于其发育阶段:根发育的时间越长,其潜在的药用和营养价值越大。因此,MR(成熟根)可能提供最多的药用和营养成分。我们发现,预测的药用/营养价值在MR到TR方面的差异较小。
具体操作步骤如下:
(1)、质量控制(QC)样品的制备:
将精确称重的100mg样品转移到1.5mL Eppendorf管中,向其中加入两个小钢球。在每个样品中加入20μL内标的甲醇、水(1/1,v/v)和1mL甲醇与水的混合物(7/3,v/v),将所有样品放置-80℃至2分钟。然后将样品在60Hz下研磨2分钟,涡旋运动2分钟,并在环境温度下超声30分钟,并在4℃下放置10分钟。样品在14000rpm和4℃下离心10分钟。使用晶体注射器收集来自每个管的随后的上清液(500μL),然后通过0.22μM的过滤器过滤并转移到LC 小瓶中,将其储存在-80℃随后进行LC-MS分析。质量控制(QC)样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品。
(2)、LC/MS分析:
UHPLC系统,与LTQ OrbitrapMS(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)偶联的 Ultimate 3000-Velos Pro,用于执行和分析ESI正离子和负离子模式中的代谢谱。在前一种模式中,代谢物的分离是在2.1×100mm ACQUITYTM1.7μmBEH C8色谱柱上进行的,流动相含有0.1%甲酸(A)和乙腈(B)的水。线性洗脱梯度程序如下:5%B保持1.0分钟,线性增加至100%B 24 分钟,然后保持4分钟,100-5%B保持28.0至28.1分钟,5%B持续28.1至30分钟。每个运行时间持续30分钟。在负离子模式下,代谢物分离在2.1×100mmACQUITYTM1.8μmHSS T3柱上进行,流动相含有6.5mM碳酸氢铵水溶液(C)和6.5mM碳酸氢铵在95%甲醇中和水(D)。线性洗脱梯度程序为5%D保持1.0min,然后线性增加至100%D18min,保持4min,100-5%D保持22.0至22.1min,5%D保持22.1至25.0分钟。每个运行时间持续25分钟。
流速设定为0.35mL/min,柱温保持在50℃,注射量为5μL。质谱检测设定如下:正离子和负离子模式的毛细管温度分别为350℃和360℃,相应的喷雾电压为3.5kV和3.0kV。质量扫描范围为50至1000m/z。MS的分辨率设置为30000.在整个分析过程中定期注射QC(每10个样品一次),以提供一组可重复性的可靠的评估数据。
(3)、数据预处理和统计分析:
从UHPLC-LTQ Orbitrap获得的质谱数据在XCMS软件中进行分析,该软件产生了与保留时间、精确质量数和色谱相关的特征矩阵。两组中至少有80%的变量被提取出来。保留QC样品中相对标准偏差(RSD)小于30%的变量,进行进一步的多元数据分析,这些分析对于长时间的UHPLC-LTQ 分析足够稳定。从数据集中删除内部峰。使用Microsoft Excel 2007软件(Microsoft, Washington,USA)将所得数据标准化为每个样品的总峰面积。
将主成分分析(PCA),偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 结果导入SIMCA(v14.0,Umetrics,Umea,Sweden)DA)中进行。Hotelling的T2区域(在模型的分数图中显示为椭圆)定义了建模变化的95%置信区间。模型的质量由R2X或R2Y和Q2术语的值来描述。R2X或R2Y被定义为由模型解释的数据中的方差的比例,因此表示拟合的优度。 Q2被定义为由模型预测的数据中的方差比例,因此表示通过交叉验证程序计算的可预测性。在 SIMCA中进行默认的七轮交叉验证,以确定主要组件的最佳数量,并避免模型过度拟合数据。 OPLS-DA模型也通过置换分析(n=200次运行)进行验证。
(4)、鉴定差异代谢物:
差异代谢物的选择基于从OPLS-DA模型获得的统计上显著的VIP阈值(投影变量影响)和归一化峰面积的双尾Student's t-检验的P值的组合。我们使用由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司合作开发的代谢组学研究中小分子识别一步法解决方案。由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司共同编制的参考资料数据库,以及HMDB在线数据库(http://www.hmdb.ca/ spectra/ms/search)和 METLIN(https://metlin.scripps.edu/)。HMDB数据库搜索的质量公差设置为0.005Da。自行构建的代谢物LC-MS/MS鉴定系统是鉴定化合物的有效技术。
表1三个比较组(ER/TR,TR/MR和ER/MR)中281个不重复代谢物
Claims (1)
1.地黄根发育过程中大量差异代谢产物的鉴定方法,包括 3个发育阶段地黄材料收集、质量控制QC样品的制备、 LC / MS分析、数据预处理和统计分析、鉴定差异代谢物,其特征在于:
所述3个发育阶段地黄材料收集:
在河南温县种植的“金九 03-2”品种地黄作为试验材料,分别在2016年5月20日,8月20日和11月10日分别收集其伸长E,膨胀或增厚T和成熟M 3个发育阶段的根,将这些样品标记为伸长根ER,扩大或增厚根TR和成熟根MR;
所述质量控制QC样品的制备:
将精确称重的100mg样品转移到1.5mL Eppendorf管中,向其中加入两个小钢球,在每个样品中加入20μL内标的体积比为1/1的醇、水和1mL体积比为7/3的甲醇与水的混合物,将所有样品放置-80℃至2分钟,然后将样品在60Hz下研磨2分钟,涡旋运动2分钟,并在环境温度下超声30分钟,并在4℃下放置10分钟,样品在14000rpm和4℃下离心10分钟,使用晶体注射器收集来自每个管的随后的上清液500μL,然后通过0.22μM的过滤器过滤并转移到LC小瓶中,将其储存在-80°C随后进行LC-MS分析,质量控制QC样品是通过混合所有样品的等分试样制备的一个汇集样品;
所述LC / MS分析:
UHPLC系统,与LTQ OrbitrapMS-Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA偶联的Ultimate 3000-Velos Pro,用于执行和分析ESI正离子和负离子模式中的代谢谱,在前一种模式中,代谢物的分离是在2.1×100mm ACQUITYTM1.7μmBEH C8色谱柱上进行的,流动相含有0.1%甲酸A和乙腈B的水,线性洗脱梯度程序如下:5%B保持1.0分钟,线性增加至100%B 24分钟,然后保持4分钟,100-5%B保持28.0至28.1分钟,5%B持续28.1至30分钟,每个运行时间持续30分钟,在负离子模式下,代谢物分离在2.1×100mm ACQUITYTM1.8μmHSS T3柱上进行,流动相含有6.5mM碳酸氢铵水溶液C和6.5mM碳酸氢铵在95%甲醇中和水D,线性洗脱梯度程序为5%D保持1.0 min,然后线性增加至100%D18 min,保持4 min,100-5%D保持22.0至22.1 min,5%D保持22.1至25.0分钟,每个运行时间持续25分钟;
流速设定为0.35mL / min,柱温保持在50℃,注射量为5μL,质谱检测设定如下:正离子和负离子模式的毛细管温度分别为350℃和360℃,相应的喷雾电压为3.5kV和3.0kV, 质量扫描范围为50至1000 m / z, MS的分辨率设置为30000.在整个分析过程中定期注射QC,每10个样品一次,以提供一组可重复性的可靠的评估数据;
所述数据预处理和统计分析:
从UHPLC-LTQ Orbitrap获得的质谱数据在XCMS软件中进行分析,该软件产生了与保留时间、精确质量数和色谱相关的特征矩阵,两组中至少有80%的变量被提取出来,保留QC样品中相对标准偏差RSD小于30%的变量,进行进一步的多元数据分析,这些分析对于长时间的UHPLC-LTQ分析足够稳定,从数据集中删除内部峰,使用Microsoft Excel 2007软件-Microsoft,Washington,USA将所得数据标准化为每个样品的总峰面积;
将主成分分析PCA,偏最小二乘判别分析PLS-DA和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA结果导入SIMCA-v14.0,Umetrics,Umea,Sweden DA中进行,Hotelling的T2区域-在模型的分数图中显示为椭圆定义了建模变化的95%置信区间,模型的质量由R2X或R2Y和Q2术语的值来描述,R2X或R2Y被定义为由模型解释的数据中的方差的比例,因此表示拟合的优度,Q2被定义为由模型预测的数据中的方差比例,因此表示通过交叉验证程序计算的可预测性,在SIMCA中进行默认的七轮交叉验证,以确定主要组件的最佳数量,并避免模型过度拟合数据, OPLS-DA模型也通过置换分析,n = 200次运行,进行验证;
所述鉴定差异代谢物:
差异代谢物的选择基于从OPLS-DA模型获得的统计上显著的VIP阈值-投影变量影响和归一化峰面积的双尾Student's t-检验的P值的组合,我们使用由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司合作开发的代谢组学研究中小分子识别一步法解决方案,由中国科学院大连化学物理研究所和大连化学数据解决方案信息技术有限公司共同编制的参考资料数据库,以及HMDB在线数据库-http://www.hmdb.ca/spectra / ms / search和METLIN-https://metlin.scripps.edu/, HMDB数据库搜索的质量公差设置为0.005 Da,自行构建的代谢物LC-MS / MS鉴定系统是鉴定化合物的有效技术。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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