CN108034681A - 利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括：以地黄属植物茎为外植体，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；然后于生物反应器中加入联合诱导子β‑CD和茉莉酸甲酯进行悬浮培养，之后经超声提取、大孔树脂吸附、高效液相制备柱进行精制后得到高纯度的梓醇。本发明利用的植物干细胞培养体系具有同步生长、遗传性状稳定、生长速度快、梓醇合成稳定等优良特性，其作为制备梓醇的原料，为梓醇的制备提供了一种新方法；此外，与化学合成相比，本发明利用生物反应器培养技术结合植物干细胞培养技术生产高纯度梓醇，具有生产周期短，安全性高，成本低，产量高，低污染等优点。

Description

利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法
技术领域
本发明属于医药生物工程技术领域，特别涉及一种利用悬浮培养的地黄属植物茎形成层干细胞生产梓醇的方法。
背景技术
地黄是我国最著名的中药材之一，据统计，约有80多种中成药以生地黄为主要原料，如六味地黄丸、知柏地黄丸、乌鸡白凤丸、消糖丸等。梓醇是地黄中主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、神经保护等。2017年1月25日，青海央宗药业有限公司自主研发的“梓醇片”取得国家食品药品监督管理局中药一类药物临床试验批件。
地黄生长周期较长，且易受生长环境的影响，连续种植的地黄，地下根茎多为须根，无法形成膨大的具备要用价值的块茎，只能间隔8-10年后才能种植。连作障碍已经成为制约地黄种植生产亟待解决的难题。河南焦作是怀地黄的道地产区，随着种植面积的不断增加，较多地区出现无新地可供种植，轮作年限严重缩短的情况，严重制约了地黄的产量及质量。此外，地黄植物中梓醇含量较低(1吨干重的熟地黄中仅能提取得到2g的梓醇)，化学组分复杂，提取分离纯化的成本较高。
19世纪30年代，科学家首次建立了离体培养植物细胞的培养技术。经过80年的发展，植物生物技术得到了长足的发展，利用植物细胞培养技术生产重要活性次生代谢产物得到越来越多科学家的关注，并已有一些成功实现工业化生产的案例，如利用生物反应器技术悬浮培养红豆杉脱分化细胞可工业化生产紫杉醇，利用悬浮培养的黄连脱分化细胞可工业化生产小檗碱，利用悬浮培养的彩叶草脱分化细胞可工业化生产迷迭香酸等。
当前所使用的植物细胞培养技术多以离体的茎、根、叶等为细胞来源，这种方式获得的细胞均为脱分化细胞。在离体细胞的获得过程中，细胞易发生有害的表观遗传变异和基因变异或缺失，经过长期培养后细胞生长变慢，次生代谢产物的种类和含量逐渐下降。因此，建立遗传信息稳定，经长期培养后仍然保持较高的生长速率和较高产量次生代谢产物的细胞培养体系是植物细胞培养亟待解决的首要问题。
植物干细胞是一种原始的、未分化的，具有全能性或多能性的细胞，它可以分化成多种细胞类型或组织器官。植物干细胞为根、茎和叶等器官的形成及再生源源不断的提供新细胞，并贯穿植物的整个生命周期。植物干细胞存在于植物的茎顶端分生组织、根尖分生组织和维管形成层。植物维管束形成层为干细胞提供小生境，并维持多能干细胞的数量和功能。
2010年，韩国云火科学院的科学家从野生的红豆杉枝条中分离培养了红豆杉形成层分生组织细胞，经稳定化培养后获得红豆杉干细胞培养体系，其紫杉醇含量高达264mg/kg，并可实现3吨规模的工业化生产。利用现有的植物细胞培养技术获得的地黄脱分化细胞梓醇含量较低，且不能长期稳定的用于工业化生产活性次生代谢产物。
发明内容
为解决目前地黄脱分化细胞梓醇含量较低的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞长期稳定生产梓醇的方法，该方法具有生产周期短、环境友好、可持续性强、产量高且稳定等特点。
本发明提供的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括如下步骤：
S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；
S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子β-CD和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；
S3：收集经S2悬浮培养的培养物，并进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；
S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并提取液后低温减压浓缩得浸膏II；
S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。
优选地，所述地黄属植物包括天目地黄Rehmanniachingii Li、高地黄Rehmanniaelata N.E.Brown、地黄Rehmanniaglutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.etMey.、湖北地黄Rehmanniahenryi N.E.Brown、裂叶地黄Rehmanniapiasezkii Maxim、茄叶地黄Rehmanniasolanifolia Tsoong et Chin。
优选地，S1中，所述稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系是通过如下方法建立得到的：
1)取新鲜采摘的野生地黄茎部，清洗后切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的小块作为外植体；
2)使用灭菌水对步骤1)处理后的外植体进行灭菌冲洗，再使用至少一种灭菌剂进行灭菌处理后，杀死外植体表面和内部的内生真菌，然后用无菌水冲洗3～5次，获得表面无菌的外植体；
3)将经步骤2)灭菌处理后的外植体置于诱导培养基中培养5～15天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中培养3～12天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；
所述诱导培养基的配方为：添加有10～20g/L蔗糖、1.5～4.5g/L结冷胶和1.5～3.5mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.5～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；
所述分离培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、1.0～3.0mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；
4)将步骤3)中发生分层的细胞转移至继代培养基中培养10～20天，然后再转移至新鲜的生长培养基中10～20天，如此重复连续继代培养后获得能稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；
所述继代培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、0.4～0.8g/L活性炭、0.5～3.0mg/L NAA和0.5～3.0mg/L 6-BA的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0。
更优选地，上述步骤3)中的诱导培养和分离培养，以及步骤4)中的继代培养的培养条件均为：温度22～28℃，湿度60～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为12～16h。
优选地，S2中，将所述地黄形成层干细胞培养体系在悬浮培养基中进行悬浮培养，接种量为45～65g/L；悬浮培养条件为：温度为20～26℃，转速100～140rpm，溶氧量0.2～0.45mg/L，通气比0.35～0.55vvm，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为10～18h，pH值为5.5～5.9，连续培养10～24天；
所述悬浮培养基为添加有15～35g/L蔗糖、0.5～2.5mg/L生长素的MS液体培养基，所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种。
更优选地，S2中，所述β-CD的添加浓度为60～160mmol/L，所述茉莉酸甲酯的添加浓度为50～160μmol/L。
优选地，S3中，对所述冻干粉进行超声提取时，单次超声提取温度为20～30℃，提取时间为30～60min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过以地黄属植物茎为外植体，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；由于地黄干细胞具有生长同步、遗传信息稳定、次生代谢产物生物合成稳定及产量高等特点，很好的克服了脱分化细胞培养体系存在的容易遗传变异而导致其生理生化特征发生改变的缺陷。
(2)由于地黄脱分化细胞呈大的细胞团，仅有一个大液泡，抗剪切力差，使用生物反应器培养时生长较差；而本发明提供的地黄形成层干细胞培养体系中梓醇的含量是地黄脱分化细胞的10～50倍，且地黄形成层干细胞多为单细胞或小的细胞团，且细胞内有小而多的液泡，有较强的抗剪切力，极为适合大规模生物反应器培养，
(3)本发明使用的复合诱导子甲基-β-环糊精和茉莉酸甲酯能5～10倍的提高梓醇的产量，这是因为诱导子是指能够引起目标生物体发生生理变化的各种生物与非生物因子。单独或联合使用茉莉酸甲酯作为诱导子可显著促进植物次生代谢产物的生物合成。此外，甲基-β-环糊精既可作为诱导子引发植物防御反应，释放抗毒素，从而刺激植物次生代谢产物的合成，另一方面，甲基-β-环糊精通过和次生代谢产物形成复合物，减少对植物细胞的反馈抑制作用以促进次生代谢产物的合成。经研究发现，在生物反应器中培养地黄茎形成层干细胞时，同时加入诱导子甲基-β-环糊精和茉莉酸甲酯可有效提高次生代谢产物的产量，约能5～10倍的提高梓醇的产量。
(4)与现有技术分离培养的地黄脱分化细胞相比，长期培养时，地黄形成层干细胞的生长及梓醇含量保持相对稳定，地黄形成层干细胞培养体系具有生长同步、遗传稳定及次生代谢产物合成稳定等优点。
(5)利用生物反应器技术对地黄干细胞培养进行培养，具有生长速度快，培养条件可控，培养周期短，梓醇产量高，成本低等优点。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。
需要特别说明的是，以下是实施例中所用到的WPM基础培养基和MS基础培养基，其中，WPM培养基的基础配方如表1所示，MS培养基的基础配方如表2所示。保存外植体所用到的抗褐化保存液的配方如表3所示，
表1 WPM培养基的基础配方
组分 浓度 组分 浓度
K2SO4 990mg/L FeSO4· 27.8mg/L
MgSO4·7H2O 370mg/L Na2EDTA 37.3mg/L
KH2PO4 170mg/L 肌醇 100mg/L
NH4NO3 400mg/L 甘氨酸 2.0mg/L
MnSO4·4H2O 22.5mg/L 盐酸硫胺素 1.0mg/L
ZnSO4·7H2O 8.6mg/L 盐酸吡哆素 0.5mg/L
H3BO3 6.2mg/L 泛酸 0.5mg/L
CuSO4·5H2O 0.25mg/L 烟酸 0.5mg/L
Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L L-甘氨酸 2.0mg/L
Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L / /
WPM培养基的基础配方如表1所示，配制WPM液体培养基时，按表中配方使用蒸馏水分别溶解，加入一定量的蔗糖蔗糖，混匀后定容，调pH 5.5～5.8，灭菌温度121℃，灭菌时间20min，冷却即得WPM液体培养基；配制WPM固体培养基时，，加入一定量的蔗糖和结冷胶作为固定剂，即得WPM固体培养基(本发明所用WPM培养基基础配方均为此)。需要说明的是，诱导培养基、分离培养基和继代培养基是固体培养基，而悬浮培养基用的是液体培养基。
表2 MS培养基的基础配方
组分 浓度 组分 浓度
KNO3 2500mg/L Na2MoO4PO4·2H2O 0.25mg/L
(NH4)2NO3 134mg/L CuSO4·5H2O 0.025mg/L
KH2PO4·5H2O 150mg/L CoCl2·6H2O 0.025mg/L
MgSO4·7H2O 250mg/L Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L
CaCl2 113.2mg/L FeSO4·7H2O 27.8mg/L
C6H12O6 100mg/L C12H17ClN4OS·HCl 10.0mg/L
KI 0.75mg/L C8H12ClNO3 1.0mg/L
H3BO3 3.0mg/L ZnSO4·7H2O 2.0mg/L
MnSO4·4H2O 10.0mg/L 烟酸 1.0mg/L
MS液体培养基和MS固体培养基的制备过程和上述WPM液体培养基和WPM固体培养基的制备过程相同。
表3抗褐化保存液的配方
下面我们就以具体示例的形式，对本发明的技术方案进行详细的描述和说明。
实施例1
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，具体包括如下步骤：
S1：地黄形成层干细胞培养体系的获得
春季早晨时采集三年生野生地黄属植物裂叶地黄(Rehmannia piasezkii Maxim)新长出的嫩茎，剪成3～5cm小段，用流动的无菌蒸馏水连续冲洗6h后，擦干表面水分，切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的1cm2的小块作为外植体；
在无菌条件下，用流动的无菌蒸馏水连续冲洗上述外植体2h，再用70％乙醇溶液浸泡2.0min，转移至0.2％次氯酸钠溶液中浸泡5min，再用0.01％的氯化汞溶液灭菌处理2min，最后用流动的灭菌蒸馏水冲洗3min，获得表面无菌的外植体。将该外植体放入无菌的抗褐化保存液中震荡35min使外植体和抗褐化保存液充分接触，所述抗褐化保存液的配方如上表3所示，其中，蔗糖为25g/L，青霉素为200U/mL，链霉素为200U/mL。
将上述处理后的外植体转移至诱导培养基中诱导培养10天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中分离培养6天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；诱导培养和分离培养的条件相同，均为温度25℃，湿度70～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200lx，光照时间为12h。
上述诱导培养基的配方为：添加有20g/L蔗糖、1.5g/L结冷胶和1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤的WPM基础培养基，培养基pH值为5.5；
上述分离培养基的配方为：添加有22g/L蔗糖、1.0g/L结冷胶、1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤的WPM基础培养基，培养基pH值为5.0；
将上述发生分层的细胞转移至生长培养基中培养10天，然后再转移至新鲜的继代培养基中12天进行继代培养，如此重复连续培养后获得能稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；继代培养的条件为温度25℃，湿度70～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200lx，光照时间为12h。
上述继代培养基的配方为：添加有20g/L蔗糖、1.0g/L结冷胶、0.4g/L活性炭、0.5mg/L NAA和3.0mg/L 6-BA的WPM基础培养基，培养基pH值为5.0。
S2：将上述获得的地黄形成层干细胞培养体系按照接种量50g(湿重)/L的比例置于10L搅拌气升式生物反应器中进行悬浮培养，悬浮培养基为添加有30g/L蔗糖、1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤的MS液体培养基，生物反应器搅拌器转速100rpm，培养液溶氧量0.20，温度为20～26℃，通气比0.35(air volume/culture volume/min)，光照来源为LED白光灯，光照强度2200lx，光照时间为10h，调节pH 5.5。培养8天时向生物反应器中加入联合诱导子80mmol/L甲基-β-环糊精和80μmol/L茉莉酸甲酯，培养时间16天，刺激梓醇的累积。
地黄形成层干细胞培养体系中的干细胞悬浮培养时呈小细胞团，在光学显微镜及透射电镜观察下具有小而多的液泡。
S3：收集经S2悬浮培养的培养物，抽滤，得地黄干细胞，冷冻干燥至恒重，称取1kg，按料液比(重量体积比)5:1加入95％乙醇超声提取3次，单次超声提取温度为20℃，提取时间为60min，之后过滤，合并提取液后使用旋转蒸发仪低温减压浓缩得浸膏I；
S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，缓慢加入预处理后的H103大孔树脂柱中进行吸附，然后用蒸馏水、95％浓度的乙醇进行梯度洗脱，流速0.8mL/min，使用自动收集器收集洗脱液，合并洗脱液后使用旋转蒸发仪低温减压浓缩得浸膏II，干燥至恒重后得到梓醇粗品；
S5：再用10％乙腈水溶液溶解后，利用高效液相制备柱进行精制，使用5％乙腈洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液后使用旋转蒸发仪低温减压浓缩，干燥至恒重后得到梓醇纯品9.45g。
实施例2
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，地黄形成层干细胞培养体系的获得和实施例1相同，不同之处仅在于：
培养8天时向生物反应器中加入联合诱导子120mmol/L甲基-β-环糊精和120μmol/L茉莉酸甲酯，刺激梓醇的累积，共培养时间16天。最终制得的梓醇纯品为16.18g。
实施例3
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，地黄形成层干细胞培养体系的获得和实施例1相同，不同之处仅在于：
培养10天时向生物反应器中加入联合诱导子120mmol/L甲基-β-环糊精和120μmol/L茉莉酸甲酯共，培养时间20天。最终制得的梓醇纯品为17.86g。
实施例4
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，地黄形成层干细胞培养体系的获得和实施例1相同，不同之处仅在于：
培养12天时向生物反应器中加入联合诱导子160mmol/L甲基-β-环糊精和160μmol/L茉莉酸甲酯，刺激梓醇的累积，共培养时间24天。最终制得的梓醇纯品为20.26g。
实施例5
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，地黄形成层干细胞培养体系的获得和实施例1相同，不同之处仅在于：
S3中，收集经S2悬浮培养的培养物，抽滤，得地黄干细胞，冷冻干燥至恒重，称取1kg，按料液比(重量体积比)8:1加入95％乙醇超声提取3次，单次超声提取温度为25℃，提取时间为50min，之后过滤，合并提取液后使用旋转蒸发仪低温减压浓缩得浸膏I。最终制得的梓醇纯品为10.3g。
实施例6
本实施例一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，地黄形成层干细胞培养体系的获得和实施例1相同，不同之处仅在于：
S1中的地黄形成层干细胞培养体系的获得的原料不同，本实施例是采集三年生野生地黄属植物天目地黄(Rehmanniachingii Li)新长出的嫩茎。最终制得的梓醇纯品为12.55g。
上述实施例测定结果显示，上述实施例1～实施例5中地黄干细胞的生长率为670％，实施例6中地黄干细胞的生长率为800％，表明本发明实施例1～实施例6中S1过程制备的地黄干细胞具备快速生长的能力。而每1kg地黄干细胞可以制备出高纯度梓醇9.45g～20.26g，表明本发明提供的方法可以高效、绿色、环保的制备出高纯度的梓醇。
进一步地，我们还以其他地黄属植物为原料，如高地黄(RehmanniaelataN.E.Brown)、地黄(Rehmanniaglutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.et Mey.)、湖北地黄(Rehmanniahenryi N.E.Brown)、茄叶地黄(RehmanniasolanifoliaTsoong et Chin)，采用实施例1-5提供的梓醇制备方法进行实验，均取得了一致的结果，进一步确证了可用于利用生物反应器培养技术大规模发酵培养地黄形成层干细胞培养体系，本发明提供的方法可以进行梓醇的高效制备。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.一种利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1：以地黄属植物茎为外植体，对外植体进行灭菌，通过诱导培养、分离培养和继代培养建立稳定生长的地黄茎形成层干细胞培养体系；
S2：将地黄形成层干细胞培养体系于生物反应器中进行悬浮培养，向悬浮培养基中加入联合诱导子β-CD和茉莉酸甲酯刺激梓醇的累积；
S3：收集经S2悬浮培养的培养物，进行冷冻干燥，得到冻干粉，采用70～95％的乙醇溶液对所述冻干粉进行超声提取数次，过滤并合并提取液后于低温减压浓缩得浸膏I；
S4：将S3所得浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，对粗提液进行大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；
S5：采用高效液相制备柱对S4所得浸膏II进行精制得到高纯度的梓醇。
2.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，所述地黄属植物包括天目地黄Rehmanniachingii Li、高地黄RehmanniaelataN.E.Brown、地黄Rehmanniaglutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.et Mey.、湖北地黄Rehmanniahenryi N.E.Brown、裂叶地黄Rehmanniapiasezkii Maxim、茄叶地黄Rehmanniasolanifolia Tsoong et Chin。
3.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S1中，所述稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系是通过如下方法建立得到的：
1)取新鲜采摘的野生地黄茎部，清洗后切成含有维管束的木质部、韧皮部和形成层的小块作为外植体；
2)使用灭菌水对步骤1)处理后的外植体进行灭菌冲洗，再使用至少一种灭菌剂进行灭菌处理后，杀死外植体表面和内部的内生真菌，然后用无菌水冲洗3～5次，获得表面无菌的外植体；
3)将经步骤2)灭菌处理后的外植体置于诱导培养基中诱导培养5～15天，维管束形成层干细胞和脱分化细胞快速分裂生长，形成明显的细胞团后置于分离培养基中培养3～12天，直至维管束形成层干细胞从外植体中剥离开，与脱分化细胞相互发生分层现象；
所述诱导培养基的配方为：添加有10～20g/L蔗糖、1.5～4.5g/L结冷胶和1.5～3.5mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.5～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；
所述分离培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、1.0～3.0mg/L生长素的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0；所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种；
4)将步骤3)中发生分层的细胞转移至继代培养基中培养10～20天，然后再转移至新鲜的生长培养基中10～20天，如此重复连续继代培养后获得能稳定生长的地黄形成层干细胞培养体系；
所述继代培养基的配方为：添加有10～25g/L蔗糖、1.0～4.0g/L结冷胶、0.4～0.8g/L活性炭、0.5～3.0mg/L NAA和0.5～3.0mg/L 6-BA的WPM基础培养基或MS基础培养基，培养基pH值为5.0～6.0。
4.根据权利要求3所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，步骤3)中的诱导培养和分离培养，以及步骤4)中的继代培养的培养条件均为：
温度22～28℃，湿度60～80％，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为12～16h。
5.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S2中，将所述地黄形成层干细胞培养体系在悬浮培养基中进行悬浮培养，接种量为45～65g/L；悬浮培养条件为：温度为20～26℃，转速100～140rpm，溶氧量0.2～0.45mg/L，通气比0.35～0.55vvm，光照来源为LED白光灯，光照强度2200～3200lx，光照时间为10～18h，pH值为5.5～5.9，连续培养10～24天；
所述悬浮培养基为添加有15～35g/L蔗糖、0.5～2.5mg/L生长素的MS基础培养基，所述生长素选自6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸中的一种。
6.根据权利要求1或5所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S2中，所述β-CD的添加浓度为60～160mmol/L，所述茉莉酸甲酯的添加浓度为50～160μmol/L。
7.根据权利要求1所述的利用悬浮培养的地黄茎形成层干细胞生产梓醇的方法，其特征在于，S3中，对所述冻干粉进行超声提取时，单次超声提取温度为20～30℃，提取时间为30～60min。
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