CN101177666A - 产紫杉醇的新菌种及其选育和制备紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
产紫杉醇的新菌种及其选育和制备紫杉醇的方法，紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物碱类药物，由于红豆杉，又名紫杉，是两亿年前的史前植物，是珍稀树种，生长速度缓慢，并且其生物学特性对生态环境要求较高，天然更新能力差，所以种群数量极为有限，属濒危保护植物，资源十分有限，因此，国内外学者都在积极地研究开发紫杉醇的新药源，本发明产紫杉醇的新菌种，所述的新菌种为从东北红豆杉(T.cuspidate Sieb.& Zucc.)的树皮中分离的菌种又经诱变选育得到的菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为206035。本发明用于生产紫杉醇的药源。
Description
技术领域：
本发明涉及一种菌种，具体涉及一种产紫杉醇的新菌种及其选育和制备紫杉醇的方法。
背景技术：
恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康，而癌症是目前人类疾病中仅次于心脑血管疾患的第二大死因。
紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物碱类药物。由于红豆杉，又名紫杉，是两亿年前的史前植物，是珍稀树种，生长速度缓慢，并且其生物学特性对生态环境要求较高，天然更新能力差，所以种群数量极为有限，属濒危保护植物，资源十分有限，因此，国内外学者都在积极地研究开发紫杉醇的新药源。
微生物发酵生产是降低成本、大量获取紫杉醇的理想方法。1993年美国蒙塔那(Montana)州立大学化学家Andrea Stierle和植物病理学家Gary Strobel在蒙塔那西北部国家冰川公园的短叶红豆杉中分离到一株内生真菌Taxomycesandreanae，在Stierle等的工作一经发表，美国细胞克隆公司就出价100万美元支持蒙塔那州立大学的这项研究。在这美妙前景的鼓舞下，国内外的学者纷纷展开了这方面的研究，分离新的产紫杉醇内生真菌、进行菌种选育和培养条件的优化。
发明内容：
本发明的目的是提供一种从红豆杉中分离的能够产紫杉醇的新菌种及其选育和制备紫杉醇的方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种产紫杉醇的新菌种，所述的新菌种为从东北红豆杉(T.cuspidate Sieb.&Zucc.)的树皮中分离的菌种又经诱变选育得到的菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为206035。
该菌株的物理形态特性：
在PDA培养基上28℃培养4d，菌落圆形，边缘较整齐，初期白色绒毛状，后期颜色变深，逐渐变为灰绿色，直径达6.1～8.0cm，菌丝初期无色，后期呈深绿色，匍匐，分枝，具隔膜，直径2.0-5.9μm，分生孢子梗侧生在菌丝上，灰黑色，直立或弯曲，常二叉或三叉状分枝，具隔膜，光滑，1400μm长，18-33μm宽。产孢细胞顶端膨大成球形，全壁多芽产孢，分生孢子卵圆形，灰黑色，聚集成葡萄穗状，无隔膜，长8.0-19μm，宽5.0-16μm。
该菌株的最适培养温度25-28℃，最适pH为4.5-6.0，代谢可产生紫杉醇。
上述的产紫杉醇的新菌种的选育，将红豆杉的树皮等先用无菌水冲洗掉表面的尘土等，再用75％的酒精浸泡3-10min；用无菌水洗掉表面的酒精；用无菌剪刀将树皮剪成0.5×0.5cm的小块；将经上述表面消毒的树皮分别栽种PDA培养基、查氏(Czapek)培养基、马丁(Martin)琼脂培养基平板，25℃恒温培养；待样品周围明显长出菌丝，采用尖端菌丝挑取法，挑取不同形态的菌落，转到PDA斜面，22-27℃纯化培养，储藏备用；
菌株HD104的紫外线诱变，
(1)取4mL制备好的孢子悬液置于灭过菌的并带有磁力搅拌棒的直径为7.5cm的培养皿中，然后盖上皿盖，将其放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外线照射10min，进行培养皿的表面消毒；
(2)开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，并计时；分别在45s、90s、120s时关闭紫外灯，在无菌、无光照操作的条件下，取出0.5ml孢子液，选取三个稀释度，即100、10-1、10-2，然后从每个稀释度中取出0.2mL，
倾注在PDA固体平板上，涂板，每个稀释度三个平行样，用黑布盖好倒置于28℃恒温培养箱中暗培养，获得诱变菌株即为本发明新菌种。
上述的产紫杉醇的新菌种的选育，所用的培养基有PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，将马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min；所述的查氏(Czapek)培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000mL pH自然，121℃灭菌20min；所述的马丁(Martin)琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4 7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红100mL，琼脂15-20g，蒸馏水800mL，临用前，加入0.03％链霉素稀释液100mL。
一种产紫杉醇的新菌种制备紫杉醇的方法，1).菌体活化：将4℃保存的新菌种接种于PDA斜面，28℃活化48h，将斜面活化两次后的菌种接于装有50mLPDA液体培养基的小摇瓶，28℃，120r/min摇床培养，继续活化48h；
2).发酵培养：将生长均匀的菌丝体悬液按3％的接种量转入改良后的S-7(在Strobel，1993原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度1.5-5.0mg/L)(200mL/500mL三角摇瓶)中，28℃，120r/min培养；分别于发酵12d测定紫杉醇的产量，每组设3个平行样；
3).紫杉醇的提取：将培养不同时间的菌体发酵液抽滤，滤液和固体均回收；用等体积的乙酸乙酯分两次对滤液进行萃取，分液漏斗静止1h分层；上层有机相中溶有紫杉醇，下层水相弃掉；同时研磨抽滤后的菌体，加入30mL的乙酸乙酯，震荡萃取30min过滤，将滤液与发酵液萃取后的有机相混合；用旋转蒸发仪除去溶剂乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液时，将溶液倒入平皿中，50℃干燥；用少量的乙腈反复冲洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL，4℃保存。
这个技术方案有以下有益效果：
1.紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是一种二萜类化合物，最早由Wani等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离到并确定了其化学结构，但因天然更新能力弱，属濒危保护植物，资源十分有限，即使将全部天然红豆杉资源砍伐，也难以满足市场需要，而且必然破坏自然环境与生态平衡，并将导致资源枯竭，解决药源不足已成为限制紫杉醇在临床中大量应用的瓶颈，因此本发明的研制从根本上解决了作为药源的紫杉醇难于取得的问题。
2.利用本发明方法产生紫杉醇，从而可以不用砍伐树木作为材料提取紫杉醇。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
菌株HD104是从黑龙江省穆棱林业局某林场东北红豆杉(T.cuspidate Sieb.&Zucc.)的树皮中分离得到，并经过发酵试验、TLC及HPLC，证明可以产紫杉醇。
分离方法如下：将红豆杉的树皮等先用无菌水冲洗掉表面的尘土等，再用75％的酒精浸泡3-10min；用无菌水洗掉表面的酒精；用无菌剪刀将树皮剪成0.5×0.5cm的小块；将经上述表面消毒的树皮分别栽种PDA培养基；查氏(Czapek)培养基；马丁(Martin)琼脂培养基平板，25℃恒温培养；待样品周围明显长出菌丝，采用尖端菌丝挑取法，挑取不同形态的菌落，转到PDA斜面，22-27℃纯化培养，储藏备用。
所用的培养基有：马铃薯(PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，将马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min；查氏(Czapek)培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000mL pH自然，121℃灭菌20min；马丁(Martin)琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4 7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红100mL，琼脂15-20g，蒸馏水800mL，临用前，加入0.03％链霉素稀释液100mL。
试验方法为将HD104菌分别接种在PDA、查氏、马丁培养基上，在28℃温箱内倒置培养，采用载玻片培养法，无菌挑取PDA固体平板上的菌丝，在显微镜下观察并进行显微测量。
在PDA培养基上28℃培养4d，菌落圆形，边缘较整齐，初期白色绒毛状，后期颜色变深，逐渐变为灰绿色，直径达6.1～8.0cm。菌丝初期无色，后期呈深绿色，匍匐，分枝，具隔膜，直径2.0-5.9μm，分生孢子梗侧生在菌丝上，灰黑色，直立或弯曲，常二叉或三叉状分枝，具隔膜，光滑，1400μm长，18-33μm宽。产孢细胞顶端膨大成球形，全壁多芽产孢，分生孢子卵圆形，灰黑色，聚集成葡萄穗状，无隔膜，长8.0-19μm，宽5.0-16μm。
该菌株的最适培养温度25-28℃，最适pH为4.5-6.0，代谢可产生紫杉醇。
模式菌株的培养物保存在黑龙江大学微生物实验室(HD104，Holotypus)，菌株HD104的紫外线诱变：
(1)取4mL制备好的孢子悬液置于灭过菌的并带有磁力搅拌棒的直径为7.5cm的培养皿中，然后盖上皿盖，将其放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外线照射10min，进行培养皿的表面消毒；
(2)开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，并计时；分别在45秒、90秒、120秒时关闭紫外灯，在无菌、无光照操作的条件下，取出0.5mL孢子液，选取三个稀释度，即100、10-1、10-2，然后从每个稀释度中取出0.2mL，倾注在PDA固体平板上，涂板，每个稀释度三个平行样，用黑布盖好倒置于28℃恒温培养箱中暗培养，获得诱变菌株(HD104-1)，诱变菌株与原始菌株在形态特征上没有差别。
实施例2：
一种产紫杉醇的新菌种(HD104-1)制备紫杉醇的方法，
1).菌体活化：将4℃保存的菌种J1-3接种于PDA斜面，28℃活化48h，将斜面活化两次后的菌种接于装有50mL PDA液体培养基的小摇瓶，28℃，120r/min摇床培养，继续活化48h；
2).发酵培养：将生长均匀的菌丝体悬液按3％的接种量转入改良后的S-7(为在Strobel，1993原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度1.5-5.0mg/L)(200mL/500mL三角摇瓶)中，28℃，120r/min培养；分别于发酵12d测定紫杉醇的产量，每组设3个平行样；
3).紫杉醇的提取：将培养不同时间的菌体发酵液抽滤，滤液和固体均回收；用等体积的乙酸乙酯分两次对滤液进行萃取，分液漏斗静止1h分层；上层有机相中溶有紫杉醇，下层水相弃掉；同时研磨抽滤后的菌体，加入30mL的乙酸乙酯，震荡萃取30过滤，将滤液与发酵液萃取后的有机相混合；用旋转蒸发仪除去溶剂乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液时，将溶液倒入平皿中，50℃干燥；用少量的乙腈反复冲洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL，4℃保存。
Claims (4)
1.一种产紫杉醇的新菌种，其特征是：所述的新菌种为从东北红豆杉(T.cuspidate Sieb.& Zucc.)的树皮中分离的菌种又经诱变选育得到的菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏号为206035。
2.一种权利要求1所述的产紫杉醇的新菌种的选育，其特征是：将红豆杉的树皮等先用无菌水冲洗掉表面的尘土，再用75％的酒精浸泡3-10min；用无菌水洗掉表面的酒精；用无菌剪刀将树皮剪成0.5×0.5cm的小块；将经上述表面消毒的树皮分别栽种马铃薯(PDA)培养基、查氏(Czapek)培养基、马丁(Martin)琼脂培养基平板，25℃恒温培养；待样品周围明显长出菌丝，采用尖端菌丝挑取法，挑取不同形态的菌落，转到PDA斜面，22-27℃纯化培养，储藏备用；
菌株HD104的紫外线诱变：
(1)取4mL制备好的孢子悬液置于灭过菌的并带有磁力搅拌棒的直径为7.5cm的培养皿中，然后盖上皿盖，将其放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外线照射10min，进行培养皿的表面消毒；
(2)开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，并计时；分别在45s、90s、120s时关闭紫外灯，在无菌、无光照操作的条件下，取出0.5mL孢子液，选取三个稀释度，即100、10-1、10-2，然后从每个稀释度中取出0.2mL，倾注在PDA固体平板上，涂板，每个稀释度三个平行样，用黑布盖好倒置于28℃恒温培养箱中暗培养，获得诱变菌株即为本发明新菌种。
3.根据权利要求2所述的产紫杉醇的新菌种的选育，其特征是：所用的培养基有马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，将马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min；所述的查氏(Czapek)培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCl 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，水1000mL pH自然，121℃灭菌20min；所述的马丁(Martin)琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4 7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红100mL，琼脂15-20g，蒸馏水800mL，临用前，加入0.03％链霉素稀释液100mL。
4.一种权利要求1或2所述的产紫杉醇的新菌种制备紫杉醇的方法，其特征是：
1).菌体活化：将4℃保存的新菌种接种于PDA斜面，28℃活化48h，将斜面活化两次后的菌种接于装有50mLPDA液体培养基的小摇瓶，28℃，120r/min摇床培养，继续活化48h；
2).发酵培养：将生长均匀的菌丝体悬液按3％的接种量转入改良后的S-7培养基(500mL三角摇瓶)中，28℃，120r/min培养；分别于发酵12d测定紫杉醇的产量，每组设3个平行样；
3).紫杉醇的提取：将培养不同时间的菌体发酵液抽滤，滤液和固体均回收；
用等体积的乙酸乙酯分两次对滤液进行萃取，分液漏斗静止1h分层；上层有机相中溶有紫杉醇，下层水相弃掉；同时研磨抽滤后的菌体，加入30mL的乙酸乙酯，震荡萃取30min过滤，将滤液与发酵液萃取后的有机相混合；用旋转蒸发仪除去溶剂乙酸乙酯，待剩下5mL左右的溶液时，将溶液倒入平皿中，50℃干燥；用少量的乙腈反复冲洗平皿表面的微量的紫杉醇，定溶2mL，4℃保存。
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