CN103283786B - 木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途。所述木霉菌菌株为哈茨木霉(Trichoderma？harzianum)SH2303CGMCC？NO.4963。所述防治黄瓜枯萎病药物的主要成分为所述哈茨木霉(Trichoderma？harzianum)SH2303的分生孢子；该生物农药可以为种子包衣剂或颗粒剂。本发明的木霉菌菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率达43.01％，非挥发性抑制物对黄瓜枯萎病的抑制率为41.33％，挥发性物质对黄瓜枯萎病的抑制率为11.49％，几丁质酶活为3.9573U，β-1，3-葡聚糖酶酶活为0.5092U，胞外蛋白酶酶活为3.0678U；针对黄瓜枯萎病的活体防效为71.43％，菌株中起拮抗作用的抗生性次生代谢物总体比重占30.28％，能够高效防治黄瓜枯萎病病害。

Description

木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途。

背景技术

黄瓜(CucumissativusL.)是我国设施栽培的主要种植瓜类蔬菜之一，由于设施栽培倒茬困难、连作障碍日趋严重，作为常见且难以控制的土传病害，黄瓜枯萎病严重影响黄瓜生产产量。黄瓜枯萎病又叫蔓割病、萎蔫病,是土壤传播、根部侵入的一种维管束病害，一般发病率20％-30％,严重地块达80％-90％,甚至全部毁种。近几年，由于我国黄瓜栽培面积的扩大，黄瓜枯萎病几乎在全国各地都有发生，其中吉林、辽宁、山东、湖北、北京等18个省市发生严重。发病高峰期，一般年份发病率在20％左右，严重的田块高达80％-90％，已成为制约黄瓜产量和品质的重要因素。目前我国控制黄瓜枯萎病主要应用化学农药，使用效果不稳定，且长期大量施用化学农药严重污染环境、威胁人民身体健康，且病原菌逐渐产生抗病性随之变异产生很多生理小钟。因此，黄瓜枯萎病防治急需绿色安全无公害且靶标性强的生物农药。

十二五规划中，国家越来越重视绿色安全低毒的生物农药的开发及应用推广，同时农业部也投入大量资金用于生物防治资源的搜集。目前用于黄瓜枯萎病生物防治的微生物资源主要有丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhiza,AM)、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、海洋枯草芽孢杆菌、黄瓜内生细菌、一些致病菌、木霉菌等。其中，木霉菌(TrichodermaPers.exFr.)，是国际上应用普遍的工业、农业微生物，在农业生产中主要做为植物病害生物防治微生物和环境修复微生物而得到应用。作为国际公认的生防菌，其生防、促生、土壤改良、环境净化等效果已得到全世界的关注和认可，具有极大的开发潜力。孟洁等实验证明木霉菌对黄瓜枯萎病的防治效果良好，同时还具有促进黄瓜提前开花和增加产量的作用；郭敏等人用绿色木霉诱导黄瓜植株产生抗性，枯萎病防治效果明显。目前，木霉菌制剂产品中暂无专一高效防治黄瓜枯萎病的产品。因此，针对黄瓜枯萎病菌防治，筛选高效拮抗木霉菌菌株日渐重要，研究其菌株特性对防治黄瓜枯萎病菌剂开发有必要的推进作用，最终得以快速实现工业化规模生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途。本发明的哈茨木霉的菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率达43.01％，非挥发性抑制物对黄瓜枯萎病的抑制率为41.33％，挥发性物质对黄瓜枯萎病的抑制率为11.49％，几丁质酶活为3.9573U，针对黄瓜枯萎病的活体防效为71.43％，能够高效防治黄瓜枯萎病病害，进而能够用于制备防治黄瓜枯萎病的农药。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途，所述木霉菌菌株为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303CGMCCNO.4963。

优选地，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQIDNO.1所示。

优选地，所述防治黄瓜枯萎病生物农药的主要成分为所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子。

优选地，所述防治黄瓜枯萎病的生物农药中所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子含量为10⁷-10¹⁰个/克。

优选地，所述防治黄瓜枯萎病的生物农药中最终哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子含量为10⁸个/克。

优选地，所述防治黄瓜枯萎病生物农药为种子包衣剂或颗粒剂。

优选地，所述种子包衣剂为木霉菌分生孢子粉与阿维菌素、申唪霉素或井岗霉素复配的种子包衣剂。

优选地，所述木霉菌分生孢子粉与阿维菌素复配的种子包衣剂具体为：用量分别为1.8％的阿维菌素与木霉菌分生孢子粉以1:500(V/W)的比例混合，以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10(重量比)的比例均匀包衣在种子表面；所述木霉菌分生孢子粉与申唪霉素复配的种子包衣剂具体为：有效成分为1％的申嗪霉素稀释1000倍后包在种子表面，用木霉菌分生孢子粉进行第二次包衣，随后以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10(重量比)的比例均匀包衣在种子表面；所述木霉菌分生孢子粉与井岗霉素复配的种子包衣剂具体为：有效成分为1％的井冈霉素·蜡质芽孢杆菌与木霉菌分生孢子粉以7:10(V/W)的比例混合，以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10(重量比)的比例包衣种子。

优选地，所述颗粒剂包括所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303发酵菌液以及质量比为77:23的硅藻土和麸皮；所述硅藻土和麸皮的混合体与发酵菌液的质量体积比为1.25Kg:1L，所述发酵菌液中分生孢子含量为10⁸cfu/mL。

本发明具有如下有益效果：本发明的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303CGMCCNO.4963，菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率达43.01％，非挥发性抑制物对黄瓜枯萎病的抑制率为41.33％，挥发性物质对黄瓜枯萎病的抑制率为11.49％，几丁质酶活为3.9573U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.5092U，胞外蛋白酶酶活为3.0678U；针对黄瓜枯萎病的活体防效为71.43％；菌株中起拮抗作用的抗生性次生代谢物总体比重占30.28％，是一种高拮抗性、强专化性的新型杀黄瓜枯萎病病害的木霉菌菌株，可用于生产高效快速杀黄瓜枯萎病菌的生物农药。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的SH2303菌株不同类别的抗生性次生代谢物分配比例示意图；

图2为施用木霉菌分生孢子颗粒剂后，黄瓜出苗率与株高的示意图；其中A为未施用的情况，B为施用后的情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2011年06月17日，保藏号为CGMCCNo.4963。

实施例

一、哈茨木霉SH2303CGMCCNO.4963的获得

申请人针对分离自华东地区蔬菜保护地土壤的野生菌株1032株木霉菌，选取木霉菌生长速度、产孢量及与离体对峙病原菌抑制率指标进行初筛，然后通过对非挥发性物质和挥发性物质检测、几丁质酶活性检测对初筛木霉进行复筛，最后通过活体接菌防效试验确定最终优选菌株SH2303，并给予保藏，名称为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303CGMCCNO.4963。

具体过程如下：采集华东地区蔬菜保护地土壤→土壤于4℃下保藏→分离纯化菌株(共计1032株)→初筛指标(生长速度、产孢量及与离体对峙病原菌抑制率)→复筛(非挥发性物质和挥发性物质检测、几丁质酶活性检测)→活体接菌防效试验。经过以上步骤反复筛选，最终选出生长速度快、高产孢量、高拮抗性的杀黄瓜枯萎病病害的木霉菌菌株，编号为SH2303。完成该菌株的菌落及分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析，从中确定了该菌株的分类地位：木霉属(TrichodermaPers.exFr.)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。

所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303CGMCCNO.4963的微生物学特性如下：

培养学的特性：25℃黑暗条件下PDA培养，菌落生长快速，3天后多数菌株的菌落半径可达8cm，气生菌丝呈卷毛状，白色至灰色。产孢区平展，在富糖培养基上常布满整个平板，或者在MA上起初形成致密的扁平产孢簇，直径可达8mm，常常呈同心轮纹状排列，或者在菌落边缘密集排列，并愈合为大的但是形状不规则的聚合体，由于分生孢子丰富，产孢簇表面常呈颗粒状或者粉状；产孢簇起初为水绿色，很快就转为黑绿色。通常边缘包围有不育的白色菌丝体，平展产孢区常呈黄绿色，从浅绿色至深葡萄绿色，反面无色至暗黄色。渗出物无色至琥珀色或者黄绿色有些菌株无明显气味或者有微弱的土腥味。

形态学的特性：菌丝透明，壁光滑，直径为2-7μm，基内菌丝直径可达12μm；分生孢子梗透明，壁光滑，直或者波曲，近基部宽度为8μm，多数区域变细，宽度为2.5-4.5μm，粗大分生孢子梗复杂分枝，初级分枝几乎呈直角，常2-3个旋涡状排列，向基部逐渐变长整个结构类似金字塔形状；瓶梗为安瓿形至亚球形或坛形，多数3.5-7.5×2.5-3.8μm，顶生瓶梗长达10μm，基部明显缢缩，中部显著膨大；分生孢子亚球形至卵圆形或短的椭球形，多数为1.7-3.2×1.3-2.5μm，壁光滑很少粗糙半透明至浅绿色。

二、哈茨木霉SH2303CGMCCNO.4963的生物学测定

1、离体条件下生长速率、产孢量的测定及对峙抑菌试验

生长速率、产孢量的测定：从活化2d的木霉菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于PDA平板中央，28℃恒温培养箱中，2d后测菌落半径及产孢半径，拮抗菌株筛选以实试验室已有的拮抗菌株H6、T23、T30为对照。

对峙抑菌试验：参照吴海云等的方法(吴海云,高增贵等,防治甜瓜枯萎病木霉菌REMI变异株筛选[J].中国植物保护周刊,2007,27:5-7.)，从活化2d的尖孢镰刀菌菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将其置于PDA平板一侧中央，28℃培养3d后，将同样大小的木霉菌饼置于尖孢镰刀菌的对侧。每菌株重复5次，以只接种尖孢镰刀菌的平板作对照。对峙平板置于28℃恒温培养箱中培养5d，测量尖孢镰刀菌的菌落半径，并计算抑制率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。由表1可以看出，相对对照菌株，SH2303生长速度最快，3d后产孢面积较大，病菌抑菌率最高。

表1菌株生长速度、产孢量及抑菌率的测定

2、离体条件下非挥发性产物、挥发性产物对病原菌的抑制作用

非挥发代谢产物抑菌作用圆盘滤膜法测定：在直径9cm的PDA平板上铺上灭过菌的圆形玻璃纸，将活化2d的木霉菌菌饼(直径5mm)置于平板玻璃纸中央，28℃恒温培养。以接种尖孢镰刀菌的处理为对照，3d后去除玻璃纸，在平板中央接入尖孢镰刀菌菌饼(直径5mm)。恒温培养3d，测量尖孢镰刀菌菌落半径，并计算抑制率，方法同上。

挥发性产物对病原菌的抑制作用：参照从姚玉桃等的方法(曹玉桃,姚革等,木霉拮抗黄瓜枯萎病菌菌株的筛选[J].西南农业学报,2007,20(3):408-411.)，活化2d的木霉菌菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，接种于PDA平板中央，黑暗条件下28℃恒温培养至菌落半径约5cm。此时，弃去平板上的菌饼，在平板上方盖上单层无菌玻璃纸，然后对扣一个大小相等，接种有直径5mm的尖孢镰刀菌菌饼的平板，病菌菌饼与上方的玻璃纸之间的空间供释放的木霉菌挥发性物质与病菌的互作，封口膜密封后将平板置于黑暗条件下28℃恒温培养。以未接供试木霉菌株的PDA平板和只接种尖孢镰刀菌的平板对扣处理为对照，每次处理重复3次，3d后测量尖孢镰刀菌菌落半径并计算抑制率，方法同上。由表2可以看出，SH2303产生非挥发性物质表现出较强的抑制效果，对病菌的抑制率为41.33％；其产生的挥发性物质抑制黄瓜枯萎病的生长，抑制率为11.49％。

表2菌株非挥发性抑制物、挥发性抑制物对病菌抑菌率的测定

3、胞壁降解酶酶活的检测

将木霉菌株接种到PDA培养基平板(直径90mm)上，在光照恒温恒湿培养箱25℃、60％湿度培养5d。把长满木霉的平板用灭菌水浸泡3-5min，用棉签轻轻刮洗下孢子及菌丝体，脱脂棉或4层纱布过滤除去菌丝体，滤液即为孢子悬浮液。根据血球记数板法进行计数，稀释后孢子悬浮液浓度为10⁶个·mL^-1孢子量。

(1)几丁质酶酶活力检测

配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)(色谱纯，SigmaChemicalCo.P.O.，Germany)的1mg·ml^-1的标准溶液，取6支25mm×250mm试管，按表3所示加入试剂，将各管混匀，在沸水中准确煮5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每个试管加入21.5ml蒸馏水，摇均。稀释后各管NAG的浓度依次为0、8、12、16、20、24、28(μg/ml)。先对7管样品通过紫外分光光度计在200～700nm范围进行全波扫描，得到其最大吸收值的波长。再对上述6支管在最大光吸收(OD)值的波长下按NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度(μg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。

表3NAG标准曲线

	0(CK)	1	2	3	4	5
							NAG标准液(mg·ml-1)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于NAG量(mg)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水(mL)	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂(mL)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

每瓶产几丁质酶发酵液(培养基组分：NH₄NO₃3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O0.6g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，胶体几丁质5g/L粉状，pH5-6，1000ml蒸馏水)接种5ml孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-1、28℃培养。采取DNS比色法测几丁质酶活：取0.5ml发酵液，加入0.05MpH6.0磷酸盐缓冲液2mL，再加入0.5mL胶体几丁质(用10g干粉几丁质制备成400mL胶体几丁质液)，每样品三个重复，一个对照，反应在25mm×250mm试管里进行；然后立即在恒温水浴锅(37℃)下准确保温水浴1h，再迅速在4℃下11000g离心10min，取上清液2mL，加入DNS试剂1.5mL，在沸水浴中准确煮沸10min，取出后立即用冷水冷却至室温。对照为0.5mL发酵液，加0.05MpH6.0磷酸盐缓冲液2mL，混合液在沸水浴中煮10min(灭活几丁质酶)，取出后用冷水冷却至室温，再加入0.5mL胶体几丁质，然后11000r·min^-1离心10min，其它操作同上。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定几丁质酶酶活，通过紫外分光光度计在530nm处测定光吸收(OD)值，把测得的OD值与NAG标准曲线对照，定量几丁质酶的活性。

几丁质酶酶活：一个几丁质酶酶活单位(1U)定义为在特定条件下(37℃、pH6.0)，每分钟酶催化胶体几丁质反应释放1μmolN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。由表4可以看出，随着培养天数的增加，SH2303几丁质酶酶活力呈先上升再下降的趋势；蛋白酶酶活力在第5d时最高，为3.9573U。

表4菌株不同培养天数的几丁质酶酶活

天数(d)	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活(U)	1.2890	2.5499	3.9573	3.5052	2.7251	1.8940	1.3877	1.1298

(2)β-1,3-葡聚糖酶酶活力检测

葡萄糖标准曲线的制作，参照杨艳红的方法(杨艳红.华山松疱锈病原菌重寄生菌的筛选及其作用机理初步研究[D].昆明：西南林学院，2004)，按表5所示加入试剂，取1mg·mL^-1标准葡萄糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，再各加入蒸馏水补足至2mL，然后分别加入0.75mLDNS溶液充分混匀，于沸水浴中准确反应15min后，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，再加入5mL蒸馏水充分混匀。于722型分光光度计540nm处测定光吸收值，以标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表5建立葡萄糖标准曲线

	0(CK)	1	2	3	4	5
							葡萄糖标准液(mL)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于葡萄糖量(mg)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水(mL)	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂(mL)	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75

每瓶TLE产酶诱导培养液(成分：1g细菌用蛋白胨，0.3g尿素，2gKH₂PO₄，1.4g(NH₄)₂SO₄，0.3gMgSO₄.7H₂O，0.3gglucose，0.005gFeSO₄，0.0017gMnSO₄，0.0014gZnSO₄，0.002gCaCl₂，1000ml蒸馏水)接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-1、28℃培养。培养3d后的发酵液样液2mL纱布过滤，4℃5000r·min^-1下离心20min，上清液即为粗酶液。参照Bara的方法并稍加改动测酶活，吸取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg·mL^-1的昆布多糖溶液1mL，50mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)0.5mL，混匀.于40℃下准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀，再于沸水浴中准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃下放置2min，再加入5mL蒸馏水充分混匀。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定β-1，3-葡聚糖酶酶活，通过紫外分光光度计在540nm处测定光吸收(OD)值，把测得的OD值与标准曲线对照，定量β-1，3-葡聚糖酶的活性，根据标准曲线求出样品中的葡萄糖含量。每个处理三次重复测定。

β-1,3-葡聚糖酶酶活：一个β-1，3-葡聚糖酶酶活单位(1U)定义为，在特定条件下(40℃、pH5.0)，以1h催化分解昆布多糖产生lμg葡萄糖的酶量。

表6菌株不同培养天数的β-1,3-葡聚糖酶酶活

天数(d)	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活(U)	0.4353	0.5092	0.2627	0.1312	0.0682	0.0490	0.0326	0.0162

由表6可以看出，随着培养天数的增加，SH2303β-1,3-葡聚糖酶酶活力呈先上升再下降的趋势；β-1,3-葡聚糖酶酶活力在第4d时最高，为0.5092U。

(3)胞外蛋白酶酶活力检测

牛血清白蛋白(BSA)标准曲线的制作：按表7所示加入试剂，取0.1mg·mL^-1标准牛血清溶液0，20，40，60，80，100μL，再各加入蒸馏水补足至200μL，然后分别加入0.02mLSK5031-1溶液和0.98mLSK5031-2溶液充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μLFolin-酚试剂迅速混匀，室温下静置30min,于紫外线型分光光度计750nm处测定光吸收值，以标准牛血清白蛋白溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表7建立BSA标准曲线

	0(CK)	1	2	3	4	5
							BSA标准溶液(μL)	0	20	40	60	80	100
蒸馏水(μL)	200	180	160	140	120	100
							BSA终浓度(mg·μL-1)	0	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05

每瓶MYG产酶诱导培养液(成分：10.0g葡萄糖，5.0g麦芽糖，5.0g酵母膏，1000ml蒸馏水)接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-1、28℃培养。发酵液每天取样，样液2mL经离心(10,000r·min-1，4℃，20min)后，取上清液于-20℃保存备用。

采用Lovrien的方法(LovrienRE，GusekT，HartB.Cellulaseandproteasespecificactivitiesofcommerciallyavailablecellulasepreparations.JApplBiochem，1985，7：258-272)进行蛋白酶酶活测定。取各样品蛋白酶溶液200μL，分别加入0.02mLSK5031-1溶液(型号为SK5031的Folin-PhenolReagent福林酚蛋白浓度测定试剂，购自生工生物工程(上海)有限公司)和0.98mLSK5031-2(购自生工生物工程(上海)有限公司)溶液充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μLFolin-酚试剂(购自生工生物工程(上海)有限公司)迅速混匀，室温下静置30min,取1mL反应混合液于紫外线分光光度计750nm处测定光吸收值，分别于第1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d测定胞外蛋白酶酶活。每个处理三次重复测定。

胞外蛋白酶酶活力：以每分钟催化分解蛋白质生成1g牛血清白蛋白的酶量为一个酶活性单位(Pu)。

表8菌株不同培养天数的胞外蛋白酶酶活

天数(d)	1	2	3	4	5	6	7	8
									酶活(U)	1.5940	3.0678	2.2906	2.0802	1.1526	0.9943	1.2931	1.5797

由表8可以看出，随着培养天数的增加，SH2303胞外蛋白酶酶活力呈先上升再下降的趋势；蛋白酶酶活力在第2d时最高，为3.0678U。

四、温室防治枯萎病试验

黄瓜种子经表面消毒(先用75％酒精浸泡15s，后用25％次氯酸钠浸泡10min)催芽后播种于直径10cm的塑料花盆中，每盆5粒种子，每菌株处理重复5盆。待植株第一片真叶伸展后，拔除生长不一致植株。当黄瓜长出2-3片复叶时，向每株黄瓜苗根际注入5ml木霉菌分生孢子粉剂(10⁷个/克、10⁸个/克、10⁹个/克和10¹⁰个/克)。3d后以沾根的方式接种黄瓜枯萎病，病菌孢子浓度约10⁷cfu/ml。28℃黑暗保湿36h，5d后调查结果。

调查方法参照闫敏等(闫敏,李磊等,利用木霉防治地黄枯萎病的研究[J].山西农业科学,2009,37(4):70-72.)：病级：0级，叶面无症状；1级，植株上1/3以下的叶面表现萎蔫症状；3级，植株上1/3～2/3叶面表现萎蔫症状；5级，全株萎蔫死亡。病株率(％)＝(病株数/调查总株数)×100，病情指数＝[∑(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×5)]×100，防治效果(％)＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100。

表9

由表9可知，花盆中接入木霉菌孢子悬液后，SH2303菌株分生孢子悬液浓度为10⁸个/克时的防效较好，为83.23％。

五、菌株抗生性次生代谢物提取分析

1、木霉菌分生孢子中抗生物质的提取

用50倍体积的CH₂C1₂于4℃低温浸提6g干燥的分生孢子2d，浸提液经5％活性炭振荡吸附2h，用已灭菌的四层纱布过滤除杂，上清液加入等体积的3％碳酸钠溶液萃取，重复一次，将碳酸钠溶液合并后留取CH₂Cl₂部分，用少许CH₂C1₂洗涤回收后并人洗涤液，洗涤液加无水硫酸钠脱水，再用快速滤纸进行过滤，最后将脱水洗涤液于40℃下真空减压浓缩后得到1mL的粘稠状含抗生物质的粗提物。

粗提物溶剂挥发后，精确称量固形粗提物，作为测定粗提物组分绝对含量的标准量。

2、提取物GS-MS分析

采用气相色谱-质谱联用仪对提取物的成分进行分析，仪器型号为Agilent6890-5973NGC—MS，参数设置为：

离子源为EI，

电子能量为70eV，

离子源温度为230℃，

接口温度为280℃，

质量扫描范围为290amu-500amu，

起始柱温50℃，恒温5min后以5℃/min升温到300℃

汽化室温度为300℃，

载气为氦气，

分流比为10：1，

进样量为1μl。

3、提取物化学成分分析

采用气相色谱-质谱联用仪进行定性分析，结合计算机检索技术，对化学成分进行分离鉴定，应用气相色谱峰面积归一化法测定各成分的相对含量。由表10、图1可知，木霉菌菌株SH2303抗生性次生代谢物物质较多，共检测分析到53馏分，按照抗生性次生代谢物种类分类汇总如图1所示，其中烷烃类比例最大，达34.96％；在拮抗中起着至关重要作用的聚酮类和萜烯类分别占3.42％和11.82％，其次羧酸及其衍生物比重占15.04％。总体来看，菌株SH2303中起拮抗作用的抗生性次生代谢物总体比重占30.28％。

表10菌株抗生性次生代谢物分析结果

综上所述，本发明的哈茨木霉的菌株生长速度快、产孢量大、离体对峙病原菌抑制率达43.01％，非挥发性抑制物对黄瓜枯萎病的抑制率为41.33％，挥发性物质对黄瓜枯萎病的抑制率为11.49％，几丁质酶活为3.9573U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.5092U，胞外蛋白酶酶活为3.0678U；针对黄瓜枯萎病的活体防效最少为71.43％，菌株中起拮抗作用的抗生性次生代谢物总体比重占30.28％，能够高效防治黄瓜枯萎病病害，进而能够用于制备防治黄瓜枯萎病的农药。

六、防治黄瓜枯萎病的农药剂型的选择

1、种子包衣剂

表11供试药剂及来源

1.1戊唑醇与拮抗木霉菌复配

将有效成分为25％的戊唑醇与分生孢子含量为10⁸个/克的木霉菌分生孢子粉分别以1:5、1:10、1:20、1:100(V/W)的比例混合。以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10的比例均匀包衣在种子表面，自然晾干后播种，以下种子包衣方法与此相同。

多数混配比例对玉米出苗影响未达到显著性的水平，但1：10比例表现出显著性抑制。单独木霉菌粉剂包衣种子对黄瓜出苗率无明显影响，而且对株高具有明显促进作用，实现了防治黄瓜枯萎病的同时而不伤害植株本体。随着混剂中戊唑醇含量增加，对黄瓜株高的抑制作用越明显(表12)。

表12戊唑醇与拮抗木霉菌分生孢子粉复配包衣种子对黄瓜幼苗生长的影响

注：相同小写字母表示在0.05水平上差异不著性(新复极差法)，下表同。

CK1：木霉菌粉剂包衣，药种比：1:10；CK2：空白处理

1.2阿维菌素与拮抗木霉菌复配

将有效成分为1.8％的阿维菌素与木霉菌粉剂分别以1:25、1:50、1:100、1:500(V/W)的比例混合，然后将混剂以药种比1:10的比例均匀包衣种子。

拮抗木霉菌粉剂和阿维菌素1：100、1：25混配对出苗率的抑制作用比较明显，其中1：100混合比例抑制出苗最明显。1:500和1:25对于株高具有明显促进作用(表13)。

表13阿维菌素与拮抗木霉菌复配包衣种子对黄瓜幼苗生长的影响

CK1：木霉菌粉剂，药种比：1:10；CK2：空白处理

1.3申嗪霉素与拮抗木霉菌复配

先将有效成分为1％的申嗪霉素稀释50、100、300、500、1000倍，分别包在种子表面，然后再用木霉粉剂进行第二次包衣。

随着申嗪霉素浓度的降低，其对于种子的出苗率抑制作用也逐渐降低。当稀释至300倍以上时，对株高促进作用明显增强(表14)。

表14申嗪霉素与拮抗木霉菌复配包衣种子对黄瓜幼苗生长的影响

1.4井冈霉素·蜡质芽孢杆菌与拮抗木霉菌复配

将有效成分为1％的井冈霉素·蜡质芽孢杆菌与木霉菌粉剂分别以2:10、5:10、7:10、1:1(V/W)的比例混合，将混剂以药种比1:10的比例包衣种子。

除2:10混合比例外，其它混合比例对出苗影响不大，其中5:10反而对出苗有一定的促进作用(表15)。

表15井冈霉素·蜡质芽孢杆菌与木霉菌粉剂复配包衣种子对黄瓜幼苗生长的影响

当拮抗木霉菌粉剂与各种农药混配后对出苗率和株高的影响主要取决于混配比例，而且并不是混剂中化学组分含量越高抑制作用越强，说明拮抗木霉菌粉剂与化学组分、黄瓜幼苗间存在一定的特异互作。相比较而言，阿维菌素、申唪霉素、井岗霉素·蜡质芽孢杆菌等生物化学农药与拮抗木霉菌粉剂混配包衣种子对出苗和幼苗生长比较安全。木霉菌粉剂与阿维菌素和申唪霉素混配包衣种子具有一定的协同促黄瓜生长作用。因此创制木霉菌与阿维菌素、申唪霉素、井岗霉素复合种衣剂具有较好的应用前景，可实现病虫兼治和防病增产作用。

研究还表明：尽管对戊唑醇进行减量化使用，但与木霉菌粉剂复配后，仍能易抑制玉米出苗和植株生长。因此，拮抗木霉菌与该两种化学杀菌剂复配需要慎重。

2、颗粒剂

按照质量比77:23分别称取硅藻土与麸皮，混合均匀制作营养体；将所述营养体与发酵菌液以质量体积比为1.25Kg:1L的比例搅拌混匀，然后取出湿润的半成品，经过干燥粉碎机干燥粉碎。将木霉菌分生孢子颗粒剂在机械化播种前撒施于地表，等玉米出苗后开始调查黄瓜出苗率及株高。如图2所示，左边的柱形图A表示未施用木霉菌分生孢子颗粒剂的黄瓜出苗率与株高，右边的柱形图B表示施用木霉菌分生孢子颗粒剂后的黄瓜出苗率与株高。结果显示，施用木霉菌分生孢子颗粒剂后，黄瓜出苗率与株高都有明显提高。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (3)

1.一种木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途，所述木霉菌菌株为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303CGMCCNO.4963；所述防治黄瓜枯萎病生物农药为种子包衣剂；所述种子包衣剂为木霉菌分生孢子粉与阿维菌素、申嗪霉素或井岗霉素复配的种子包衣剂；所述防治黄瓜枯萎病生物农药的主要成分为所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子；所述防治黄瓜枯萎病的生物农药中所述哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子含量为10⁷-10¹⁰个/克；所述木霉菌分生孢子粉与阿维菌素复配的种子包衣剂具体为：用量分别为1.8％的阿维菌素与木霉菌分生孢子粉以1:500的体积质量比混合，以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10的比例均匀包衣在种子表面；所述木霉菌分生孢子粉与申嗪霉素复配的种子包衣剂具体为：有效成分为1％的申嗪霉素稀释1000倍后包在种子表面，用木霉菌分生孢子粉进行第二次包衣，随后以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10的比例均匀包衣在种子表面；所述木霉菌分生孢子粉与井岗霉素复配的种子包衣剂具体为：有效成分为1％的井冈霉素·蜡质芽孢杆菌与木霉菌分生孢子粉以7:10的体积质量比混合，以1％的CMC为粘着剂，将混剂以药种比1:10的比例包衣种子。

2.根据权利要求1所述的木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途，其特征在于，所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的木霉菌菌株在制备防治黄瓜枯萎病生物农药中的用途，其特征在于，所述防治黄瓜枯萎病的生物农药中最终哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SH2303的分生孢子含量为10⁸个/克。