CN100381432C - 吡喃酮抗生素及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

吡喃酮抗生素及其制备方法与应用，属于生物技术领域。抗生素吡喃酮，分子式C₁₀H₁₆O₂，分子量168，分子结构为：见右式，用固体培养基培养绿色木霉LTR-2，获得孢子粉。用二氯甲烷5-10℃浸泡孢子粉，浸泡液依次经活性炭吸附，碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸钠脱水，最后将处理液减压浓缩至粘稠状，得到含抗生素吡喃酮的浓缩物。以吡喃酮浓缩物为有效成分配制成农用制剂，一种可湿性粉剂，组分为硅藻土、含吡喃酮的浓缩物、十二烷基苯磺酸钠和吐温80。本发明吡喃酮抗生素有强烈的抗菌活性，可广泛用于农业领域。

Description

吡喃酮抗生素及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及吡喃酮抗生素及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

木霉菌(Trichoderma spp.)在产生抗生素方面具有优势，就其种类而言，仅抗真菌的代谢产物在70种左右，多数种类产生的抗生素不止一种，如哈茨木霉可产生12种，康氏木霉可产生9种，绿色木霉可产生10种，钩状木霉可产生7种，长枝木霉可产生3种，多孢木霉可产生2种。

丹尼斯，韦伯斯特，木霉菌产生的非挥发性抗生素，菌物学，1971年57期(DENNIS C，WEBSTER J.Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma production ofnon-volatile antibiotics[J].Trans Br Mycelia Soc，1971，57：25-39.)认为抗菌物质包括烷基吡喃酮、丁烯羟酸内酯、环硫氧化哌、嗪、吡啶类、萜类和肽类化合物。贺瑞斯，理查德，梵尼斯等，哈兹木霉产生的6-戊烷基吡喃酮：植物生长抑制剂和杀菌剂，农业生物化学，1986年50期(HORACE G C，RICHARD H C，FANIST G，et al.6-Pentyl-Q-pyrone fromTrichoderma harzianum：Its plant growth inhibitory and antimicrobial properties[J].Agric Biol Chem，1986，50(11)：2943-2945.)报道，哈茨木霉菌防治立枯丝核菌的主要机制之一就是产生了挥发性抗生素，经过鉴定为6-戊烷基吡喃酮。朱天辉，邱德勋，哈茨木霉对立枯丝核菌的抗生现象[J]，四川农业大学学报，1994，12(1)：11-15，研究哈茨木霉菌对立枯丝核菌的抗生作用，发现F060菌株的代谢物质能抑制立枯丝核菌的菌落扩散，降低其菌丝干量，而且非挥发性代谢物具热稳定性。贝斯特，木霉属下定义：长枝木霉，澳洲羊毛制品，1984年62期(Bissett J.A revision of the genus Trichoderma.I.Sectionlongibrachiatum sect.nov.[J].Canad.J.Bot.，1984，62：924-931.)从长枝木霉菌中分离提纯出特殊的抗菌肽，命名为trichobrachin，并测定了其氨基酸序列。

我国的农作物病害每年造成大量损失，现在的防治手段除了一部分抗病品种外，主要依赖于喷洒大量的化学杀菌剂，造成农产品的有毒化学物质的残留，病原菌的抗药性上升，生态环境恶化。发展生物农药，是保证农业生产不受病虫草害危害，而又不污染农产品的重要途径。木霉菌是重要的植物病害生物防治菌，能够产生多种抗生素，其中吡喃酮类化合物已被证实有强烈的抗菌活性，但现在还没有具体的制备方法及农用制剂。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种吡喃酮抗生素及其制备方法与应用

1、本发明的抗生素吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)，分子式C₁₀H₁₆O₂，分子量168，分子结构为：

2、本发明的吡喃酮抗生素的制备方法，步骤如下，均为重量比：

(1)用固体培养基，麸皮∶玉米粉＝7∶3，含水量为70％，硫酸亚铁为100μg/mL，pH6.0，培养绿色木霉(Trichoderma viride)LTR-2，获得孢子粉。所述的绿色木霉LTR-2，保藏号为CGMCC NO.1498。

(2)用二氯甲烷5-10℃浸泡孢子粉2天，浸泡液依次经5％活性炭吸附，3％碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸钠脱水，最后将处理液减压浓缩至粘稠状，得到含抗生素吡喃酮的浓缩物。

对于上述产物进行分离纯化和活性测定，继续以下步骤：

(3)采用硅胶柱分离纯化上述浓缩物。用流动相(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，体积比)梯度洗脱，离心管收集流分。

(4)用硅胶板将各管收集样展开(石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，体积比)，经波长λ＝302nm的紫外灯检测后，合并相同的流分，减压浓缩，以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为指示菌，采用PDA平板扩散法测定各流分的抑菌活性。

(5)保留有抗性的流分，在硅胶板上展开。合并R_f值(比移值)相同的样品，用二氯甲烷复溶，采用PDA平板扩散法测定其抑菌活性。如此重复展开及收集检测，至活性样品薄层展开后仅为一纯斑点。

样品测定采用气相色谱-质谱联用仪(Agilent 6890N-5973N GC-MSD)：离子源为EI，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为280℃，质量扫描范围为29-500amu，色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25um)，起始柱温50℃，恒温5min后以5℃/min升温到300℃，汽化室温度为300℃，载气为氦气，分流比为10∶1，进样方式为GC。结果抗性成分为吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)。

上述步骤(2)中按孢子粉50g/lL的量加入二氯甲烷。

上述步骤(2)所述的活性炭吸附是除去二氯甲烷浸泡液中的色素，洗涤是用3％碳酸钠溶液洗涤1-2次，除去二氯甲烷浸泡液中的酸性成分。

上述步骤(3)采用的硅胶柱为40cm×3cm，用10mL离心管收集流分。

上述步骤(4)所用硅胶板为GF254，10cm×20cm×0.25mm。

上述步骤(1)的绿色木霉LTR-2是按如下方法获得的：

样品的采集：采集样品为蔬菜田土，地点为济南，用铁铲拨开表层泥土，直至见到有植物根系存在的土层，将土壤连同植物的根一起铲出，用聚乙烯袋装好，带回实验室。

分离方法：将根系连同土壤稍风干，轻拍根系，使粘附土壤脱落，然后以灭菌水充分漂洗根上残留的土壤，保留漂洗液，用无菌生理盐水作梯度稀释，并分别取0.1mL滴入TSM培养基平板上，用灭菌的L形玻璃棒涂匀，置28℃恒温箱中培养2-4天。挑取菌落形态近似木霉菌的单菌落，转接PDA平板纯化培养，经镜检初步鉴定为木霉菌，编号保存于PDA斜面上。

上述PDA培养基：取土豆200g，洗净切成小块，用水煮沸30min，用纱布过滤，保留滤液，加入10g葡萄糖，15g琼脂，定容至1000mL，121℃灭菌20min备用(无菌操作加入氯霉素使培养基氯霉素含量达到100μg/mL)。

上述TSM培养基(木霉菌半选择培养基)：MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄0.9g，KCl 0.15g，NH₄NO₃1.0g，葡萄糖3.0g，玫瑰红0.15g，60％敌克松可湿性粉剂0.3g，PCNB 0.2g，琼脂15g，水1000mL。121℃灭菌20min备用(无菌操作加入氯霉素使培养基氯霉素含量达到100μg/mL)。

3、吡喃酮抗生素的应用

本发明吡喃酮抗生素在农业上的应用，以吡喃酮为有效成分配制成农用制剂，一种可湿性粉剂，组分如下，均为重量份：

硅藻土                                   68-84份

含吡喃酮的浓缩物(上述步骤(2)的产物)      10-20份

十二烷基苯磺酸钠                         5-10份

吐温                                     801-2份。

将上述组分用超微粉碎机进行粉碎，过325目筛。

上述组分中硅藻土为载体，十二烷基苯磺酸钠为助剂，非离子表面活性剂吐温80为消泡剂。

上述农用制剂的应用效果如下：

(1)抗菌谱测定(表1)：

将上述吡喃酮抗生素可湿性粉剂稀释，与冷却至45℃的PDA培养基混合倾倒平板，使混合后粉剂的浓度为200μg/mL。将事先培养好的植物病原真菌平板用无菌打孔器打取直径为5mm的菌片，分别接入上述配制好的含药平板中央，相同的处理设3个重复，以不加药的PDA平板作空白对照，25℃培养2-5天记录病原真菌的菌落扩展直径，计算抑制率。

抑制率％＝(对照菌落扩展面积-药剂处理菌落扩展面积)×100％/对照菌落扩展面积。

表1本发明农用制剂的抗菌谱测定

(注：“CK”表示病原真菌在无药PDA平板上的扩展直径，“处理”表示病原真菌在含本制剂浓度200μg/mL的PDA平板上的扩展直径。)

(2)温室生物活性测定(表2)：

供试病原真菌为棉花立枯病菌(R.solani)，用小米培养基培养病原真菌(取新鲜小米，自来水浸泡24h，用纱布滤去多余水分，将小米装入三角瓶中，121℃、30min灭菌，取出30℃培养12h，第二天121℃、45min二次灭菌。冷却后，用无菌接种环从平皿上挑取预培养的菌丝块接入瓶中，置25℃恒温箱中培养，中间不断振摇，至病原菌布满小米粒即可)。

供试作物为棉花(新陆早1号)，用本发明的吡喃酮抗生素可湿性粉剂拌种(干种子量的0.5％)，以多菌灵1％拌种为药剂对照，以清水浸种作空白对照。每盆内分别接入上述不同处理的种子20粒，布满病原菌的小米5粒，每处理设3个重复，随机区组排列。温室培养，温度为25-35℃，湿度为40-70％，定期定量浇水。试验期为42天。

棉花立枯病病情调查与防治效果计算：

0：无病；1：茎基部有小病斑，占茎围的1/4以下；2：茎基部病斑较大，约占茎围的1/4-1/2；3：茎基部病斑占茎围的1/2以上，但尚未破坏整个茎围；4：茎基部病斑占据全部茎围，植株死亡。

病株率％＝每个处理的病株数×100％/每个处理的总株数

病情指数％＝∑(各病级×各级株数)×100％/(最高病级×总调查株数)

防治效果％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100％/对照病情指数

表2本发明农用制剂对棉花立枯病的防治效果

(注：数据采用LSR法统计，不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。)

上述试验结果表明本发明的吡喃酮抗生素有强烈的抗菌活性，可广泛用于农业抗菌制剂的制备。

附图说明

图1是实施例2步骤(4)的产物吡喃酮对立枯丝核菌的PDA平板抑制作用。1为对照，2为吡喃酮。

图2是本发明吡喃酮的分子结构和质谱图。纵坐标(Abundance)：峰度，横坐标m/z：质核比，图中Scan 4125：扫描数，YHT9.D(-)：文件名。

具体实施方式

实施例1：绿色木霉LTR-2的固体发酵培养，以下均为重量比或重量百分比。

绿色木霉LTR-2，保藏号为CGMCC NO.1498，是从土壤中分离、筛选得到的，经室内平板拮抗实验和大田生物防治试验发现，该菌株抑菌谱广，防治效果好，易培养，无污染。

绿色木霉LTR-2的固体发酵培养，按以下步骤进行：

(1)斜面菌种：采用固体PDA培养基，将该绿色木霉LTR-2接种在试管培养基上，28℃培养2-3天。

(2)茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体茄瓶中，置于摇床上28℃振荡培养3-4天。

(3)液体菌种：采用种子培养基，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.3％，碳酸钙1％，pH6.0，121℃灭菌40分钟，将1-2个茄瓶的种子用无菌水洗下，接种于150立升的种子罐内，30℃培养，通气量1∶0.6-0.8，搅拌速度为200r/min，培养时间为36-48小时。

(4)固体菌种：采用固体培养基，麸皮∶稻壳∶玉米粉＝7∶1∶2，含水量为70％(其中包括接种的液体菌种的水分)，pH6.0，121℃灭菌40分钟后以循环水冷却，在混合接种器内将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为5-10％，接种完毕转移到固体培养室内培养。

(5)培养：培养基厚度为5cm，料温控制在30±2℃，室温控制在25-30℃±2℃，空气的相对含水量控制在95-100％，培养时间为5-7天。

培养完毕，将固体培养物自然风干，成品含水量控制在5-10％，得绿色木霉LTR-2固体培养物。过100目筛收集孢子粉。

实施例2：吡喃酮抗生素的制备，以下均为重量百分比。

(1)孢子制备

将绿色木霉菌LTR-2固体培养物(实施例1产物)用100目筛过筛，收集孢子粉。

(2)孢子中吡喃酮抗生素的提取

将孢子粉按50g/1L的量加入二氯甲烷5℃浸泡2天，浸泡液用5％活性炭吸附2h，经滤纸过滤除去活性炭及孢子残渣，上清液加入等体积的3％碳酸钠溶液洗涤，重复一次，将碳酸钠溶液合并后，用少许二氯甲烷洗涤，并入二氯甲烷浸泡液，然后加无水硫酸钠脱水，将二氯甲烷浸泡液在35℃下减压浓缩至粘稠状液体，得到含吡喃酮抗生素的浓缩物。

(3)吡喃酮抗生素的分离纯化

采用硅胶柱(40cm×3cm)分离纯化上述浓缩物。取100g硅胶G(60-100目)，置120℃活化1h，与500mL石油醚混匀后小心装入硅胶柱内，平衡1h，放出石油醚至接近硅胶上表面1cm左右。

浓缩物与少量硅胶及石油醚混匀，小心倒入柱中，平衡30mi n。

加入流动相(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，体积比)梯度洗脱，用10mL离心管收集流分。

硅胶板(GF254，10cm×20cm×0.25mm)置115℃烘箱中活化1h，在距底边1.5cm处点样，将收集流分在硅胶薄板上(石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1)展开，待溶剂前沿上升至距板上边缘2cm处即可结束层析。取出硅胶板用吹风机吹干，置λ＝302nm的紫外灯下检测。合并相同流分，减压浓缩，以立枯丝核菌为指示菌采用PDA平板扩散法测定各流分的抑菌活性。

(4)保留有抗性的流分，在硅胶板上展开，合并R_f值相同的样品，用二氯甲烷复溶，同(3)法测定抑菌活性。如此重复展开及收集检测，至活性样品薄层展开后仅为一纯斑点。

上述步骤(4)的产物吡喃酮对立枯丝核菌的PDA平板抑制作用(见图1)，1为对照，2为吡喃酮。在PDA平板垂直交叉线上距中央35mm处打取4个直径5mm的孔洞，2个洞内滴入50uL的浓度为200μg/mL的吡喃酮(溶剂为二氯甲烷)，另2个洞内滴入同体积的对照溶剂二氯甲烷，平板中央接入直径5mm的立枯丝核菌菌片，25℃培养2-3天观察吡喃酮的抑菌效果。结果吡喃酮对立枯丝核菌有强烈的抑制作用，抑菌带大小为6.5mm(孔洞内边缘与病原菌菌落外边缘间的最小值)，而对照孔洞已长满病原菌。

(5)用气相色谱-质谱联用仪(Agi lent 6890N-5973N GC-MSD)分析：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，柱温从50℃升到300℃。结果抗性成分为吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)。检测结果如图2所示。

实施例3：抗生素吡喃酮的农用制剂，均为重量份：

硅藻土              84份

含吡喃酮的浓缩物    10份

十二烷基苯磺酸钠    5份

吐温80    1份。

上述含吡喃酮的浓缩物为实施例2中步骤(2)的产品。

实施例4：抗生素吡喃酮的农用制剂，均为重量份：

硅藻土              74.5份

含吡喃酮的浓缩物    16份

十二烷基苯磺酸钠    8份

吐温                801.5份。

上述含吡喃酮的浓缩物为实施例2中步骤(2)的产品。

其中，生物材料绿色木霉LTR-2样品已保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市海淀区中关村北一条13号；保藏日期：2005年10月20日；保藏编号：CGMCC No.1498；分类命名：绿色木霉(Trichoderma viride)。

Claims (6)

1.一种以下结构的吡喃酮抗生素的制备方法，

其步骤如下：

(1)用固体培养基培养绿色木霉LTR-2，获得孢子粉，所述的绿色木霉LTR-2，保藏号为CGMCC NO.1498；

(2)用二氯甲烷5-10℃浸泡孢子粉2天，浸泡液依次经5％活性炭吸附，3％碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸钠脱水，最后将处理液减压浓缩至粘稠状，得到含抗生素吡喃酮的浓缩物；

对于上述产物进行分离纯化和活性测定，继续以下步骤：

(3)采用硅胶柱分离纯化上述浓缩物，用流动相，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，梯度洗脱，离心管收集流分；

(4)用硅胶板将各管收集样展开，石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，经λ＝302nm的紫外灯检测后，合并相同的流分，减压浓缩，以立枯丝核菌为指示菌，采用PDA平板扩散法测定各流分的抑菌活性；

(5)保留有抗性的流分，在硅胶板上展开，合并R_f值相同的样品，用二氯甲烷复溶，采用PDA平板扩散法测定其抑菌活性；如此重复展开及收集检测，至活性样品薄层展开后仅为一纯斑点，采用气相色谱-质谱联用仪测定，结果抗性成分为吡喃酮。

2.如权利要求1所述的吡喃酮抗生素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中按孢子粉50g/1L的量加入二氯甲烷。

3.如权利要求1所述的吡喃酮抗生素的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的活性炭吸附是除去二氯甲烷浸泡液中的色素，洗涤是用3％碳酸钠溶液洗涤1-2次，除去二氯甲烷浸泡液中的酸性成分。

4.如权利要求1所述的吡喃酮抗生素的制备方法，其特征在于，步骤(3)采用的硅胶柱为40cm×3cm，用10mL离心管收集流分。

5.如权利要求1所述的吡喃酮抗生素的制备方法，其特征在于，步骤(4)所用硅胶板为GF254，10cm×20cm×0.25mm。

6.如权利要求1所述的吡喃酮抗生素作为农用杀菌剂的用途，其中将权利要求1所述的吡喃酮有效成分配制成农用制剂，该农用制剂为一种可湿性粉剂，组分如下，均为重量份：

硅藻土              68-84份

含吡喃酮的浓缩物    10-20份

十二烷基苯磺酸钠    5-10份

吐温80              1-2份；

将上述组分用超微粉碎机进行粉碎，过325目筛。

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