CN117778242A

CN117778242A - 一种多功能微生物菌剂及应用

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Publication number: CN117778242A
Application number: CN202311749064.7A
Authority: CN
Inventors: 汪军; 梁昌聪; 黄俊生; 周游; 郭立佳; 杨腊英; 杨扬
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2023-12-19
Filing date: 2023-12-19
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明公开了一种多功能微生物菌剂及应用。所述微生物菌剂包括具有协同作用的枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06、载体和增效剂，该菌剂对多种植物病害如枯萎病、根结线虫、心腐病、白粉病、炭疽病、锈病、青枯病、溃疡病、黄龙病具有防病促生功效。本发明解决了以往微生物菌剂因质量构成和施用方式不科学缺陷所致的田间应用不稳定的问题，具有绿色环保高效的优势。

Description

一种多功能微生物菌剂及应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治、微生物发酵技术领域，特别涉及一种多功能微生物菌剂及应用。

背景技术

由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、根结线虫(Meloidogyne spp.)引起的作物枯萎病、青枯病、根腐病和根结线虫病等毁灭性土传病害；由专性寄生在柑橘韧皮部筛管组织中的革兰氏阴性细菌(Candidatus Liberibacter)亚洲种(Candidatus Liberibacterasiaticus，CLas)引起的柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)，被视为“柑橘癌症”，已严重制约了柑橘产业健康发展。以及灰梨孢菌(Magnaporthe oryzae)、单丝壳白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、桑锈孢锈菌(Aecidium mori)、地毯草黄单胞杆菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的水稻稻瘟病、甜瓜白粉病、芒果炭疽病、桑树赤锈病、柑橘溃疡病等叶面病害给我国农业生产造成巨大损失。传统以化学药剂防治为主的措施不但未能遏制上述重大病害上升的趋势，而且还抑制了土壤和植株中的有益微生物，导致病原菌产生抗药性和再猖獗，同时造成有害物质残留，导致农产品质量下降，高毒高残留农药使用还会造成农产品重大安全问题。

当前国内外有关应用微生物菌剂克服防控土传病害的研究论文和市场上微生物菌剂产品很多，但总体防控治理效果不稳定、不理想。究其原因，主要是两个方面的问题：(1)质量构成缺陷：功能菌株协同性差、助剂和载体配比不合理；(2)施用技术缺陷，按照传统化学肥料直接稀释施用，忽略了菌剂中的有效菌处于休眠状态，未经预培养施用，导致有效施用菌量和活性物质不足。

尽管有论文“邵雪凤.防控土传病害的41号菌肥田间激活技术研究与应用.2020.华中农业大学.”报道了含氨基酸的复合芽孢杆菌菌肥田间激活技术可以提高其有效活菌量13.8倍、抑菌圈直径70.7％、IAA含量81.4％，对香蕉枯萎病和番茄枯萎病菌的拮抗作用，但是该技术还存存在缺陷：稀释倍数单一(50倍)，温度范围窄(25-37℃)，成本偏高(打氧泵连续通气36h)；抗菌谱窄和拮抗机制单一(针对两种土传真菌病害香蕉枯萎病和番茄枯萎病)，导致田间激活过程中易受自然界中杂菌污染，抑制产品中功能菌的繁殖，从而影响产品施用活性；同时上述技术没有涉及到不同拮抗机制的微生物之间的如何协同，以及与载体等复配后从而扩大抗菌谱，不仅控制预培养或施用后的杂菌污染，而且有效防治多种土传真菌、细菌和根结线虫病害、叶部真菌和细菌病害、系统性病害柑橘黄龙病等不同施用关键技术，因此有必要选用功能不同的优良菌株协同组合，补充配比合理的载体和增效剂，研发抗菌谱广而且高效的多功能微生物菌剂和科学施用技术。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明选择功能互补的优良生防菌株构建微生物菌群，研发多功能微生物菌剂和科学的田间应用技术，为植物病害绿色高效防控提供有效技术支撑。

本发明的技术方案如下：

一种多功能微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HW05、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)E16和绿色木霉(Trichoderma viride)H06，每克多功能微生物菌剂中的有效活菌数分别为：枯草芽孢杆菌1.2×10⁹-1.8×10¹⁰个、解淀粉芽孢杆菌1.2×10⁹-1.8×10¹⁰个、淡紫拟青霉1.2×10⁸-1.8×10⁹个、绿色木霉1.2×10⁸-1.8×10⁹个。

四株菌株由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述枯草芽孢杆菌BLG010的保藏编号为CGMCC No.5953，保藏日2012年04月06日；解淀粉芽孢杆菌HW05保藏编号为CGMCC No.10273，保藏日2015年01月04日；淡紫拟青霉E16保藏编号为CGMCC No.5951，保藏日2012年04月06日；绿色木霉H06保藏编号为CGMCC No.6229，保藏日2012年06月15日。

优选的，所述的多功能微生物菌剂中还包括载体；所述载体为氨基酸螯合钙镁锌硼粉(游离氨基酸总量＝35.6％，螯合钙含量＝10.7％，螯合镁含量＝3.1％，锌含量＝1.54％，硼含量＝0.52％)。

进一步的，本发明提供所述的多功能微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将枯草芽胞杆菌BLG010接种于1/2LB液体培养基中培养48-72h，喷雾干燥得到枯草芽胞杆菌菌粉；

(2)将解淀粉芽孢杆菌HW05接种到1/2LB液体培养基中培养48-72h，喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌菌粉；

(3)将淡紫拟青霉E16接种到液体发酵培养基中培养48-72h，按质量比20％接种到装有固体发酵培养基的双层纱布袋中，培养5-7d，干燥24h-48h，取发酵产物震荡过筛，获得淡紫拟青霉菌粉；

(4)将绿色木霉H06接种到1/2LB液体培养基中培养48-72h，按质量比20％接种到装有固体发酵培养基的双层纱布袋中，培养5-7d，干燥24h-48h，取发酵产物震荡过筛，获得绿色木霉菌粉；

(5)按照重量比，取枯草芽孢杆菌菌粉10-30份、解淀粉芽孢杆菌菌粉10-30份、淡紫拟青霉菌粉1-5份、绿色木霉菌粉1-5份，将菌粉混合，获得复合菌粉，按照质量比1:10-20将复合菌粉与载体混合，得多功能微生物菌剂。

优选的，按质量百分比计，所述1/2LB液体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％和NaCl 0.5-1％；所述1/2LB固体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％、NaCl 0.5-1％和琼脂1.2-1.5％；淡紫拟青霉液体发酵培养基含有：2％蔗糖、1％几丁质和0.001％硫酸锰；淡紫拟青霉E16固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:1-5:10-30的木薯渣:玉米粉:椰糠:壳聚糖:水；绿色木霉H06固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:20-40的木薯渣:玉米粉:椰糠:水。

另一方面，本发明提供所述的多功能微生物菌剂在防治由病原物引起的植物病害中的应用，所述病害包括：枯萎病、根结线虫、心腐病、青枯病、稻瘟病、白粉病、锈病、炭疽病、溃疡病和黄龙病。

优选的，所述病害包括：香蕉枯萎病、香蕉根结线虫、番茄根结线虫、芹菜根结线虫、辣椒根结线虫、菠萝心腐病、水稻稻瘟病、甜瓜白粉病、芒果炭疽病、桑树赤锈病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病。

优选的，所述病原物包括：尖孢镰刀菌、根结线虫、烟草疫霉、青枯雷尔氏菌、灰梨孢菌、单丝壳白粉菌、胶孢炭疽菌、桑锈孢锈菌、韧皮部杆菌、地毯黄单胞杆菌。

优选的，所述应用的方法包括以下步骤：

(1)制备预培养液：多功能微生物菌剂每次盆栽用量按0.1-0.3g/kg土施用，每次田间用量按1-10kg/亩施用，按质量倍数用水稀释10-30倍后，在环境温度15-40℃条件下放置24-72小时，静置或用水泵通气或每隔2-12小时手动搅拌1次，获得预培养液，再稀释50-100倍，按照质量比0.1-0.5％比例添加增效剂，获得预培养液，将预培养液分成两份，根部喷施预培养液体积的70％-90％，叶部施用预培养液体积的10％-30％；

(2)根部施用预培养液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的预培养液，或按质量比添加0.1％～0.5％复合肥的预培养液根部喷施；

(3)叶部施用预培养液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的预培养液，或按质量比添加0.1％～0.5％复合肥和/或常见叶面杀虫剂的预培养液喷施叶片正面和背面。

采用该应用方法，可提高多功能微生物菌剂中有效施用菌量和活性物质含量，克服叶部表面的蜡质层疏水性和土壤粘附性，促进多功能微生物菌剂施用后快速渗透扩散到植株内部和发病部位，提高施用后的防病促生功效。

优选的，按质量百分比，所述增效剂包括甘油10％-30％、牛樟芝多糖10％-70％、甲基纤维素20％-80％、十二烷基苯磺酸钠10％-20％。其主要作用协助多功能微生物菌剂中的有效菌在土壤和植株表面快速附着、生长、扩散和渗透到植株体内发病部位，清除发病部位的病原物。

本发明的有益效果：

生物防治具有绿色环保优势，无任何农药残留和要害等问题。枯草芽胞杆菌抗菌谱广，对多种土传枯萎病、疫病真菌和青枯病细菌具有拮抗作用，抗逆性强；解淀粉芽孢杆菌对抗菌谱广，对系统性病害柑橘黄龙病、多种土传病原菌真菌病害(枯萎病、疫病等)和土传细菌病害(青枯病等)、叶部病害(白粉病、溃疡病、锈病和炭疽病等)具有拮抗作用；淡紫拟青霉是防治根结线虫的优良生防菌，同时对枯萎病具有抑制作用，木霉菌拮抗土传病原菌的能力比不上拮抗芽胞杆菌，在土壤中营养竞争能力、宿存能力较长，根际促生效果较好，四者互配能协同增效。四种菌株复配后与载体和增效剂形成具有协同增效菌群应用组合，菌剂中有效活菌数含量，延长货架期。同时可补充田间菌体萌发和分泌活性物质所需的关键营养，抗菌谱广而且高效，通过田间施用前的预培养既可以避免杂菌污染，而且快速促进菌群由休眠结构转换到萌发状态，菌体数量和活性物质含量大幅增加，配合水肥一体化施用，在载体和增效剂的辅助下土壤和植株表面快速附着、生长、扩散和渗透到植株体内发病部位，清除发病部位的病原物，达到田间应用中防病促生功效、稳定性显著增加的目的。

本发明操作简便、效率高、周期短，优势显著，同时通过微生物菌剂和/或复合肥、杀虫剂的协同施用，降低施用成本，使有益微生物在施用后在土壤和植株内扩散繁殖，能够有效消除土壤和植株内的病原菌含量，大幅度降低导致枯萎病、根结线虫、青枯病、心腐病和柑橘黄龙病等重大病害，以及稻瘟病、白粉病、溃疡病、炭疽病、锈病、溃疡病等叶部病害的发病率，提高植株产量和品质。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

枯草芽孢杆菌BLG010保藏编号为CGMCC No.5953；解淀粉芽孢杆菌HW05保藏编号为CGMCC No.10273；淡紫拟青霉E16保藏编号为CGMCC No.5951；绿色木霉H06保藏编号为CGMCC No.6229，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。以上所述菌株均为已经公开的，公众可从公开渠道获得的菌株。

解淀粉芽孢杆菌HW05的公开文献：汪军,黄俊生,梁昌聪,周游,刘磊,杨腊英,郭立佳.一株高效解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用(ZL201810578016.9)。

枯草芽孢杆菌BLG010的公开文献：黄俊生,梁昌聪,朱利林,王国芬,刘磊.一株枯草芽孢杆菌及其应用(ZL201210248300.2)。

淡紫拟青霉E16的公开文献：黄俊生，汪军，梁昌聪，邓国平，任文彬，郭立佳.一株淡紫拟青霉及其应用(ZL201210358765.3)。

绿色木霉H06的公开文献：黄俊生,梁昌聪,杨腊英,吴琳,王亚.一株绿色木霉菌及其应用(ZL201210323738.2)。

实施例中涉及的尖孢镰刀菌、烟草疫霉菌、辣椒疫霉菌、青枯雷尔氏菌、根结线虫、灰梨孢菌、单丝壳白粉菌、胶孢炭疽菌、桑锈孢锈菌、柑橘溃疡病菌等病原物、大肠杆菌均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，可由现有技术中的常规方法获得。

本发明实施例中所述载体：氨基酸螯合钙镁锌硼粉(游离氨基酸总量＝35.6％，螯合钙含量＝10.7％，螯合镁含量＝3.1％，锌含量＝1.54％，硼含量＝0.52％)，购自四川世宏科技有限公司。

本发明实施例中的镰刀菌选择性培养基：见文献(景晓辉，吴伦英，区小玲，朱利林，薛玉潇，吴琳，黄俊生。一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基[J].热带作物学报,2009,30(11):1671-1673.)。

本发明实施例中的枯草芽孢杆菌BLG010通过抗生素标记实验诱导具有抗硫酸链霉素抗性，在含有硫酸链霉素300μg/mL的1/2LB等培养基上能稳定生长和保持拮抗尖孢镰刀菌等病原物的活性。由于其具有硫酸链霉素抗性，可用于检测BLG010在田间的存活能力。

本发明实施例中的淡紫拟青霉E16选择性培养基和脱乙酰几丁质酶活测定：见文献(任文彬,蒋桂芳,张世清,黄俊生.发酵条件对拟青霉E7菌株产脱乙酰几丁质酶的影响[J].农业环境科学学报,2006.25(3),812-816.)

本发明实施例中的绿色木霉H06选择性培养基为孟加拉红培养基。

本发明实施例中的对照菌株D34选择性培养基见文献(曹智淳.构建香蕉枯萎病拮抗芽胞杆菌多重筛选体系及防效研究[D].海南大学,2016.)

解淀粉芽孢杆菌bwa7的见文献：(薛玉箫.解淀粉芽孢杆菌bwa7在香蕉上的定殖及其生防机制的初步研究[D].海南大学,2012)。

本发明实施例中的对照菌剂41号菌肥(氨基酸100g/L，有机质≥40％，总养分N+P₂O₅+K₂O≥12％，总有效活菌数:50x10⁸cfu/g，其中枯草芽抱杆菌BLG010活菌数:28×10⁸cfu/g，解淀粉芽抱杆菌HC200活菌数:22×10⁸cfu/g，粉剂。)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。公开文献：(邵雪凤.防控土传病害的/>41号菌肥田间激活技术研究与应用[D].华中农业大学,2020)。

BLG010、HW05、H06、E16有效活菌数的检测方法采用稀释涂布平板法，参照文献(李阜棣，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京:中国农业出版社，1996:32-34，305-306.)。

土壤中菠萝心腐病病原菌烟草疫霉的检测方法，参照文献(秦海利.海南金菠萝心腐病致病菌的分离鉴定及生防效应研究[D].海口:海南大学硕士学位论文,2015)。

几丁质酶活、蛋白酶活性参考文献(邓国平.淡紫拟青霉E7菌株生物学特性及其防治植物根结线虫的应用研究[D].儋州:华南热带农业大学硕士学位论文,2007)。

脂肽类活性物质分析参考文献(桑树内生拮抗菌的分离鉴定及其对桑断枝烂叶病的生防初探[J].微生物学报.2019,59(11):2130-2143)。

拮抗菌株和对照菌株D34在柑橘叶肉、叶脉的内生定殖检测涉及的叶片样本处理方法，参照文献(朱利林.香蕉枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选及其定殖特性研究[D].海口:海南大学,2012)。

柑橘黄龙病PCR检测方法参照文献(柑橘黄龙病PCR检测引物比较研究.植物检疫.2022,36(02):1-6)。

复合肥指有效含量≥45％，其中N、P₂O、K₂O含量均为15％，市售。

本发明所述1/2LB液体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％和NaCl 0.5-1％；所述1/2LB固体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％、NaCl 0.5-1％和琼脂1.2-1.5％；实施例所使用的1/2LB液体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.5％、胰蛋白胨0.5％、酵母提取物0.5％和NaCl 0.1％；所述1/2LB固体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.5％、胰蛋白胨0.5％、酵母提取物0.5％和NaCl 0.1％和琼脂1.5％。

本发明所述淡紫拟青霉E16固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:1-5:10-30的木薯渣:玉米粉:椰糠:壳聚糖:水；绿色木霉H06固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:20-40的木薯渣:玉米粉:椰糠:水。实施例所使用的淡紫拟青霉E16固体发酵培养基包括质量比40:30:40:5:10的木薯渣:玉米粉:椰糠:壳聚糖:水；绿色木霉H06固体发酵培养基包括质量比40:30:30:20的木薯渣:玉米粉:椰糠:水。

本发明所述增效剂(按质量百分比)包括甘油10％-30％、牛樟芝多糖10％-70％、甲基纤维素20％-80％、十二烷基苯磺酸钠10％-20％，实施例所使用的增效剂①为甘油20％、牛樟芝多糖20％、甲基纤维素65％、十二烷基苯磺酸钠15％，其主要作用为协助多功能微生物菌剂中的有效菌在土壤和植株表面快速附着、生长、扩散和渗透到植株体内。在以下具体实施例中，若无特别标注，所述增效剂均指增效剂①。增效剂②为甘油20％、壳聚糖20％、甲基纤维素65％、十二烷基苯磺酸钠15％。

所述牛樟芝多糖为市售产品，多糖含量30％。

本发明实施例中稀释用水为清水或自来水等干净水源。

实施例一：枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06具有良好协同性，与载体和增效剂具有兼容性

选用枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06，以枯草芽孢杆菌BSA-6、解淀粉芽孢杆菌C10-1、解淀粉芽孢杆菌bwa7、解淀粉芽孢杆菌D34作为对照菌株，配制各菌株的菌悬液，调整浓度均为1.2×10⁸个/mL，对峙培养测定兼容性：分别制备含有上述菌株的菌悬液，制备1/2LB固体培养基，倒入6cm直径的培养皿，按照表1中的处理，分别取不同菌株菌悬液、增效剂、载体各0.1g稀释1000倍，摇匀，移液枪吸取5微升，以每个培养皿圆心为中点，沿直线方向在距离圆心两端0.5cm处等距离接入2个不同待测菌液，以等体积清水、载体和增效剂作为对照，在28℃培养箱培养2-3d，统计其两者之间的抑菌带宽度。每实验重复3次。结果如表1所示。

其中，-代表无抑制；+代表弱拮抗，抑菌带宽度1-5mm；++代表较强拮抗，抑菌圈直径5-10mm；+++代表强拮抗，抑菌带宽度>10mm。

表1

结果表明，两两对峙培养中，枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06相互无明显抑菌带，载体和增效剂与全部菌株之间无抑菌带，而4个对比菌株BSA-6、C10-1、bwa7和D34相互具有抑菌带，与淡紫拟青霉E16之间也具有抑菌带，bwa7与枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05之间具有抑菌带，bwa7和D34与绿色木霉H06之间具有抑菌带。综上，枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06四个菌株具有良好的协同性，与增效剂和载体也具有兼容性，说明该组合具有制备多功能微生物菌剂的前景。

实施例二、一种多功能微生物菌剂的制备方法

该复合微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌BLG010(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌HW05(Bacillus amyloliquefaciens)、淡紫拟青霉E16(Paecilomyces lilacinus)、绿色木霉H06(Trichoderma viride)和载体，具体制备方法如下：

(1)解淀粉芽孢杆菌HW05菌粉的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌接种于1/2LB液体培养基中，培养48h，喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌粉；

(2)枯草芽孢杆菌BLG010菌粉的制备方法：是枯草芽孢杆菌接种到1/2LB液体培养基中，培养48h，喷雾干燥得到解淀粉芽孢杆菌粉；

(3)淡紫拟青霉E16菌粉的制备方法：将淡紫拟青霉E16斜面菌种接种到淡紫拟青霉选择性培养基中，28℃生化培养箱中培养40小时，待长出单菌落后，接种液体培养基中培养60h获得种子液，按质量比20％接种到装有固体培养基的双层纱布袋中，培养5d，干燥36h，取发酵产物震荡过筛，获得淡紫拟青霉菌粉；

(4)绿色木霉HW06菌粉的制备方法：将绿色木霉H06斜面菌种接种到选择性培养基中，28℃生化培养箱中培养40小时，待长出单菌落后，接种固体液体培养基中培养72h获得种子液，质量比20％接种到纸固体培养基的双层纱布袋中，培养5d，干燥36h，取发酵产物震荡过筛，获得绿色木霉菌粉。

按照质量比取枯草芽孢杆菌20份、解淀粉芽孢杆菌20份、淡紫拟青霉3份、绿色木霉3份均匀混合获得复合微生物菌粉，复合微生物菌粉：载体按照质量比1：15，得到多功能微生物菌剂，每隔1个月测定1次有效活菌数，连续测定18个月。

存放18个月，有效活菌数无显著变化，每克多功能微生物菌剂中的有效活菌数分别为：枯草芽孢杆菌1.8×10¹⁰个、解淀粉芽孢杆菌1.5×10¹⁰个、淡紫拟青霉1.6×10⁹个、绿色木霉1.2×10⁹个。

实施例三：实施例二制备的多功能微生物菌剂对多种病原菌具有协同拮抗作用

应用实施例二的方法取单一菌株菌粉和载体，分别制备单一的枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16、绿色木霉H06菌剂，D34菌剂、不同单一菌剂组合的微生物菌剂作为对照，同时以41号菌肥、载体和增效剂、清水作为对照，测定多功能微生物菌剂对多种病原菌协同拮抗作用，具体处理见表2。

1、多功能微生物菌剂对多种病原菌的拮抗作用测定

分别制备含有尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、灰梨孢菌、胶孢炭疽菌和地毯草黄单胞杆菌、青枯雷尔氏菌菌悬液的1/2LB固体培养基，倒入9cm直径的培养皿，在28℃预培养12小时后，按照表2中的处理，分别取相同质量的多功能微生物菌剂、不同组合的对照菌剂、增效剂、载体各0.1g，用清水稀释1000倍，摇匀，获得1000倍稀释液，移液枪吸取5微升，以每个培养皿中心为圆心，距离圆心2.5cm，依次等距离接入6个待测菌液，以等体积清水、载体和增效剂作为对照，在28℃培养箱培养3d，观察抑菌带，每实验重复3次。测量待测菌菌落边缘与病原菌之间的抑菌带宽度(结果见表2)。

2、多功能微生物菌剂根结线虫的卵孵化抑制率测定

取1mL浓度为120个/mL的根结线虫卵悬浮液，分装至2mL离心管中，再往离心管中加入200μL步骤1中制备的多功能微生物菌剂、不同组合的对照菌剂、增效剂和载体的1000倍稀释液。

其中香蕉根结线虫虫卵悬浮液由南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)按照1:1组成。

每个实验重复3次，到第3天统计卵孵化率和卵孵化抑制率，结果见表2。

卵孵化率(％)＝[孵化幼虫数/(孵化幼虫数+未孵化卵粒数)]×100

卵孵化抑制率(％)＝[(对照卵孵化率一处理卵孵化率)/对照卵孵化率]×100

表2结果表明，多功能微生物菌剂对上述病多种原菌均有拮抗活性，优于单一菌株的菌粉，说明了BLG010+HW05+E16+H06组合的微生物菌剂优于其他组合的菌剂，抗菌谱广，具有制备多功能微生物菌剂的潜力。

表2

实施例四：实施例二制备的多功能微生物菌剂对香蕉枯萎病的盆栽防效

本实施例每个处理土壤用量用20个花盆分装，3kg/盆，共需要60kg，以载体和清水为对照，取多功能微生物菌剂和实施例三的对照菌剂均按相同用量0.1g/kg土计算，每个处理需要6g菌剂，分为预培养施用、未预培养直接施用；取相同质量的载体，直接稀释1000倍参照多功能微生物菌剂根部和叶部施用方法施用，同时以喷施等量清水作为对照，以无病土种植香蕉苗作为空白对照，共37个处理，见表3。具体如下：

海南儋州香蕉基地大棚，取无病土，按10⁵cfu/g土的浓度接入香蕉枯萎病孢子悬浮液，搅拌均匀获得香蕉枯萎病病土，进行35个实验组布置，按照病土质量3kg/盆分装于塑料花盆，其中空白组也按照3kg/盆分装于塑料花盆，每组20盆，移栽5片叶巴西蕉。每个实验组20株，重复3次。以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待第34天对照出现发病症状后统计病情指数和发病率。

预培养施用：

(1)制备预培养液：预培养期间的温度为自然温度20-28℃，取多功能微生物菌剂6g，用清水或自来水稀释10倍置于塑料桶等容器中48小时，每隔12小时手动搅拌1次，获得预培养液，再稀释100倍，按照质量比0.1％比例添加增效剂，获得预培养液；根据根部施用和叶部施用所需用量按体积百分比分为2份，根部喷施所用体积80％，叶部施用所用体积20％。

(2)根部施用预培养液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的预培养液，添加0.1％的复合肥混匀后根部均匀喷施至各个重复；

(3)叶部施用预培养液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的预培养液，添加0.1％的复合肥混匀后均匀喷施各个重复的叶片正面和背面。

未预培养施用：

(1)制备稀释液：取多功能微生物菌剂1kg，稀释1000倍，按照0.1％比例添加增效剂。根据根部施用和叶部施用所需用量按体积百分比分为2份，根部喷施所用体积80％，叶部施用所用体积20％。

(2)根部喷施稀释液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的稀释液，添加0.1％的复合肥混匀后根部均匀喷施至各个重复；

(3)叶部施用稀释液：选择在晴天下午4点后或阴天，取步骤(1)中的稀释液，添加0.1％的复合肥混匀后均匀喷施至各个重复的叶片正面和背面。

将香蕉枯萎病发病程度统计分为以下5个标准：

0级：植株无枯黄症状。

1级：植株下部叶片出现轻微的枯黄症状，嫩叶完好，少部分根系轻微褐变，茎部出现水渍状褐变。

2级：植株下部叶片出现明显的枯黄症状，但嫩叶完好，根系出现褐变，茎部和假茎部出现水渍状褐变。

3级：整株出现枯黄症状，根系褐变腐烂，茎部和假茎部褐变连片，少数叶柄出现红褐。

4级：整株出现枯萎死亡症状，根系严重褐变腐烂。

病情指数＝100×∑(各级发病株数×该级代表数)/(调查总株数×最高级代表值)

防治效果＝(对照病情指数-实验病情指数)/对照病情指数×100％

表3

结果表明：多功能微生物菌剂对香蕉枯萎病具有很好的防病效果和促生作用，采用多功能微生物菌剂的各项指标均优于单一菌株菌剂或其他对照菌株组合的菌剂，说明BLG010+HW05+E16+H06四个菌株组对香蕉枯萎病的防治具有协同增效作用，同一种菌剂，经过预培养后施用防病效果和促生作用优于未经预培养施用的处理。

实施例五：实施例二制备的多功能微生物菌剂对香蕉枯萎病的田间防控作用

取相同质量多功能微生物菌剂、对照菌剂41号菌肥和载体，施用方法参照实施例四。

在海南省东方市板桥镇香蕉种植地，试验前香蕉枯萎病发病率90％以上，栽培前均匀翻地，翻土深度0.5m，经选择性培养基检测土壤中的镰刀菌浓度达4.2×10⁵个/克土。各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，分别于香蕉定植前7d，定殖后每隔30d施用一次，连续施用8次，共20kg/亩，水肥一体化喷施，共6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；3)41号菌肥，预培养后施用；(4)41号菌肥，未预培养喷施施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。常规水肥管理，调查病情指数、防病效果、所用的植株品种、树势、树龄以及管理水平等均一致。结果见表4。随机排列，重复3次，共18个小区，每小区面积1亩。小区间开沟，垫塑料薄膜隔离。香蕉栽培密度170株/亩，行距1.6m，株距1.5m，之字形种植。常规施肥的供试肥料全部用作追肥，底肥、其他追肥及田间管理按当地正常水平统一进行。

发病率：香蕉移栽后300d，测定发病率，观察香蕉生长情况，记录发病的植株数量，计算累积发病率和亩产。发病率(％)＝发病株数/(总株数)×100％。

表4

结果表明，田间条件下多功能微生物菌剂预培养后施用的防病促生效果，优于未培养直接施用的菌剂，同时优于按相同方法施用的对照菌剂。

实施例六：实施例二制备的多功能微生物菌剂对香蕉根结线虫病的盆栽防效

本实施例每个处理土壤用量用50个花盆分装，5kg/盆，共需要250kg土壤，以载体和清水为对照，取多功能微生物菌剂和实施例三的对照菌剂均按相同用量0.1g/kg土计算，每个处理需要25g菌剂，分为预培养施用、未预培养直接施用；取相同质量的载体，直接稀释1000倍参照多功能微生物菌剂根部和叶部施用方法施用，同时以喷施等量清水作为对照，以无病土种植香蕉苗作为空白对照，共37个处理，见表5。具体如下：

香蕉根结线虫病土采集于儋州市宝岛新村香蕉种植地，将病根切碎与病土混匀备用，虫口密度达214条/100g土。在海南儋州铺仔基地，每个实验组50盆，每盆装病土5kg，移栽5片叶巴西蕉，重复3次。以上实验植物置于温室大棚，常规水肥管理，待第42天对照出现发病症状后，统计病情指数和防效。

将香蕉根结线虫发病程度统计分为以下5个标准：

0级：没有根结或卵囊

1级：1-10个根结或卵囊/株

2级：10-20个根结或卵囊/株

3级：20-40个根结或卵囊/株

4级：40个以上根结或卵囊/株

表5结果表明：多功能微生物菌剂对香蕉根结线虫具有很好的防病效果和促生作用，采用多功能微生物菌剂的各项指标均优于单一菌株菌剂或其他对照菌株组合的菌剂，说明多功能微生物菌剂中的BLG010+HW05+E16+H06四个菌株组合对香蕉枯萎病的防治具有协同增效作用，同一种菌剂，经过预培养后施用防病效果优于未经预培养直接施用的处理。

表5

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实施例七：实施例二的多功能微生物菌剂对4种植物根结线虫的田间防控作用

多功能微生物菌剂施用方法参照实施例四，以市售化学药剂10％噻唑膦颗粒作为对比药剂。

在海南省东方市的根结线虫发病率80％以上的香蕉、番茄、辣椒、芹菜种植地，多功能微生物菌剂每次用量为2.5kg/亩，其中香蕉定植前7d，定殖后每隔30d施用一次，连续施用8次，共20kg/亩；番茄、辣椒、芹菜，定植时、定植后15天和30天共施用3次，每次2.5kg/亩，共7.5kg/亩，水肥一体化喷施，预培养施用和未预培养直接施用参照实施例四方法。对比药剂10％噻唑膦颗粒剂用量按1.5kg/亩，定植前施用1次。香蕉、番茄、辣椒、芹菜均设计4个试验处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3)10％噻唑膦颗粒剂1.5kg/亩，定植前施用1次，将颗粒剂和细土搅拌均匀(1.5kg10％噻唑膦颗粒剂拌细土15公斤)，均匀撒施到地表面，再用旋耕机或手工工具将药剂和土壤充分混匀；(4)清水对照：喷施等量清水。随机排列，重复3次，共12个小区，每小区面积1亩。小区间开沟，垫塑料薄膜隔离。常规水肥管理，参考实施例六方法调查病情指数、防病效果、所用的植株品种、树势、树龄以及管理水平等均一致。参照实施例调查增产率，计算防效。

表5结果表明，表多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，与化学药剂10％噻唑膦颗粒剂相当。

表6

实施例八、实施例二制备的多功能微生物菌剂对菠萝心腐病盆栽防效

取相同质量多功能微生物菌剂、对照菌剂41号菌肥和载体，施用方法参照实施例四。本实施例每个处理土壤用量用30个花盆分装，装土量5kg/盆，共需要150kg，多功能微生物菌剂和对照菌剂均按相同用量0.1g/kg土计算，每个处理需要15g菌剂，分为预培养施用、未预培养直接施用；取相同质量的载体，直接稀释1000倍参照多功能微生物菌剂根部和叶部施用方法施用，同时以喷施等量清水作为对照。

取海南临高菠萝连作3年地块土壤，病原菌含量≥5×10³CFU/g，试验设计处理共6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；3)41号菌肥，预培养后施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。每处理设30个重复，每个塑料盆装土5.0kg。装盆前按土重的1％(质量分数)施入有机肥，化肥处理的氮磷钾含量差异用化肥补齐。装盆5d后种苗，每盆定植1株。全生长期肥效保持均等，采用常规水肥管理。

供试菠萝品种为“金菠萝MD-2”，菠萝苗定植后，每天观察记录发病的植株数量。菠萝植株出现黄叶、矮小、叶片易脱落，即统计为发病植株。在90d试验后，计算发病率。

发病率(％)＝100×发株数/定植菠萝总株数病

生防效果(％)＝100×(CK发病率-处理发病率)/CK发病率

菠萝定植140d后记录菠萝叶片数；用卷尺测量菠萝植株叶片束起时最长的叶片长度(菠萝叶长)和宽，用选择性培养基检测病原菌含量。

表7结果表明，多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，同时优于同样方法施用的41号菌肥。

表7

实施例九、实施例二制备的多功能微生物菌剂对甜瓜白粉病的田间防控作用

取相同质量的多功能微生物菌剂、对照菌剂41号菌肥和载体，施用方法参照实施例四。

在海南三亚温室大棚微型小区进行。各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，选择发病初期的甜瓜植株喷施，7天后再喷施1次，2次共5kg/亩，试验设计处理共6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3) 41号菌肥，预培养后施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。每个处理1亩，重复3次。置于温室大棚，常规水肥管理，7d后调查病情指数、防病效果、株高、糖度，结果见表8。

将甜瓜白粉病发病程度统计分为以下5个标准

0级：无病；

1级：病斑面积占整个叶片面积的20％以下；

2级：病斑面积占整个叶片面积的20-50％；

3级：病斑面积占整个叶片面积的50％-70％；

4级：病斑面积占整个叶片面积的70％以上。

表8

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结果表明，多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，同时优于对照菌剂41号菌肥。

实施例十：实施例二制备的多功能微生物菌剂防对芒果炭疽病的田间防控作用

在海南三亚的芒果种植地选择炭疽病发病初期的芒果树，各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，选择发病初期的植株喷施，7天后再喷施1次，2次共5kg/亩，试验设计处理共6个处理:(1)多功能微生物菌剂2.5kg，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3)41号菌肥，预培养后施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。每处理1亩，重复3次。以上处理7d后参考实施例九方法调查发病率和计算防治效果，结果见表9。

表9

结果显示，施用多功能微生物菌剂7d后芒果炭疽病的病斑基本消失，复发较少，防效达90.16％，说明多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，同时优于同样方法施用的41号菌肥。

实施例十一：实施例二制备的多功能微生物菌剂对桑树赤锈病的田间防控作用

在海南琼中的桑树种植地，各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，选择赤锈病发病初期的桑树喷施，喷施后7天再喷施1次，2次共5kg/亩，试验设计处理共6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3) 41号菌肥，预培养后施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。每处理1亩，重复3次。以上处理10d后参考实施例九方法调查发病率和计算防治效果，结果见表10。

表10

结果显示，施用多功能微生物菌剂10d后芒果炭疽病的病斑基本消失，复发较少，说明多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，防效达88.27％。同时优于同样方法施用的41号菌肥。

实施例十二：实施例二制备的多功能微生物菌剂对柑橘黄龙病的防控作用

取相同质量的多功能微生物菌剂、对照菌剂41号菌肥、载体，施用方法参照实施例四。

在海南琼中柑橘种植地，选取发病6年柑橘(琼中绿橙)。在春梢萌发期开始施肥，之后每隔1月施用1次，各处理所施用菌剂或载体每次用量均为5kg/亩，连续施用6次，共30kg/亩，水肥一体化喷施，分6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3)41号菌肥，预培养施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，参照；(6)清水对照：参照处理4方法施用，喷施等量清水。每个处理1亩，重复3次。常规水肥管理。定期采集植株枝叶样本，每处理在东、西、南、北、中5个方位选5株柑橘，每株柑橘在东、西、南、北、中5个方位各随机采集1片叶片样品混匀，测定叶片淀粉含量，采集的样本提取DNA后，PCR方法测定植株的黄龙病菌携带情况；收获期按同样方法采集果实，测定果实产量、出汁率。

表11

表12

表13

结果表明，与对照比较，施用多功能微生物菌剂降低病叶中淀粉含量，清除发病部位的病原菌，提高产量、出汁率和糖度，说明多功能微生物菌剂经预培养后防效和促生长优于直接施用，同时优于同样方法施用的41号菌肥。

实施例十三：实施例二制备的多功能微生物菌剂对柑橘溃疡病的田间防控作用

在海南琼中柑橘种植地，各处理所施用菌剂或载体每次用量均为5kg/亩，在柑橘溃疡病发病初期喷施，之后间隔1个月后施用1次，连续5次，共25kg/亩，水肥一体化喷施，之后每隔1月施用1次，连续施用6次，每次5kg/亩，共30kg/亩，水肥一体化喷施，分6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3) 41号菌肥，预培养施用；(4)/>41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照：喷施等量清水。每个处理1亩，重复3次。处理30d后观察并记录植株发病情况，统计防效。

按以下分级标准计算病情指数及防治效果：

0级：无病；1级：每叶有病斑1-5个；3级：每叶有病斑6-10个；5级：每叶有病斑11-15个；7级：每叶有病斑16-20个；9级：每叶有病斑21个以上。

病情指数＝∑[各级病叶数×相对级数]/[调查总叶数×最高相对级数]×100

防治效果(％)＝[1-(处理区处理后病指-处理区处理前病指数)/(对照区处理后病指-对照区处理前病指数)]×100

表13

结果显示，施用多功能微生物菌剂防效达88.09％。同时优于同样方法施用的41号菌肥。

实施例十四：实施例二的多功能微生物菌剂对番茄青枯病的田间防控作用

在海南琼海的番茄种植地，连续种植3年，青枯病发病率90％以上，各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，番茄定殖时施用多功能微生物菌剂，之后间隔20天施用1次，连续3次，共7.5kg/亩，水肥一体化喷施，分6个处理：(1)多功能微生物菌剂，预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂，未预培养施用；(3)41号菌肥，预培养施用；(4)41号菌肥，未预培养施用；(5)载体，直接稀释1000倍，施用；(6)清水对照，喷施等量清水。每个处理1亩，重复3次。处理30d后观察并记录植株发病情况，测定土壤养分含量，统计防效。

表14

结果显示，施用多功能微生物菌剂防效达81.59％，同时提高了土壤养分指标，优于同样方法施用的对照菌剂41号菌肥。

实施例十五：根部施用和叶部施用对实施例二的多功能微生物菌剂田间防控香蕉枯萎病的影响

本实施例以清水为对照，取相同质量的多功能微生物菌剂和实施例三制备对照菌剂D34菌剂，施用方法参考实施例四。

在海南省东方市板桥镇香蕉种植地，试验前香蕉枯萎病发病率90％以上，栽培前均匀翻地，翻土深度0.5m，经选择性培养基检测土壤中的镰刀菌浓度达4.2×10⁴个/克土。各处理所施用菌剂或载体每次用量均为2.5kg/亩，分别于香蕉定植前7d，定殖后每隔30d施用一次，连续施用8次，共计20kg/亩，水肥一体化喷施，共7个处理：(1)多功能微生物菌剂预培养后施用；(2)多功能微生物菌剂预培养后根部施用；(3)多功能微生物菌剂预培养后叶部施用；(4)D34菌剂预培养后施用；(5)D34菌剂预培养后根部施用；(6)D34菌剂预培养后叶部施用；(7)清水对照：喷施等量清水。常规水肥管理，调查病情指数、防病效果、所用的植株品种、树势、树龄以及管理水平等均一致。随机排列，重复3次，共21个小区，每小区面积1亩。小区间开沟，垫塑料薄膜隔离。香蕉栽培密度170株/亩，行距1.6m，株距1.5m，之字形种植。常规施肥的供试肥料全部用作追肥，底肥、其他追肥及田间管理按当地正常水平统一进行。

香蕉移栽后300d，测定香蕉根部的香蕉枯萎病菌，香蕉根系和叶部的BLG010、HW05、E16、H06、D34定殖量，测定发病率，观察香蕉生长情况，记录发病的植株数量，计算累积发病率和亩产。发病率(％)＝发病株数/(总株数)×100％。

表15、16和17结果显示，根部和叶部同时施用提高BLG010、HW05、E16、H06以及对照菌株在根和叶部的定殖菌量，降低病原菌含量，明显优于单一根部或叶部施用。说明叶部施用能促进有效菌株BLG010、HW05从叶部渗透传导根部。

表15

表16

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表17

实施例十六：载体和增效剂对实施例二的多功能微生物菌剂田间防控香蕉枯萎病的影响

取相同质量的多功能微生物菌剂和实施例三制备对照菌剂D34菌剂、不含增效剂和载体的多功能微生物菌剂、载体和增效剂，施用方法参考实施例四。

在海南省东方市板桥镇香蕉种植地，试验前香蕉枯萎病发病率90％以上，栽培前均匀翻地，翻土深度0.5m，经选择性培养基检测土壤中的镰刀菌浓度达4.2×10⁴个/克土。各处理所施用菌剂、载体或增效剂，每次用量均为2.5kg/亩，分别于香蕉定植前7d，定殖后每隔30d施用一次，连续施用8次，共20kg/亩，水肥一体化喷施，共13个处理：(1)多功能微生物菌剂预培养施用(含载体和增效剂①)；(2)多功能微生物菌剂预培养后施用(含载体和增效剂②)；(3)多功能微生物菌剂(不含载体)预培养施用；(4)多功能微生物菌剂(不含增效剂)预培养施用；(5)多功能微生物菌粉(不含载体和增效剂)预培养后施用；(6)D34菌剂预培养施用；(7)D34(不含载体)预培养施用；(8)D34(不含增效剂)预培养施用；(9)D34菌粉(不含载体和增效剂)预培养施用；(10)载体；(12)增效剂①；(12)增效剂②；(13)清水对照：喷施等量清水。常规水肥管理，调查病情指数、防病效果、所用的植株品种、树势、树龄以及管理水平等均一致。随机排列，重复3次，共39个小区，每小区面积1亩。小区间开沟，垫塑料薄膜隔离。香蕉栽培密度170株/亩，行距1.6m，株距1.5m，之字形种植。常规施肥的供试肥料全部用作追肥，底肥、其他追肥及田间管理按当地正常水平统一进行。

香蕉移栽后300d，测定香蕉根部的香蕉枯萎病菌，香蕉根系、叶部的、BLG010、HW05、E16、H06、D34定殖量，测定发病率，观察香蕉生长情况，记录发病的植株数量，计算累积发病率和亩产。发病率(％)＝发病株数/(总株数)×100％。

表18、19结果显示，载体和增效剂提高BLG010、HW05、E16、H06以及对照菌株在根和叶部的定殖菌量，降低病原菌含量，明显优于单一菌粉，也明显优于只含载体或增效剂的多功能微生物菌剂和对照菌剂。说明增效剂能促进有效菌株BLG010、HW05、E16、H06从叶部和土壤分别扩散渗透传导叶内和根系。此外，增效剂①的效果明显优于增效剂②。

表18

表19

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表20

实施例十七：叶片正面和背面施用对实施例二制备的多功能微生物菌剂防控柑橘黄龙病的影响

取相同质量的多功能微生物菌剂和实施例三制备对照菌剂D34菌剂。在海南琼中柑橘种植地，各处理所施用菌剂每次用量均为5kg/亩，在柑橘黄龙病发病初期喷施，水肥一体化喷施，之后每隔1月施用1次，连续施用6次，每次5kg/亩，共30kg/亩，分7个处理：(1)多功能微生物菌剂，叶片正面和叶片背面施用；(2)多功能微生物菌剂(叶片正面施用)；(3)多功能微生物菌剂(叶片背面施用)；(4)D34菌剂，叶片正面和叶片背面施用；(5)D34菌剂，叶片正面施用)；(6)D34菌剂，叶片背面施用；(7)清水对照：喷施等量清水。每个处理1亩，重复3次。处理30d后观察并记录植株发病情况，叶片样品采集方法参照实施例十五，测定PCR检测叶片携带黄龙病病原菌情况，选择性培养基测定叶片表面、叶肉、叶脉拮抗菌定殖情况。

结果表明，叶片正面和背面同时喷施菌剂，明显降低病原菌含量(表21)，提高拮抗菌BLG010、HW05、E16、H06叶脉和叶肉定殖菌量(表22-23)，明显优于单独喷施叶片正面或背面的定殖效果，提高拮抗菌在柑橘体内的移动和定殖。

表21

表22

表23

实施例十八：预培养施用和未预培养对实施例二制备的多功能微生物菌剂菌量和活性的影响

模拟田间自然条件下温度对多功能微生物菌剂预培养的影响：

(1)制备预培养稀释液：取多功能微生物菌剂1kg，稀释10倍后分装置于4个塑料桶，分别置于4个不同温度的生化培养箱，48小时，每隔6小时手动搅拌1次，获得预培养液，再稀释100倍，获得终浓度为1000倍的预培养稀释液，

(2)制备未预培养稀释液：取多功能微生物菌剂1g，直接稀释至1000倍，获得未预培养稀释液。

(3)指标测定：选择性培养基分别测定BLG010、HW05、E16、H06在不同温度下多功能微生物菌剂1000倍稀释液的有效活菌数；参考实施例三方法，以未预培养稀释液为对照，测定预培养液稀释液对不同病原物的拮抗作用；参考实施例三方法，取预培养液1000稀释液，取2mL置于离心管中，在8000r/min离心5分钟，再用0.22μm微孔滤膜过滤，获得预培养稀释液的无菌代谢物，按照同样方法获得未预培养稀释液的无菌代谢物。以未预培养稀释液的无菌代谢物为对照，测定预培养稀释液的无菌代谢物对不同病原物的抑制作用；取菌剂10倍稀释液，参照文献方法测定活性物质含量。

结果表明，由表24可知，在温度15-40℃范围，施用前预培养比未预培养的多功能微生物菌剂稀释液拮抗菌有效菌量提高100倍以上；

由表25可知，在温度15-40℃范围，多功能微生物菌剂施用前预培养稀释液比未预培养稀释液抑制病原真菌、细菌和根结线虫作用显著，同时能显著抑制环境中常见的致病菌大肠杆菌；

由表26可知，在温度15-40℃范围，多功能微生物菌剂施用前预培养稀释液的无菌代谢物，比未预培养稀释液的无菌代谢物抑制病原真菌、细菌和根结线虫作用显著，同时能显著抑制环境中常见的致病菌大肠杆菌。

由表27可知，在温度15-40℃范围，未预培养的多功能微生物菌剂稀释液中的无菌菌代谢物未检出，而预培养的多功能微生物菌剂稀释液中的无菌代谢物含有活性物质脂肽Iturin A和Bacillomycin L、脱乙酰几丁质酶、蛋白酶和几丁质酶。

综上所述，直接证明了施用前的预培养技术可以提高多功能微生物菌剂中有效菌繁殖、分泌活性物质含量，有助于避免施用过程受环境中杂菌污染，从而显著提高对病原菌真菌、细菌和根结线虫等多种不同类型病害的拮抗作用。

表24

表25

表26

表27

以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多功能微生物菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌BLG010、解淀粉芽孢杆菌HW05、淡紫拟青霉E16和绿色木霉H06，每克多功能微生物菌剂中的有效活菌数分别为：枯草芽孢杆菌1.2×10⁹～1.8×10¹⁰个、解淀粉芽孢杆菌1.2×10⁹～1.8×10¹⁰个、淡紫拟青霉1.2×10⁸～1.8×10⁹个、绿色木霉1.2×10⁸～1.8×10⁹个。

2.根据权利要求1所述的多功能微生物菌剂，其特征在于，四株菌株均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述枯草芽孢杆菌BLG010的保藏编号为CGMCC No.5953，保藏日2012年04月06日；解淀粉芽孢杆菌HW05保藏编号为CGMCC No.10273，保藏日2015年01月04日；淡紫拟青霉E16保藏编号为CGMCC No.5951，保藏日2012年04月06日；绿色木霉H06保藏编号为CGMCC No.6229，保藏日2012年06月15日。

3.根据权利要求1所述的多功能微生物菌剂，其特征在于，还包括载体；所述载体为氨基酸螯合钙镁锌硼粉。

4.权利要求1～3任一项所述的多功能微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)将绿色木霉H06菌接种到1/2LB液体培养基中培养48-72h，按质量比20％接种到装有固体发酵培养基的双层纱布袋中，培养5-7d，干燥24h-48h，取发酵产物震荡过筛，获得绿色木霉菌粉；

(5)按照重量份，取枯草芽孢杆菌菌粉10-30份、解淀粉芽孢杆菌菌粉10-30份、淡紫拟青霉菌粉1-5份、绿色木霉菌粉1-5份，将菌粉混合，获得复合菌粉，按照质量比1：10-20将复合菌粉与载体混合，得多功能微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按质量百分比计，所述1/2LB液体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％和NaCl 0.5-1％；所述1/2LB固体培养基含有：蔗糖或葡萄糖0.1-0.5％、胰蛋白胨0.5-1％、酵母提取物0.1-0.5％、NaCl 0.5-1％和琼脂1.2-1.5％；淡紫拟青霉E16液体发酵培养基含有：2％蔗糖、1％几丁质和0.001％硫酸锰；

淡紫拟青霉E16固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:1-5:10-30的木薯渣:玉米粉:椰糠:壳聚糖:水；绿色木霉H06固体发酵培养基包括质量比20-40:30-60:30-40:20-40的木薯渣:玉米粉:椰糠:水。

6.权利要求1～3任一项所述的多功能微生物菌剂在防治由病原物引起的植物病害中的应用，其特征在于，所述病害包括：枯萎病、根结线虫、心腐病、稻瘟病、青枯病、白粉病、锈病、炭疽病、溃疡病和黄龙病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病害包括：香蕉枯萎病、香蕉根结线虫、番茄根结线虫病、芹菜根结线虫病、辣椒根结线虫病、菠萝心腐病、水稻稻瘟病、番茄青枯病、甜瓜白粉病、桑树赤锈病、芒果炭疽病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病原物包括：尖孢镰刀菌、根结线虫、烟草疫霉、灰梨孢菌、青枯雷尔氏菌、单丝壳白粉菌、桑锈孢锈菌、胶孢炭疽菌、地毯黄单胞杆菌、韧皮部杆菌。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：

(1)制备预培养液：多功能微生物菌剂每次盆栽用量按0.1-0.3g/kg土施用，每次田间用量按1-10kg/亩施用，按质量倍数用水稀释10-30倍后，在环境温度15-40℃条件下放置24-72小时，静置或用水泵通气或每隔2-12小时手动搅拌1次，获得预培养液，再稀释50-100倍，按照质量比0.1-0.5比例添加增效剂，获得预培养液，将预培养液分成两份，根部喷施预培养液体积的70％-90％，叶部施用预培养液体积的10％-30％；

(3)叶部施用预培养液：选择在晴天下午4点后或阴天；取步骤(1)中的预培养液，或按质量比添加0.1％～0.5％复合肥和/或常见叶面杀虫剂的预培养液喷施叶片正面和背面。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，按质量百分比，所述增效剂包括甘油10％-30％、牛樟芝多糖10％-70％、甲基纤维素20％-80％和十二烷基苯磺酸钠10％-20％。