FI95598B

FI95598B - Mikro-organismi kasvitautien biologiseen torjuntaan

Info

Publication number: FI95598B
Application number: FI940463A
Authority: FI
Inventors: Risto Tapio Tahvonen; Milja Tuulikki Keskinen; Marja-Leena Lahdenperae; Pekka Tapani Seiskari; Esa Petri Teperi; Ulla Anita Tuominen
Original assignee: Kemira Agro Oy
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1994-01-31
Publication date: 1995-11-15
Also published as: DK0742816T3; LV11746A; MX9602967A; DE69528753T2; NZ278907A; EP0742816A1; BG63169B1; MD960242A; PT742816E; FI940463A; SK280507B6; PL315659A1; KR100361473B1; JPH09508274A; FI95598C; NO963178L; AU1538695A; EP0742816B1; HUT74599A; EE03243B1

Description

95598

Mikro-organismi kasvitautien biologiseen torjuntaan Keksinnön ala 5 Tämä keksintö kuuluu kasvitautien biologisen torjunnan piiriin ja koskee erityisesti uusia Nectria-sukuun kuuluvia mikro-organismeja ja niiden käyttöä sieni-infektioiden torjuntaan kasveissa. Samoin keksintö koskee uusia Nectria-suvun kantoja sisältäviä koostumuksia ja niiden käyttöä 10 mainittuun tarkoitukseen. Keksintö koskee myös menetelmää tehokkaiden torjuntaeliöiden seulomiseksi maasta eristetyistä mikrobikannoista.

Keksinnön taustaa 15

Viljelykasveja vaivaavat erilaiset sieni-, bakteeri- ja virustaudit sekä lukuisat tuhohyönteiset. Näiden torjuntaan on kehitetty useita viljelyteknisiä, kemiallisia ja biologisia torjuntamenetelmiä. Tällaisten menetelmien avulla on 20 tarkoitus ehkäistä kasvitautien ja muiden tuholaisten aiheuttamat laadulliset ja määrälliset satovahingot.

Biologisella kasvitautien torjunnalla tarkoitetaan yleisesti haittaeliöiden torjuntaa käyttämällä toista organismia, 25 jota sanotaan tällöin kasvitautien biologiseksi torjunta-eliöksi, ja siitä valmistettua preparaattia biologiseksi torjunta-aineeksi eli biopestisidiksi. Kasvitautien biolo-gisen torjunnan mekanismit vaihtelevat, ja teho perustuu usein monen eri mekanismin yhteisvaikutukseen. Torjunta 30 saattaa perustua organismin tuottamiin inhiboiviin kemiallisiin aineisiin, joskus taas torjuntaorganismi loisii ja kilpailee patogeenin kanssa kasvutilasta ja/tai käytössä olevista ravintoaineista. 1

Tarvetta uusien biologisten torjunta-aineiden löytämiseksi on lisännyt se, että moni perinteisistä kemiallisista torjunta-aineista on osoittautunut haitalliseksi ympäristölle ja ihmisille. Kemikaalien haittapuolena on myös se, että 2 95598 useat tuholaiset ovat kehittyneet resistenteiksi yhdelle tai jopa useammalle torjunta-aineelle. Resistenssin kehittyminen biopestisideille on sen sijaan epätodennäköistä, koska niiden teho perustuu useaan erityyppiseen mekanis-5 miin. Kemikaalit vaikuttavat yleensä nopeammin ja tehok kaammin kuin biopestisidit. Biopestisidit ovat puolestaan usein pitkävaikutteisempia kuin kemikaalit, koska niiden teho perustuu elävään ja lisääntyvään mikro-organismiin.

10 Tärkein biopestisidien ryhmä ovat hyönteisiä vastaan suunnatut bakteeripohjaiset tuotteet. Yleisimmin käytettyjä lienevät Bacillus thurlnglensis -bakteeriin perustuvat bio-insektisidit. Suomessa tuotetaan Streptomyces-sädesieneen perustuvaa biofungisidia, joka tehoaa useisiin maa- ja 15 siemenlevintäisiin kasvien sienitauteihin. Myös harmittomasta Phlebia-lahottajasienestä on kehitetty tuote, joka kykenee estämään haitallisen juurikäävän eli maannousema-sienen leviämisen havumetsissä.

20 Pseudomonas-suvun, erityisesti Pseudomonas fluorescens -lajin bakteereita on myös paljon tutkittu, ja nykyään tunnetaan erittäin suuri määrä P. fluorescens -kantoja, joilla on fungisidinen aktiivisuus. Ks. esimerkiksi hake-musjulkaisut WO 92/18613, FI 92 1722 ja W0 90/01327, sekä 25 EP-patentti 228 457.

9 ♦

Etsittäessä biologiseen torjuntaan sopivia mikro-organismeja seulotaan tavallisesti suuria määriä maasta eristettyjä mikrobikantoja jonkin ominaisuuden tai aktiivisuuden suh-30 teen. Joitakin seulontamenetelmiä on kuvattu patenttikir-j allisuudessa.

US-patentissa 4,647,533 kuvataan kolmivaiheinen seulontamenetelmä, jossa bakteerit ensin eristetään maasta, joka 35 sisältää runsaasti haitallisen Pythium-sienen itiöitä.

Toisessa vaiheessa eristetyt bakteerit seulotaan kasvihuo- 3 95598 neessa kasvattamalla viljan siemeniä maassa, jossa on runsaasti Pythium-itiöitä, kulloinkin halutun bakteerin itiösuspension kanssa ja (kontrollikoe) ilman sitä, josta testistä jatkoon valitaan sellaiset bakteerit, joiden läs-5 näollessa kasvit kasvattavat suurimmat lehdet ja muutenkin kasvavat pisimmiksi. Kolmannessa vaiheessa valitut bakteerit seulotaan vielä pellolla samanlaisessa kokeessa kuin kasvihuonekoe. Myös tässä vaiheessa valitaan sellaiset bakteerit, joiden läsnäollessa kasvit kasvavat parhaiten.

10 FI-patenttihakemuksessa n:o 92 1722 taas käytetään seuraavanlaista menetelmää. Ensin jonkin Pythium-kannan rihmastoa kasvatetaan sopivalla kasvualustalla, rihmaston päälle pannaan sitten kerros steriiliä maata, johon lisätään tutkit-15 tavaa sienenvastaista mikro-organismia, ja arvioidaan tes-tiyhdisteen vaikutus Pythixmin kasvuun. Toisessa vaiheessa infektoidaan maanäyte taimipoltteen aiheuttavalla sienellä, kylvetään maahan sieni-infektiolle herkän kasvin siemen ja määritetään em. sienenvastaisen aineen inhibitorinen vaiku-20 tus kasvin kasvuun. Jatkotesteihin valitaan aineet, jotka ovat inhibitorisia molemmissa edellämainituissa testeissä.

Keksinnön yhteenveto 25 Tämän keksinnön kohteena on Nectria-suvun mikro-organismi, Nectria pityrodes Montagne, jonka havaittiin olevan erittäin aktiivinen erityisesti Fusarium-sieniä vastaan.

Keksinnön kohteena on edelleen mikrobikannasta valmistettu 30 biofungisidinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana edellä mainittuja Nectria-sukuun kuuluvia sienikanto-ja sekä mahdollisesti alalla tavanomaisia lisä- tai kantaja-aineita sopivana formulaationa. Esimerkkejä tällaisista formulaatioista ovat siementen peittaukseen soveltuvat 35 koostumukset, jauhemaiset tai rakeiset koostumukset kasvien 4 95598 kasvupaikalle levitettäväksi tai nestemäiset valmisteet maaperän kastelemiseksi.

Tämän keksinnön kohteena on myös uusi ja tehokas sienikan-5 tojen valintatesti, jossa käytetään kolmivaiheista koesarjaa, johon kuuluvat hiekka-, turve- ja peltomaatestit. Jokaisessa testivaiheessa karsitaan tehottomiksi osoittautuneet sienikannat jatkokokeista. Kasvihuoneessa parhaimmiksi osoittautuneet sienikannat viedään sitten valintakokeisiin 10 pelto-oloihin.

Lyhyt selitys kuvista

Kuva 1. J76:n käyttömääräkokeilu kesällä -92. Sairaiden 15 oraiden %-osuus F. culmorum -sienellä saastute tulla siemenellä.

K = Käsittelemätön, B * Baytan-peittaus, J76-0 = J76:n itiösuspensio, 1,2 x 107 cfu/ml J76-1 = J76:n itiösuspensio, 1,2 x 106 cfu/ml 20 J76-2 = J76:n itiösuspensio, 1,2 x 105 cfu/ml J76-3 = J76:n itiösuspensio, 1,2 x 104 cfu/ml Kuva 2. J76:n käyttömääräkokeilu kesällä -92. Sairaiden oraiden %-osuus käytettäessä tervettä siementä. Lyhenteet kuten kuvassa 1.

25 Kuva 3. Histogrammi kasvihuonetestien eri vaiheissa . karsiutuneiden sieni-isolaattien vaikutuksesta oraiden terveyteen pelto-olosuhteissa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30

Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti keksinnön mukaiset sienikannat, niiden eristäminen ja karakterisointi sekä tehokokeet kentällä. Edelleen kuvataan näistä kannoista muodostettujen biofungisidisten koostumusten formulointi, 35 koostumusten ominaisuudet, ja tehokokeet näillä koostumuksilla. Samoin kuvataan menetelmä maanäytteistä eristettyjen sienikantojen seulomiseksi.

• 95598 5

Mikro-organismien eristäminen

Maanäytteitä, joista keksinnön mukaiset sienikannat on eristetty, kerättiin vuosina -89, -90 ja -91, yhteensä n.

5 190 kpl. Näytteet kerättiin eri puolilta Suomea, pääasiassa MTTK:n (Maatalouden tutkimuskeskus) tutkimusasemilta, eri maalajeilta ja erilaisista viljelykierroista. Näytteet on otettu juuristokerroksesta (0-15 cm syvyydestä). Kultakin pellolta on otettu useita osanäytteitä, jotka yhdistettiin 10 1-2 litran näytteeksi.

Eristykset suoritettiin joko laimennosmenetelmällä (maa-eristykset) tai syöttikasvimenetelmällä (juurieristykset), joiden suoritus on yksityiskohtaisesti kuvattu jäljempänä 15 Menetelmät-osassa.

Mikro-organismien karakterisointi

Maanäytteistä eristettyjä sienikantoja testattiin keksinnön 20 mukaisella seulontamenetelmällä, joka kuvataan jäljempänä Menetelmät-osassa. Tällöin löytyi viisi kantaa, jotka antoivat erittäin hyviä tuloksia. Kannat, joille annettiin nimet J76, J1431, J1432, M0S1 ja R0S2, karakterisoitiin DSMrssä (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul-25 turen GmbH) Saksassa. Nämä kannat on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti DSM-talletuslaitokseen talletusnume-roilla DSM 7522 (15.3.1993), DSM 8805 (10.12.1993), DSM 8806 (10.12.1993), DSM 8807 (10.12.1993) ja vastaavasti DSM 8808 (10.12.1993).

30

Mikro-organismien morfologiset ominaisuudet ovat seuraavat:

Morfologia: Kuromapahkoissa ei ole steriilejä reunahyyfejä. Konidioforit ovat toistuvasti haarautuneet siten, että 35 kustakin päästä kasvaa useita haaroja. Ulommaisissa haaroissa on fialideja järjestäytyneenä paalumaiseksi kerrokseksi. Fialidit ovat sylinterimäisiä, jopa 15 pm pitui- 6 95598 siä ja niissä on kärkihuokonen. Itiöt muodostuvat ketjuina tai limaisina palloina, ne ovat ellipsin - pisaran muotoisia, joissa on lyhyt hilum, 7-8 x 4 pm, pehmeäseinäisiä, ilman lisäkkeitä.

5

Pesäkkeen morfologia: Kaurahiutaleagarilla pesäke kasvaa 7 päivässä 22 °C:ssa halkaisijaltaan 40 mm:iseksi, rihmasto on lasimainen (läpinäkyvä), itiöivällä alueella syntyy sporodochioita, jotka ovat vihreitä ja järjestäytyneet 10 samankeskisiksi renkaiksi. Ei voimakasta hajua, pesäkkeen alapuoli väritön, vain vähän nestettä, kirkas.

J76-kannan konidioforien rakenne on samankaltainen kuin Myrothecium verrucariällä, mutta se eroaa tästä lajista 15 kuitenkin siten, että se tuottaa sporodochioita, joissa ei ole erilaistuneita marginaalirihmoja, sekä kuivissa ketjuissa olevia konidioita, joissa ei ole tyypillistä viuhka-maista lisäkettä.

20 Gliocladium-suvun edustajat eroavat uusista kannoista siten, että Gliocladiumille on tyypillistä yksittäisten konidioforien tuotto, jotka ovat haarautuneet samoin kuin Penicillium-sienillä.

25 Kannat J76, J1431, J1432, M0S1 ja ROS2 identifioitiin siten . lajiksi Nectria pityrodes Montagne.

Näistä kannoista voidaan valmistaa formulaatteja, so. keksinnön mukaisia biofungisidisiä koostumuksia, jotka ovat 30 hyvin säilyviä, ja joita on helppo levittää torjuntaa vaativille viljelmille. Formulaatio voidaan tuottaa esimerkiksi pulverin muodossa. Mikrobia voidaan lähteä kasvattamaan siirroksesta, joka on itiösuspensiota sisältävä PDA-nappi, jota on säilytetty -80 °C:ssa. Mikrobia voidaan 35 kasvattaa joko nestekasvatuksena tai kiinteällä kantajalla. Ravintoalusta sisältää sokeria, esimerkiksi sakkaroosia, ja typpeä sekä pieniä määriä muita ravinteita. Kasvatuksissa il ' ϊβ·ι M ti lii 4 *» i 7 95598 voidaan käyttää epäspesifisiä ravintoalustoja, esimerkiksi maissinliotusvettä (CSL, Corn Steep Liquor) tai spesifisiä ravintoalustoja, esim. GYM (glukoosi 4 g/1, hiivauute 4 g/1, mallasuute 10 g/1) tai PDB (peruna-dekstroosi-liemi).

5 pH on noin 6,0, se säädetään alussa ennen sterilointia.

Kasvatetaan ravistellen viikosta kahteen viikkoon. Solumassa voidaan erottaa liuoksesta joko suodattamalla suodatinpaperin läpi tai sentrifugoimalla. Jos on käytetty neste-kasvatusta, solumassaan sekoitetaan kantaja-aine, esim.

10 silika, maitojauhe ja/tai CMC (karboksimetyyliselluloosa). Massa kuivataan huoneenlämmössä ja jauhetaan pulveriksi.

Menetelmät 15 Mikrobien eristykset: a) Laimennosmenetelmä (maaeristykset) 10 g maata sekoitettiin 100 ml:aan 0,5%:ista vesiagaria 20 (Bactoagar). Seoksesta tehtiin 10'1 ja 10*2 laimennokset 0,5% vesiagariin, kolme kerrannette. Laimennoksia ravisteltiin (vesihauteessa) ravistelijassa 20-30 min. 1 ml laimennosta pipetoitiin tyhjälle petrimaljalle ja 20 ml Littman Oxgall Agaria (LOA) valettiin päälle. Maljoja 25 inkuboitiin huoneenlämmössä 3-7 vrk. Kasvaneet sieni-pesäkkeet eristettiin puhtaiksi PDA-maljoille (Potato Dextrose Agar).

b) Syöttikasvimenetelmä (juurieristykset) 30

Maanäytettä pantiin kennolevyn (Vefi-VP 96 kartiopottialus-ta) koloihin, 15 koloa/maanäyte (kolot 40x40x60 mm). Koloihin kylvettiin vehnää, ohraa ja rypsiä 5 koloa/laji. Vehnää ja ohraa kylvettiin 4 siementä/kolo, rypsiä 10-20 siemen-35 tä/kolo. Siemenet peitettiin hiekalla. Kastelu siementen päälle ja pintaan, yhteensä vajaa 10 ml/potti. Kasvatus +15 °C:n lämpötilassa. Kahden viikon kasvatuksen jälkeen kasvit , 95598 nostettiin ylös ja pestiin juoksevassa vedessä tai puhdistettiin harjalla ilman vettä. Juurista leikattiin pieniä paloja ja ne pantiin maljoille. Käytetyt alustat: LOA (10 g peptonia, 10 g dekstroosia, 15 g Bacto-Oxgall, 0,01 g B-5 kristalliviolettia, 0,03 g streptomysiiniä, 20 g agaria, ad. 1000 ml vettä), PCNB (15 g peptonia, 1 g KH2P04, 0,5 g MgS04.7H20, 2 g Avicol, 3 ppm streptomysiiniä, 20 g agaria, ad. 1000 ml vettä) ja PDA-Streptomysiini (39 g PDA-valmis-tetta, 300 ppm streptomysiiniä, ad. 1000 ml vettä). Muuta-10 man vuorokauden inkuboinnin jälkeen sienet siirrettiin PDA-maljoille.

Kannat säilytettiin siten, että PDA-maljoista irrotettiin korkkiporalla nappeja, jotka pakastettiin ampulleissa 15 (Nalgene 5000-0012, PP Sterile 1,2 ml) -80 °C:seen.

Seulontamenetelmään sisältyvien kasvihuonetestien suoritus

Hiekkatesti 20 Viljakasvin siemeniä kylvetään hiekkakerroksen päälle. Ensin taudinaiheuttajan rihmastoa ja itiöitä ja sitten testattavan sienen itiöitä pipetoidaan vesisuspensiossa siementen päälle ja kasvualustaan, minkä jälkeen siemenet peitetään hiekalla. Kahden ja puolen viikon kuluttua orai-25 den tautioireiden voimakkuus tarkastetaan. Jatkotesteistä karsitaan ne sienet, jotka eivät vaikuta taudin voimakkuuteen tai osoittautuvat itse patogeenisiksi.

Turvetesti 30 Viljakasvin siemen kastellaan taudinaiheuttajan itiösus-pensiossa ja kuivataan. Tämän jälkeen siemen kastellaan testattavan sienen itiösuspensiolla, kuivataan ja kylvetään. Kasvualustana käytetään höyrytettyä turvetta. Kahden ja puolen viikon kasvatuksen jälkeen tehdään havainnot 35 oraiden terveydestä. Sienikannat, jotka estävät selvästi tautia, jatkavat peltomaatestiin.

t 9 95598

Peltomaatestit

Hienonnettua ja kostutettua peltomaata pannaan 1,5 litran purkkeihin ja kuhunkin purkkiin kylvetään 36 viljakasvin siementä. Siemenkäsittelyt ennen kylvöä tehdään kuten tur-5 vetestissä. Kokeessa käytetään esimerkiksi kolmea kerranneita . Oraiden oireet tutkitaan neljän viikon kasvatusajan j älkeen.

Näissä testeissä hyviksi todetut kannat otetaan kenttä-10 kokeisiin, joilla saadaan lopullinen varmistus valikoitujen mikrobi-isolaattien biopestisiditehosta.

Sienikantojen patogeenisuus J76-sienikannan mahdollisia haitallisia vaikutuksia kasvei-15 hin on alustavasti selvitetty. Tähän mennessä saadut tulokset osoittavat, että sieni ei ole patogeeninen millekään kasville. Testattuja kasvilajeja oli 33 kpl. 1

KOKEELLINEN OSA

Seuraavat kokeet havainnollistavat keksinnön hyödyntämistapoja. Kohdassa (A) kuvataan keksinnön mukaisten Nectria pityrodes -kantojen J76, J1431, J1432, M0S1 ja R0S2 käyttöä 25 itiösuspensioina pääasiassa Fusarium-sienten, mutta myös • muiden sienten aiheuttamien kasvitautien torjunnassa.

Kohdassa (B) kuvataan näistä kannoista valmistettujen formulaatioiden valmistus ja käyttö, kohdassa (C) kokeet, joilla tutkittiin J76-sienikannan vaikutusmekanismia ja 30 kohdassa (D) kuvataan keksinnön mukaisen seulontamenetelmän suoritus ja arviointi.

10 95598

(A) SIENIKANTOJEN KÄYTTÖ ITIÖSUSPENSIOINA

Kokeet kannan J76 itiösuspensiolla 5 Kesällä -92 J76-kannan itiösuspension tehoa testattiin kolmella koepaikalla. Kokeissa käytettiin kahta erilaista siementä: keinotekoisesti Fusarium culmorum -sienellä saastutettua vehnää ja F. nivale -sienen luontaisesti saastuttamaa ohraa.

10

Vehnäkokeiden tulokset on esitetty taulukossa 1. Satotulokset keinosaastutetulla vehnällä on esitetty taulukossa 2.

Ohralla tehdyt orashavainnot on esitetty taulukossa 3.

15 Ohran satoon taudilla ei ollut tilastollisesti merkitseviä vaikutuksia.

« u 95598 TAULUKKO 1. Kesän -92 kolmen koepaikan koe keinosaastu- tetulla vehnällä. Orastuminen ja oraiden tautisuus.

5 ________ käsittely oraat tautisuus lkm/rivimetri pahasti sairaiden 10 oraiden %- osuus JOKIOINEN: terve siemen 50 5,2 käsittelemätön 11 48 15 Baytan-peittaus 45 10 J76 47 7,2 20 MIETOINEN: terve siemen 45 7,3 käsittelemätön 10 42

Baytan-peittaus 39 3,8 25 J76 33 13 30 PÄLKÄNE: terve siemen 50 3,0 käsittelemätön 15 57

Baytan-peittaus 51 24 35 J76 45 11 40 TAULUKKO 2. Kesän -92 kolmen koepaikan koe keinosaastu- tetulla vehnällä. Satotulokset (kg/ha).

45

käsittely JOKIOINEN MIETOINEN PÄLKÄNE

terve siemen 3650 3190 5290 käsittelemätön 1830 1690 1950 50 Baytan -peittaus 3270 3190 4940 J76 3530 2950 4900 55 12 95598 TAULUKKO 3. Kesän -92 kolmen koepaikan koe luonnollisesti saastuneella (F. nivale) ohralla.

5 Orastuminen ja oraiden tautisuus.

käsittely oraat tautisuus lkm/rivim. pahasti 10 sairaiden oraiden %-osuus JOKIOINEN: 15 käsittelemätön 39 7,7

Baytan-peittaus 40 1,2 J76 40 0,9 20 MIETOINEN: 25 käsittelemätön 42 7,4

Baytan-peittaus 42 1,4 J76 43 2,8 30 _ PÄLKÄNE: käsittelemätön 42 26 35 Baytan-peittaus 42 9,4 J76 44 6,3 40

Kannan J76 käyttömäärän koe kesällä -92

Koska J76 antoi todella hyviä tuloksia alkukesän -92 45 orashavainnoissa, sen käyttömäärän vaikutusta torjuntatehoon testattiin kokeessa, joka kylvettiin juuri ennen juhannusta. Kylvösiemenenä käytettiin sekä keinotekoisesti Fusarlum culmorum -sienellä saastutettua että tervettä kevätvehnää.

50 13 95598

Koe kylvettiin pieninä 2 m2:n ruutuina. Niistä laskettiin oraiden tiheys ja havainnoitiin oraiden tautioireiden kehitystä. Orasnäytteet taudinseurantaan kerättiin neljänä eri ajankohtana. Jokaisen käsittelyn näytteet otettiin 5 neljästä kutakin näytteenottokertaa varten erikseen kylvetystä ruudusta. Oraiden havaitut määrät on esitetty taulukossa 4 ja sairaiden oraiden %-osuudet on esitetty taulukossa 5 erikseen sairaalle ja terveelle siemenelle. Taulukon 5 tiedot on esitetty graafisesti kuvissa 1 ja 2.

10 TAULUKKO 4. J76:n käyttömääräkokeilu kesällä -92.

Orastuminen.

15 käsittely oraat lkm/rivimetri 20 Fusarium-saastutettu siemen: Käsittelemätön 18

Baytan-peittaus 57 25 J76-itiösuspensio (1,2 x 107 cfu/ml) 74 J76-itiösuspensio (1,2 x 106 cfu/ml) 58 J76-itiösuspensio (1,2 x 105 cfu/ml) 51 J76-itiösuspensio (1,2 x 104 cfu/ml) 20 30 terve siemen: Käsittelemätön 71

Baytan-peittaus 66 J76-itiösuspensio (1,2 x 107 cfu/ml) 80 35 14 95598 TAULUKKO 5. J76:n käyttömääräkokeilu kesällä -92. Sai raiden oraiden %-osuus F. culmorum -sienellä saastutetulla siemenellä ja terveellä 5 siemenellä. Lyhenteet kuten kuvassa 2.

käsittely päiviä orastumlsesta 10 10 17 30 44

Fusarium-saastutettu siemen: 15 K 75,4 82,8 79,5 85,1 B 15,9 60,9 65,3 78,2 J76-0 10,1 50,0 66,6 70,3 J76-1 23,1 51,8 55,5 62,9 J76-2 36,4 64,7 76,0 78,0 20 J76-3 68,6 72,8 77,1 76,2 terve siemen: K 54,7 71,8 67,7 85,1 B 8,4 50,4 58,3 73,6 25 J76-0 14,3 48,0 69,9 73,8 1

Kenttäkokeet J76:n itiösuspensiolla kesällä -93

Kokeet toteutettiin MTTK:n pelloilla Jokioisilla, Mietoi-sissa ja Pälkäneellä. Kokeissa käytettiin kuutta siemenerää: 35 'Luja'-vehnä, luonnollisesti F. culmorum -sienen saastuttama 'Luja’-vehnä, keinotekoisesti F. culmorum -sienellä saastutettu 40 - 'Luja'-vehnä, terve ’Laari’-vehnä, terve ’Kustaa'-ohra, luonnollisesti eri Fusarium -sienten ja Bipolaris sorokiniana -sienen saastuttama 'Yty'-kaura, luonnollisesti F. avenaceum -sienen saas-45 tuttama - 95598 15

Terveitä vehnäeriä kylvettiin vain Jokioisille, muilla neljällä siemenellä perustettiin kokeet kaikille kolmelle koepaikalle. Kokeet kylvettiin 10 m2:n ruutuihin.

5 Siemenkäsittelyt olivat kaikilla siemenerillä samat: K = käsittelemätön kontrolli B = kemiallinen kontrolli, Baytan I -peittaus J76S = J76-itiösuspensio puhdasviljelmästä (8,4 x 10’ 10 cfu/kg siementä)

Taulukossa 6 on esitetty oraiden tautivioitusten voimakkuus käsittelyittäin kullakin siemenerällä erikseen. Satotulokset on koottu taulukkoon 7.

15 TAULUKKO 6. J76-itiösuspension kenttäkoe -93. Tautiha- vainnot luonnollisesti saastuneella vehnällä. Pahasti sairaiden oraiden %-osuus 20

OHRA KAURA LUONN. KEINOT. TERVE TERVE

SAAST. SAAST. LUJA LAARI

VEHNÄ VEHNÄ

25 JOKIOINEN

K 6,0 10,1 7,4 34,2 20,6 5,7 B 0,9 2,0 2,1 1,0 1,4 0,7 J76S 0,9 1,4 0,7 1,0 3,3 5,7 30

MIETOINEN

K 12,8 3,5 20,4 72,0 35 B 1,3 0,6 5,7 6,6 J76S 5,4 0 7,1 7,3

PÄLKÄNE

40 K 9,6 7,4 10,9 26,9 B 2,5 3,3 2,1 0,6 J76S 2,4 3,6 2,3 0 45___ 16 95598 TAULUKKO 7. Satotulokset J76-itiösuspension kenttäko keista -93. (kg/ha)

5 OHRA KAURA LUONN. KEINOT. TERVE TERVE

SAAST. SAAST. LUJA LAARI

VEHNÄ VEHNÄ

JOKIOINEN

10 K 7460 6650 6060 2950 6100 6360 B 7500 6790 5870 5690 5940 6060 J76S 7840 6650 6050 6040 6150 6570 15

MIETOINEN

K 5900 5780 4920 3890 B 6070 5200 4910 4990 20 J76S 6120 5440 4670 4810

PÄLKÄNE

K 4670 5560 3630 2950 25 B 4550 5200 4190 4000 J76S 4710 5430 3710 3650 30 J76:n testaus vehnän haisunokea ja ohran tyvi- ja lehtilaikkua vastaan 1 2 3 4 5 6

Kesällä -93 Kasvinsuojelulaitos järjesti kenttäkokeen, 2 jossa testattiin 9 kemiallisen peittausaineen tehoa vehnän 3 haisunokeen (Tiilettä caries). Siemenet käsiteltiin joko 4 kunkin peittausaineen käyttöohjeen mukaan tai J76:n itiö- 5 suspensiolla. Kylvöt tehtiin pellolle 0,1 m2:n ruutuihin ja 6 kokeesta havainnoitiin infektoituneiden tähkien lukumäärät (taulukko 8).

17 95598 TAULUKKO 8. Peittauskäsittelyjen teho vehnän haisunoki- kokeessa.

5 PEITTAUSTEHO (%) (»Infektoituneiden tähkien määrän väheneminen)

KÄSITTELY

10 Täyssato S -neste 78

Baytan WS 100

Beret 050 100

Fungazil C 100

Panoctine 35 100 15 Raxl I -jauhe 100

Raxl I -neste 100

Prelude LS 100

Vitavax 200 FF 100 20 J76 85

Baytanin tehoaineena on triadimenoli. Baytan I on seos,

25 joka sisältää triadimenolia ja imatsaliinia. Täyssato S

sisältää karboksiinia ja imatsaliinia. Panoctinen tehoaine on guatsatiini.

Siementen käsittely J76-itiöillä oli mukana myös kenttä-30 kokeessa, jossa testattiin kemiallisia torjunta-aineita ohran tyvi- ja lehtilaikkua (Bipolar is sorcikinlana) vastaan. Kokeessa käytettiin 10 m2:n ruutuja. Orastumisessa ei havaittu eroja eri käsittelyjen välillä. J76 lievensi oireita selvästi (taulukko 9), vaikka taudinaiheuttaja 35 onkin hyvin erilainen verrattuna Fusarium-sieniin, joita vastaan se on valittu.

• .

18 95598 TAULUKKO 9. Peittauskäsittelyjen teho ohran tyvi- ja lehtilaikkua vastaan.

5 PEITTAUSTEHO (%) (= sairaiden oraiden määrän väheneminen)

KÄSITTELY

10 Prelude LS 85

Dividend 37,5 (400 ml) 84

Dividend 37,5 (200 ml) 81

Baytan I 81

Beret Special (400 ml) 74 15 Raxl I -jauhe 70 Täyssato S -neste 66

Panoctine Plus 66

Fungazil C 66

Beret Special (200 ml) 65 20 Raxl I -neste 64

Beret FS 050 49 PNL 210 39 J76 69 25

(B) SIENIKANN01STA VALMISTETUT FORMULAATIOT JA NIIDEN TEHO 30 KENTTÄKOKEISSA

J76-sienikannasta valmistettiin pulveriformulaatiot seuraavasti : 1 35 Formulaatio 1

Kasvatus tehtiin 1 1 erlenmeyer-pullossa, jossa oli 0,5 1 ravintoalustaa, joka sisälsi sakkaroosia 4 g/1, hiivauutet-ta 4 g/1 ja mallasuutetta 10 g/1. pH säädettiin ennen autoklavoimalla suoritettavaa sterilointia arvoon 6,0.

40 Siirroksena käytettiin itiöitä sisältävää, -80 eC:ssa säilytettyä agarnappia (Potato dextrose agar-alusta). Ravistelijan kierrosnopeus oli 150 rpm, kasvatuslämpötila oli huoneenlämpö (22 °C) ja kasvatusaika 7-12 vrk. Solut erotettiin suodattamalla suodatinpaperia käyttäen. Solumas-45 saan sekoitettiin silikaa, maitojauhetta ja CMC:tä (karbok-simetyyliselluloosaa) seuraavasti: • · 19 95598 soluja 20 %, silikaa 55 %, maitojauhetta 15 %, CMC:tä (vesil. 7%) 10 %.

5

Kuivattiin huoneenlämmössä avonaisilla petrimaljoilla vetokaapissa 2 vrk. Kerroksen paksuus oli 1-2 cm. Kuivatut levyt jauhettiin pulveriksi. Formulaation elävyys oli 107 cfu/g. (cfu 1 colony forming units).

10 cfu (colony forming units) on yksikkö, jota käytetään mikrobien elävyysmäärityksessä. Laimennettu mikrobisuspen-sio levitetään agar-maljoille ja pesäkkeet lasketaan parin vuorokauden kuluttua. Kun tiedetään laimennos, voidaan 15 laskea pesäkkeiden eli mikrobisolujen määrä alkuperäisessä näytteessä.

Formulaatio 2

Soluja kasvatettiin samalla tavalla kuin formulaatiota 1 20 varten, minkä jälkeen solumassaan sekoitettiin silikaa, maitojauhetta, CMC:tä ja askorbiinihappoa seuraavasti: soluja 60 %, silikaa 20 %, maitojauhetta 14 %, 25 CMC:tä (7%) 3 %, . askorbiinihappoa 3 %.

Kuivattiin samalla tavalla kuin formulaatio 1 ja jauhettiin pulveriksi. Elävyys 107 cfu/g. 2 3 4 5 6 7 2

Formulaatio 3 3

Soluja kasvatettiin samalla tavalla kuin formulaatiota 1 4 varten, minkä jälkeen solumassaan sekoitettiin sakkaroosia 5 ja tärkkelystä seuraavasti: 6 soluja 20 % 7 sakkaroosia 25 % tärkkelystä 55 %.

95598 20

Kuivattiin samalla tavalla kuin formulaatio 1 ja jauhettiin pulveriksi. Elävyys 107 cfu/g.

Formulaatio 4 5 J76-kantaa kasvatettiin suoraan kiinteällä silika-kantajaa sisältävällä alustalla. Ravintoliuokseen käytettiin 8% mallasuutetta (Maltax MP10, Lahden Polttimo). 120 g ravintoliuosta sekoitettiin dekantterilasissa 50 grammaan sili-kapulveria ja autoklavoitiin 20 min 120 eC:ssa. Jäähtynyt 10 alusta siirrostettiin 10 g:11a J76 itiösuspensiota, joka saatiin raaputtamalla itiöt PDA-maljalta steriiliin veteen. Alustaa inkuboitiin 20 vuorokautta 16 eC:ssa, minkä jälkeen sitä kuivattiin huoneenlämmössä 2 vrk. Kuivatun preparaatin elävyys oli 107 cfu/g.

15

Muista keksinnön mukaisista kannoista voidaan valmistaa formulaatiot samalla tavalla.

Pulveriformulaatioiden teho peltokokeissa.

20

Seuraavassa on kuvattu Kasvinsuojelulaitoksen järjestämät kokeet J76-kannalla kesällä -93. Kokeet toteutettiin MTTK:n pelloilla Jokioisilla, Mietoisissa ja Pälkäneellä. Kokeissa käytettiin kuutta siemenerää: 25 'Luja'-vehnä, luonnollisesti F. culmorum -sienen saastuttama 'Luja'-vehnä, keinotekoisesti F. culmorum -sienellä saastutettu 30 - 'Luja'-vehnä, terve ’Laari *-vehnä, terve 'Kustaa'-ohra, luonnollisesti eri Fusarium -sienten ja Bipolaris sorokiniana -sienen saastuttama 'Yty'-kaura, luonnollisesti F. avenaceum -sienen saas-35 tuttama il isä Illil li 14 4#» . ; - 95598

5 Siemenkäsittelyt olivat kaikilla siemenerillä samat: K = käsittelemätön kontrolli B = kemiallinen kontrolli, Baytan I -peittaus J76PK = J76-pulveri kuivapeittauksena (8,4 x 10® cfu/kg 10 = suurin siemeniin tarttunut määrä) J76PN = J76-pulveri nestepeittauksena (8,4 x 10® cfu/kg)

Taulukossa 10 on esitetty oraiden tautivioitusten voimak-15 kuus käsittelyittäin kullakin siemenerällä erikseen. Satotulokset on koottu taulukkoon 11.

TAULUKKO 10. J76-pulverin kenttäkokeet -93. Pahasti sairaiden oraiden %-osuus.

20 _

OHRA KAURA LUONN. KEINOT. TERVE TERVE

SAAST. SAAST. LUJA LAARI

VEHNÄ VEHNÄ

25 JOKIOINEN

K 6,0 10,1 7,4 34,2 20,6 5,7 B 0,9 2,0 2,1 1,0 1,4 0,7 J76PK 2,2 1,5 2,7 7,0 6,2 2,8 30 J76PN 1,2 1,9 3,9 1,3 5,7 4,6

MIETOINEN

K 12,8 3,5 20,4 72,0 35 B 1,3 0,6 5,7 6,6 J76PK 10,1 0 17,2 42,5 J76PN 9,1 0,3 13,7 14,3

PÄLKÄNE

40 K 9,6 7,4 10,9 26,9 B 2,5 3,3 2,1 0,6 J76PK 5,3 2,6 4,8 6,1 J76PN 3,9 3,8 3,9 2,7 45 22 95598 TAULUKKO 11. Satotulokset J76-pulverin kenttäkokeista -93.

5 OHRA KAURA LUONN. KEINOT. TERVE TERVE

SAAST. SAAST. LUJA LAARI

VEHNÄ VEHNÄ

JOKIOINEN

10 K 7460 6650 6060 2950 6100 6360 B 7500 6790 5870 5690 5940 6060 J76PK 7610 6940 6060 5140 6400 6320 J76PN 7610 6970 6040 6020 *6000 6400 15

MIETOINEN

K 5900 5780 4920 3890 B 6070 5200 4910 4990 20 J76PK 6000 5670 4770 4620 J76PN 6110 5760 4790 4950

PÄLKÄNE

25 K 4670 5560 3630 2950 B 4550 5200 4190 4000 J76PK 4730 5560 3600 3390 J76PN 4870 5470 3660 3760 30 _

Lisäksi J76-kannasta valmistettujen erilaisten formulaati-35 oiden torjuntavaikutusta eri sieniin testattiin vuonna -93. Taulukoissa 12-18 on esitetty näiden kokeiden tulokset.

23 95598 TAULUKKO 12. J76:n torjuntavaikutus Gaeumannomyces-sie nellä saastutetussa hietamaassa Polkka-vehnällä. Astiakoe, katoksen alla.

5

Koejäsen Oras- Täysin Tau- Tuorepaino 1

tumis- tervei- tisuus- - H

% den %- indeksi g/ker_ g/tai- I

________ osuus__() ranne__mi_I

Saastutettu 78,7 65,3 0,76 5,8 0,28 (Ei käsitelty 10 J76:lla)______ J76 KF kuiva- 81,3 76,0 0,55 10,1 0,46 peittaus 8 g/kg______ J76 neste- 90,7 81,3 0,31 10,4 0,43 15 peittaus 10® cfu/ml KF * kiinteän faasin preparaatti (formulaatio 4) 20 Tautisuusindeksi: 0 terve 1 lievästi tautinen 2 voimakkaasti tautinen 3 orastumaton ,. 95598 TAULUKKO 13. J76-preparaattien torjuntavaikutus Fusarium culmorum -sieneen Polkka-vehnällä. Astia-koe, kasvualustana turve. KF = Kiinteällä 5 faasilla kasvatettu (Formulaatio 4), R = ravistelukasvatus nesteessä (Formulaatio 1), M = pelkkä mikrobi maljalla kasvatettuna.

10 Koejäsenet Orastu- Täysin Tau- Tuore- mis-% terv. %- tisuus- paino osuus indeksi g/ker- ____(0-3)__ranne

Terve__91__84__0,37__16,2 |

Saastutettu__30__5__2, 54__4, 5_ J76 KF 40/931 nes- 72 44 1,17 14,0 tep. 106 cfu/ml_____ 15 J76 R 10/2 C nes- 71 49 1,21 13,0 tep. 106 cfu/ml______ J76 M 106 cfu/ml 76 58 0,99 14,8

Tautisuusindeksi: 20 0 terve 1 lievästi tautinen 2 voimakkaasti tautinen 3 orastumaton 25 TAULUKKO 14. J76:n teho Pythium-sieneen kurkulla. Tulok set kolmen astiakokeen (pH 6,2, pH 6,9 ja pH 7,4) keskiarvolukuina.

«

Koejäsen Elävien Tauti- Tuorepaino taimien suusin- g/kerranne %-osuus deksi ___(0-2)__

Terve__98__0,04__12,1_ E Saastutettu__47__0, 63__5,4_ J76 nestep. 106 58 0,52 6,9 j

cfu/ml I

Tautisuusindeksi: 0 terve 1 kuollut 40 2 itämätön ·« i tiili l i i h 25 95598 TAULUKKO 15. j76-sienikannan torjuntavaikutus Rhizocto- nia solani -sienen saastuttamassa hieta-5 maassa kukkakaalilla. Astiakoe kasvihuo neessa .

Koejäsen Taimet- Täysin Tuorepaino tumis-% tervei- -- ^en g/kerran- g/taimi ___osuus ne__ Käsittelemätön 92,7__52,0__21,7__0,79_ 10 I J76 nestep. 107 94,7 72,0 24,1 0,84 15 TAULUKKO 16. J76-sienikannan torjuntavaikutus Fusarium nivale -sienellä saastutetussa hietamaassa Kustaa-ohralla. Astiakoe ulkona, katoksen alla.

Koejäsen Orastu- Täysin Tau- Tuore- I

mis-% tervei- tisuusin- paino I

den %- deksi g/ker- I

___osuus__( 0-3 )__ranne_I

Terve__93,3__37,3__0,91__0^9_

Saastutettu__73,3__29,3__1,43__7,8_ J76 KF nestep. 80,0 52,0 0,91 9,7 25 106 cfu/ml_____ J76 nestep. 106 81,3 52,0 0,93 10,3 | cfu/ml | E====a=====ss^=3sasLsxEE====J=aiBsa=ä3=====^l

Tautisuusindeksi: 30 0 terve 1 lievästi tautinen 2 voimakkaasti tautinen 3 orastumaton 1 26 95598 TAULUKKO 17. J76-sienikannan torjuntateho Alternaria brassicicola -sieneen kukkakaalilla. Tulokset keskiarvolukuja kolmessa eri lämpöti-5 lassa (15 °C, 20 eC ja 25 eC) tehdyistä kokeista.

Koejäsen Taimettu- Tau- Tuorepaino mis-% tisuusin- g/kerranne deksi ___(0-3)__

Terve__96__0,17__33,2_ 10 Saastutettu__50__2,01__21,8_ J76 nestep. 106 96 0,22 35,4

Tautisuusindeksi: 15 0 terve 1 lievästi tautinen 2 voimakkaasti tautinen 3 kuollut tai itämätön 20

Taulukossa 18 esitetään tulokset keksinnön mukaisten Nect-ria pityrodes -kantojen J76, J1431, J1432, M0S1 ja R0S2 torjuntatehokokeista Fusarium culmorvm -sieneen vehnällä.

25 Tulokset on esitetty keskiarvona kahdesta kokeesta, joita toisessa käytettiin kasvualustana turvetta ja toisessa peltomaata.

t il i«:r ΐϋΐί I i -i ftt 27 95598 TAULUKKO 18. Viiden Nectria pityrodes -kannan (J76, J1431, J1432, MOS1 ja ROS2) torjuntateho Fusarium culmorum -sieneen vehnällä. Tulok-5 set kahden astiakokeen (turve ja peltomaa) keskiarvolukuina.

g—E—=m ti

Koejäsenet Täysin Tau- Tuore- tervei- tisuus- paino den %- indeksi (g/ker- __ osuus__(0-3)__ranne)

Saastutettu__23__2,06__3,0_ 10 J76 nestep. 107 cfu/ml__73__0, 66__8,0_ J1431 nestep. 107 cfu/ml 80__0, 51__8, 5_ J1432 nestep. 107 cfu/ml 72__0,78__8,0_ MOS1 nestep. 107 cfu/ml 76__0,66__8,8_ ROS2 nestep. 107 cfu/ml 76 0,66 8,3

Tautisuusindeksi: 0 terve 1 lievästi tautinen 2 voimakkaasti tautinen 20 3 orastumattomat

(C) J76:N VAIKUTUSMEKANISMI

25 Alustavia havaintoja tavoista, joilla J76 toimii muiden sienten antagonistina, on tehty mikroskoopilla ja joillakin laboratoriotesteillä.

Kun mikroskoopissa tarkastellaan J76:n ja F. culmorum 30 -sienen rihmojen vuorovaikutuksia, voidaan ensimmäisten selvien reaktioiden todeta olevan hyvin nopeita. Rihmojen kosketuskohdassa Fusarium-rihman solut alkavat hajota havaittavasti n. tunnin kuluttua kontaktista. Ensin solujen seinämät menettävät muotoaan, sitten solut tyhjenevät ja 35 lopulta myös soluseinät hajoavat täysin. Kosketuskohdista

Fusarium-rihmojen hajoaminen leviää hitaasti eteenpäin. Kun J76 ja F. culmorum ovat kasvaneet sekaisin muutaman päivän, ei Fusarium-sienen rihmoja voida enää löytää. Myös sen 28 95598 itiöt (sekä kuromat että kätköitiöt) hajoavat J76:n vaikutuksesta, mutta hitaammin kuin rihmasto. Tavallisesti J76 -rihmat kietoutuvat löysästi Fusarium-itiöiden ympärille ennen niiden hajoamista. J76:n ei ole havaittu varsinaises-5 ti tunkeutuvan Fusarium-rihmojen sisään.

Mikroskooppihavaintojen perusteella voidaan päätellä, että J76 todennäköisesti erittää ympäristöönsä biologisesti aktiivisia aineita. Ne voivat olla luonteeltaan entsyymien 10 tai antibioottien kaltaisia. Niiden tuotto voi hyvin olla myös J76:n pääasiallinen toimintatapa, sillä sen ei ole havaittu suoraan loisivan muita sieniä, eikä se hidaskasvuisena voi ilmeisesti kovin tehokkaasti kilpailla ravinteista. Muiden sienten kasvuun vaikuttavien metaboliittien 15 tuotosta on saatu viitteitä myös sellofaanitestissä.

Kun J76 ja F. culmorvm kasvavat rinnakkain hyvin ohuella kasvualustalla, syntyy estovyöhyke, jossa Fusarium-sienen kasvu pysähtyy. Normaalipaksuisella kasvualustalla tätä ei 20 voida havaita. Tämä johtuu todennäköisesti kasvualustaan diffuntoituneiden aineiden pienistä konsentraatioista.

J76:n erittämillä haihtuvilla aineilla on myös havaittu heikkoa F. culmorum -sienen kasvua estävää vaikutusta. 1 2 3 4 5 6

Sellofaanitesti: Kasvualustan päälle asetettiin sello- 2 ’ faanikalvo ja J76-kantaa kasvatettiin tämän kalvon päällä.

3 10 päivän kasvatuksen jälkeen kalvo ja sen mukana J76 4 poistettiin. Kasvualustaan jäivät J76:n erittämät kalvon 5 läpi kulkeutuneet aineet. Kontrollina käytettiin maljoja, 6 joilla pidettiin pelkkää sellofaanikalvoa ilman J76:a. Sellofaanitestin tulokset on esitetty taulukossa 19.

„ 55598 TAULUKKO 19. J76-sienen tuottamien aineenvaihduntatuot teiden vaikutus F. culmorum-sienen kasvuun sellofaani testissä, kasvunopeus nun/vrk 5 J76 2,5 10 Kontrolli 6,2

15 (D) SEULONTAMENETELMÄN SUORITUS JA TULOSTEN ARVIOINTI

HIEKKATESTIT

Kylvöalusta

Kylvöalustana käytettiin hiekkaa, raekoko 0,2 - 0,7 mm 20 (Kauniston Sora Oy, Loimaa). Hiekka kasteltiin sekoittamalla 4 osaan hiekkaa 1 osa vettä. Kartiokennostosta (Vefi-VP 96 kartiopottialusta) leikattiin 5x7 potin (ä 50 ml) kokoinen levy, joka pantiin muovilaatikkoon. Potit täytettiin kostutetulla hiekalla, niin että 1-1,5 cm niiden yläreunas-25 ta jäi tyhjäksi. Jokaiseen pottiin kylvettiin kolme Luja-kevätvehnän siementä.

Käsittelyt

Fusarium culmorum -saastuke: F. culmorum kasvatettiin PDA-30 maljoilla huoneenlämmössä n. 1 kk:n ajan (kunnes itiöi runsaasti). Rihmasto itiöineen irrotettiin maljalta ja' sekoitettiin tislattuun veteen Ultra-Turrax-sekoittimella. Itiöiden määrä säädettiin 10® itiöön/ml. Liuos pakastettiin 30 ml annoksina Minigrip-pusseihin -20 eC:seen. Testiä 35 varten pakastetut liuokset sulatettiin ja sekoitettiin uudelleen. Liuosta käytettiin sellaisenaan (perusliuos) ja 10'2-laimennoksena. Fusarium-kantojen patogeenisuutta pidettiin yllä kierrättämällä niitä kasvien kautta (vehnän siemeniä saastutettiin Fusarium-suspensiolla ja taudinai-40 heuttaja eristettiin uudelleen sairaista oraista).

30 95598

Antagonistlsuspensio: Syväpakastimesta otettu antagonistia sisältävä PDA-nappi jaettiin kolmeen osaan ja pantiin kasvamaan kolmelle PDA-maljalle. Maljoja kasvatettiin huoneenlämmössä (pimeässä) noin kolmen viikon ajan. Antagonis-5 tisuspension perusliuos valmistettiin raaputtamalla kaksi antagonistimaljaa 50 ml:aan tislattua vettä. Sekoitettiin Ultra-Turrax-sekoittimella. Perusliuoksesta tehtiin 10'1 ja 10'3 -laimennokset.

10 Siemenkäsittelyt: Kartiopottialustaan kylvettyjen siementen päälle pipetoitiin ensin 1 ml F. culmorum -suspensiota ja sen päälle 1 ml antagonistisuspensiota. Kaikilla kuudella suspensioiden itiötiheyksien yhdistelmällä (kaksi F. culmorum -suspension laimennosta x kolme antagonistisuspension 15 laimennosta) käsiteltiin 15 siementä viidessä potissa.

Kontrollikäsittelyt: Jokaisessa yhden sienen testaukseen käytetyssä pottialustassa oli lisäksi 15 siementä viidessä potissa, jotka käsiteltiin pelkästään testattavan sienen 20 perusliuoksella.

Hiekkatesteissä testattiin kerralla 15-30 eristettyä sieni-kantaa. Jokaisena testien aloituspäivänä kylvettiin myös yksi erillinen pottialusta, jonka avulla tarkastettiin 25 siemenen terveys ja käytetyn F. culmorum -saastukkeen kyky aiheuttaa tautia. Kolme erilliseen alustaan kylvettyä kontrollikäsittelyä olivat: saastuttamaton (pelkkä vesi), saastutus F. culmorum -perusliuoksella ja saastutus F. culmorum -perusliuoksen laimennoksella (10'2). Kutakin 30 näitä kolmea käsittelyä varten kylvettiin 30 siementä 10 pottiin.

Kasvatusolot: Sienisuspensioiden pipetoinnin jälkeen siemenet peitettiin kostutetulla hiekalla. Laatikot potti-35 alustoineen käärittiin läpinäkyvään muoviin ja siirrettiin kylmiöön. Siellä kylvöksiä kasvatettiin 16-18 vrk 10-15 3i 95598 eC:n lämpötilassa. Kasvatuksille annettiin keinovaloa 14 h/vrk.

Hiekkatestien tarkastus ja arvostelu 5 Kasvatuksen jälkeen oraat juurineen pestiin juoksevan veden alla ja niiden tautioireista tehtiin havainnot. Terveiksi laskettiin oraat, joissa ei näkynyt juuri- tai koleoptii-lisolukon tummumista, ja itämättömät kovina säilyneet siemenet. Sairaiksi luokiteltiin oraat, joissa oli selviä 10 oireita, ja itämättömät pehmenneet siemenet.

Ensin tarkastettiin kontrollikäsittelyjen kasvit. Jos vedellä käsitellystä siemenestä oli kehittynyt vain terveitä kasveja ja kummallakin patogeenikäsittelyllä saatiin 15 selviä tautioireita, testi hyväksyttiin ja päätettiin tehdä havainnot myös testattavilla sienikannoilla käsitellyistä kasveista.

Hiekkatestissä kullekin eristetylle sienikannalle annettu 20 arvosana määräytyi niiden sillä käsiteltyjen kasvien lukumäärästä, jotka luokiteltiin sairaiksi. Jos pelkästään testattavalla sienellä käsiteltyjen kasvien orastuvuus oli selvästi heikentynyt verrattuna terveeseen kontrolliin tai jos niistä löytyi muita tautioireita, todettiin sieni 25 kelpaamattomaksi jatkotesteihin. Jos vioituksia ei havaittu, arvosteltiin kukin eristetyn sienikannan testauksessa käytetyistä kuudesta patogeenin itiötiheyden ja testattavan sienen itiötiheyden yhdistelmästä erikseen asteikolla: 1 2 3 4 5 6 • 0 = kaikki 15 kasvia terveitä 2 1 = enintään 2 vioittunutta kasvia 3 2 = 3-5 vioittunutta kasvia 4 3 = 6-9 vioittunutta kasvia 5 4 = 10-13 vioittunutta kasvia 6 5 = enintään yksi terve kasvi 32 95598

Kuuden yllämainitun erillisen arvosanan perusteella testatuista sienikannoista valittiin ne, jotka jatkoivat seuraa-vaan testivaiheeseen eli turvetesteihin. Jatkoon kelpuutettiin ne kannat, jotka saivat vähintään kolme kappaletta 5 arvosanoja 0 ja 1. Jos sieni ei saanut arvosanoja 0, se kelpasi jatkoon, jos se sai vähintään neljä kappaletta arvosanoja 1.

TURVETESTIT 10 Kasvualusta

Kasvualustana käytettiin höyrytettyä, lannoitettua ja kalkittua turvetta. Syksyyn 1992 asti käytettiin Torron-suolta peräisin olevaa seulomatonta raakaturvetta, tämän jälkeen valmiiksi seulottua raakaturvetta Eurajoelta.

15 (Lannoitus: 800 g dolomiittikalkkia ja 100 g turpeen Y-lannosta/100 1 turvetta). Kostutettu turve levitettiin sipulilaatikoihin (28,5 x 49,5 x 9,4 cm, Weibulls Robusta "Mammut"-läda, Muoviyhtymä Oy) n. 5 cm kerrokseksi. Laatikon pohjalla oli muovi.

20 Käsittelyt T = terve, saastuttamaton siemen, Luja-kevätvehnää. Kasteltiin tislatulla vedellä.

F = F. culmorumilla saastutettu siemen. Siemenet upotet- 25 tu F. culmorum -perusliuokseen (liuosta käytettiin ; ylimäärin), jossa n. 106 itiötä/ml (Fusarium-kasva- · tus, kts. hiekkatesti). Käsittelyn jälkeen siementen annettiin kuivua yön yli paperille levitettynä.

F0 = F. culmorum -saastutus kuten F-käsittelyssä. Kun 30 siemenet olivat kuivuneet, ne kasteltiin antagonis- tiperusliuokseen. Perusliuos tehtiin raaputtamalla yhden antagonistimaljan rihmasto ja itiöt 25 ml:aan tislattua vettä. Käsittely tehtiin ravistelemalla siemeniä ja antagonistiliuosta pienessä muovipul-35 lossa. Käsittelyn jälkeen siemenet kuivattiin paperilla.

as 95598 F2 = F. culmorum -saastutus kuten F-käsittelyssä. Anta-gonistikäsittely kuten FO-käsittelyssä antagonistin perusliuoksen 10*2-laimennoksella.

5 Turpeeseen kylvettiin laatikon poikkisuunnassa 10 riviä, 30 siementä/rivi. Kylvöjärjestys oli seuraava: suojarivi, F, F0, F2, T, F, F0, F2, T, suojarivi. Kylvön jälkeen siemenet peitettiin turpeella ja laatikot kasteltiin.

10 Kasvatusolot

Kylvöksiä kasvatettiin kasvihuoneessa n. 15 °C:n lämpötilassa. Pimeänä vuodenaikana annettiin lisävaloa monimetal-lilampuilla 12 h/vrk. Kylvöksiä kasteltiin tarvittaessa lannoittamattomalla vedellä. Kasvatusaika 18 vrk.

15

Arvostelu

Oraat pestiin ja niiden tautioireista tehtiin havainnot kuten hiekkatestin jälkeen. T- ja F-käsittelyistä tehtyjen havaintojen perusteella päätettiin, hyväksyttiinkö testin 20 tulos. Terveessä kontrollissa sai olla yhteensä enintään 12 sairasta kasvia (60 kylvetystä siemenestä) ja patogeeni-kontrollissa (F) piti olla vähintään 52 sairasta kasvia (60 siemenestä). Testattu sienikanta kelpuutettiin seuraavaan testivaiheeseen (peltomaatesteihin), mikäli jommalla kum-25 maila sen liuosväkevyydellä käsitellyistä siemenistä (ä 60 kpl) kehittyi enintään 19 sairasta kasvia.

PELTOMAATESTIT

Kylvöalusta 30 Käytetty peltomaa oli Jokioisten kenttäkoealueelta haettua peltomaata, hietasavea. Maa joko hienonnettiin käsin tai (talvella 1992-1993) lxl cm pöytäseulan läpi. Kasvatusastioina käytettiin 1,5 1 muoviruukkuja (Φ 14 cm), jotka täytettiin niin että 3-4 cm yläreunasta jäi tyhjäksi. Ruukun 35 pohjalla oli suodatinpaperi.

34 9 5 5 9 8 Käsittelyt 1. Terve siemen. Kasteltiin pelkällä tislatulla vedellä.

2. Fusarium-kontrolli. Siemenet kasteltiin Fusarium-saas-tukkeella (valmistus, kts. hiekkatestit), jossa n. 106 5 itiötä/ml, liuosta käytettiin ylimäärin.

3. Saastutus kuten Fusarium-kontrollissa. Siementen kuivuttua ne käsiteltiin antagonistisuspensiolla, joka valmistettiin sekoittamalla yhden maljan rihmasto ja itiöt 25 mitään tislattua vettä. Käsittely tehtiin 10 muovipullossa, johon pantiin 130 kpl (120-150 kpl) siemeniä ja 1 ml (tai 1,5 ml) antagonistisuspensiota.

4. Torjunta-ainekäsittely. Saastutus kuten Fusariuni-kontrollissa. Siementen kuivuttua ne käsiteltiin Baytan I -peittausjauheella 2 g/siemenkilo. Aiemmin myös Ceresan 15 ja Täyssato S-käsittely.

Käsitellyt siemenet kylvettiin ruukkuihin, 36 siementä/ ruukku, kolme kerrannetta/käsittely. Kylvökset peitettiin peltomaalla. Kasvatusolot kuten turvetestissä. Kasvatusaika 20 n. neljä viikkoa.

Tarkastus ja arvostelu

Oraat pestiin ja niiden tautisuus arvioitiin: 1 2 3 4 5 6 · 0 = täysin terve 2 : 1 = lievä Fusarium-vioitus 3 • # 4 2 = kohtalaista-voimakasta taudin vioitusta 5 3 = oraat ruskettuneita kauttaaltaan - kuolleita 6

KASVXHUONETESTIEN TEHOKKUUS

, Kesällä -93 yhdessä laajassa kenttäkokeessa testattiin edellä kuvatun sienten valintamenetelmän tehokkuutta.

Kokeessa selvitettiin olivatko oikeat eristetyt sienikannat 35 selvinneet jatkoon lokakuun -91 ja helmikuun -93 välisenä aikana suoritetun karsintatestisarjan aikana. Siemenkäsit-telyihin valittiin satunnaisesti 60 sellaista hiekkates- 35 9 5 5 9 8 teissä hylätyistä kannoista, jotka eivät olleet osoittautuneet patogeenisiksi vehnälle. Turvetesteissä karsiutuneista kannoista kokeeseen arvottiin 92 kappaletta. Kaikki 58 maatesteihin selvinnyttä sientä otettiin myös mukaan ko-5 keeseen. Näistä 43 oli karsiutunut maatestissä ja 15 oli valittu sen perusteella kenttäkokeisiin.

Yllämainittujen 210 käsittelyn lisäksi kokeessa oli myös 6 kontrollikäsittelyä: Käsittelemätön (K), Baytan I -peittaus 10 (B) ja neljä aikaisemmissa kokeissa eniten tutkittua sieni- kantaa, mm. J76.

Kokeessa käytettiin F. culmorxm -sienen luonnollisesti saastuttamaa 'Luja'-vehnää. Havaintoyksikkönä oli 1,4 m 15 pitkä orasrivi, jonka kylvämiseen käytettiin 5,5 g siementä. Kaikista 216 käsittelystä kylvettiin kuusi kerrannette. Kokeen satunnaistaminen tehtiin kuutiohila-koemallin mukaan. Näin vähennettiin kentän aiheuttamaa virhevaihtelua tehdyissä havainnoissa. Suunnilleen viiden viikon kuluttua 20 kylvöstä oraat kaivettiin maasta, ne laskettiin ja niiden tautioireet havainnoitiin.

Kokeen tulokset on havainnollistettu neljällä histogram- milla kuvassa 3. 'Turvetesteissä hylättyjen ja ei-pato- 25 geenisten hiekkatestissä hylättyjen isolaattien välillä ei ,· voida havaita mitään eroa. Turvetesti on ilmeisesti toi- * minut kohtalaisen hyvin. Siitä jatkoon selvinneet kannat olivat keskimäärin selvästi parempia kuin siinä karsiutuneet sienet.

30

Kaikenkaikkiaan hiekka- ja turvetestissä hylättiin suhteellisen vähän sieniä, joita tämän kenttäkokeen perus- « teella ei olisi tullut karsia. Maatestin perusteella on taas hylätty huomattava osuus kaikkein parhaista isolaa-35 teista, mutta peltokokeisiin selvinneistä vain kahdella viidestätoista oli puutteellinen teho luonnonoloissa.

6 * ’ « 36 95598

Tuloksista voidaan päätellä, että hiekka- ja turvetestien perusteella voidaan valita luotettavasti parhaat antagonistit jatkotutkimuksiin, mutta peltomaatesteissä voi karsiutua hyviäkin antagonistiehdokkaita.

5

Jl431-sienikannan testaus valintatesteissä

Keksinnön mukaisista sienikannoista J1431 testattiin kaikissa kolmessa kasvihuoneessa tehdyssä valintatestissä.

10

Hiekkatestissä J1431 sai arvosanat 0, 0, 1, 1, 1, ja 2, ja selviytyi jatkotesteihin.

Turvetestissä J1431 sai seuraavat tulokset: 15 T: 3 sairasta F: 36 sairasta F0: 3 sairasta F2: 7 sairasta 20

Peltomaatestissä, jossa J1431 oli mukana, saatiin sairaiden oraiden %-osuuksiksi eri käsittelyissä: terve 66 %

Fusarium-kontrolli 87 % 25 Baytan I -peittaus 31 % J1431 19 %

Valintatestien perusteella J1431 vietiin kenttäkokeeseen 61 jt 30 muun sienikannan kanssa kesällä -93. Kokeessa käytettiin keinotekoisesti F. culmorum-sienen itiösuspensiolla saastutettua 'Luja'-kevätvehnää. Siemenet kylvettiin yhden rivin (1,4 m) ruutuihin ja kokeessa oli kuusi kerrannette. 34 vrk kylvön jälkeen oraat kaivettiin maasta, pestiin ja niiden 35 tautioireista tehtiin havainnot. Terveiden oraiden lukumää-. räksi rivimetriä kohti eri käsittelyissä saatiin:

Fusarium-kontrolli 5,9

Baytan I -peittaus 56 J76 61 40 J1431 65 muut testatut kannat 30-68.

r « 37 95598 J1432-sienikannan testaus valintatesteissä J1432 testattiin kaikissa kolmessa kasvihuoneessa tehdyssä valintatestissä.

5

Hiekkatestissä J1432 sai arvosanat 0, 0, 0, 1, 1 ja 2 ja selviytyi jatkotesteihin.

Turvetestissä J1432 sai seuraavat tulokset: 10 T: 10 sairasta F: 60 sairasta F0: 10 sairasta F2: 37 sairasta 15

Peltomaatestissä, jossa J1432 oli mukana, saatiin sairaiden oraiden %-osuuksiksi eri käsittelyissä: terve 56 %

Fusarium-kontrolli 98 % 20 Baytan I -peittaus 18 % J1432 38 %

Peltomaatestin tulosten perusteella J1432 jäi pois kenttä-25 kokeista.

» • ·

Claims

3β 95598

1. Nectria pityrodes Montagne -sienikannan J76 (DSM 7522) biologisesti puhdas viljelmä. 5

2. Nectria pityrodes Montagne -sienikannan J1431 (DSM 8805) biologisesti puhdas viljelmä.

3. Nectria pityrodes Montagne -sienikannan J1432 (DSM 8806) 10 biologisesti puhdas viljelmä.

4. Nectria pityrodes Montagne -sienikannan M0S1 (DSM 8807) biologisesti puhdas viljelmä.

5. Nectria pityrodes Montagne -sienikannan R0S2 (DSM 8808) biologisesti puhdas viljelmä.

6. Biofungisidinen aine, tunnettu siitä, että se sisältää Nectria pityrodes-lajin sienikantaa J76, J1431, J1432, M0S1 20 tai R0S2, joilla on talletusnumerot DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 ja vastaavasti DSM 8808.

7. Biofungisidinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää Nectria pityrodes-lajin sienikantaa J76, J1431,

25 J1432, M0S1 tai R0S2, joilla on talletusnumerot DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 ja vastaavasti DSM 8808, ja alalla tavanomaisia kantaja- ja/tai lisäaineita.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu 30 siitä, että kantaja- ja lisäaineina käytetään yhtä tai useampaa seuraavista: silikaa, maitojauhetta, karboksime-tyyliselluloosaa, sakkaroosia, askorbiinihappoa ja tärkkelystä. 1 • ·

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se valmistetaan siten, että 39 95598 (a) kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaista sienikantaa sopivassa kasvualustassa, erotetaan solumassa ja lisätään siihen kantaja- ja/tai lisäaineita, kuivatetaan saatu massa ja jauhetaan pulveriksi, tai 5 (b) kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaista sienikantaa sopivassa kasvualustassa silikan kanssa ja lisätään siihen haluttaessa kantaja- ja/tai lisäaineita, kuivatetaan saatu massa ja jauhetaan pulveriksi.

10. Menetelmä sieni-infektion estämiseksi kasveissa, tun nettu siitä, että patenttivaatimuksen 6 mukaista ainetta tai jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukaista koostumusta annetaan kasville tai sen siemenille tai lisätään kasvin kasvualustaan ennen tai jälkeen siementen kylvämisen. 15

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen Nectria pityrodes -kannan käyttö kasvitautien torjuntaan.

12. Menetelmä fungisidisen mikro-organismin seulomiseksi 20 mikrobinäytteistä, tunnettu siitä, että a) suoritetaan hiekkatesti, jossa viljakasvin siemeniä kylvetään hiekkakerroksen päälle, ja taudinaiheuttajan rihmastoa ja itiöitä ja sitten testattavan sienen itiöitä pipetoidaan vesisuspensiossa siementen päälle ja kasvualus-25 taan, minkä jälkeen siemenet peitetään hiekalla, oraiden ·' tautioireiden voimakkuus tarkastetaan sopivan ajan kulut tua, ja jatkotesteistä karsitaan ne sienet, jotka eivät vaikuta taudin voimakkuuteen tai osoittautuvat itse patogeenisiksi ja 30 b) suoritetaan jatkoon otetuille sienille turvetesti, jossa viljakasvin siemen kastellaan taudinaiheuttajan itiösus-pensiossa ja kuivataan, siemen kastellaan testattavan sienen itiösuspensiolla, kuivataan ja kylvetään höyrytet-tyyn turpeeseen, sopivan ajan kasvatuksen jälkeen tehdään 35 havainnot oraiden terveydestä, ja isolaatit, jotka estävät selvästi tautia, otetaan jatkokokeisiin. • ·« 40 95598