KR100361473B1

KR100361473B1 - 식물질병을생물학적으로제어하기위한미생물

Info

Publication number: KR100361473B1
Application number: KR1019960704155A
Authority: KR
Inventors: 리스토 타피오 타보넨; 밀야 투울리키 케스키넨; 마르야-레나 라덴페라; 페카 타파니 세이스카리; 에사 페트리 테페리; 울라 아니타 투오미넨
Original assignee: 베르데라 오이
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2003-04-10
Also published as: PT742816E; FI940463A; NO963178D0; MX9602967A; CA2182364A1; FI95598C; FI940463A0; WO1995020646A1; CN1102958C; DK0742816T3; EP0742816B1; JPH09508274A; HUT74599A; ATE227339T1; PL179895B1; BG100790A; MD1651G2; DE69528753D1; NZ278907A; SK280507B6

Abstract

본 발명은 식물 병해의 생물학적 제어 및 넥트리아(Nectria) 속에 속하는 신규미생물, 및 식물의 진균 감염을 제어하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Nectria 속의 신규한 균주를 함유하는 조성물 및 상기 목적을 위한 이들의 용도에도 관한다. 본 발명은 또한 토양으로부터 분리된 미생물 균주들로부터 효과적인 제어 미생물을 스크리닝하는 방법도 제공한다.

Description

식물 질병을 생물학적으로 제어하기 위한 미생물

농작물은 여러가지 해충뿐 아니라 진균, 세균 및 바이러스성 질환에 잘 걸린다. 이러한 병해를 제어하기 위해 여러가지 재배기술, 화학적 및 생물학적 제어방법들이 개발되어 왔다. 이러한 방법의 목적은 식물 질병 및 기타 병해에 야기되는 농작물의 손실을 질과 양의 측면에서 방지하는데 있다.

일반적으로 식물 질병을 생물학적으로 제어한다는 것은 생물학적 제어제(BCA:biological control agents)라고 부를 수 있는 다른 생명체에 의해 식물 병원균을 제어함을 의미한다. BCA 와 관련하여 개발된 생성물은 흔히 바이오살균제(biopesticides)라 불리운다. 식물 질병을 생물학적으로 제어하는 메카니즘은 실제로 매우 다양하고. 그 효과는 종종 다른 많은 메카니즘과의 상호협동적인 작용에 기초한다. 제어 효과는 제어제에 의해 생산된 저해성 대사물에 기초할 수 있으며, 때로는 이러한 저해 효과는 병원균을 마비시키거나 또는 이용가능한 공간 및/또는 영양원을 사이에 두고 병원균과 경쟁할 수 있다.

전통적인 많은 화학적 제어제가 환경 및 인간에게 해롭다는 것이 밝혀짐에 따라 새로운 생물학적 제어제를 발견할 필요가 증대되었다. 많은 병원체가 하나 또는 심지어 몇가지의 화학적 제어체에 내성을 획득했다는 것도 화학물질의 단점이다. 그러나 바이오살균제의 효과는 상이한 종류의 여러 메카니즘에 기초하기 때문에 바이오살균제에 대한 내성을 발달시키는 것은 있음직한 일이 아니다. 화학물질들은 대개 바이오살균제보다 효과가 더 빠르고 더 강력하다. 바이오살균제들은 그 효과가 살아있으며 번식가능한 미생물에 기초하기 때문에 흔히 화학물질보다 효과가 더 오래 지속된다.

바이오살균제의 가장 중요한 그룹은 해충에 대항하기 위한 세균성 생성물이다. 특히 세균인 바실러스 써린지엔시스(Bacillus thuringiensis)에 기초한 바이오살균제장 흔히 사용되고 있다. 여러가지 토양-유래 및 종자-유래의 식물의 진균성 질병에 효과적인 방선균 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 기초한 바이오살진균제가 핀란드에서 생산되고 있다. 침엽수림에서의 포메스 부제증(Fomes root rot)의 확산을 방지할 수 있는 생성물이 해롭지 않은 목제부패 진균인 플레비아 기간테아(Phlebia gigantea)로부터 개발된 바 있다.

슈도모나스(Psudomonas)속에 속하는 세균, 특히 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 종은 많이 연구되어 왔으며 근래에는 살진균 활성을 갖는 대량의 P. Fluorescens 균주들이 알려져 있다. 예컨대 공개 특허출원 제 WO 92/18613, FI 92 1722 및 WO 90/01327 및 EP 특허 228 457호 참조.

생물학적 제어에 적합한 미생물을 조사하는 중에 제어 활성 또는 기타 어떤 특성에 대한 미생물 균주가 흔히 대량으로 스크리닝된다. 몇가지 스크리닝 방법이 특허공개문헌에 설명되어 있다.

미국특허 제 4,647,533호에는 먼저 해로운 진균인 피티움(Pythium)의 포자를 대량 함유하는 토양으로부터 세균을 분리하는 3단계 스크리닝법이 설명되어 있다. 제 2 단계에서는 곡식의 종자를 테스트하고자 하는 각 세균의 현탁액과 함께, 또는 세균 현탁액 없이 (대조군 테스트) Pythium 포자를 대량으로 함유하는 토양에서 배양함으로써, 분리된 세균을 온실에서 스크리닝하고, 이 테스트로부터 가장 큰 일을 발달시킨 식물 또는 가장 키가 큰 식물이 재배된 세균을 선택한다. 제 3 단계에서는 선택된 세균을 온실 테스트와 유사한 야외 테스트에서 선별한다. 이 단계에서도 식물의 성장이 가장 우수한 세균을 선별한다.

다른 한편 FI 특허출원 제 92 1722 호에서는 다음의 방법이 사용되고 있다. 먼저 Pythium 균주의 균사를 적절한 성장 배지에서 배양시키고, 균사 위에 멸균 토양층을 깔고, 여기에 테스트할 미생물을 첨가하여, Pythium 의 성장에 미치는 그의 효과를 평가한다. 2 단계 말기에 토양 시료에 노균병을 일으키는 Pythium 균주를 접종하고, 이 진균 감염에 민감한 식물의 종자를 토양에 심고 테스트 미생물이 식물 성장에 미치는 효과를 측정한다. 상술한 테스트 두가지 모두에 있어서 Pythium에 저해적인 물질들을 선택한다.

본 발명은 Nectria 속에 속하는 미생물, 즉, Nectria pityrodes Montagne에 관한 것으로 이것은 푸사리움(Fusarium) 진균에 대해 특히 매우 활성이 뛰어난 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 또한 활성성분으로서 상술한 Nectria 속에 속하는 진균 균주와 임의로 통상적으로 적절한 제제 성분으로서 사용되는 첨가제 또는 담체를 함유하는 미생물 균주로 이루어진 바이오살진균 조성물에 관한 것이기도 하다. 이러한 제제의 예로는 종자 드레싱(seed dressing)에 적합한 조성물, 성장 기질 상에 살포될 분말 또는 과립상 조성물이나 토양 처리를 위한 액상 제제를 들 수 있다.

본 발명은 또한 3 단계 모래, 이탄(peat) 및 필드(filed) 토양 테스트로 이루어진, 3 단계 테스트 순서가 이용되는 진균 균주의 새롭고도 효과적인 스크리닝 공정도 제공한다. 각 레스트 단계에서 비효율적인 것으로 나타난 진균 균주들은 추후 테스트로부터 제외된다. 이어서 온실에서 가장 우수한 효과를 나타낸 진균 균주들을 필드 조건하에서 스크리닝 테스트한다.

본 발명은 식물 질병의 생물학적 제어 및 넥트리아(Nectria)속에 속하는 새로운 미생물, 및 식물의 진균 감염(fungal infections)을 제어하는 데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 도는 Nectria에 속하는 신규한 균주를 함유하는 조성물 및 상기한 목적에 대한 이들의 용도에도 관한다. 본 발명은 토양으로부터 분리된 미생물 균주들로부터 효과적인 제어 미생물을 스크리닝하는 방법도 제공한다.

도 1 은 92 년 여름에 J76 을 이용하여 실시한 투여량 반응실험도. 진균 F. culmorum이 접종된 종자를 이용한 병에 걸린 새싹의 백분율.

K = 미처리군, B = Baytan 드레싱,

J76-0 = J76 포자 현탁액, 1.2 × 10⁷cfu/㎖

J76-1 = J76 포자 현탁액, 1.2 × 10⁶cfu/㎖

J76-2 = J76 포자 현탁액, 1.2 × 10⁵cfu/㎖

J76-3 = J76 포자 현탁액, 1.2 × 10⁴cfu/㎖

도 2 는 92년 여름에 J76을 이용하여 실시한 투여량 반응실험도 건강한 종자를 이용한 경우 병에 걸린 새싹의 백분율. 약어는 도 1 에 설명된 바와 같음.

도 3a 내지 도 3d는 여러 단계의 온실 테스트에서 거절된 진균 분리물이 필드 조건에서 새싹의 건강상태에 미치는 효과를 나타내는 히스토그램임. K = 미처리군, B = Baytan I 드레싱.

이하에 본 발명의 진균 균주를 상세히 설명한다. 이들의 분리 및 특성화, 그리고 필드 조건에서의 이들의 효능 테스트를 설명한다. 또한 이 균주들로 이루어진 바이오살진균 조성물의 제제, 조성물의 특징화 및 이들 조성물에 대한 효능 테스트도 설명된다. 토양 샘플로부터 분리된 진균 균주를 스크리닝하는 방법 역시 설명된다.

미생물의 분리

본 발명의 진균 균주를 분리해낸 토양 샘플들은 1989년, 1990년, 및 1991년에 수집된 모두 약 l90 여가지의 것이었다. 핀란드 각지, 주로 MTT의 연구 스테이션(Agricultural Research Center) 지역으로부터, 그리고 여러가지 상이한 토양 유형 및 상이한 작물 로테이션으로부터 샘플들을 수집하였다. 샘플들을 뿌리층(0 -15㎝ 깊이)으로부터 취하였다. 각각의 필드로부터 몇가지 준샘플(subsamples)을 취하여 1 내지 2 리터의 샘플로 모았다.

희석법(토양 분리) 또는 미끼 식물법 (뿌리 분리)에 의해 분리를 행하였다. 이들의 수행방법은 이하의 방법란에 상세히 설명되어 있다.

미생물의 특정

토양 샘플로부터 분리한 진균 균주들을 이하 방법란에 상세히 설명되는 바와 같은 본 발명의 스크리닝법을 이용하여 테스트하였다. 테스트에 의해 매우 우수한 결과를 낸 것을 5 가지 균주인 것으로 나타났다. 이 균주들을 J76, J1431, J1432, MOS1 및 ROS2로 명명하고, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Netherlands에서 특정화하였다. 이 균주들을 부다페스트 조약에 따라 DSM 기탁기관(Deutsche Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 각각 수탁번호 DSM 7522(1993년 3월 15일), DSM 8805(1993년 12월 10일), DSM 8806(1993년 12월 10일), DSM 8807(1993년 12월 10일) 및 DSM 8808(1993년 12월 10일)로 기탁하였다.

이들 미생물의 미생물적 특징은 다음과 같다:

형태학: 가장자리의 멸균 균사(hyphae)가 없는 분생자진(sporodochia). 각 분절마다 몇개의 가지가 뻗어있으며, 분생포자병이 반복적으로 가지를 치고 있음. 가장 끝의 가지들은 책상(palisade-like) 층으로 배열된 경자(phialides)의 윤생체(whorls)를 산생하고 있다. 원통형 경자는 15 m 길이이고, 정점의 포자를 가지고 있다. 타원형 부터 짧은 종제(hilum)를 갖는 방울형에 이르기까지, 사슬형 또는 날씬한 공모양으로 생성된 분생포자기(conidia), 7-8×4m, 매끄러운 벽을 가지며 부속기(appendage)는 없다.

집락 습성: 귀리 플레이크-한천 배양시 22℃에서 7일동안 직경 40 ㎜로 배양됨; 초자질의 균사체(mycellium), 포자분열생식 영역은 동심원 배열로 녹색의 분생자진농포를 생성함. 냄새는 그다시 심하지 않으며, 집락 배면은 무색이고, 삼출물은 제한적임, 투명.

J76 균주의 분생포자병(conidiophore) 구조는 마이로쎄슘 베루카리아(Myrothecium verrucaria)의 그것과 유사하나, 비-가장자리의 분생자진, 마른 사슬에서의 분생포자기 생산 및 일반적인 팸-모양의 부속기가 없다는 점에서 상이하다.

글리오클라디움(Gliocladium) 속의 대표적인 것은 Gliocladium은 개별적인 페니실레이트 분생포자병을 생산한다는 점에서 이 새로운 균주와 다르다.

따라서 J76, J1431, J1432, MOS1 및 ROS2는 Nectria pityrodes Montagne 종으로 동정되었다.

이 균주들로부터 비-부패성 제제를 제조할 수 있으며 이는 질병 제어를 요구하는 재배장에 확산시키기가 쉽다. 예컨대 분말 형태로 제제를 생산할 수 있다. 미생물의 배양은 -80℃에서 유지된 포자를 함유하는 PDA 펠렛인 접종체로부터 시작할 수 있다. 미생물은 액상 배양체 또는 고체 지지체상에서 배양될 수 있다. 영양 배지는 예컨대 수크로스와 같은 당 및 질소 및 기타 소량의 영양분을 함유할 수 있다. 배양시 예컨대 Corn Steep LIquor(CSL)과 같은 비-특이적인 영양배지 또는 예컨대 GYM(글루코스 4 g/1, 효모 추출물 4 g/1, 몰트 추출물 10 g/1) 또는 PDB(감자-덱스트로스-브로쓰)와 같은 특수 영양배지를 이용할 수 있다. pH는 약 6.0이며 이 pH를 멸균 전 시작무렵에 조정한다. 배양은 1 내지 2 주일간 와동시키면서 수행한다. 세포 매스를 여과지에 의해 여과하거나 또는 원심분리에 의함으로써 브로쓰로부터 분리할 수 있다. 액체 배양이 이용된 경우에는, 세포 매스(cell mass)에 예컨대 실리카, 분유 및/또는 CMC(카르복시메틸셀룰로스)와 같은 담체를 혼합한다. 세포 매스를 실온에서 건조하고 분쇄하여 분말화한다.

방법

미생물의 분리 :

a) 희석법 (토양 분리)

토양 10 g을 0.5% 물 한천(Bacto-agar) 100 ㎖에 혼합한다. 이 혼합물로부터 3개의 10㎖ 짜리 준샘플을 취하고 이들 각각으로부터 2 희석(10^-1및 10^-2)을 행하여 0.5% 물 한천으로 만들었다. 희석물을 20 내지 30분간 쉐이커를 이용하여 가동(수조에서)시켰다. 희석물을 1 ㎖를 피펫으로 취하여 빈 페트리 디쉬에 놓고 Littman Oxgall Agar(LOA) 20㎖를 그 위에 붓는다. 페트리 디쉬를 실온에서 3-7일간 배양하고 각각의 진균을 PDA(감자 덱스트로스 한천)상에서 순수한 배양체로 분리하였다.

b) 미끼(bait) 식물법 (뿌리 분리)

15개의 연쇄적인 포트 플레이트(50 ㎖ 포트짜리 Vefi-VP 96 연쇄 포트 플레이트)에 한 샘플로부터의 토양을 채웠다. 밀 종자 4개, 보리 종자 4개 또는 순무평지 종자 15개를 한 포트에 심고 5개의 포트를 각 식물종 마다에 대해 사용하였다. 종자들을 모래로 덮고 포트에 물을 주고 +15℃의 배양실에서 14시간 낮길이 동안 배양하였다. 배양 2주일 후에 식물을 취하여 수돗물로 세척하거나 물을 이용치 않고 솔로 씻었다. 뿌리로부터 작은 단편을 절단하여 플레이트에 올려놓았다. 사용된 배지는 다음과 같았다: LOA(10g 펩톤, 10g 덱스트로스, 15 g Bacto-Oxagall, 0.01 g B-크리스탈 바이올렛, 0.03 g 스트렙토마이신, 20 g 한천, 총 1000 ㎖ 되는 양의 물), PCNB(15 g 펩톤, 1 g KH₂PO₄, 0.5 g MgSO₄· 7H₂O, 2 g Avicol, 3 ppm 스트렙토마이신, 20 g 한천, 총 1000 ㎖ 되는 물) 및 PDA-스트렙토마이신(39g PDA- 제제, 300 ppm 스트렙토마이신, 총 1000 ㎖ 되는 물). 접종 며칠 후 단일의 진균을 분리하여 FDA 플레이트상에서 서브배양하였다.

균주들을 앰플(Nalgene 5000-0012, PP Sterile 1.2 ㎖) 중 PDA 펠렛에서 -80℃에서 저장하였다.

스크리닝법의 온실 테스트 수행

모래 테스트

곡물의 종자를 모래층에 심는다. 병원체의 첫번째 균사체와 포자 그리고 테스트 진균의 포자들을 물 현탁액 중 종자 및 배양 기질에 피펫팅한 후 종자를 모래로 덮는다. 2주일 반 경과 후 새싹의 질병 징후의 강도를 평가한다. 추가실험으로부터 질병의 강도에 영향을 미치지 않은 진균들 또는 그 자체가 병원성인 진균들은 배제한다.

이탄 (peat) 테스트

곡물의 종자를 병원체의 포자 현탁액에 침지시킨 다음 건조시킨다. 그 후 종자들을 테스트될 진균의 포자 현탁액에 침지시킨 다음 건조하여 파종한다. 성장 기질로는 훈증된(steamed) 이탄을 이용한다. 2주일 반 경과 후 새싹의 건강 상태에 대해 관찰한다. 질병을 분명히 예방한 진균 균주들을 필드 토양 테스트에 이용한다.

필드 토양 테스트

분쇄 및 습윤시킨 필드 토양을 1.5 L 들이 포트에 넣고 각 포트 당 36개의 곡물종자를 파종한다. 파종 전의 종자 처리는 이탄 테스트의 경우와 동일하며 각 처리군 당 세가지 레플리케이트 포트를 이용한다. 새싹의 질병 징후를 배양 4주일 후에 측정한다.

이 테스트들에 있어서 우수한 것으로 밝혀진 균주들을 필드 테스트를 거치게 하여 선택된 미생물 분리물의 바이오살균 효과의 최종 확실성을 부여한다.

진균 균주의 병원성

혹시 J76 진균 균주가 해로운 효과를 가질 수도 있으므로 이에 대해 잠정적으로 조사하였다. 이제까지의 실험 결과에 따르면 이 진균은 식물에 병원성이지 않은 것으로 나타났다. 33종의 식물에 대해 테스트하였다.

실험

다음의 실험들은 본 발명의 이용 양상을 설명해준다. (A) 항목에서는 본 발명의 Nectria pityrodes 균주인 J76, J1431, J1432: MOS1 및 ROS2의 포자 현탁액을이용하여 주로 Fusarium spp.에 의해 야기되는 식물의 질병을 제어하는 것을 설명한다. (B) 항목에서는 이 균주들로부터 만들어진 제제의 생산 및 용도를 설명하며, (C) 항목에서는 J76 진균 균주가 발휘하는 작용 양상이 조사되고, (D) 항목에서는 본 발명 스크리닝법의 수행 및 평가가 설명된다.

(A) 포자 현탁액으로서 진균 균주의 사용

균주 J76의 포자 현탁액을 이용한 실험

1992년 여름 균주 J76의 포자 현탁액의 효과를 세가지 테스트에서 시험하였다. 테스트에는 두가지 상이한 종자를 이용하였다: 즉 Fusarium culmorum이 인위적으로 접종된 밀과 F. nivale에 의해 자연적으로 감염된 보리를 이용하였다.

밀의 테스트 결과를 표 1에 나타내었다. 인공적으로 접종된 밀의 경우 얻어진 수확 결과를 표 2에 나타내었다.

보리의 새싹 관찰 사항은 표 3에 나타내었다. 보리 수확에는 이 질병이 통계학적으로 볼 때 유의적인 효과를 갖지 않았다.

[표 1]

1992년 여름 인위적으로 접종된 밀에 대해 행한 세가지 테스트 실험. 새싹의출현 및 질병률.

[표 2]

1992년 여론 인위적으로 접종된 밀에 대해 행한 세가지 테스트 실험. 수확량 결과(kg/ha)

[표 3]

1992년 여름 자연적으로 감염된 (F. nivale) 보리에 대해 행한 세가지 테스트 실험. 새싹의 출현 및 질병률.

1992년 여름의 J76 균주의 투여량 반응 테스트

J76 균주는 1992년 초여름 진정 우수한 새싹 관찰 결과를 보였으므로, 제어 효과에 대한 이것의 응용률 효과를 그해 여름의 중반에 이르기 전에 파종된 것에 대해 실험하였다. 건강한 밀 종자와 인위적으로 Fusarium culmorum을 접종시킨 종자의 두가지를 이용하였다.

이 실험에는 소형 2 ㎠ 플롯을 이용하였다. 새싹의 출현 및 질병 증상을 관찰하였다. 질병 추적을 위한 새싹 샘플을 서로 다른 4 시점에서 수집하였다. 각 처리에 필요한 샘플들을 각 샘플링 시기에 별도로 파종된 네가지 플롯으로부터 취하였다. 새싹의 관찰된 양을 표 4 에 나타내었으며 병에 걸린 새싹의 백분율을 병에 걸린 종자 밀 건강한 종자에 대해 개별적으로 표 5 에 나타내었다. 표 5 의 데이타는 도 1 및 도 2 에 도식적으로 나타내었다.

[표 4]

1992년 여름 J76의 투여량 반응 실험. 출현.

[표 5]

1992년 여름 J76의 투여량 반응 실험. F. culmorum이 접종된 종자, 및 건강한 종자에 따른 병에 걸린 새싹의 백분율. 약어는 도 2 에서와 같음

1993년 여름 J76 포자 현탁액에 대한 필드 실험

Jokioinen, Mietoinen 및 Palkane에서 실험을 수행하였다. 이 시도에서 여섯가지 종자 샘플을 사용하였다:

-'Luja' 밀, 진균 F. culmorum에 의해 자연적으로 감염됨

-'Luja' 밀, 진균 F. culmorum이 인공적으로 접종됨

-'Luja' 밀, 건강함

-'Laari' 밀, 건강함

-'Kustaa' 보리, 변종 Fusarium 진균과 진균 Bipolaris sorokiniana에 의해 자연적으로 감염됨

-'Yti' 귀리, 진균 F. avenaceum에 의해 자연적으로 감염됨.

건강한 밀 샘플은 Jokioinen에만 파종하였고, 다른 네가지 종자 샘플 실험은각각 세가지 시험 장소에서 수행하였다. 실험을 위해 10㎡ 플롯에 매 처리당 6 레플리케이션 파종하였다.

종자 처리는 종자 샘플 각각에 대해 동일하였다:

K = 미처리 대조군

B = 화학 대조군, Baytan I 드레싱

J76S = 플레이트 배양체로부터 J76 포자 현탁액 (8.4 × 10⁹cfu/kg 종자)

표 6 에 병해 손상의 강도를 각각의 처리 및 종자 샘플에 대해 개별적으로 나타내었다. 수율 결과는 표 7 에 요약하였다.

[표 6]

J76 포자 현탁액에 대한 필드 실험 - 1993년. 병해가 심한 새싹의 백분율

[표 7]

J76 포자 현탁액에 대한 필드 실험으로부터의 수확량 결과 - 1993년 (kg/ha)

밀의 흑수병(bunt) 및 보리의 부제증(foot rot)에 대한 J76 테스트

1993년 여름, J76을 필드 실험에 포함시켰다. 여기서는 곡물 종자의 드레싱에 사용된 9가지 화학적 살진균제를 밀의 흑수병(Tilletia caries에 의해 발생됨)에 대해 테스트하였다. J76은 분생포자 현탁액으로서 적용하였고 화학물질은 각자의 사용지침에 따라 사용하였다. 0. 1㎡ 플롯 및 5 레플리케이션을 이용하였다 (표 8)

[표 8]

밀에 있어서 흑수병에 대한 드레싱 처리의 효과

Baytan의 경우 활성 성분은 트리아디메놀이다. Baytan I은 트리아디메놀과 이마잘릴을 포함하는 혼합물이다. Tayssato S 는 카르복신과 이마잘릴을 함유한다. Panoctine의 활성신분은 구아자틴이다.

필드 실험에는 J76 포자에 의한 종자 처리도 포함되었는데, 이 실험에서는 보리의 부제증(Bipolaris rosokiniana)에 대한 여러 화학적 제어제가 시험되었다. 이 실험에는 10 ㎡ 플롯과 4 레플리케이션이 사용되었다. 상이한 처리간에 어떠한 차이는 발견되지 않았다. 비록 병원체가 Fusarium 진균과 비교하여 많이 다르기는 하지만 J76은 분명히 증상을 완화시켰다 (표 9).

[표 9]

보리의 부제증에 대한 드레싱 처리 효과

(B) 진균 균주로부터 제조한 제제, 및 필드 실험에서의 이들의 영향

J76 진균 균주로부터의 분말 제제를 다음과 같이 제조하였다:

제제 1

수크로스 4 g/1, 효모 추출물 4 g/l 및 몰트 추출물 10 g/l을 포함하는 영양 배지 0. 1 L가 들어있는 1L 들이 어얼렌마이어 병에서 배양을 수행하였다. pH는 멸균전 오토클라브에서 6.0으로 조정하였다. 정종물로서, 포자를 함유하는, -80℃에서 보관된 한천 펠렛(감자 덱스트로스 한천 배지)을 사용하였다. 쉐이커의 회전 속도는 150 rpm이었으며, 성장 온도는 실온(22℃), 배양기간은 7 내지 12일이었다.세포들을 여과지로 여과시켜 분리하였다. 세포 매스 실리카에 분유와 CMC (카르복시메틸셀룰로스)를 다음과 같이 혼합하였다:

세포 20%,

실리카 55%,

분유 15%,

CMC (7% 수용액) 10%.

혼합물을 멸균 분위기, 개방 페트리 디쉬에서 2일간 실온에서 건조시켰다. 층의 두께는 1 - 2㎝였다. 건조된 혼합물을 분쇄하여 분말로 만들었다. 제제의 생존률(viability)은 10⁷cfu/g (cfu = colony forming units: 집락형성 단위)였다.

cfu는 미생물의 생존률 측정에 이용되는 단위이다. 희석된 미생물 현탁액을 한천 플레이트에 뿌리고 며칠 후 집락수를 센다. 희석배수를 알면, 본래 샘플 중의 집락의 양 또는 미생물 세포의 양을 알 수 있다.

제제 2

제제 1에서와 유사한 방식으로 세포를 배양한 다음, 실리카, 분유, CMC 및 아스코르브산을 다음과 같이 세포 매스와 혼합하였다:

세포 60%,

실리카 20%,

분유 14%,

CMC (7%) 3%,

아스코르부산 3%.

제제 1의 경우와 동일한 방식으로 혼합물을 건조 및 분쇄하여 분말화하였다. 생존률 10⁷cfu/g.

제제 3.

제제 1에서와 유사한 방식으로 세포를 배양한 다음, 수크로스와 전분을 다음과 같이 세포 매스와 혼합하였다:

세포 20%,

수크로스 25%,

전분 55%,

제제 4

J76 균주를 실리카 담체를 포함하는 고체 배지위에서 직접 배양하였다. 영양 브로쓰로는 8% 몰트 추출물(Maltax MP10, Lahden Polttimo)을 이용하였다. 영양 브로스 120 g을 실리카 분말 50 그램이 든 비이커에 넣고 120℃에서 20분간 오토클라브 처리하였다. 냉각된 배지에, PCD 플레이트로부터 긁어 모은 포자를 멸균수에 넣어얻은 J76 포자 현탁액 10 그램을 접종하였다. 배지를 20일간 16℃에서 인큐베이션한 후 실온으로 2일간 건조하였다. 건조 제제의 생존률은 10⁷cfu/g이었다.

본 발명의 나머지 균주들도 유사한 방식으로 제제화할 수 있다.

필드 실험에서의 분말 제제의 효과

다음에 1993년 여름, J76 균주의 분말 제제를 이용하여 Agricultural Research Centre of Finland에서 Institute of Plant Protection에 의해 수행된 실험 내용을 설명한다. 실험은 Jokioinen, Mietoinen 및 Palkane에서 MTT (Agricultural Research Centre)데서 수행하였다. 다음의 6가지 종자 샘플이 실험에 이용되었다:

-'Luja' 밀, 진균 F. culmorum에 의해 자연적으로 감염됨

-'Luja' 밀, 진균 F. culmorum이 인공적으로 접종됨

-'Luja' 밀, 건강함

-'Laari' 밀, 건강함

-'Yti' 귀리, 진균 F. avenaceum에 의해 자연적으로 감염됨.

건강한 밀 샘플은 Jokioinen에만 파종하였고, 다른 네가지 종자 샘플 실험은 각각 세가지 시험 장소에서 수행하였다. 실험을 위해 10㎡ 플롯에 매 처리당 6 레플리케이션을 파종하였다.

종자 처리는 종자 샘플 각각에 대해 동일하였다:

K = 미처리 대조군

B = 화학 대조군, Baytan I 드레싱

J76PK = 건조 드레싱으로서 J76 분말(8.4 × 10⁸cfu/kg = 종자에 의해 취해진 최대량)

J76PN = 액상 드레싱으로서의 J76 분말(8.4 × 10⁸cfu/kg 종자)

표 10 에 병해 손상의 강도를 각각의 처리 및 종자 샘플에 대해 개별적으로 나타내었다. 수율 결과는 표 11 에 요약하였다.

[표 10]

J76 분말에 대한 필드 실험 - 1993년. 병해가 심한 새싹의 백분율

[표 11]

J76 분말에 대한 필드 실험으로부터의 수확량 결과 - 1993년

이에 더해, J76 균주로부터 제조된 여러 제제의 여러가지 진균류에 대한 제어효과를 1993년에 테스트하였다. 이 실험들의 결과를 다음 표 12 내지 18에 나타내었다.

[표 12]

진균 Gaeumannomyces이 접종된 모래 토양에서 J76이 Polkka 밀에 미치는 제어 효과 포트 테스트, 방호처리.

KF = 고상 제제 (제제 4)

병해 지수:

건강

1 약간 병해

2 심한 병해

3 발아하지 못함.

[표 13]

Polkka 밀에 있어서 진균 Fusarium culmorum에 대한 J76 제제의 제어 효과 포트테스트, 기질은 이탄. KF=고상 (제제 4)에서 성장, R=액상 (제제 1)에서 와동배양, M=한천 배양체로부터 본래의 미생물.

병해 지수:

0 건강

1 약간 병해

2 심한 병해

3 발아하지 못함.

[표 14]

오이에 있어서 진균 Pythium 대한 J76의 효과. 결과는 3가지 포트 테스트에 대한 평균치임 (pH 6.2, pH 6.9 및 pH 7.4).

병해 지수:

0 건강

1 사멸

2 발아하지 못함.

[표 15]

꽃양배추에 있어서 진균 Rhizoctonia solani에 의해 오염된 모래 토양에서의 J76 진균 균주의 제어 효과. 온실에서 포트 테스트.

[표 16]

진균 Fusarium nivale이 접종된 모래 토양에서 'Kustaa' 보리에 대한 J76 진균 균주의 제어 효과. 포트 테스트 실외, 방호처리.

병해 지수:

0 건강

1 약간 병해

2 심한 병해

3 발아하지 못함.

[표 17]

오이에 있어서 진균 Alternaria brassicicola에 대한 J76 진균 균주의 제어 효과. 결과는 세가지 온도(15℃, 20℃, 25℃)에서의 실험의 평균치임.

병해 지수.

0 건강

1 약간 병해

2 심한 병해

3 발아하지 못함.

밀에 있어서 Fusarium culmorum에 미치는 본 발명의 5가지 Nectria pityrodes 균주(J76, J1431, J1432, MOS1 및 ROS2)의 제어 효과에 대한 실험 결과를 표 18에 나타내었다. 이 결과는 2회 실험의 평균치로서 주어진 것이며, 그 중 하나는 기질로서 이탄을, 다른 하나는 기질로서 필드 토양을 이용한 것이다.

[표 18]

밀에 있어서 진균 Fusarium culmorum 에 대한 5가지 Nectria pityrodes 균주 (J76, J1431, J1432, MOS1 및 ROS2)의 제어 효과. 결과는 2가지 포트 테스트(이탄 및 필드 토양)의 평균치임

병해 지수:

0 건강

1 약간 병해

2 심한 병해

3 발아하지 못함.

(C) J76에 의한 작용 모드

현미경과 몇몇 실험 테스트를 통해, J76이 다른 진균에 대해 안타고니스트로서 작용하는 방식을 예비 관찰하였다.

J76의 균사와 진균 F. culmorum의 균사의 상호작용은 현미경으로 관찰되므로, 최초의 현저한 반응은 매우 빨리 발견될 수 있다. 균사체 접촉 시점에서Fusarium 균사 세포가 접촉 약 1시간 후에 눈에띄게 분해되기 시작한다. 먼저 세포벽의 형태가 흩어지고, 이어서 세포가 비게 된 다음 마지막으로 세포벽이 총체적으로 분해된다. 접촉시점으로부터 Fusarium 균사의 분해는 서서히 앞으로 진전된다. J76 및 F. culmorum이 며칠간 함께 성장했을 때, 진균 Fusarium의 균사는 더 이상 발견되지 않는다. 또한 그의 포자(분생포자기와 유협포자 두가지 모두) 역시 균사보다 다소 느리기는 하나 J76의 영향으로 분해된다. 대개 J76 균사는 분해되기 전에 Fusarium 포자 주위를 느슨하게 감는다. J76이 Fusarium 균사를 실질적으로 침투한다는 관찰은 아직 없다.

현미경 관찰에 기초해서 J76은 아마도 그 주변에 생물학적으로 활성적인 물질을 분비하는 것으로 결론지을 수 있다. 특성상 이들은 효소 또는 항생제와 유사한 것일 수 있다. 또한 다른 진균류를 직접적으로 마비시키는 것으로 나타나지는 않았고, 서서히 성장하기 때문에 이들의 생산은 J76에 의한 주요 작용 모드가 될 수 있으며 영양분에 대해서는 그렇게 효과적으로 경쟁하지 못한다는 것이 분명하다. 다른 진균류의 성장에 미치는 대사물질의 생산엔 대한 암시가 셀로판 테스트에서도 얻어졌다.

J76 과 F. culmorum을 매우 얇은 성장 기질 상에서 나란히 성장시킬 경우, Fusarium의 성장이 저지되는 억제 대역이 형성된다. 정상적인 두께의 기질 상에서는 이러한 것이 발견되지 않는다. 이것은 아마도 기질 내로 어떤 물질의 소량 농축물이 확산되었기 때문이라고 할 수 있다. J76에 의해 분비되는 휘발성 물질들 역시 F. culmorum에 대해 약한 성장 제어효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.

셀로판 테스트: 성장 기질 상에 셀로판 필름을 얹고 J76 균주를 이 필름 위에서 배양하였다. 10일간 배양시킨 후 필름을 J76과 함께 제거하였다. J76에 의해 분비된 물질들과 필름을 통해 전달된 물질이 기질에 잔존하였다. 대조군 플레이트로서 J76이 없는 단순한 셀로판 필름을 사용하였다. 셀로판 테스트의 결과를 표 19에 나타내었다.

[표 19]

셀로판 테스트에 있어서 J76 진균에 의해 생산되는 대사물질이 F. culmurom의 성장에 미치는 효과. 성장률 ㎜/일

(D) 스크리닝법의 수행 및 결과의 평가

모래 테스트

파종 기질

파종 기질로서 입도 0.2 - 0.7 ㎜의 모래(Kauniston Sora Oy, Loimaa)를 이용하였다. 모래 4부와 물 1부를 혼합하여 모래를 습윤시켰다. 시리얼 포트 플레이트(Vefi-VP 96)으로부터 5 × 7 포트(50 ㎖)의 플레이트를 떼어내고 이를 플라스틱 박스에 넣었다. 포트에 젖은 모래를 위 가장자리가 1 - 1.5 cm가 빌 정도로 채웠다. 각각의 포트에 'Luja' 봄 밀의 세 종자를 파종하였다.

처리

Fusarium culmorum감염: 실온에서 약 l개월 (완전히 발아할 때까지)간 PDA상에서 F. culmorum을 성장시켰다. 플레이트로부터 균사체를 포자와 함께 분리하고 Ultra-Turrax 호모지나이져를 이용하여 증류수와 혼합하였다. 포자의 양을 10⁶포자/㎖로 조절하였다. Minigrip 백에서 30㎖ 부분으로 용액을 -20℃까지 냉동시켰다. 테스트를 위해 냉동 용액을 해동시킨 다음 재혼합하였다. 용액은 그대로(기본 용액), 그리고 10^-2희석물로서 사용하였다. Fusarium 균주의 병원성은 이들을 식물을 통해 순환시킴으로써 유지시켰다(밀의 종자에 Fusarium 현탁액을 접종하고 병에 걸린 새싹으로부터 병원균을 재분리하였다).

안타고니스트 현탁액:안타고니스트를 포함하는 강 냉동고로부터 취한 PDA 펠렛을 세부분으로 나누고 세개의 PDA 플레이트에서 성장시켰다. 플레이트를 실온(암실)에서 약 3주일간 인큐베이션시켰다. 두개의 안타고니스트 플레이트를 긁어 50㎖ 증류수에 섞어 안타고니스트 현탁액의 기본 용액을 제조하였다. 이를 Ultra-Turrax 호모지나이저로 혼합하였다. 기본 용액으로부터 10^-1및 10^-3희석액을 만들었다.

종자 처리:F. culmorum 현탁액 1 ㎖를 먼저 시리얼 포트 플레이트상에 파종된 종자 위에 피펫으로 붓고, 이 위해 1 ㎖ 안타고니스트 현탁액을 뿌렸다. 5개의 50㎖ 포트 중 l5개의 종자를 모두 6가지 배합(F. culmorum 현탁액 2가지 희석물 ×안타고니스트 현탁액 3가지 희석물)의 포자 밀도 현탁액으로 처리하였다.

대조군 처리:한가지 진균 테스트마다 각각 한가지 포트 플레이트를 사용하고 5개 포트는 테스트된 진균의 기본 용액만으로 처리된 15개의 종자를 추가로 포함하였다.

모래 테스트에서 15 내지 30개의 진군 균주를 동시에 테스트하였다. 매일 테스트를 시작하였으며 병해를 일으키는 F. culmorum 접종물의 병원성 뿐 아니라 종자의 건강상태를 체크하기 위해 별도의 포트 플레이트에 파종하였다. 별도의 플레이트에 파종된 세가지 대조군 처리는 다음과 같았다: 비접종(물만 첨가): F. culmorum 기본용액으로 접종 및 F. culmorum 기본 용액의 희석물로 접종(10^-2). 10개 포트의 이들 세가지 처리물 각각에 30개의 종자를 파종하였다.

성장 조건:진균 현탁액을 피페팅한 후 종자에 습기있는 모래를 덮었다. 포트플레이트가 들어있는 상자를 투명 플라스틱으로 감싸고 성장실(10-15℃, 14시간 조명함)로 옮겼다.

17 내지 18일간 성장시킨 후, 이들을 수돗물로 깨끗이 씻고, 이들의 병해 증상을 관찰하였다. 뿌리나 떡잎 세포가 어둡게 변색하지 않은 새싹들과 단단한채로 움트지 않은 종자들은 건강한 것으로 간주되었다. 현저한 증상을 나타내고, 물렁물렁해진 움트지 않은 종자들은 병해에 걸린 것으로 간주하였다.

대조군 처리 식물을 먼저 조사하였다. 만일 물로 처리한 종자로부터 건강한 식물만 관찰되고, 두가지 병원체 처리군 모두가 현저한 병해 증상을 나타낼 경우에는, 이 테스트는 허용되며 테스트될 진균 균주로 처리된 식물의 관찰을 수행키로 결정하였다.

모래 테스트에 있어서 각각의 분리된 진균 균주에 주어진 등급을 이것으로 처리된 식물의 수로 측정되며 병에 걸린 것으로 간주되었다. 테스트할 진균으로 처리된 식물의 출현이 건강한 대조군에 비해 현저히 감소되었거나, 또는 다른 병해 증상이 발견될 경우, 이 진균은 추후 테스트에 적절치 않은 것으로 밝혀졌다. 손상이 발견되지 않을 경우, 6가지 병원체 및 테스트될 진균의 포자 밀도 배합물을 다음의 척도로 개별적으로 등급을 매겼다.

0 = 15개 식물 모두 건강

1 = 병해 식물 2개 이하

2 = 병해 식물 3 - 5개

3 = 병해 식물 6 - 9개

4 = 병해 식물 10 - 13개

5 = 건강한 식물이 하나도 없음.

상기 6가지 개별적인 등급을 기초로 하여 다음 단계: 즉, 이탄 테스트에 이용될 테스트 진균 균주를 선정하였다. 계속해서 적어도 3회 0 및 1 등급을 얻은 균주들을 선정하였다. 0 등급을 전혀 얻지 못한 진출은, 4회 이상 1등급을 받지 못하는 한 이후의 테스트에 이용하지 않았다.

이탄 테스트

성장 기질

성장 기질로스, 훈증시키고 시비(施肥)한 석회질 이탄을 이용하였다. 1992년 가을이 될 때까지 Torronsuo로부터 채취된 체질하지 않은 조질의 이탄을, 그 후에는 Eurajoki로부터의 체질한 조질의 이탄을 사용하였다(시비: 돌로마이트 석회 800 g 및 효보 Y-lannos 100 그램/이탄 100 L (Y-lannos = 핀란드의 일반적인 화학비료의 상표명). 습윤화시킨 이탄을 플라스틱 상자(29.5 × 49.5 × 9.4 ㎝, Weibulls Robusta "Mammut"-상자, Muoviyhtyma Oy)에 약 5 ㎝ 층으로 뿌렸다. 상자 바닥에는 플라스틱 필름을 깔았다.

처리

T = 건강하고 접종물이 없는 종자, 'Luja' 봄 밀. 증류수로 수세됨.

F = F. culmorum이 접종된 종자. 이 종자들을 약 10⁶포자/㎖ (Fusarium 배양, 모래 테스트란 참조)를 포함하는 F. culmorum 기본 용액(이 용액은 풍부히 사용되었음)에 침지시켰다. 처리 후 종자들을 밤새 건조시키고 종이위에 뿌렸다.

FO = F-처리에 있어서의 F. culmorum 접종과 마찬가지. 종자가 건조되면, 이들을 안타고니스트의 기본용액으로 습윤시켰다. 기본 용액은 하나의 안타고니스트 플레이트로부터 균사체와 포자를 긁어모아 25 ㎖ 증류수에 섞어 만들었다, 종자와 안타고니스트 용액을 작은 플라스틱 병에서 와동시켜 처리를 수행하였다. 처리 후 종자를 종이 위에서 건조시켰다.

F2 = F- 처리에서처럼 F. culmorum 접종. F0-처리에서처럼 안타고니스트 처리. 단, 안타고니스 기본용액의 10^-2희석물 사용.

이달에 30 종자/줄로 10줄을 파종하였다. 파종 순서는 다음과 같았다: 보호 줄,F, F0, F2, T, F, F0, F2, T, 보호 줄. 파종 후 종자들을 이탄으로 덮고 상자를습윤시켰다.

성장 조건

약 15℃ 온도의 온실에서 파종물을 성장시켰다. 어두운 계절에는 멀티메탈 램프를 이용하여 하루 12시간 빛을 더 쪼였다. 필요한 경우, 파종물을 물로 보습시켰다. 배양 기간은 18일이었다.

등급 정하기

새싹들을 세정하고 모래 테스트에서와 같이 이들의 병해 증상을 관찰하였다. T-및 V- 처리로부터의 관찰을 기초로 해서 테스트 결과가 수용할 만한 것인지를 결정하였다. 건강한 대조군(T)은 12개 이상의 병해 식물(파종된 60개 종자 중)을 가져서는 안되는 것으로 했고 병원체 대조군(F)는 52개 이상의 병해 식물(60개 종자중)을 갖는 것으로 하였다. 두가지 용액 농축물 중 한가지로 처리된 종자로부터 병해 식물이 19개 이하로 발생하면 테스트된 진균 균주를 다음의 테스트(필드 토양실험)에도 계속 받아들여 이용하였다.

필드 토양 테스트

파종 기질

사용한 토양(모래질 점토)을 Jokioinen의 필드 실험 지역으로부터 가져왔다. 이 토양은 손으로 분쇄하거나 또는 1 × 1 ㎝ 테이블 스크린을 통해 분쇄하였다(1992 - 1993 겨울). 1.5 L 들이 플라스틱 포트(σ 14㎝)를 위 가장자리 3 - 4 ㎝를 남기고 채웠다. 포트의 바닥에는 여과지를 깔았다.

처리

1. 건강한 종자. 오직 증류수만으로 적신다.

2. Fusarium 대조군. 약 10⁶포자/㎖를 갖는 Fusarium 접종물 (제제, 모래 테스트란 참조)로 종자를 적셨다. 용액은 충분량 사용하였다.

3. Fusarium 대조군의 경우와 같은 접종물 종자가 건조한 경우, 한 플레이트의 균사체와 포자를 25 ㎖ 증류수에 혼합함으로써 제조한 안타고니스트 현탁액으로 처리하였다. 처리는 플라스틱 병에서 수행하였으며, 여기에 종자 130개(120 내지 150개의 종자)를 넣고, 안타고니스트 현탁액 1 ㎖ (또는 1.5 ㎖)을 넣었다.

4. 살진균제 대조군. Fusarium 대조군의 경우와 같은 접종물. 종자가 건조한 경우 종자 1 kg 당 Baytan I 드레싱 분말 2 g으로 이들을 처리하였다. 이에 앞서 Ceresan 및 Tayssalo S 처리도 이용하였다.

처리된 종자를 포트 당 36개 종자, 3 레플리케이션/처리로 하여 포트에 파종하였다. 파종물에 필드 토양을 덮었다. 성장조건은 이탄 테스트에서와 같이 하였다. 약 4주일간 배양하였다.

시험 및 등급 정하기

새싹을 씻고 이들의 병해 정도를 다음과 같이 평가하였다:

0 = 완전히 건강함.

1 = Fusarium에 의해 약간 손상됨

2 = 중간-심한 정도로 병해 손상됨.

3 = 새싹이 온통 갈색을 띰. 사멸됨.

온실 테스트의 효력

1993년 여름 넓은 필드 실험에서 본 발명의 선별법의 효력을 테스트하였다. 이 테스트에서는 1991년 10월과 1993년 2월 사이의 선별 테스트 시리즈 동안의 추가테스트에, 분리된 진균 균주 중 올바른 것들이 선택되었는지를 평가하였다. 모래 테스트시 포기되고 밀에 병원성인 것으로 나타나지 않은 균주 60개를 임의로 종자처리하였다. 이탄 테스트에서 폐기된 균주 중 92개를 테스트에 할당하였다. 토양테스트에 션택된 총 58개의 진균 역시 이 테스트에 이용하였다. 이들 중 43개는 토양 테스트에서 폐기된 것이고 15개는 이를 근거로 필드 실험용으로 선택된 것이었다.

상기의 210개 처리개체에 더해 이 테스트에는 6개의 대조군 처리도 포함시켰다: 미처리군(K), Baytan I 드레싱 (B) 및 이전 테스트에서 대부분 연구된 네개의 진균 균주, a.o. J76.

이 테스트에는 진균 F. culmorum에 의해 자연적으로 감염된 'Luja' 밀을 이용하였다. 관찰 단위는 1.4 m 길이의 새싹 줄이었으며 종자 5.5 g을 파종하였다. 총 216 처리에 대해 6 레플리케이션을 파종하였다. 입방 격자 실험 디자인에 따라 테스트를 무작위화시켰다. 이러한 방식으로 토양 팩터에 따른 오차 편차를 감소시켰다. 파종 후 약 35 주일이 지난 후 토양으로부터 새싹을 파내어, 이들의 수를 세고 이들의 병해 증상을 조사하였다.

테스트 결과를 도 3a 내지 도 3d 의 네가지 히스토그램에 도시하였다. 이 테스트에서 폐기된 분리물과 모래 테스트에서 폐기된 비-병원성 분리물들 간에는 아무런 차이점이 발견되지 않았다. 이 테스트는 분명히 매우 잘 진행된 것으로 판단된다. 이로부터 취하여 이후의 테스트에 계속 이용된 균주들은 평균적으로 폐기된 진균보다 분명히 더 우수하였다.

모래 테스트와 이탄 테스트 모두에서 폐기되어서는 안되는 진균들은 비교적 적게 포기되었다. 다른 한편 토양 테스트를 기초한 경우에는 매우 우수한 분리물이 실질적인 양으로 포기되었으나 필드 실험으로부터 취해진 것들은 자연적인 조건에서 15개 중 단지 2개만 결함 효과를 가졌다.

이상의 결과로부터, 모래 테스트와 이탄 테스트를 기초로 하면 추후의 연구를 위해 최상의 안타고니스트를 신뢰성있게 선택할 수 있을 것이나, 필드 토양 테스트에서는 우수한 안타고니스트 후보들도 폐기될 수 있을 것으로 결론지을 수 있다.

선별 테스트에 있어 Jl43l 진균 균주의 테스트

본 발명의 여러가지 진균 균주들 중 J1431을 온실에서 행해진 세가지 선별 실험에 이용하였다.

모래 테스트에서는 J1431은 0, 0, 1, 1, 1 및 2등급을 얻었으며 추후의 테스트에 이용되었다.

이탄 테스트에서는 J1431은 다음의 결과를 얻었다:

T: 3 사멸

F: 36 사멸

F0: 3 사멸

F2: 7 사멸

J1431이 포함된 필드 토양 테스트에서, 병에 걸린 새싹의 백분률은 다음과 같았다:

건강함 66%

Fusarium 대조군 87%

Baytan I 드레싱 31%

J1431 19%

선별 테스트에 기초하여 J1431을 1993년 여름 61개의 다른 진균 균주와 함께 필드 실험에 이용하였다. 이 테스트에서는 F. culmorum 진균의 포자 현탁액이 인공적으로 접종된 'Luja' 봄 밀을 이용하였다. 종자를 단일 줄 (1.4m) 플롯으로 파종하고 테스트에 6 레플리케이션을 이용하였다. 파종한지 34일 후 새싹을 토양으로부터 파내어, 세정하고, 이들의 병해상황을 평가하였다. 상이한 처리에 있어 줄 미터 당 건강한 새싹의 양은 다음과 같았다:

Fusarium 대조군 5.9

Baytan I 드레싱 56

J76 61

J1431 65

기타 테스트 균주 30 - 68.

선별 테스트에 있어서 J1432 진균 균주의 테스트

J1432를 온실에서 세가지 모두의 선별 테스트를 거치게 하였다.

모래 테스트에서 J1432는 0, 0, 0, 1, 1 및 2등급을 얻었고 추후 테스트에이용하였다.

이탄 테스트에서 J1432는 다음의 결과를 나타내었다:

T: 10 사멸

F: 60 사멸

F0: 10 사멸

F2: 37 사멸

J1432가 포함된 필드 토양 테스트에서, 상이한 처리에서의 병해에 걸린 새싹의 백분률은 다음과 같았다:

건강함 56%

Fusarium 대조군 98%

Baytan I 드레싱 18%

J1432 38%

필드 토양 테스트 결과에 근거하여 J1432는 필드 실험으로부터 제외시켰다.

기탁 미생물

부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 독일 Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig에 소재하는 DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturem GmbH에 다음의 미생물을 기탁하였다.

본 발명에 따라 제공되는 넥트리아(Nectria)속에 속하는 새로운 미생물, 이를 이용한 살진균제, 및 살진균조성물은 식물의 질병, 특히 식물의 진균감염을 제어하는데 있어서 효과적이다.

Claims

수탁 번호 DSM 7522인 진균 균주 Nectria pityrodes Montagne J76.
수탁 번호 DSM 8805인 진균 균주 Nectria pityrodes Montagne J1431.
수탁 번호 DSM 8806인 진균 균주 Nectria pityrodes Montagne J1432.
수탁 번호 DSM 8807인 진균 균주 Nectria pityrodes Montagne MOS1.
수탁 번호 DSM 8808인 진균 균주 Nectria pityrodes Montagne ROS2.
수탁 번호가 각각 DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 및 DSM 8808인 진균 균주 Nectria pityrodes J76, J1431, J1432, MOS1 및 ROS2로 이루어진 군 중에서 선택된 진균 균주를 한가지 이상 함유하는 바이오살진균제.
수탁 번호가 각각 DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM-8807 및 DSM 8808인 진균 균주 Nectria pityrodes J76, J1431. J1432, MOS1 및 ROS2로 이루어진 군 중에서 선택된 진균 균주 한가지 이상과 당해 기술분야에 통상적인 담체 및/또는 첨가제를 함유하는 바이오살진균 조성물.
제 7 항에 있어서, 담체 및 첨가제가 실리카, 분유, 카르복시메틸셀룰로스, 수크로스, 아스코르브산 및 전분 중에서 선택되는 조성물.
제 7 항 또는 8 항에 있어서,

(a) 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 진균 균주를 적절한 성장 배지에서 성장시켜, 세포 매스를 분리하고 여기에 담체 및/또는 첨가제를 첨가한 다음 이 세포 매스를 건조 및 분말화하거나, 또는

(b) 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 진균 균주를 실리카와 함께 적절한 성장 배지에서 성장시키고, 소망되는 경우, 여기에 담체 및/또는 첨가제를 첨가하고, 이 세포 매스를 건조 및 분말화시키는 방법에 의해 생산되는 조성물.
제 6 항에 따른 살진균제 또는 제 7 항 또는 제 8 항에 따른 살진균 조성물을 식물 또는 식물의 종자에 적용시키거나 또는 종자 파종 전 또는 파종 후에 성장기질에 첨가하는 것을 포함하는, 식물의 진균 감염을 억제하는 방법.
(a) 모래층에 곡물 종자를 파종하고, 병원체의 균사체와 포자, 이어서 테스트될 진균의 포자를 물 현탁액으로 만들어 종자와 성장 기질에 피펫팅한 다음, 종자에 모래를 덮고, 적절한 기간 경과 후 새싹의 병해 증상의 정도를 평가하여, 병해의 정도에 영향을 미치지 않거나 그 자체가 병원성인 진균을 폐기하는 것으로 이루어지는 모래 테스트를 수행하고,

(b) 병원체의 포자 현탁액으로 곡물의 종자를 습윤시키고 종자를 건조시키고, 테스트될 진균의 포자 현탁액으로 곡물의 종자를 습윤시키고 종자를 건조시킨 다음, 종자를 훈증된 이탄에 파종하고, 적절한 기간동안 성장시켜 새싹의 건강상태를 관찰하고, 병해를 분명히 억제한 분리물을 이후의 테스트에 계속 이용하는 단계를 포함하는, 미생물 샘플로부터 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 진균 미생물을 스크리닝하는 방법.
제 9 항에 따른 살진균 조성물을 식물 또는 식물의 종자에 적용시키거나 또는 종자 파종 전 또는 파종 후에 성장 기질에 첨가하는 것을 포함하는, 식물의 진균 감염을 억제하는 방법.