HU220838B1

HU220838B1 - Microorganisms for biological control of plant diseases

Info

Publication number: HU220838B1
Application number: HU9602091A
Authority: HU
Inventors: Milja Tuulikki Keskinen; Marja-Leena Lahdenperae; Pekka Tapani Seiskari; Risto Tapio Tahvonen; Esa Petri Teperi; Ulla Anita Tuominen
Original assignee: Kemira Agro Oy
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2002-06-29
Also published as: LV11746A; FI95598C; ES2185694T3; MD1651G2; CA2182364A1; CZ289942B6; EP0742816A1; FI940463A0; JPH09508274A; PL179895B1; BR9507052A; DE69528753D1; KR100361473B1; AU686311B2; PL315659A1; MD960242A; HUT74599A; AU1538695A; HU9602091D0; US5811090A

Description

A találmány növényi betegségek biológiai módszerekkel történő leküzdésére vonatkozik. Közelebbről, a találmány tárgya a Nectria nemzetségbe tartozó új mikroorganizmusok, valamint ezek növényi gombafertőzések leküzdésében való alkalmazása. A találmány további tárgya a Nectria nemzetség új törzseit tartalmazó készítmények és e készítmények említett célra történő alkalmazása.

A mezőgazdasági terménynövényeket különböző gomba-, baktérium- és vírusbetegségek, valamint számos rovarkártevő károsítja. Ezek leküzdéséhez sok termesztéstechnikai, kémiai és biológiai védekezési eljárást fejlesztettek ki. Ezen eljárások célja, hogy megakadályozzák a növénybetegségek és a rovarkártevők által okozott minőségi és mennyiségi termésveszteségeket.

A növényi betegségek elleni biológiai védekezés általánosan a növénypatogének egyéb organizmusokkal történő leküzdését jelenti (az ilyen organizmusokat biológiai védekező organizmusoknak [BCA; biological control agents] nevezhetjük). A BCA-k által termelt anyagokat gyakran biopeszticideknek nevezzük. A növénybetegségek elleni biológiai védekezés mechanizmusa változó, és hatása gyakran sok különböző mechanizmus együttes hatásán alapul. A védőhatás alapulhat a BCA által termelt gátló anyagcseretermékek hatásán; a védekezéshez alkalmazott organizmus lehet a patogén parazitája; továbbá a rendelkezésre álló tér és/vagy tápanyagok tekintetében kompetitora is lehet.

Az új biológiai védekező organizmusok felfedezésének szükségességét fokozza az a tény, hogy a hagyományos kémiai védekezőszerek közül sokról kiderült, hogy károsak a környezetre és az emberekre. A vegyszerek további hátránya, hogy sok rovarkártevő rezisztenssé vált egy vagy több ilyen szerre. Ezzel szemben, a biopeszticidekkel szembeni rezisztencia kifejlődése nem valószínű, mivel ezek hatása számos különböző típusba tartozó mechanizmuson alapul. A vegyszerek gyorsabban fejtik ki hatásukat és hatékonyabbak, mint a biopeszticidek, ezzel szemben a biopeszticidek gyakran hosszabb hatásúak, és hatásuknak az életképes és szaporodó mikroorganizmusok képezik alapját.

A biopeszticidek legfontosabb csoportja a rovarok elleni bakteriális termékek. A legáltalánosabban a Bacillus thuringiensis baktériumon alapuló bioinszekticideket alkalmazzák. Finnországban olyan, az Actinomycetales rendbe tartozó Streptomyces-en alapuló biofungicidot készítenek, amely a növények számos (talajban, illetve magban kialakuló) gombabetegsége ellen hatásos. Egy ártalmatlan, fakorhasztó gombából (Phlebia gigantea) olyan terméket fejlesztettek ki, amely tűlevelű erdőkben képes a Heterobasidion annosum okozta Fomes gyökérrothadás terjedésének megakadályozására.

A Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumokat, különösen a Pseudomonas fluorescens-t, sokat tanulmányozták, és az utóbbi időben sok fungicid aktivitással rendelkező Pseudomonas fluorescens vált ismertté (ld. például a közrebocsátott WO 92/18613, FI 92 1722 és WO 90/01327 számú szabadalmi bejelentéseket, illetve a 228 457 számú európai szabadalmat.

A biológiai védekezéshez alkalmas mikroorganizmusok megtalálása érdekében rendszerint a patogének elleni védekező aktivitásra vagy bizonyos egyéb tulajdonságokra sok baktériumtörzset szelektálunk. Az ilyen szűrési (szelekciós) eljárások némelyike szabadalmi leírásokban megtalálható.

A 4.647.533 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban háromlépéses szelekciós eljárást írnak le. Az első lépésben a káros Pythium gomba nagy mennyiségű spóráját tartalmazó talajból baktériumokat izolálnak. A második lépésben az izolált baktériumokat melegházban vizsgálják oly módon, hogy nagy mennyiségű Pythium spórát tartalmazó talajban a tesztelni kívánt baktériumok szuszpenziójával együtt (és kontrollként baktériumok nélkül) gabonamagvakból növényt nevelnek, és azokat a baktériumokat választják ki, amelyek jelenlétében a növények nagyobb leveleket fejlesztenek és magasabbra nőnek. A harmadik lépésben a kiválasztott baktériumokat a melegházi teszthez hasonló módon szántóföldön szelektálják. Ebben a lépésben is azokat a baktériumokat választják ki, amelyek jelenlétében a növények jobban növekednek.

Az FI 92 1722 számú finn szabadalomban az alábbi eljárást alkalmazzák. Elsőként egy Pythium törzs micéliumait megfelelő tápközegen növesztik, a micéliumokra egy réteg steril talajt tesznek - amelyre a tesztelni kívánt mikroorganizmust helyezik -, majd értékelik a mikroorganizmus Pythium növekedésére gyakorolt hatását. A második fázisban egy talajmintát rothadást okozó Pythium törzzsel oltanak be, az így kezelt talajba a gomba által okozott fertőzésre érzékeny növény magját vetik, és meghatározzák a tesztelt mikroorganizmusnak a növény növekedésére gyakorolt hatását. A későbbi tesztekhez azokat az anyagokat választják ki, amelyek mindkét tesztelési fázisban gátló hatást mutattak a Pythiumma\ szemben.

A találmány tárgya a Nectria nemzetségbe tartozó mikroorganizmus (nevezetesen a Nectria pityrodes Montagne), mely nagyon hatásosnak bizonyult a Fusarium gombákkal szemben.

A találmány további tárgya a gombatörzsből készült biofungicid készítmény, amely aktív összetevőként a Nectria nemzetségbe tartozó, fentebb említett gombatörzseket, és adott esetben a megfelelő készítmények kialakításához alkalmas, hagyományos adalék anyagokat és hordozókat tartalmazza. Az ilyen készítmények példái a magvak csávázásához alkalmas készítmények, a táptalajra szórható por vagy granuláris alakú készítmények, illetve a talaj kezeléséhez alkalmas folyadékkészítmények.

Az ábrák rövid leírása át. 1. ábrán a J76 törzzsel 1992 nyarán végzett dózisreakció-kísérlet eredményeként a megbetegedett csíranövények százalékos mennyiségét mutatjuk be (F. culmorum gombával beoltott magvak alkalmazása esetén). A rövidítések jelentése: K=kezelés nélkül; B=Baytan-csávázás;

J76-0=J76 spóraszuszpenzió, 1,2 χ 10⁷ cfu/ml (telepképző egység/ml);

HU 220 838 Bl

J76-1 = J76 spóraszuszpenzió, 1,2 χ 10⁶ cfu/ml;

J76-2=J76 spóraszuszpenzió, 1,2 χ IO⁵ cfu/ml;

J76-3=J76 spóraszuszpenzió, 1,2 χ 10⁴ cfu/ml.

A 2. ábrán a J76 törzzsel 1992 nyarán végzett dózisreakció-kísérlet eredményeként a megtámadott csírák százalékos mennyiségét mutatjuk be (egészséges magvak alkalmazása esetén). A rövidítések jelentése megegyezik az 1. ábrához leírtakkal.

A 3a-3d. ábrákon a melegházi tesztek különböző stádiumaiban kiselejtezett gombaizolátumoknak a csírák egészségi állapotára (szabadföldi körülmények között) gyakorolt hatását mutatjuk be (K=kezelés nélkül; B=Baytan I-csávázással).

Az alábbiakban a találmány szerinti gombatörzseket írjuk le részletesen, melynek során beszámolunk izolálásukról és karakterizálásukról, valamint hatékonyságuk szabadföldi körülmények között végzett teszteléséről. Leírjuk továbbá az e törzsekből készített biofungicid készítmények előállítását, valamint az így kapott készítmények hatékonysági tesztjeit, illetve a talajmintákból izolált gombatörzsek szelektálás! eljárását.

A mikroorganizmusok izolálása

A talajmintákat (összesen körülbelül 190), melyekből a találmány szerinti gombatörzseket izoláltuk, 1989ben, 1990-ben és 1991-ben, Finnország különböző területeiről gyűjtöttük (elsősorban az MTT [Mezőgazdasági Kutatóintézet] kutatóállomásain, különböző talajtípusokból és különböző vetésforgókból). A mintákat a gyökerek rétegéből (0-15 cm) vettük. Az egyes földekről több almintát vettünk, s az azonos földekről származó almintákat 1-2 liternyi térfogatú mintákban egyesítettük.

Az izolálást hígítási eljárással (izolálás talajból) vagy „csalinövény” alkalmazásával (izolálás gyökérből) végeztük, mely eljárásokat a „Módszerek” szakaszban írjuk le részletesen.

A mikroorganizmusok karakterizálása

A talajmintákból izolált gombatörzseket a találmány szerinti szelekciós eljárással teszteltük, melyet szintén a „Módszerek” szakaszban írunk le. A szelektálás eredményeként öt törzset találtunk, amelyek nagyon jó eredményeket adtak. Ezeket a törzseket (J76, J1431, J1432, MOS1 és ROS2) a Centraalbureau voor Schimmelculturesben (Baam, Hollandia) karakterizáltuk. A törzseket a Budapest Szerződés értelmében a DSM-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) az alábbi deponálási számokon helyeztük letétbe: DSM 7522 (1993. március 15.), DSM 8805 (1993. december 10.), DSM 8806 (1993. december 10.), DSM 8807 (1993. december 10.), illetve DSM 8808 (1993. december 10.).

Az alábbiakban a mikroorganizmusok morfológiai jellemzőit írjuk le.

Morfológia

A gombákra marginális steril hifák nélküli sporodochia jellemző. A konidiofórok ismételt elágazódást mutatnak, az egyes nóduszokból kiinduló több elágazással. Az utolsó elágazások palánkszerű rétegben elhelyezkedő fialid örvvel rendelkeznek. A fialidok hengeresek, legfeljebb 15 pm hosszúak, és apikális pórus található rajtuk. A konidiumok ellipszoidtól csepp alakig terjedő nyálkás labdák formájában termelődnek, rövid hilummal rendelkeznek, méretük 7-8x4 pm, faluk sima, függelékek nélkül.

Telepmorfológia

A telep zabpehely agaron, 22° C-on 7 nap alatt 400 mm átmérőig növekedett; a micélium átlátszó, a spóraképző területek hólyagos sporodochiumok, színük zöld, és koncentrikus körökben helyezkednek el. A szag nem feltűnő, a telep hátoldala színtelen; a váladék kevés, tiszta.

A J76 törzs konidiofór struktúrája hasonló a Myrothecium verrucariáéhoz, de abban különbözik, hogy a J76 törzs nem marginális sporodochiumokat termel, a konidiumok száraz láncokban helyezkednek el, és a konidiumokon nincs jelen a jellegzetes legyezőszerű függelék.

A Gliocladium nemzetség jellemző képviselői abban térnek el az új törzstől, hogy különálló, ecsetszerű konidiofórokat termelnek.

A J76, J1431, J1432, MOS1 és ROS2 törzseket Nectria pityrodes Montagne fajként azonosítottuk.

Ezekből a törzsekből nem romlandó készítmények állíthatók elő, melyek betegséggel szembeni védelmet igénylő ültetvényekre szórhatok. A készítmény például por alakjában állítható elő. A mikroorganizmus tenyésztése spórákat tartalmazó PDA (burgonyadextróz agar) üledékből álló oltóanyagból indítható meg, melyet előzetesen -80° C-on tartottunk. A mikroorganizmus tenyészthető folyadéktenyészetben vagy szilárd hordozón. A tápközeg cukrot (például szacharózt) és nitrogént, továbbá kisebb mennyiségben egyéb tápanyagokat tartalmaz. A tenyésztés során nem specifikus tápközegek, például Com Steep Liquor (CSL) vagy specifikus tápközegek, például GYM (4 g/1 glükóz, 4 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 malátakivonat) vagy PDB (burgonyadextróz tápleves) alkalmazhatók. A tápközeg pH-ja körülbelül 6,0, amit a sterilizálás előtt állítunk be. A tenyésztést egy- vagy kéthetes rázatással végezzük. A sejtmassza szűrőpapíron végzett szűréssel vagy centrifugálással választható el a tápközegtől. Amennyiben folyadéktenyésztést végzünk, a sejtekhez vivőanyagot, például szilícium-dioxidot, tejport és/vagy CMC-t (karboxi-metil-cellulóz) adunk. A sejtmasszát szobahőmérsékleten szárítjuk és porrá őröljük.

Módszerek

A mikroorganizmusok izolálása a) Hígítási eljárás (izolálás talajból) g talajt 100 ml 0,5%-os vizes agarral (Bactoagar) kevertünk össze. Az elegyből három 10 ml-es almintát vettünk, és 0,5%-os vizes agarban mindegyikből két hígítást (10^_1 és 10^-2) készítettünk. A hígításokat rázógépen 20 30 percig vízfürdőben rázattuk. A hígítás 1 ml-ét üres Petri-csészébe pipettáztuk, és 20 ml LittmanOxgall Agart (LOA) töltöttünk rá. A csészéket szobahőmérsékleten 3-7 napig inkubáltuk, és az

HU 220 838 Bl izolált különálló gombákból PDA tápközegen tiszta tenyészeteket készítettünk.

b) „ Csalinövény -eljárás (izolálás gyökérről)

Cserépsorozat lemezen (Vefi-VP 96) 15 darab 50 ml-es cserepet egy mintából származó talajjal töltöttünk meg. Háromszor öt cserépbe, cserepenként négy búzaszemet, négy árpaszemet, illetve körülbelül 15 fehérrépamagot ültettünk. A magokat homokkal befedtük, meglocsoltuk és nevelőkamrában 15 °C-on 14 órás megvilágítási ciklussal inkubáltuk. Kéthetes inkubálás után a növényeket kivettük a cserepekből, folyóvíz alatt lemostuk, vagy víz nélkül kefével letisztítottuk. A gyökerekből kis darabokat vágtunk ki, s ezeket lemezekre tettük, melyeken az alábbi tápközegeket alkalmaztuk: LOA (1000 ml vízben 10 g pepton, 10 g dextróz, 15 g Bacto-Oxgall, 0,01 g B-kristályibolya, 0,03 g streptomycin és 20 g agar); PCNB (1000 ml vízben 15 g pepton, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 2 g Avicol, 3 ppm streptomycin és 20 g agar); és PDAStreptomycin (1000 ml vízben 39 g PDA készítmény és 300 ppm streptomycin). Néhány napos inkubálás után különálló gombákat izoláltunk, melyeket PDA lemezeken tenyésztettünk tovább.

A törzseket -80 °C-on PDA üledéken ampullákban (Nalgene 5000-0012, PP steril, 1,2 ml) tároltuk.

A szelekciós eljárás melegházi tesztjeinek végrehajtása

Homokteszt

Gabonaszemeket homokrétegre szórtunk. A szemekre és a nevelőközegre vizes szuszpenzióban először a patogén micéliumait és spóráit, majd a tesztelt gomba spóráit pipettáztuk, végül a szemeket homokkal lefedtük. Két és fél hét elteltével a csíranövényeken vizsgáltuk a betegség tüneteit. A további kísérletekből kihagytuk azokat a gombákat, amelyek nem csökkentették a betegség intenzitását, vagy amelyek önmaguk is patogéneknek mutatkoztak.

Tőzegteszt

Egy gabonaszemet egy patogén spórájából készült szuszpenzióban megnedvesítettünk, majd megszárítottunk. Ezután a gabonaszemet a tesztelt gombaspóra szuszpenziójába merítettük, megszárítottuk és elültettük. Nevelőközegként kigőzölt tőzeget alkalmaztunk. Két és fél hetes inkubálás után megvizsgáltuk a csíranövények egészségi állapotát. Azokat a gombatörzseket, amelyek egyértelműen megakadályozták a betegség kialakulását, a szántóföldi talajon végzett tesztben tovább vizsgáltuk.

Szántóföldi talajteszt

1,5 literes cserepekbe morzsolt és nedvesített talajt tettünk, és mindegyik cserépbe 36 gabonaszemet helyeztünk. A szemeket elvetésük előtt a tőzegtesztnél leírtak szerint kezeltük (mindegyik kezeléshez három cserepet alkalmaztunk). A csíranövények tüneteit négy hé10 tig tartó inkubálás után vizsgáltuk.

A fenti tesztekben megfelelőnek talált törzseket szabadföldi tesztekben vizsgáltuk, melyek végső bizonyosságot szolgáltattak a kiválasztott gombaizolátumok biopeszticid hatásáról.

A gombatörzsekpatogenitása

Próbaképpen megvizsgáltuk a J76 gombatörzs esetleges káros hatásait. Az eddig kapott eredmények azt mutatják, hogy ez a gomba nem patogén a növényekre (33 növényfajt teszteltünk).

Az alábbi példákban a találmány gyakorlati felhasználását mutatjuk be. Az 1. példában a Nectria pityrodes J76, J1431, J1432, MOS1 és ROS2 törzseiből készített spóraszuszpenziók alkalmazását írjuk le (főként

Fusarium fajok által okozott növénybetegségek elleni védekezésben). A 2. példában a fenti törzsekből készített készítmények előállítását és alkalmazását; a 3. példában a J76 gombatörzs hatásmechanizmusának vizsgálatára végzett kísérleteket; míg a 4. példában a talál30 mány szerinti szelekciós eljárás végrehajtását és értékelését mutatjuk be.

1. példa

A gombatörzsek alkalmazása spóraszuszpenziók alakjában

A J76 törzsből készített spöraszuszpenzióval végzett kísérletek

1992 nyarán a J76 törzsből készített spóraszuszpenzió hatását három teszthelyszínen vizsgáltuk. A tesztek során két különböző magot alkalmaztunk: Fusarium culmorummal mesterségesen beoltott búzát, illetve F. nivaléval természetesen fertőzött árpát.

A búzával végzett tesztek eredményeit az I. táblázatban, a mesterségesen beoltott búza hozameredményeit a II. táblázatban mutatjuk be.

Az árpa csíravizsgálatának eredményeit a III. táblázatban mutatjuk be. A betegségnek nem volt statisztikailag szignifikáns hatása az árpa hozamára.

I. táblázat

A három teszthelyszínen mesterségesen beoltott búzával 1992 nyarán végzett kísérletek eredményei (a kibújt csíranövények mennyisége és a beteg csíranövények aránya)

Terület	Kezelés	Csíranövények száma sorméterenként	A súlyosan beteg csiranövények százalékos aránya
JOKIOINEN	egészséges szemek	50	5,2
	kezelés nélkül	11	48
	Baytan-csávázás	45	10
	J76	47	7,2

HU 220 838 Bl

1. táblázat (folytatás)

Terület	Kezelés	Csíranövények száma sorméterenkent	A súlyosan beteg csíranövcnyck százalékos aránya
MIETOINEN	egészséges szemek	45	7,3
	kezelés nélkül	10	42
	Baytan-csávázás	39	3,8
	J76	33	13
PÁLKÁNE	egészséges szemek	50	3,0
	kezelés nélkül	15	57
	Baytan-csávázás	51	24
	J76	45	11

II. táblázat

A három helyszínen 1992 nyarán mesterségesen beoltott búzával végzett kísérletek hozameredményei (kg/ha)

Kezelés	JOKIOINEN	MIETOINEN	PÁLKÁNE
Egészséges szemek	3650	3190	5290
Kezelés nélkül	1830	1690	1950
Baytan-csávázás	3270	3190	4940
J76	3530	2950	4900

III. táblázat

A három helyszínen 1992 nyarán természetesen fertőzött (F. nivale) árpával végzett kísérletek eredményei (a kibújt csíranövények mennyisége és a beteg csíranövények aránya)

Terület	Kezelés	Csíranövények száma sormeterenként	A súlyosan beteg csíranövények százalékos aránya
JOKIOINEN	kezelés nélkül	39	7,7
	Baytan-csávázás	40	1,2
	J76	40	0,9
MIETOINEN	kezelés nélkül	42	7,4
	Baytan-csávázás	42	1,4
	J76	43	2,8
PÁLKÁNE	kezelés nélkül	42	26
	Baytan-csávázás	42	9,4
	J76	44	6,3

A J76 törzs 1992 nyarán végzett dózisreakció-tesztje Mivel a J76 törzs a ‘92-es nyár elején végzett csíravizsgálatokban igen jó eredményeket mutatott, közvetlenül a nyárközép előtt elvetett egészséges, illetve Fusarium culmorummál mesterségesen fertőzött búzaszemek alkalmazásával vizsgáltuk a betegséget megakadályozó hatását.

A kísérlet során 2 m²-es parcellákat vetettünk be. Vizsgáltuk a csírák kibújását és a betegség tüneteit.

A betegség tüneteinek megfigyeléséhez a csíramintákat négy különböző időpontban vettük. Az egyes kezelési csoportokban a mintákat a négy mintavételi időpont szerint elkülönített négy parcellából vettük. A csírák számát a IV. táblázatban, míg a beteg csírák százalékos arányát (külön a Fusariummal fertőzött, és külön az egészséges szemek esetében) az V. táblázatban mutatjuk be. Az V. táblázat adatait grafikusan az 1. és 2. ábrán mutatjuk be.

HU 220 838 Bl

IV. táblázat

A J76 törzzsel 1992 nyarán végzett dózisreakciókísérlet eredményei (a kibújt csíranövények száma)

Kezelés	Csíranövény/ sorméter
FusariummsX fertőzött magvak
Kezelés nélkül	18
Baytan-csávázás	57
J76 spóraszuszpenzió (1,2 χ 10⁷ cfu/ml)	74
J76 spóraszuszpenzió (1,2 χ 10⁶ cfu/ml)	58
J76 spóraszuszpenzió (1,2 χ 10⁵ cfu/ml)	51
J76 spóraszuszpenzió (1,2 χ 10⁴ cfu/ml)	20
Egészséges magvak
Kezelés nélkül	71
Baytan-csávázás	66
J76 spóraszuszpenzió (1,2 χ 10⁷ cfu/ml)	80

V. táblázat

A J76 törzzsel 1992 nyarán végzett dózisreakciókísérlet eredményei (a megbetegedett csíranövények százalékos aránya F. culmorummal beoltott magvak, illetve egészséges magvak alkalmazása esetén; a rövidítések jelentése megegyezik a 2. ábra kapcsán megadottakkal)

Kezelés	A csíranövcnyck kibújásától eltelt napok száma
	10	17	30	44
Egészséges magvak
K	54,7	71,8	67,7	85,1
B	8,4	50,4	58,3	73,6
J76-0	14,3	48,0	69,9	73,8

Kezelés	A csíranövények kibújásától eltelt napok száma
	10	17	30	44
Fusariummal fertőzött magvak
K	75,4	82,8	79,5	85,1
B	15,9	60,9	65,3	78,2
J76-0	10,1	50,0	66,6	70,3
J76-1	23,1	51,8	55,5	62,9
J76 2	36,4	64,7	76,0	78,0
J76-3	68,6	72,8	77,1	76,2

A J76 spóraszuszpenzióval 1993 nyarán végzett szántóföldi kísérletek

A kísérleteket Jokioinenben, Mietoinenben és Pálkáneben végeztük, melyek során az alábbi hat magmintát alkalmaztuk:

- „Luja” búza, F. culmorummal természetesen fertőzött;

- „Luja” búza, F. culmorummal mesterségesen fertőzött;

- „Luja” búza, egészséges;

- „Laari” búza, egészséges;

- „Kustaa” árpa, különböző Fusarium gombákkal és Bipoláris sorokinianával természetesen fertőzött;

- „Yti” zab, F. avenaceummal természetesen fertőzött.

Az egészséges búzamintákat csak Jokioinenben vetettük, míg a többi magmintával mind a három helyszínen végeztünk kísérleteket. A kísérletek során 10 m²-es parcellákat vetettünk be, kezelési csoportonként hat ismétléssel.

A magukkal mindegyik magmintában azonos kezeléseket végeztünk:

K=kezelés nélküli kontroll;

B=kémiai kontroll, Baytan I-csávázás;

J76S=lemeztenyészetből származó J76 spóraszuszpenzió (8,4 χ 10⁹ cfu/kg mag).

A VI. táblázatban az egyes kezelési csoportokra és magmintákra külön-külön adjuk meg a beteg csíranövények százalékos arányát. A hozameredményeket a VII. táblázatban mutatjuk be.

VI. táblázat

A J76 spóraszuszpenzióval 1993-ban végzett kísérlet eredményei (a súlyosan megbetegedett csíranövények százalékos aránya)

	Árpa	Zab	Term. fért. búza	Mcst. fért. búza	Egészs. „Luja”	Egészs. „Laari”
JOKIO1NEN
K	6,0	10,1	7,4	34,2	20,6	5,7
B	0,9	2,0	2,1	1,0	1,4	0,7
J76S	0,9	1,4	0,7	1,0	3,3	5,7
MIETOINEN
K	12,8	3,5	20,4	72,0
B	1,3	0,6	5,7	6,6
J76S	5,4	0	7,1	7,3

HU 220 838 BI

VI. táblázat (folytatás)

	Árpa	Zab	Term. fért. búza	Mest. fért. búza	Egészs. „Luja”	Egcszs. „Laari”
PÁLKANE
K	9,6	7,4	10,9	26,9
B	2,5	3,3	2,1	0,6
J76S	2,4	3,6	2,3	0

VII. táblázat

A J76 spóraszuszpenzióval 1993-ban végzett szántóföldi kísérletek hozameredményei (kg/ha)

	Árpa	Zab	Term. fért. búza	Mest. fért. búza	Egészs. „Luja”	Egészs. „Laari”
JOKIOINEN
K	7460	6650	6060	2950	6100	6360
B	7500	6650	5870	5690	5940	6060
J76S	7840	6650	6050	6040	6150	6570
MIETOINEN
K	5900	5780	4920	3890
B	6070	5200	4910	4990
J76S	6120	5440	4670	4810
PÁLKANE
K	4670	5560	3630	2950
B	4550	5200	4190	4000
J76S	4710	5430	3710	3650

A J76 törzs búzaüszög és árpa-gyökérrothadás elleni tesztelése

1993 nyarán a J76 törzset kilenc kémiai fungiciddel csávázott gabonamagvak alkalmazásával szántóföldi kísérletekben búzaüszög (Tilletia caries) elleni hatására 40 vizsgáltuk. A J76 törzset konidiumszuszpenzió formájában, a vegyszereket pedig használati útmutatásuk szerint alkalmaztuk (VIII. táblázat).

Kezelés	Búzaüszöggcl szembeni vedelem hatékonysága (a fertőzött kalászok mennyiségének %-os csökkenése)
Raxil I folyadék	100
Prelude LS	100
Vitavax 200 FF	100
J76	85

VIII. táblázat

A csávázási kezelések hatása a búzaüszög-kísérletben

Kezelés	Búzaüszöggel szembeni védelem hatékonysága (a fertőzött kalászok mennyiségének %-os csökkenése)
Tayssato S folyadék	78
Baytan WS	100
Bérét 050	100
Fungazil C	100
Panoctine 35	100
Raxil 1 por	100

A Baytan-vegyszerben a triadimenol a hatóanyag. A Baytan I triadimenol és imazalil elegye. A Táyssato S karboxint és imazalilt tartalmaz, míg a Panoctine hatóanyaga a guazatin.

A kémiai védekezőszerek árpa-gyökérrothadás (Bipoláris sorokiniana) elleni szántóföldi tesztjébe is bevontuk a magok J76 spórákkal végzett kezelését. A kísérlet során 10 m²-es parcellákat és négy ismétlést alkalmaztunk. A különböző kezelések alkalmazása esetén a csírázásban nem találtunk különbségeket. A J76 egyértelműen csökkentette a tüneteket (IX. táblázat), bár ebben az esetben a patogén jelentősen különbözött a Fusarium gombáktól, amely ellen a J76 törzset kiválasztottuk.

HU 220 838 Β1

IX. táblázat

A csávázási kezelések hatása az árpa gyökérrothadására

Kezelés	A gyökérrothadással szembeni védelem hatékonysága (a megbetegedett csírák mennyiségének százalékos csökkenése)
Prelude LS	85
Dividend 37,5 (400 ml)	84
Dividend 37,5 (200 ml)	81
Baytan I	81
Bérét Special (400 ml)	74
Raxil I por	70
Tayssato S folyadék	66
Panoctine Plus	66
Fungazil C	66
Bérét Special (200 ml)	65
Raxil I folyadék	64
Bérét FS 050	49
PNL 210	39
J76	69

2. példa

A gombatörzsekböl előállított készítmények, valamint szántóföldi kísérletekben mutatott hatásuk A J76 gombatörzsből az alábbiak szerint porkészítményeket állítottunk elő.

1. készítmény

A gombák tenyésztését 1 literes Erlenmeyerlombikban 0,5 liter tápközegben (4 g/1 szacharóz, 4 g/1 élesztőkivonat és 10 g/1 malátakivonat) végeztük. Az autoklávban végzett sterilizálás előtt a pH-t 6,0-ra állítottuk be. Oltóanyagként spórákat tartalmazó agarüledéket alkalmaztunk (burgonyadextróz agar tápközeg), melyet a felhasználás előtt -80 °C-on tartottunk. A tenyésztést szobahőmérsékleten (22 °C), percenként 150 fordulatszámmal működő rázógépen 7-12 napig végeztük. A sejteket szűrőpapíron végzett szűréssel különítettük el. A sejtmasszához szilícium-dioxidot, tejport és CMC-t (karboxi-metil-cellulóz) adtunk az alábbiak szerint:

sejtek	20%
szilícium-dioxid	55%
tejpor	15%
CMC (7%-os vizes oldat)	10%.
Az elegyet nyitott Petri-csészékben szobahőmérsék-

létén két napig steril levegővel szárítottuk. Az elegy rétegvastagsága 1-2 cm volt. A kiszárított elegyet porrá őröltük. A készítmény életképessége 10⁷ cfu/g volt (cfu=telepképző egység).

A telepképző egység a mikroorganizmusok életképességének meghatározására alkalmazott egység. Ezt úgy határozzuk meg, hogy a hígított mikroorganizmusszuszpenziót agarlemezekre kenjük, és néhány nap elteltével megszámoljuk a kialakult telepeket. Ha ismert a hígítás, meghatározható az eredeti minta telepszáma vagy sejtszáma.

2. készítmény

A sejteket az 1. készítménnyel kapcsolatban leírtakhoz hasonlóan tenyésztettük, majd szilícium-dioxidot, tejport, CMC-t és aszkorbinsavat adtunk hozzájuk, az alábbiak szerint:

sejtek	60%
szilícium-dioxid	20%
tejpor	14%
CMC (7%)	3%
aszkorbinsav	3%.
Az elegyet a fentebb leírtak szerint szárítottuk és

porrá őröltük. A készítmény életképessége 10⁷ cfu/g.

3. készítmény

A sejteket az 1. készítménynél leírtakhoz hasonlóan tenyésztettük, majd szacharózt és keményítőt adtunk hozzájuk, az alábbiak szerint:

sejtek 20% szacharóz 25% keményítő 55%.

Az elegyet a fentebb leírtak szerint szárítottuk és porrá őröltük. A készítmény életképessége 10⁷ cfu/g.

4. készítmény

A J76 törzset közvetlenül (szilícium-dioxidot tartalmazó) szilárd tápközegen tenyésztettük. Táplevesként 8%-os malátakivonatot (Maltax MP10, Lahden Polttimo) alkalmaztunk. Főzőpohárban 120 g táplevest 50 g szilícium-dioxid-porral összekevertünk, és az elegyet 120 °C-on 20 percig autoklávoztuk. A lehűtött tápközeget 10 g J76 spóraszuszpenzióval beoltottuk, melyet úgy kaptunk, hogy PDA lemezről a spórákat steril vízbe kapartuk. A tápközeget 20 napig 16 °C-on inkubáltuk, majd szobahőmérsékleten 2 napig szárítottuk. A szárított készítmény életképessége 10⁷ cfu/g.

A találmány szerinti többi törzsből hasonlóan állítottunk elő készítményeket.

Por alakú készítmények hatása szántóföldi kísérletekben

Az alábbiakban a J76 törzsből készített por alakú készítménnyel a Finn Mezőgazdasági Kutatóintézet Növényvédelmi Intézetében 1993 nyarán végzett kísérleteket írjuk le. A kísérleteket a korábban említett helyszíneken (Jokioinen, Mietoinen és Pálkáne), az alábbi hat magminta alkalmazásával végeztük:

- „Luja” búza, F. culmorummal természetesen fertőzött;

- „Luja” búza, F. culmorummal mesterségesen fertőzött;

- „Luja” búza, egészséges;

- „Laari” búza, egészséges;

HU 220 838 Β1

- „Yti” zab, F. avenaceumm&l természetesen fertőzött.

Az egészséges búzamintákat csak Jokioinenben vetettük, míg a többi négy magmintával mind a három helyszínen végeztünk kísérleteket. A kísérletekhez 10 m²-es parcellákat vetettünk be, és mindegyik kezelést hat ismétléssel végeztük.

Valamennyi magmintával ugyanazokat a kezeléseket végeztük:

K=kezeletlen kontroll;

B=kémiai kontroll, Baytan I-csávázás;

J76PK=J76 por száraz csávázással (8,4 χ 10⁸ cfu/kg: a magvak által felvett legnagyobb mennyiség);

J76PN=J76 por folyadékcsávázással (8,4xl0⁸5 cfu/kg).

A X. táblázatban az egyes kezelések és magminták esetében külön-külön adjuk meg a megbetegedések mértékét. A hozameredményeket a XI. táblázatban foglaljuk össze.

X. táblázat

A J76 porkészítménnyel 1993 nyarán végzett szántóföldi kísérletek eredményei (a súlyosan megbetegedett csíranövények százalékos aránya)

	Árpa	Zab	Tcrm. fért. búza	Mcst. fért. búza	Egészs. „Luja”	Egészs. „Laari”
JOKIOINEN
K	6,0	10,1	7,4	34,2	20,6	5,7
B	0,9	2,0	2,1	1,0	1,4	0,7
J76PK	2,2	1,5	2,7	7,0	6,2	2,8
J76PN	1,2	1,9	3,9	1,3	5,7	4,6
MIETOINEN
K	12,8	3,5	20,4	72,0
B	1,3	0,6	5,7	6,6
J76PK	10,1	0	17,2	42,5
J76PN	9,1	0,3	13,7	14,3
PÁLKÁNE
K	9,6	7,4	10,9	26,9
B	2,5	3,3	2,1	0,6
J76PK	5,3	2,6	4,8	6,1
J76PN	3,9	3,8	3,9	2,7

XI. táblázat

A J76 porkészítménnyel 1993 nyarán végzett szántóföldi kísérletek hozameredményei

	Árpa	Zab	Tcrm fért. búza	Mcst. fért. búza	Egészs. „Luja”	Egészs. „Laari”
JOKIOINEN
K	7460	6650	6060	2950	6100	6360
B	7500	6790	5870	5690	5940	6060
J76PK	7610	6940	6060	5140	6400	6320
J76PN	7610	6970	6040	6020	6000	6400
MIETOINEN
K	5900	5780	4920	3890
B	6070	5200	4910	4990
J76PK	6000	5670	4770	4620
J76PN	6110	5760	4790	4950
PÁLKÁNE
K	4670	5560	3630	2950
B	4550	5200	4190	4000
J76PK	4730	5560	3600	3390
J76PN	4870	5470	3660	3760

HU 220 838 Bl

1993-ban teszteltük a J76 törzsből előállított külön- E kísérletek eredményeit a XII-XVIII. táblázatokban böző készítmények különféle gombák elleni hatását is. mutatjuk be.

XII. táblázat

A J76 törzs Polkka búzára gyakorolt védőhatása Gaeumannomyces gombával fertőzött homoktalajon végzett kísérletben (a teszteket védett cserepekben végeztük)

Kezelés	Kibújt csíranövcny	Egészséges csíranövény	Betegség- index	Friss tömeg
	(%)	(%)	(0-3)	g/ismctlcs	g/csíranövény
Kontroll (J76 kezelés nélkül)	78,7	65,3	0,76	5,8	0,28
J76KF száraz csávázás (8 g/kg)	81,3	76,0	0,55	10,1	0,46
J76 folyadékcsávázás 10⁶ cfú/ml	90,7	81,3	0,31	10,4	0,43

Kf= szilárd fázisú készítmény (4. készítmény) Betegségindex: 0=egészséges 1 = enyhe megbetegedés 2=súlyos megbetegedés 3=a csíra nem bújt ki

XIII. táblázat

A J76 Fusarium culmorum gomba elleni hatása Polkka búzán (a tesztelést cserepekben, tőzeg alkalmazásával végeztük)

Kezelés	Kibújt csíranövény	Egészséges csíranövcny	Bctegscg- index	Friss tömeg
	(%)	(%)	(0-3)	g/ismctlcs
Egészséges	91	84	0,37	16,2
Betegségkontroll	30	5	2,54	4,5
J76 KF, 40/931 folyadékcsávázás, 10⁶ cfú/ml	72	44	1,17	14,0
J76 R 10/2 C folyadékcsávázás, 10⁶ cfu/ml	71	49	1,21	13,0
J76 Μ, 10⁶ cfú/ml	76	58	0,99	14,8

KF=szilárd fázisú készítmény (4. készítmény) R=folyadckban rázatott tenyészet (1. készítmény)

M=arányos tenyészetből származó mikroorganizmusok Betegségindex: lásd fentebb

XIV. táblázat

A J76 törzs hatása uborkán, Pythium gomba ellen (az eredmények a három, cserépben végzett teszt [pH=6,2; pH=6,9 és pH=7,4] átlagát jelentik)

Kezelés	Élő csíranövények %-os aránya	Betegségindex (0-2)	Friss tömeg g/ismétlés
Egészséges	98	0,04	12,1
Betegségkontroll	47	0,63	5,4
J76 folyadékcsávázás 10⁶ cfú/ml	58	0,52	6,9

Betegségindex: 0= egészséges 1 = elpusztult 2=ncm bújt ki

HU 220 838 Bl

XV. táblázat

A J76 gombatörzs karfiolra gyakorolt védőhatása Rhizoctonia solani gombával fertőzött homoktalajon (melegházban, cserepekben végzett teszt)

Kezelés	Kibújt csíranövény	Egészséges csíranövény	Friss tömeg
	(%)	(%)	g/ismétlés	g/csíra
Kezeletlen	92,7	52,0	21,7	0,79
J76 folyadékcsávázás (10⁷ cfú/ml)	94,7	72,0	24,1	0,84

XVI. táblázat

A J76 gombatörzs „Kustaa” árpára gyakorolt védőhatása Fusarium nivale gombával fertőzött homoktalajon, szabadban, védett helyen elhelyezett cserepekben végzett kísérletekben

Kezelés	Kibújt csíranövény	Egészséges csíranövény	Bctegscg- index	Friss tömeg
	(%)	(%)	(0-3)	g/ismétlés
Egészséges	93,3	37,3	0,91	8,9
Betegségkontroll	73,3	29,3	1,43	7,8
J76 KF folyadékcsávázás (10⁶ cfu/ml)	80,0	52,0	0,91	9,7
J76 folyadékcsávázás (10⁶ cfú/ml)	81,3	52,0	0,93	10,3

Betegségindex: 0=egészséges 1 = enyhe megbetegedés 2=súlyos megbetegedés 3=a csíra nem bújt ki

XVII. táblázat

A J76 gombatörzs Altemaria brassicicola elleni hatása karfiolon (az eredmények három különböző kísérleten (15° C, 20° C és 25° C) végzett kísérletek átlagát reprezentálják)

Kezelés	Kibújt csíranövények (%)	Betegségindex (0-3)	Friss tömeg g/ismétlés
Egészséges	96	0,17	33,2
Betegségkontroll	50	2,01	21,8
J76 folyadékcsávázás(10⁶ cfú/ml)	96	0,22	35,4

Betegségindex: O=egészséges 1 = enyhe megbetegedés 2=súlyos megbetegedés 3=elpusztult vagy nem bújt ki.

A találmány szerinti öt Nectria pityrodes törzs (J76, J1431, J1432, MOS1 és ROS2) Fusarium culmorum elleni, búzán mutatott hatásának vizsgálatára végzett kísérletek eredményeit a XVIII. táblázatban mutatjuk be. 50

Az eredményeket két kísérlet átlagaként adjuk meg (az egyik kísérletben tőzegtalajt, a másikban szántóföldi talajt alkalmaztunk).

XVIII. táblázat

Az öt Nectria pityrodes törzs (J76, J1431, J1432, MOS1 és ROS2) Fusarium culmorum elleni hatása búzán (az eredmények két, tőzeggel és szántóföldi talajjal cserépben végzett teszt átlagát reprezentálják)

Kezelés	Egészséges csíranövények (%)	Betegségindex (0 3)	Friss tömeg (g/ismetlés)
Betegségkontroll	23	2,06	3,0
J76 folyadékcsávázás (10⁷ cfu/ml)	73	0,66	8,0

HU 220 838 Bl

XVI11. táblázat (folytatás)

Kezelés	Egészséges csíranövények (%)	Betegségindex (0-3)	Friss tömeg (g/ismétlés)
J143 folyadéké sávázás (10⁷ cfu/ml)	80	0,51	8,5
J1432 folyadékcsávázás (10⁷ cfu/ml)	72	0,78	8,0
MOS! folyadékcsávázás (10⁷ cfu/ml)	76	0,66	8,8
ROS2 folyadékcsávázás (10⁷ cfu/ml)	76	0,66	8,3

Betegségindex: 0=egészséges 1 = enyhe megbetegedés 2=súlyos megbetegedés 3=ncm bújt ki.

3. példa

A J76 törzs hatásmechanizmusa

A J76 gombatörzs egyéb gombák antagonistájaként való működésének hatásmechanizmusát mikroszkópos megfigyelésekkel és laboratóriumi tesztekkel vizsgáltuk.

A J76 törzs és a Fusarium culmorum gomba hifáinak kölcsönhatásait mikroszkóp alatt megfigyelve az első megkülönböztethető reakciók nagyon gyorsnak tűnnek. A micéliumok érintkezési pontjainál a Fusarium hifáinak sejtjei az érintkezés megtörténte után körülbelül egy óra múlva láthatóan kezdenek lebomlani. Először a sejtfalak elveszítik alakjukat, majd a sejtek kiürülnek, és végül a sejtfalak teljesen lebomlanak. A Fusarium hifáinak lebomlása az érintkezési pontoktól kiindulva lassan terjed előre. Ha a J76 és az F. culmorum gombákat néhány napig összekeverve növesztjük, a Fusarium hifái eltűnnek. A J76 hatására spórái (a konidiumok és a chlamydospórák egyaránt) szintén lebomlanak, de lassabban, mint a hifák. A J76 hifák rendszerint szorosan a Fusarium-spóiák köré csavarodnak, mielőtt azok lebomlanának. Nincs arra utaló tapasztalatunk, hogy a J76 gomba ténylegesen behatolna a Fusarium-hifákba.

A mikroszkópos megfigyelések alapján arra következtethetünk, hogy a J76 valószínűleg biológiailag aktív anyagokat választ ki környezetébe. Ezek az anyagok - természetüket tekintve - enzimek vagy antibiotikumok lehetnek. A J76 fő hatásmechanizmusa ezek termelődésén alapulhat, hiszen más gombákkal szemben közvetlen parazitizmust nem tapasztaltunk, és mivel a J76 gomba lassú növekedésű, a tápanyagokat illetően nyilvánvalóan nem lehet hatásos kompetitor. Celofánteszt alkalmazásával olyan anyagcseretermékek termelődésének nyomait figyeltük meg, amelyek befolyásolják más gombák növekedését.

Ha a J76 és a F. culmorum nagyon vékony táptalajon közvetlenül egymás mellett növekszik, gátlási zóna alakul ki, amelyben a Fusarium növekedése megáll. Normális vastagságú táptalajon ez nem tapasztalható, ami feltehetően a táptalajba diffundáló anyagok kis koncentrációjának köszönhető. A J76 által kiválasztott illékony anyagok szintén gyenge hatást gyakoroltak a F. culmorumra.

Celofánteszt

A táptalajra celofánfóliát helyeztünk, és a J76 törzset ezen tenyésztettük. Tíznapos tenyésztés után a fóliát és vele együtt a gombákat eltávolítottuk. A J76 által kiválasztott és a fólián áthatolt anyagok a táptalajban maradtak. Kontrollként olyan lemezeket alkalmaztunk, amelyek J76 nélkül csupán celofánt tartalmaztak. A celofánteszt eredményeit a XIX. táblázatban mutatjuk be.

XIX. táblázat

A J76 gomba által termelt anyagcseretermékek hatása a celofántesztben F. culmorumra (növekedési sebesség, mm/nap)

J76	2,5
Kontroll	6,2

4. példa

A szelektálást eljárás elvégzése és az eredmények értékelése Homoktesztek Vetötalaj

A gabonaszemek elvetéséhez 0,2-0,7 mm szemcseméretű homokot (Kauniston Sora Oy, Loimaa) alkalmaztunk. A homokot négy rész homok és egy rész víz összekeverésével megnedvesítettük. Virágcseréptartó lemezből (Vefi-VP 96) 5x7 darab (egyenként 50 mles) cserepet befogadó lemezt vágtunk ki, amelyet műanyag dobozba helyeztünk. A cserepekbe annyi nedvesített homokot töltöttünk, hogy felső szélüknél 1-1,5 cm szabadon maradjon. Mindegyik cserépbe három „Luja” tavaszi búzaszemet tettünk.

Kezelések

Fertőzés Fusarium culmorummai

Fusarium culmorumot. szobahőmérsékleten, PDA lemezeken körülbelül egy hónapig (a spórák kialakulásáig) növesztettünk. A micéliumokat a spórákkal együtt elkülönítettük a lemeztől, és Ultra-Turrax homogenizáló készülék alkalmazásával desztillált vízzel elegyítettük. Az elegyben a spórák mennyiségét 10⁶ spóra/ml-re állítottuk be. Az oldatot Minigrip-tasakokban, 30 ml-es adagokban -20 °C-ra fagyasztottuk. A teszt el12

HU 220 838 Bl végzéséhez a lefagyasztott oldatokat feloldottuk és újra felkevertük. Az oldatot változtatás nélkül (törzsoldat) és IO^-2 hígításban alkalmaztuk. A Fusarium törzsek patogenitását úgy tartottuk fenn, hogy a gombákat növényről növényre vittük át (a búzaszemeket Fusariumszuszpenzióval beoltottuk, és a patogént a megbetegedett csírákról újra izoláltuk).

Antagonista szuszpenzió

Fagyasztóból kivett PDA üledéket (amely tartalmazta az antagonistát) három részre osztottunk és három PDA lemezre helyeztünk. A lemezeket sötétben, szobahőmérsékleten körülbelül három hétig inkubáltuk. Az antagonista törzsoldatot úgy készítettük, hogy két antagonista lemezt 50 ml vízbe kapartunk, s az így kapott elegyet Ultra-Turrax homogenizáló készülékkel összekevertük. A törzsoldatból 10-* és 10~³ hígításokat készítettünk.

A magok kezelése

A cserepekbe vetett magvakra először 1 ml F. cul/nort/zn-szuszpenziót, majd 1 ml antagonista szuszpenziót pipettáztunk. Öt 50 ml cserépben összesen 15 magot mind a hat lehetséges spóradenzitású szuszpenzióval kezeltük (a F. culmorum-szuszpenzió két hígítása és az antagonista szuszpenzió három hígítása).

Kontrollkezelések

Az egyes gombák teszteléséhez alkalmazott cserépsorozatokban öt újabb cserépbe összesen további 15 magvat tettünk, melyeket csak a tesztelt gombából készített törzsoldattal kezeltünk.

A homokban végzett tesztek során egyszerre 15-30 gombatörzset teszteltünk. A tesztek beindításakor egy külön cseréptartó lemezen lévő cserepekbe is vetettünk magvakat, aminek segítségével ellenőriztük a magvak egészségi állapotát és a betegséget okozó F. culmorum patogenitását. Három külön lemezen három kontrollkezelést végeztünk: beoltás nélkül (csak vízzel); F. cuZ/woru/n-törzs-oldattal végzett beoltással; és az F. cMÓworwM-törzs-oldat hígításával (10 ²) végzett beoltással. E három kezelés mindegyikéhez 10-10 cserépbe 30-30 magot ültettünk.

Növesztési feltételek

A gombaszuszpenziók pipettázása után a magvakat benedvesített homokkal lefedtük. A cserépsorozatokat tartalmazó dobozokat átlátszó műanyaggal becsomagoltuk és nevelőkamrába tettük (10-15 °C, 14 órás megvilágítási periódus).

Megfigyelések

A csíranövényeket 16-18 napig neveltük, majd folyó csapvíz alatt tisztára mostuk, és megvizsgáltuk a betegség tüneteit. Egészségesnek tekintettük azokat a csíranövényeket, amelyekben a gyökér- vagy koleoptilsejtek nem sötétültek meg, illetve azokat a magvakat, amelyek nem csíráztak ki és kemények maradtak. A jól elhatárolható tüneteket mutató csíranövényeket és a ki nem csírázott, megpuhult magvakat betegnek tekintettük.

Elsőként a kontrollkezelésnek alávetett növényeket vizsgáltuk meg. Amennyiben a vízzel kezelt magvakból csak egészséges növények fejlődtek, és mindkét patogénnel eltérő betegségtüneteket kaptunk, a tesztet elfogadtuk, és a tesztelendő gombatörzsekkel kezelt növényekkel megfigyeléseket végeztünk.

A homokon végzett tesztben az egyes izolált gombatörzsek minősítését a kérdéses gombával kezelt és betegnek ítélt növények száma alapján határoztuk meg. Ha a gombával kezelt növények csírázása az egészséges kontrolihoz képest csak csekély mértékben is csökkent, vagy ha egyéb, betegségre utaló tüneteket észleltünk, a gombát a további teszteléshez alkalmatlannak minősítettük. Ha károsodást nem tapasztaltunk, a patogén spóradenzitásának és a tesztelni kívánt gomba spóradenzitásának hat kombinációjával végzett teszteket az alábbi skála alapján minősítettük:

0=mind a 15 növény egészséges;

= maximum 2 beteg növény;

2=3-5 beteg növény;

3=6-9 beteg növény;

4=10-13 beteg növény;

5=legfeljebb egy növény egészséges.

A fenti hat fokozat alapján kiválasztottuk azokat a tesztelt gombatörzseket, amelyeket a következő tesztelési lépésben, azaz a tőzegtesztben alkalmaztunk. A folytatáshoz azokat a törzseket tekintettük megfelelőnek, amelyek a minősítés során legalább háromszor 0 és 1 értéket kaptak. Ha a gomba egyszer sem kapott 0 értéket, a folytatáshoz csak akkor tekintettük megfelelőnek, ha legalább négyszer 1 értéket adott.

Tőzegteszt

Táptalaj

Táptalajként kigőzölt, trágyázott és mésszel kezelt tőzeget alkalmaztunk. 1992 őszéig Torronsuoból származó, rostálatlan, nyerstőzeget, később Eurajokiból származó, rostált, nyerstőzeget alkalmaztunk. A trágyázáshoz a tőzeg 100 literére vonatkoztatva 800 g dolomit mész és 100 g Y-lannos (finn univerzális trágya) keverékét alkalmaztuk. A megnedvesített tőzeget körülbelül 5 cm-es rétegben műanyag dobozokba (28,5x49,5x9,4 cm, Weibulls Robusta „Mammut” doboz, Muoviyhtymá Oy) tettük. A doboz alján műanyag fólia volt.

Kezelések

T=egészséges, patogénnel nem oltott mag, „Luja” tavaszibúza. Desztillált vízzel öntöztük.

F=F. culmorummal beoltott mag. A magvakat F. cw/tfjoraffj-törzs-oldatban (10⁶ spóra/ml) áztattuk (az oldatot feleslegben alkalmaztuk). A Fusarium tenyésztését lásd a homoktesztnél. A kezelés után a magvakat papírra terítve egy éjszakán át száradni hagytuk.

F0=az F kezeléshez hasonlóan a magokat F. culmorummal oltottuk be. A magvakat megszáradásuk után az antagonista törzsoldattal nedvesítettük meg. A törzsoldatot úgy készítettük, hogy egy antagonista lemezről 25 ml desztillált vízbe kapartuk a micéliumokat és a spórákat. A kezeléshez a magvakat és az antagonista

HU 220 838 Bl törzsoldatot egy kis műanyag palackban összeráztuk. Ezután a magvakat papíron szárítottuk.

F2 = az F kezeléshez hasonlóan a magokat F. culmorummaX oltottuk be. Az antagonista kezelést az antagonista törzsoldat 10² hígításával végeztük.

A tőzegben 10 sort vetettünk be, soronként 30 maggal. A vetési sorrend az alábbi volt: védősor, F, FO, F2, T, F, FO, F2, T, védősor. A magokat elvetésük után tőzeggel letakartuk, és a dobozokat megnedvesítettük.

Növesztést feltételek

A növesztést körülbelül 15 °C-on melegházban végeztük. Nem megfelelő természetes fény esetén naponta 12 órás megvilágítást biztosítottunk. Szükség esetén a tőzeget vízzel öntöztük. A növesztést 18 napig végeztük.

Minősítés

A csíranövényeket lemostuk, és a homokteszthez hasonlóan megfigyeltük a betegségre utaló tüneteket. A T és F kezelés esetében kapott megfigyelések alapján a tesztet akkor fogadtuk el, ha az egészséges kontroliban (F) a 60 elvetett magból legfeljebb 12 beteg növény fejlődött, és a patogén kontroliban (F) legalább 52 beteg növény volt (60 magból). A tesztelt gombatörzset akkor vittük a következő tesztbe (szántóföldi talajteszt), ha a két különböző koncentrációjú oldat egyikével kezelt magokból legfeljebb 19 beteg növény fejlődött (60 magból).

Szántóföldi talajjal végzett tesztek

Táptalaj

Az alkalmazott talajt (homokos agyag) Jokioinen szántóföldi kísérleti területéről hoztuk. A földet kézzel vagy (1992-93 telén) lxl cm-es rostán morzsoltuk össze. A földet 14 cm átmérőjű, 1,5 literes műanyag cserepekbe töltöttük úgy, hogy a cserepekben a felső 34 cm szabadon maradjon. A cserepek aljára szűrőpapírt helyeztünk.

Kezelések

1. Egészséges magvak; desztillált vízzel nedvesítettük.

2. Ft/sar/n/n-kontroll: a magvakat a Fusarium-o\íóanyaggal (elkészítését lásd a homoktesztnél; körülbelül 10⁶ spóra/ml) nedvesítettük. Az oldatot feleslegben alkalmaztuk.

3. A magvakat a Fí«arzúw-kontrollhoz hasonlóan oltottuk be. Megszáradásuk után a magvakat antagonista szuszpenzióval kezeltük, melyet az antagonista micéliumainak és spóráinak 25 ml desztillált vízben végzett elegyítésével készítettünk. A kezelést műanyag palackban, 1 ml (vagy 1,5 ml) antagonista szuszpenzióban 130 (120-150) maggal végeztük.

4. Fungicid-kontroll: a magvakat a Fusarium-kontrollhoz hasonlóan oltottuk be. Megszáradásuk után a magvakat 1 kg magra számítva 2 g Baytan I csávázóporral kezeltük. Korábban Ceresan- és Táyssato S-kezelést is alkalmaztunk.

A kezelt magokat cserepekbe ültettük (cserepenként 36 magot). Mindegyik kezelést háromszori ismétléssel végeztük. A magvakat szántóföldi talajjal fedtük le. A növesztéshez a tőzegtesztben leírt feltételeket alkalmaztuk, és körülbelül négy hétig végeztük.

Vizsgálat és minősítés

A csíranövényeket lemostuk, és értékeltük betegségük mértékét:

0=teljesen egészséges;

= enyhe Fusarium okozta károsodás;

2=mérsékelt-súlyos megbetegedés;

3=a csíranövények teljesen megbámulták, elpusztultak.

A melegházi tesztek hatékonysága

1993 nyarán egy széles körű szántóföldi kísérletben teszteltük a találmány szerinti szelekciós eljárás hatékonyságát. A teszt során azt vizsgáltuk, hogy 1991 októ bere és 1993 februárja között végzett izolált törzsek közül a megfelelőket választottuk-e ki a további tesztekhez. A magok kezeléséhez önkényesen 60 törzset választottunk ki azok közül, amelyeket a homokteszt után elhagytunk, és amelyek nem voltak patogének a búzára. A tőzegteszt után kihagyott törzsek közül 92 törzset alkalmaztunk. A talajteszthez kiválasztott 58 gombát is bevontuk a tesztekbe (ezek közül 43-at elhagytunk a talajteszt után, míg a talajteszt alapján 15-öt a szántóföldi kísérletekhez választottunk ki).

Az említett, összesen 210 kezelésen kívül a teszt során hat kontrollkezelést is végeztünk: kezelés nélkül (K), Baytan I-csávázás (B), valamint a korábbi tesztekben kezelt négy gombatörzzsel végzett kezelés.

A tesztelés során F. culmorummaX természetesen fertőzött „Luja” búzát alkalmaztunk. Megfigyelési egységként 1,4 m hosszú sort 5,5 g maggal vetettünk be. A 216 kezelést egyenként hat ismétléssel végeztük. A teszt randomizálását kísérleti kockarács-elrendezés szerint valósítottuk meg. Ezzel a módszerrel a talajtényezőknek betudható hibavariációt lecsökkentettük. A vetéstől számítva körülbelül öt hét elteltével a csíranövényeket kivettük a talajból, megszámoltuk, és tanulmányoztuk a betegségre utaló tüneteket.

A teszt eredményeit a 3a-3d. ábrákon, oszlopdiagramokon mutatjuk be. A tőzegteszt után kiselejtezett izolátumok és a homokteszt után elhagyott, nem patogén izolátumok között semmilyen különbséget nem találtunk. A tőzegteszt nyilvánvalóan igen jól működött. A tőzegtesztben a további tesztekhez kiválasztott törzsek általában egyértelműen jobbak voltak, mint azok, amelyeket kihagytunk a további tesztelésből.

A homokteszt és a tőzegteszt során viszonylag kevés olyan gombát selejteztünk ki, amelyet meg kellett volna tartani. Ezzel szemben, a talajtesztben a legjobb izolátumok közül sokat kiselejteztünk, de a szántóföldi kísérletekben vizsgált törzsek esetében természetes körülmények között 15 közül csak kettő mutatott károsító hatást.

Ezekből az eredményekből arra következtethetünk, hogy a homokteszt és a tőzegteszt alapján a további vizsgálatokhoz megbízhatóan kiválaszthatjuk a legjobb antagonistákat, a talajtesztben azonban előfordulhat, hogy a legjobb antagonistákat selejtezzük ki.

HU 220 838 Bl

A J1431 gombatörzs tesztelése szelekciós tesztekben

A találmány szerinti gombatörzsek közül a J1431 törzset mind a három, melegházban végzett szelekciós kísérletben teszteltük.

A homoktesztben a J1431 törzs 0, 0, 1,1, 1 és 2 értékeket kapott, s a későbbi tesztekben tovább vizsgáltuk.

A tőzegtesztben a J1431 törzzsel az alábbi eredményeket kaptuk:

T: 3 beteg;

F: 36 beteg;

FO: 3 beteg;

F2: 7 beteg.

A szántóföldi talajtesztben a megbetegedett csíranövények aránya a különböző kezelések esetében eltérő volt:

egészséges:	66%
Fzziarzzzzzz-kontroll:	87%
Baytan I-csávázás:	31%
J1431	19%.
A szelekciós tesztek eredménye alapján 1993 nya-

rán a J1431 törzset 61 másik gombatörzzsel együtt szántóföldi kísérletnek vetettük alá. A tesztben a F. culmorum spóraszuszpenziójával mesterségesen megfertőzött „Luja” tavaszi búzát alkalmaztunk. A magvakat egysoros (1,4 m) parcellákba vetettük, és a tesztelést hat ismétléssel végeztük. A vetéstől számítva 34 nap elteltével a csíranövényeket kivettük a földből, lemostuk, és megfigyeltük a betegség tüneteit. A különböző kezelési csoportokban az egészséges csíranövények mennyisége (a sorok hosszúságára vonatkoztatva) az alábbiak szerint alakult:

Fuizzrz'zzzn-kontroll 5,9 darab/m

Baytan I-csávázás 56 darab/m

J76 61 darab/m

J1431 65 darab/m egyéb tesztelt törzsek 30-68 darab/m

A J1432 gombatörzs tesztelése szelekciós tesztekben

A J1432 törzset mind a három, melegházban végzett szelekciós kísérletben teszteltük.

A homoktesztben a J1432 törzs 0, 0, 0, 1, 1 és 2 értékeket kapott, és a későbbi tesztekben tovább vizsgáltuk.

A tőzegtesztben az alábbi eredményeket kaptuk:

T: 10 beteg;

F: 60 beteg;

F0: 10 beteg;

F2: 37 beteg.

A szántóföldi talajtesztben a különböző kezelési csoportokban a megbetegedett csíranövények százalékos aránya az alábbiak szerint alakult:

egészséges:	56%
F«5flrzü/M-kontroll	98%
Baytan I-csávázás	18%
J1432	38%
A szántóföldi talajteszt eredményei alapján
J1432 törzset kihagytuk a	szántóföldi kísérletekből.

Letétbe helyezett mikroorganizmusok A Budapesti Szerződés értelmében az alábbi mikroorganizmusokat a DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-nál (Mascheroder Weg 1/b, D-38124 Braunschweig, Németország) helyeztük letétbe:

Mikroorganizmus	Deponálási szám	Dátum
Nectria pityrodes Montagne J76	DSM 7522	1993. 03. 15.
Nectria pityrodes Montagne J1431	DSM 8805	1993. 12. 10.
Nectria pityrodes Montagne J1432	DSM 8806	1993. 12. 10.
Nectria pityrodes Montagne MOS1	DSM 8807	1993. 12. 10.
Nectria pityrodes Montagne ROS2	DSM 8808	1993. 12. 10.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. A DSM 7522 deponálási számú Nectria pityrodes Montagne J76 gombatörzs biológiailag tiszta tenyészete.

2. A DSM 8805 deponálási számú Nectria pityrodes Montagne J1431 gombatörzs biológiailag tiszta tenyészete.

3. A DSM 8806 deponálási számú Nectria pityrodes Montagne J1432 gombatörzs biológiailag tiszta tenyészete.

4. A DSM 8807 deponálási számú Nectria pityrodes Montagne MOS1 gombatörzs biológiailag tiszta tenyészete.

5. A DSM 8808 deponálási számú Nectria pityrodes Montagne ROS2 gombatörzs biológiailag tiszta tenyészete.

6. Biofungicid, azzal jellemezve, hogy a DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807, illetve DSM 8808 deponálási számú Nectria pityrodes J76, J1431, J1432, MOS1, illetve ROS2 törzs legalább egyikét tartalmazza.

7. Biofungicid készítmény, azzal jellemezve, hogy a DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807, illetve DSM 8808 deponálási számú Nectria pityrodes J76, J1431, J1432, MOS1, illetve ROS2 törzs legalább egyikét hagyományos vivőanyagokkal és/vagy adalék anyagokkal együtt tartalmazza.

8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett vivőanyagként és adalékanyagként szilícium-dioxidot, tejport, karboxi-metil-cellulózt, szacharózt, aszkorbinsavat vagy keményítőt tartalmaz.

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy előállításához az alábbi eljárást alkalmazzuk, melynek során

a) megfelelő tápközegben egy, az 1 - 5. igénypontok bármelyike szerinti gombatörzset növesztünk, a sejtmasszát elkülönítjük, vivőanyagokat és/vagy adalékokat adunk hozzá, szárítjuk, és porrá őröljük; vagy

b) megfelelő tápközegben, szilícium-dioxiddal egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti gombatörzset

HU 220 838 Β1 növesztünk, és kívánt esetben vivőanyagokat és/vagy adalékokat adunk hozzá, majd a sejtmasszát szárítjuk és porrá őröljük.

10. Eljárás gombafertőzés gátlására növényben, azzal jellemezve, hogy a növényt vagy magjait egy, a 6. 5 igénypont szerinti fungiciddal vagy a 7-9. igénypontok bármelyike szerinti fungicid készítménnyel kezeljük, vagy az említett fungicidot vagy fungicid készítményt a magok elvetése előtt vagy után a táptalajhoz adjuk.

11. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti Nectria pityrodes törzs alkalmazása peszticidként.

HU 220 838 Bl lnt.Cl.⁷: C 12N 1/14 iegbetegedett csíranövények %-os aránya .γ A megbetegedett csíranövények %-os aránya

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

A csíra kibújásától eltelt napok száma < 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

A csíra kibújásától eltelt napok száma

2. ábra