PL179895B1

PL179895B1 - Biologicznie czyste szczepy grzyba Nectria pityrodes Montagne, srodki grzybobójcze i sposób otrzymywania srodka grzybobójczego PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL179895B1
Application number: PL95315659A
Authority: PL
Inventors: Risto Tapio Tahvonen; Milja Tuulikki Keskinen; Marjaleena Lahdenpera; Pekka Tapani Seiskari; Esa Petri Teperi; Ulla Anita Tuominen
Original assignee: Kemira Agro Oy
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2000-11-30
Also published as: AU686311B2; PT742816E; FI95598C; MD1651F2; CZ289942B6; WO1995020646A1; FI95598B; EP0742816A1; LV11746A; EP0742816B1; NZ278907A; SK97396A3; FI940463A0; CN1144534A; NO963178D0; FI940463A; US5811090A; RU2154381C2; HU9602091D0; CZ219096A3

Abstract

1. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J76 o numerze depozytu 7522. 2. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J1431 o numerze depozytu 8805. 3. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J1432 o numerze depozytu 8806. 4. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne MOS1 o numerze depozytu 8807. 5. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne ROS2 o numerze depozytu 8808. 6. Srodek grzybobójczy, znamienny tym, ze zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której naleza szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808. 7. Srodek grzybobójczy, znamienny tym, ze zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której naleza szczepy grzybów J76, J 1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808, i nosniki i/lub srodki dodatkowe korzystnie wybrane z grupy, do której nalezy krzemionka, mleko w proszku, karboksymetyloceluloza, sacharoza, kwas askorbinowy i skrobia. 8. Sposób otrzymywania srodka grzybobójczego, znamienny tym, ze hoduje sie szczep grzyba Nectria pi- tyrodes Montagne dobrany z grupy, do której naleza szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o nu- merach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808 w pozywce wzrostowej, korzystnie z dodatkiem krzemionki, oddziela sie mase komórkowa, korzystnie dodaje sie do niej no- sniki i/lub srodki dodatkowe, a nastepnie mase te suszy sie i poddaje sproszkowaniu. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest biologiczne zwalczanie chorób roślin, w szczególności nowe drobnoustroje, należące do rodzaju Nactria, i ich zastosowanie do zwalczania zakażeń grzybiczych u roślin. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również preparaty, zawierające nowe szczepy rodzaju Nectria i ich zastosowanie w tym celu. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również sposób dobierania drobnoustrojów skutecznie zwalczających te zakażenia ze szczepów drobnoustrojów wyizolowanych z gleby.

Roślinom uprawnym zagrażająróżne choroby, wywoływane przez grzyby, bakterie i wirusy, jak również owady szkodniki. Opracowano wiele technicznych, chemicznych i biologicznych sposobów zwalczania tych chorób i szkodników. Celem tych sposobów jest zapobieganie ilościowym i jakościowym stratom roślin uprawnych, spowodowanym przez choroby roślin i szkodniki.

Ogólnie rzecz biorąc, termin “biologiczne zwalczanie chorób roślin” oznacza zwalczanie patogenów roślin przez inne organiczny, zwane również środkami walki biologicznej (biological control agents - BCA). Produkty opracowane na podstawie BCA zwane są często biopestycydami. Sposoby biologicznego zwalczania chorób roślin są różne, często oparte na współdziałaniu kilku różnych mechanizmów. Zwalczanie chorób roślin może być oparte na działaniu metabolitów inhibitorowych, wytwarzanych przez taki środek; niekiedy środek ten może zakażać organizm patogenny lub współzawodniczyć z nim o dostępną przestrzeń lub substancje odżywcze.

179 895

Potrzeba odkrycia nowych środków walki biologicznej jest tym większa, że wiele z tradycyjnych środków walki chemicznej okazało się szkodliwymi dla środowiska i dla ludzi. Niekorzystną cechą środków chemicznych jest również to, że wiele szkodników i drobnoustrojów patogennych uodporniło się na działanie jednego lub nawet wielu z nich. Rozwój oporności na biopestycydy jest natomiast niemożliwy, ponieważ ich działanie oparte jest na kilku rozmaitych mechanizmach.

Środki chemiczne działają zwykle szybciej i skuteczniej, niż biopestycydy. Biopestycydy natomiast działają często dłużej, niż środki chemiczne, ponieważ ich działanie oparte jest na żywotnych i zdolnych do reprodukcji drobnoustrojach.

Najważniejszą grupą biopestycydów stanowią produkty bakteryjne, skierowane przeciwko owadom. Najpowszechniej stosuje się biologicznie środki owadobójcze, oparte na bakterii Bacillus thuringiensis. W Finlandii wytwarza się biologiczny środek grzybobójczy, oparty na promieniowcach Streptomyces, wykazujących skuteczne działanie przeciwko wielu, pochodzącym z gleby i z nasion, grzybiczym zakażeniom roślin. Z nieszkodliwego grzyba powodującego zgorzel drewna, Phlebia gigantea, wytworzono produkt, który może zapobiegać rozprzestrzenianiu się zgnilizny drewna (powodowanej przez Heterobasidion annosum) w lasach iglastych.

Przeprowadzono wiele badań nad bakteriami z rodzaju Pseudomonas, szczególnie gatunku Pseudomonas fluorescens; obecnie znane jest wiele szczepów p. fluorescens o działaniu grzybobójczym. Por. np. opublikowane zgłoszenia patentowe WO 92/18613, FI 92 1722 i WO 90/01327, jak również patent europejski 228/457.

Poszukując drobnoustrojów odpowiednich do biologicznego zwalczania chorób roślin, bada się przesiewowo liczne szczepy drobnoustrojów ze względu na ich aktyćność w zwalczaniu tych chorób lub ze względu na inną konkretną właściwość. W niektórych publikacjach patentowych omówiono kilka sposobów badań przesiewowych.

W patencie Stanów Zjednoczonych nr 4 647 533 opisano trój etapowy sposób badań, wktórym bakterie najpierw izoluje się z gleby o dużej zawartości zarodników szkodliwych grzyba Pythium. W drugim etapie prowadzi się badania przesiewowe wyizolowanej bakterii, w szklarni, hodując nasiona zbóż w glebie zawierającej dużą ilość zarodników Pythium i zawiesinę poszczególnych badanych bakterii, oraz, w próbce kontrolnej, w glebie zawierającej tylko zarodniki Pythium; na podstawie tego badania wybiera się te bakterie, w których obecności rośliny wytwarzaj ą większe liście i osiągają większe wymiary. W trzecim etapie wybrane bakterie poddaje się dalszej selekcj i w warunkach terenowych, w badaniu podobnym, j ak badanie w szklarni. Również w tym etapie dobiera się te bakterie, w których obecności rośliny wykazują najlepszy rozwój.

W zgłoszeniu patentowym FI nr 92 1722 stosuje się z kolei proces następujący. Najpierw hoduje się grzybnie szczepu Pythium na odpowiedniej pożywce wzrostowej, na grzybnie nakłada się warstwę jałowej gleby, do której dodaje się badany drobnoustrój i ocenia się jego wpływ na wzrost Pythium. W drugim etapie do próbki gleby dodaje się szczep Pythium wywołujący wysychanie, do gleby wysiewa się ziarno rośliny wrażliwej na zakażenie grzybicze i ocenia się wpływ badanego drobnoustroju na wzrost rośliny. Do dalszych badań dobiera się te substancję, które wykazująhamujące działanie na Pythium w obu wyżej wzmiankowanych badaniach.

Wynalazek ujawnia drobnoustrój z rodzaju Nectria, to znaczy Nectria pityrodes Montagne, co do którego stwierdzono, że jest bardzo aktywny, szczególnie przeciwko grzybom Fusarium. Wynalazek ujawnia również biologiczny preparat grzybobójczy, wytworzony ze szczepu drobnoustroju, zawierający jako składnik czynny, wyżej wymienione szczepy grzybów, należące do rodzaju Nectria, oraz ewentualnie środki dodatkowe lub nośniki, znane ze stanu techniki. Przykłady takich preparatów stanowią preparaty służące do zaprawiania nasion, sproszkowane lub granulowane preparaty do dodawania do podłóż wzrostowych lub preparaty płynne do obróbki gleby. Wynalazek ujawnia również nowy i skuteczny sposób badań przesiewowych szczepów grzybów, w którym stosuje się trój etapową sekwencję testową, a mianowicie test piaskowy, torfowy i test glebowy. Na każdym z etapów badania szczepy grzybów, które okazują się niesku4

179 895 teczne, eliminuje się z dalszych badań. Szczepy grzybów, które wykazały się najlepszymi właściwościami w czasie badań w szklarni, poddaje się następnie badaniom przesiewowym w warunkach terenowych.

W związku z powyższymi przedmiotami wynalazku są biologicznie czyste szczepy grzyba: Nectria pityrodes Montagne J76 o numerze depozytu 7522, Nectria pityrodes Montagne J1431 o numerze depozytu 8805, Nectria pityrodes Montagne J1432 o numerze depozytu 8806, Nectria pityrodes Montagne MOS1 o numerze depozytu 8807, Nectria pityrodes Montagne ROS2 o numerze depozytu 8808.

Kolejny przedmiotem wynalazku jest środek grzybobójczy charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest środek grzybobójczy charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DsM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808, i nośniki i/lub środki dodatkowe korzystnie wybrane z grupy, do której należy krzemionka, mleko w proszku, karboksymetyloceluloza, sacharoza, kwas askorbinowy i skrobia.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania środka grzybobójczego charakteryzujący się tym, że hoduje się szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DsM 7522, DsM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808 wpożywce wzrostowej, korzystnie z dodatkiem krzemionki, oddziela się masę komórkową, korzystnie dodaje się do niej nośniki i/lub środki dodatkowe, a następnie masę tę suszy się i poddaje sproszkowaniu.

Opis rysunków:

fig. 1 - doświadczenie badające zależność odpowiedzi od dawki, przeprowadzone z zastosowaniem J76 latem '92. Odsetek chorych kiełków przy zastosowaniu ziarna zakażonego grzybem F. culmorum.

K=nieleczone, B=zaprawa Baytan

J76-0=zawiesina zarodników J76,1,2 x 10⁷ cfu/ml

J76-1=zawiesina zarodników J76, 1,2 x 10⁶ cfu/ml

J76-2=zawiesina zarodników J76, 1,2 x 10⁵ cfu/ml

J76-3=zawiesina zarodników J76, 1,2 x 10⁴ cfu/ml;

fig. 2 - doświadczenie badające zależność odpowiedzi od dawki, przeprowadzone z zastosowaniem J76 latem '92. Odsetek chorych kiełków przy zastosowaniu ziarna zdrowego. Skóry identyczne, jak na fig. 1;

fig. 3a do 3d - histogramy przedstawiające wpływ izolatów grzybów, odrzuconych na poszczególnych etapach badań w warunkach szklarniowych na dobrostan kiełków w warunkach terenowych. K=nieleczone, B=zaprawa Baytan I.

Poniżej szczegółowo opisano szczepy grzybów według wynalazku. Omówiono ich izolowanie i charakterystykę oraz badanie ich skuteczności w warunkach terenowych. Opisano ponadto wytwarzanie biologicznych preparatów grzybobójczych z tych szczepów, charakterystykę preparatów i badania ich skuteczności. Opisano również sposób badania przesiewowego szczepów grzybów wyizolowanych z próbek gleby.

Izolowanie drobnoustrojów

W latach'89, '90 i '91 pobrano próbki gleby, w sumie około 190, z których izolowano szczepy grzybów według wynalazku. Próbki gleby pobierano w różnych częściach Finlandii, głównie w stacjach badawczych MTT (Ośrodek Badawczy Rolnictwa), z różnych typów gleby i różnych upraw. Próbki pobierano z głębokości warstwy korzeniowej (głębokość 0-15 cm). Z każdego pola pobierano kilka próbek, które następnie mieszano tak, aby wytworzyć próbki o obj ętości 1 -2 litrów.

179 895

Izolowanie przeprowadzano metodąrozcieńczenia (izolowanie z gleby) lub sposobem “rośliny - przynęty” (izolowanie z korzeni), które omówiono szczegółowo w dalszej części niniejszego opisu, w rozdziale “Sposoby”.

Charakterystyka drobnoustrojów

Szczepy grzybów, wyizolowane z próbek gleby, badano sposobami przesiewowymi według wynalazku, opisanymi poniżej w rozdziele “Sposoby”. Następnie wybrano pięć szczepów, wykazujących bardzo dobre działanie. Charakterystykę tych szczepów, nazywanych J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, złożono w Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baam, Holandia. Próbki szczepów zdeponowano, zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, w depozycie DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) pod numerami depozytów, odpowiednio, DSM 7522 (15 marca 1993), DSM 8805 (10 grudnia 1993), DSM 8806 (10 grudnia 1993), DSM 8807 (10 grudnia 1993) i DSM 8808 (10 grudnia 1993).

Charakterystyka morfologiczna drobnoustrojów jest następująca:

Morfologia: Sporodochia bezjałowych strzępek brzeżnych. Konidiofory wielokrotnie rozgałęzione, przy czym z każdego kolanka odchodzi kilka rozgałęzień. Rozgałęzienia końcowe posiadająokółki fialid, rozmieszczone w palisadowatej warstwie. Fialidy walcowate, o długości do 15 pm, z porem wierzchołkowym. Konidia wytwarzane w postaci łańcuszków lub śli skich kulek, o kształcie clipsoidalym do kroplowatego, z krótkim punktem przyczepienia, o wymiarach 7-8 x 4 wm, gładłkch ścianach, bez wypustek.

Pokrój kolonii: kolonia osiągająca na agarze z płatkami owsianymi w temperaturze 22°C w ciągu 7 dni średnicę 40 mm; hialina grzybni; strefy tworzenia zarodników pęcherzykowate, sporodochialne, zielone, rozmieszczone w koncentrycznych kręgach. Zapach niezbyt wyraźny, odwrotność kolonii bezbarwna, wysięk ograniczony, przejrzyste.

Budowa konidioforów szczepu J76 jest podobna do konidioforów Myrotbecium verrucaria, jednakże różni się od tego gatunku wytwarzaniem sporodochidów niebrzeżnych, konidiów w suchych łańcuchach i bez typowych wachlarzowatych wypustek.

Przedstawiciele rodzaju Gliocladium różnią się od nowych szczepów tym, że dla Gliocladium typowe jest wytwarzanie pojedynczych pędzelkowatych konidiofenów.

Tak -więc szczepy J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2 zidentyfikowano jako gatunek Nectria pityrodes Montagne.

Z tych szczepów można wytworzyć nie ulegające zepsuciu preparaty, łatwe do rozpylenia na plantacje wymagające zwalczania chorób roślin. Preparaty można wytwarzać np. w postaci proszku. Hodowlę drobnoustrojów można rozpocząć z inokulum, które, stanowi grudkę PDA zawierającązarodniki, którąprzechowuje się w temperaturze -80°C. Drobnoustrojów można hodować w postaci hodowli płynnej lub na pożywce stałej. Pożywka zawiera cukier, np. sacharozę, i azot, jak' również niewielką ilość innych środków odżywczych. W hodowli można stosować nieswoiste pożywki wzrostowe, np. Corn Steep Liquor (CSL), lub swoiste pożywki wzrostowe, np. GYM (glukoza 4 g/l, wyciąg z drożdży 4 g/l, ekstrakt słodowy 10 g/l), lub PDB (bulion z dekstrozaziemniaczaną). Wartość pH wynosi około 6,0, jest ona doprowadzana do tej wartości na początku, przed wyjałowieniem. Hodowlę prowadzi się mieszając przez 1 -2 tygodnie. Masę komórkową oddziela się od bulionu przez filtrowanie przez papier filtracyjny lub poprzez odwirowanie. Jeżeli hodowlę prowadzi się na pożywce płynnej, do masy komórkowej dodaje się nośnik, np. krzemionkę, mleko w proszku i/lub CMC (karboksymetylocelulozę). Masę suszy się w temperaturze pokojowej i miele na proszek.

Sposoby

Izolowanie drobnoustrojów:

a) metoda rozcieńczenia (izolowanie z gleby)

Zmieszano 10 g gleby ze 100 ml 0,5% agaru wodnego (Bactoagar). Z mieszaniny pobrano trzy próbki o objętości 10 ml i z każdej z nich wytworzono dwa rozcieńczenia (10- ,10²) w 0,5% agarze wodnym. Rozcieńczenia te mieszano (w łaźni wodnej) w mieszaczu, przez 20-30 minut. Na pustą szalkę Petriego naniesiono pipetą 1 ml rozcieńczenia i pokryto go 20 ml Littman Oxgall

179 895

Agar (LOA). Szalki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3-7 dni, po czym izolowano poszczególne grzyby do czystych hodowli na PDA (agar z dekstrozą ziemniaczaną).

b) metoda “rośliny-przynęty” (izolowanie z korzeni)

Glebą z jednej próbki wypełniano 15 doniczek w seryjnej płycie doniczkowej (seryjna płyta doniczkowa Vefi-VP 96 z doniczkami o objętości 50 ml). Do jednej doniczki wysiewano cztery ziarna pszenicy, cztery ziarna jęczmienia lub około 15 ziaren rzepaku; na każdy gatunek rośliny stosowano pięć doniczek. Ziarna pokrywano piaskiem, doniczki podlewano i inkubowano w komorze wzrostowej w temperaturze 15°C z zastosowaniem dnia 14-godzinnego. Po dwóch tygodniach hodowli rośliny zebrano i przepłukiwano pod bieżącą wodą lub oczyszczono szczotką bez użycia wody. Z korzeni pobrano niewielkie wycinki i umieszczono je na płytkach. Zastosowane pożywki: LOA (10 g peptonu, 10 g dekstrozy, 15 g Bacto-Oxgall, 0,01 g fioletu krystalicznego B, 0,03 g streptomycyny, 20 g agaru, woda do objętości 1000 ml), PCNB (15 g peptonu, 1 g KH2PO4,0,5 g MgSO4 · 7 H20,2 g Avicol, 3 ppm streptomycyny, 20 g agaru, woda do 1000 ml) i PDA-streptomycyna (39 g preparatu PDA, 300 ppm streptomycyny, woda do objętości 1000 ml). Po kilku dniach inkubacji wyizolowano poszczególne grzyby i prowadzono następną hodowlę na płytkach PDA.

Szczepy przechowywano na grudkach PDA w ampułkach (Nalgene 5000-0012, PP Sterile 1,2 ml) w temperaturze -80°C.

Przeprowadzenie testów szklarniowych badania przesiewowego

Test piaskowy

Ziarna roślin zbożowych wysiano na warstwę piasku. Najpierw grzybnie i zarodniki drobnoustroju patogennego, a następnie zarodniki badanego grzybka, w zawiesinie wodnej, przeniesiono pipetą na ziarna i podłoże wzrostowe, po czym ziarna pokryto piaskiem. Po dwóch i pół tygodniach badano nasilenie objawów chorobowych w kiełkach. Z następnych doświadczeń wykluczono te grzyby, które nie wpływały na nasilenie choroby, lub które same wykazywały działanie patogenne.

Test torfowy

Ziarna roślin zbożowych zwilżano zawiesiną zarodników patogenu i suszono. Następnie ziarno zwilżano zawiesiną zarodników badanego grzybka, suszono i wysiewano. Jako podłoże wzrostowe stosowano torf poddany uprzednio działaniu pary. Po dwóch i pół tygodniach uprawy przeprowadzano obserwację dobrostanu kiełków. Do testu glebowego dobrano szczepy grzyba, które ewidentnie zapobiegały rozwojowi choroby.

Testy glebowe

Mieloną, zwilżoną glebę nakładano do doniczek o objętości 1,5 litra, po czym do każdej doniczki wysiewano 36 ziaren zbóż. Obróbkę ziarna przed wysianiem prowadzono tak, jak w teście torfowym; na każdy rodzaj obróbki stosowano trzy jednakowe doniczki. Kiełki badano po czterech tygodniach uprawy.

Szczepy wykazujące dobre właściwości w powyższych badaniach kwalifikowano do badań terenowych, które pozwoliły uzyskać całkowitąpewność co do działania biopestycydowego wybranych izolatów drobnoustrojów.

Patogenność szczepów grzybów

Badano próbnie możliwy szkodliwy wpływ szczepu grzyba J76. Wyniki uzyskane do tej pory wskazują, że grzyb ten nie jest patogenny dla roślin. Badano 33 gatunki roślin.

Część doświadczalna

Następujące doświadczenia ilustrują zastosowanie wynalazku. W punkcie (A) opisano zastosowanie zawiesin zarodników szczepów Nectria pityrodes J76,J1431, J1432, MOS1 i ROS2 według wynalazku w zwalczaniu chorób roślin, wywoływanych głównie przez Fusarium spp. W punkcie (B) opisano wytwarzanie i zastosowanie preparatów tych szczepów, w punkcie (C) opisano doświadczenia, w których badano mechanizm działania szczepu grzyba J76, a w punkcie (D) - wykonanie i ocenę badania przesiewowego według wynalazku.

179 895 (A) Zastosowanie szczepów grzyba w postaci zawiesin zarodników

Doświadczenia z zawiesiną zarodników szczepu J76

Latem '92 badano działanie zawiesin zarodników szczepu J76 w trzech miejscach badań. W badaniach stosowano dwa różne rodzaje nasion: ziarna pszenicy, sztucznie inokulowane Fusarium culmorum i ziarna jęczmienia naturalnie zakażone F. nivale.

Wyniki badań pszenicy przedstawiono w tabeli 1. Plony uzyskane ze sztucznie inokulowanej pszenicy przedstawiono w tabeli 2.

Obserwacje kiełków jęczmienia przedstawiono w tabeli 3. Choroba nie wykazywała znamiennego statystycznie wpływu na plony jęczmienia.

Tabela 1

Doświadczenia w trzech miejscach badań latem '92, ze sztucznie inokulowaną pszenicą. Kiełkowanie i odsetek chorych kiełków.

	Obróbka	Kiełki - liczba/metr bieżący	Odsetek choroby - odsetek poważnie dotkniętych chorobą kiełków
JOKIOINEN	nasiona zdrowe	50	5,2
	bez obróbki	11	48
	zaprawa Baytan	45	10
	J76	47	7,2
MIETOINEN:	nasiona zdrowe	45	7,3
	bez obróbki	10	42
	zaprawa Baytan	39	3,8
	J76	33	13
PALKANE:	nasiona zdrowe	50	3,0
	bez obróbki	15	57
	zaprawa Baytan	51	24
	J76	45	11

Tabela 2

Doświadczenia w trzech miejscach badań latem '92, ze sztucznie inokulowaną pszenicą.

Plony (kg/ha).

Obróbka	JOKIOINEN	MIETOINEN	PALKANE:
nasiona zdrowe	3650	3190	5290
bez obróbki	1830	1690	1950
zaprawa Baytan	3270	3190	4940
J76	3530	2950	4900

179 895

Tabela 3

Doświadczenia w trzech miejscach badań latem '92, z naturalnie zakażonym (F. nivale) jęczmieniem. Kiełkowanie i odsetek chorych kiełków.

	Obróbka	Kiełki - Liczba/metr bieżący	Odsetek choroby - odsetek poważnie dotkniętych chorobą kiełków
JOKIOINEN	bez obróbki	39	7,7
	zaprawa Baytan	40	1,2
	J76	40	0,9
MIETOINEN:	bez obróbki	42	7,4
	zaprawa Baytan	42	1,4
	J76	43	2,8
PALKANE	bez obróbki	42	26
	zaprawa Baytan	42	9,4
	J76	44	6,3

Badanie zależności odpowiedzi od dawki szczepu J76 latem '92

Ponieważ szczep J76 wykazywał istotnie korzystne wyniki w obserwacjach kiełków, prowadzonych na początku lata '92, w doświadczeniu, rozpoczętym (siew) tuż przed połowąlata, badano wpływ zastosowanej dawki na działanie ochronne przeciwko chorobom. Stosowano zarówno zdrowe ziarno pszenicy, jak i ziarna sztucznie zakażone Fusarium culmorum.

Doświadczenia prowadzono na poletkach o powierzchni 2 m². Obserwowano kiełkowanie i objawy chorobowe w kiełkach. Próbki kiełków do dalszego badania choroby pobierano w czterech różnych punktach czasowych. Próbki z każdej obróbki pobierano z czterech poletek wysiewanych oddzielnie dla każdego czasu próbkowania. Obserwowaną liczbę kiełków podano w tabeli 4, a odsetek kiełków zakażonych - w tabeli 5, oddzielnie dla ziaren zdrowych i zakażonych. Dane z tabeli 5 przedstawiono graficznie na fig. 1 i 2.

Tabela 4

Doświadczenie badania zależności odpowiedzi od dawki dla J76, latem '92. Kiełkowanie.

Obróbka	Liczba Kiełków/metr Bieżący
Ziarno zakażone Fusarium
bez obróbki	18
zaprawa Baytan	57
zawiesina zarodników J76 (1,2 x 10 cfu/ml)	74
zawiesina zarodników J76 (1,2 x 10 cfu/ml)	58
zawiesina zarodników J76 (1,2 x 10⁵ cfu/ml)	51
zawiesina zarodników J76 (1,2 x 10 cfu/ml)	20
Ziarno zdrowe
bez obróbki	71
zaprawa Baytan	66
zawiesina zarodników J76 (1,2 x 107 _cfu/ml)	80

179 895

Tabela 5

Doświadczenie badania zależności odpowiedzi od dawki dla J76, latem '92. Odsetek chorych kiełków z ziarna inokulowanego F. culmorum i ze zdrowego ziarna. Skróty jak na fig. 2.

Obróbka	Dni od wykiełkowania
10	17	30	44
Ziarno zakażone Fusarium
K	75,4	82,8	79,5	85,1
B	15,9	60,9	65,3	78,2
J76-0	10,1	50,0	66,6	70,3
J76-1	23,1	51,8	55,5	62,9
J76-2	36,4	64,7	76,0	78,0
J76-3	68,6	72,8	77,1	76,2
Ziarno zdrowe
K	54,7	71,8	67,7	85,1
B	8,4	50,4	58,3	73,6
J76-0	14,3	48,0	69,9	73,8

Próby terenowe z zawiesiną zarodników J76 latem '93

Próby przeprowadzano w Jokioinen, Mietoinen i Palkane. W badaniach stosowano sześć rodzajów próbek ziarna:

- pszenica “Luja”, naturalnie zakażona grzybem F.culmorum

- pszenica “Luja”, sztucznie inokulowana grzybem F. culmorum

- pszenica “Luja”, zdrowa

- pszenica “Laari”, zdrowa

- jęczmień “Kustaa”, naturalnie zakażony różnymi grzybami Fusarium i grzybem Bipolaris sorokiniana

- owies “Yty”, naturalnie zakażony grzybem F. avenaceum

Próbki zdrowej pszenicy wysiewano tylko w Jokioinen; próby z czterema innymi rodzajami próbek ziarna prowadzono we wszystkich trzech miejscowościach. Próbki wysiewano na poletka o powierzchni 10 m², sześć poletek na jeden rodzaj obróbki.

Obróbka ziarna była identyczna dla każdego rodzaju próbek ziarna:

K = bez obróbki (kontrola)

B = środki chemiczne - zaprawa Baytan I

J76S = zawiesina zarodników J76 z hodowli na płytce (8,4 x 10⁹ cfu/kg ziarna)

W tabeli 6 przedstawiono intensywność uszkodzeń chorobowych oddzielnie dla każdego rodzaju obróbki i każdego rodzaju próbki ziarna. Plony ukazano w tabeli 7.

Tabela 6

Próba terenowa z zawiesiną zarodników J76, '93. Odsetek poważnie uszkodzonych kiełków.

	Jęczmień	Owies	Naturalnie zakażona pszenica	Sztucznie inokulowana pszenica	Zdrowa “Luja”	Zdrowa “Laari”
1	2	3	4	5	6	7
JOKIOINEN K	6,0	10,1	7,4	34,2	20,6	5,7
B	0,9	2,0	2,1	1,0	1,4	0,7
J76S	0,9	1,4	0,7	1,0	3,3	5,7

179 895 ciąg dalszy tabeli 6

1	2	3	4	5	6	7
MIETOINEN
K	12,8	3,5	20,4	72,0
B	1,3	0,6	5,7	6,6
J76S	5,4	0	7,1	7,3
PALKANE
K	9,6	7,4	10,9	26,9
B	2,5	3,3	2,1	0,6
J76S	2,4	3,6	2,3	0

Tabela 7

Plony uzyskane w próbach terenowych zawiesiny zarodników J76, '93 (kg/ha)

	Jęczmień	Owies	Naturalnie zakażona pszenica	Sztucznie inokulowana pszenica	Zdrowa “Luja”	Zdrowa “Laari”
JOKIOINEN
K	7460	6650	6060	2950	6100	6360
B	7500	6790	5870	5690	5940	6060
J76S	7840	6650	6050	6040	6150	6570
MIETOINEN
K	5900	5780	4920	3890
B	6070	5200	4910	4990
J76S	6120	5440	4670	4810
PALKANE
K	4670	5560	3630	2950
B	4550	5200	4190	4000
J76S	4710	5430	3710	3650

Badanie działania J76 przeciwko ' śnieci cuchnącej pszenicy i zgorzeli podstawy źdźbła jęczmienia

Latem '93 włączono J76 do prób terenowych, w których badano działanie dziewięciu chemicznych środków grzybobójczych, stosowanych do zaprawiania ziarna zbóż, przeciwko śnieci cuchnącej pszenicy (wywoływanej przez Tilletia caries). J76 dodawano w postaci zawiesiny konidiów, a środki chemiczne według instrukcji użycia. Wykorzystywano poletka o powierzchni 0,1 m2, po pięć na jeden środek (tabela 8).

Tabela 8

Wpływ obróbki zaprawami na test śnieci cuchnącej pszenicy.

Obróbka	Skuteczność ochrony (%) (=spadek liczby zakażonych kłosów)
1	2
Tassato S w płynie	78
Baytan WS	100
Beret 050	100
Fungazil C	100
Panoctine 35	100

179 895 ciąg dalszy tabeli 8

1	2
Raxil I w proszku	100
Raxil I w płynie	100
Prelude LS	100
Vitavax 200 FF	100
J76	85

W zaprawie Baytan składnik czynny stanowi triadimenol. Baytan I stanowi mieszaninę, zawierającą triadimenol i imazalil. Taysato S zawiera karboksynę i imazalil. Składnik czynny Panoctine stanowi guazatyna.

Obróbkę ziarna zarodnikami J76 włączono również do próby terenowej, w której badano skuteczność chemicznych środków grzybobójczych przeciwko zgorzeli podstawy źdźbła (Bipolaris sorkiniana) jęczmienia. W próbie wykorzystywano poletka o powierzchni 10 m², po cztery. Nie stwierdzono różnicy w kiełkowaniu pomiędzy ziarnami poddanymi różnym rodzajom obróbki. J76 istotnie zmniejszał nasilenie objawów (tabela 9), aczkolwiek patogen ten jest istotnie różny od grzybów Fusarium, przeciwko którym dobierano drobnoustrój.

Tabela 9

Działanie obróbki zaprawą przeciwko zgorzeli podstawy źdźbła.

Obróbka	Skuteczność ochrony (%) (=spadek liczby chorych kiełków)
Prelude LS	85
Dividend 37,5 (400 ml)	84
Dividend 37,5 (200 ml)	81
Baytan I	81
Beret Special (400 ml)	74
Raxil I w proszku	70
Tayssato S w płynie	66
Panoctine Plus	66
Fungazil C	66
Beret Special (200 ml)	65
Raxil I w płynie	64
Beret FS 050	49
PNL210	39
J76	69

(B) Preparaty wytworzone ze szczepów grzybów i ich działanie w próbach terenowych

Preparat w postaci proszku ze szczepu grzyba J76 wytworzono w następujący sposób:

Preparat 1

Hodowlę prowadzono w kolbie Erlenmayera o objętości 11, zawierającej 0.51 pożywki odżywczej , w skład której wchodziła sacharoza - 4 g/l, wyciąg z drożdży - 4 g/l i ekstrakt słodowy 10 g/l. pH przed wyjałowieniem w autoklawie doprowadzano do wartości 6,0. Jako inokulum stosowano grudkę agaru zawierającego zarodniki, przechowywanego uprzednio w temperaturze -80°C (pożywka z dekstroz,ą ziemniaczaną). Prędkość obrotów mieszacza wynosiła 150 obrotów/minutę, wzrost prowadzono w temperaturze pokojowej (22°C), a czas uprawy wynosił 7-12

179 895 dni. Komórki oddzielono przez filtrowanie na papierze filtracyjnym. Do masy komórkowej domieszano krzemionkę, mleko w proszku i CMC (karboksymetylocelulozę) w następujący sposób:

komórki 20% krzemionka 55% mleko w proszku 15%

CMC (roztwór wodny 7%) 10%

Mieszaninę suszono w temperaturze pokojowej na otwartych szalkach Petriego wj ałowym powietrzu przez dwa dni. Grubość warstwy wynosiła 1-2 cm. Wysuszoną mieszaninę zmielono na proszek. Żywotność preparatu wynosiła 107 cfu/g (cfu - jednostka kolonizująca).

cfu- (jednostka kolonizująca) stanowi jednostkę stosowanąw określaniu żywotności drobnoustrojów. Rozcieńczoną zawiesinę drobnoustrojów rozprowadza się po płytkach agarowych i po kilku dniach zlicza się kolonie. Jeżeli rozcieńczenie jest znane, można obliczyć liczbę kolonii, czyli liczbę komórek drobnoustrojów.

Preparat 2

Komórki hodowano podobnie, jak w Preparacie 1, po czym do masy komórkowej domieszano krzemionkę, mleko w proszku, CMC i kwas askorbinowy w następujący sposób:

komórki	66)%
krzemionka	20%
mleko w proszku	14%
CMC 7%	3%
kwas askorbinowy	3%
Mieszaninę wysuszono w ten sam sposób,	co Preparat 1, i zmielono na proszek. Żywotność

preparatu wynosiła 107 cfu/g.

Preparat 3

Komórki hodowano podobnie, jak w Preparacie 1, po czym do masy komórkowej domieszano sacharozę i skrobię w następujący sposób:

komórki 22% sacharoza 255% skrobia 55%

Mieszaninę wysuszono w ten sam sposób, co Preparat 1, i zmielono na proszek. Żywotność preparatu wynosiła 107 cfu/g.

Preparat 4

Szczep J76 hodowano bezpośrednio na pożywce stałej, zawierającej nośnik krzemionkowy. Jako środek odżywczy stosowano bulion zawierający 8% ekstraktu słodowego (Maltax MP10, Lahden Polttimo). 120 g bulionu odżywczego zmieszano w zlewce z 50 g proszku krzemionkowego i wyj aławiano w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120°C. Do schłodzonej pożywki dodano 10 g zawiesiny zarodników J76, uzyskanej przez zeskrobanie zarodników z płytki PDA do j ałowej wody. Mieszaninę inkubowano przez 20 dni w temperaturze 16°C, a następnie suszono w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Żywotność wysuszonego preparatu wynosiła 107 cfu/g.

W podobny sposób można wytwarzać preparaty z pozostałych szczepów według wynalazku.

Działanie preparatu w postaci proszku w próbkach terenowych

W dalszym ciągu niniejszego opisu omówiono próby przeprowadzone przez Instytut Ochrony Roślin w Ośrodku Badawczym Rolnictwa w Finlandii latem 1993, z zastosowaniem preparatu, w postaci proszku, szczepu J76. Próby przeprowadzano w MTT (Ośrodek Badawczy Rolnictwa) w Jokioinen, Mietoinen i Palkane. W badaniach stosowano sześć rodzajów próbek ziarna:

- pszenica “Luja”, naturalnie zakażona grzybem F. culmorum

- pszenica “Luja”, sztucznie inokulowana grzybem F. culmorum

- pszenica “Luja”, zdrowa

- pszenica “Laari”, zdrowa

179 895

-jęczmień “Kustaa”, naturalnie zakażony różnymi grzybami Fusarium i grzybem Biopolaris sorokiniana

- owies “Yty”, naturalnie zakażony grzybem F. avenaceum

Próbki zdrowej pszenicy wysiewano tylko w Jokioinen; próby z czterema innymi rodzajami próbek ziarna prowadzono we wszystkich trzech miejscowościach. Próbki wysiewano na poletka o powierzchni 10 m2, sześć poletek na jeden rodzaj obróbki.

Obróbka ziarna była identyczna dla każdego rodzaju próbek ziarna:

K = bez obróbki (kontrola)

B = śrockd chemiczne - zaprawa Baylarn I

J76PK = proszek J76 jako sucha zaprawa (8,4 x 10⁹ cfu/kg = największa ilość, jaka może przyjąć ziarno)

J76PN = proszek J76 jako zaprawa płynna (8,4 x 109 cfu/kg).

W tabeli 10 przedstawiono intensywność uszkodzeń chorobowych oddzielnie dla każdego rodzaju obróbki i każdego rodzaju próbki ziarna. Plony ukazano w tabeli 11.

Tabela 10

Próba terenowa z proszkiem J76, '93. Odsetek poważnie uszkodzonych kiełków.

	Jęczmień	Owies	Naturalnie zakażona pszenica	Sztucznie inckulcwana pszenica	Zdrowa “Luja”	Zdrowa “Laari”
JOKIOINEN
K	6,0	10,1	7,4	34,2	20,6	5,7
B	0,9	2,0	2,1	1,0	1,4	0,7
J76PK	2,2	1,5	2,7	7,0	6,2	2,8
J76PN	1,2	1,9	3,9	1,3	5,7	4,6
MIETOINEN
K	12,8	3,5	20,4	72,0
B	1,3	0,6	5,7	6,6
J76PK	10,1	0	17,2	42,5
J76PN	9,1	0,3	13,7	14,3
PALKANE
K	9,6	7,4	10,9	26,9
B	2,5	3,3	2,1	0,6
J76PK	5,3	2,6	4,8	6,1
J76PN	3,9	3,8	3,9	2,7

Tabela 11

Plony uzyskane w próbach terenowych proszku J76, '93.

	Jęczmień	Owies	Naturalnie zakażona pszenica	Sztucznie inokulowana pszenica	Zdrowa “Luja”	Zdrowa “Laari”
1	2	3	4	5	6	7
JOKIOINEN K	7460	6650	6060	2950	6100	6360
B	7500	6790	5870	5690	5940	6060
J76PK	7610	6940	6060	5140	6400	6320
J76PN	7610	6970	6040	6020	6000	6400

179 895 ciąg dalszy tabeli 11

1	2	3	4	5	6	7
MIETOINEN
K	5900	5780	4920	3890
B	6070	5200	4910	4990
J76PK	6000	5670	4770	4620
J76PN	6110	5760	4790	4950
PALKANE
K	4670	5560	3630	2950
B	4550	5200	4190	4000
J76PK	4730	5560	3600	3390
J76PN	4870	5470	3660	3760

Ponadto, w roku '93 badano działanie ochronne różnych preparatów wytwarzanych ze szczepu J76 przeciwko rozmaitym grzybom. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabelach 12-18.

Tabela 12

Działanie ochronne J76 w glebie piaszczystej inklowanej grzybem Gaeumannomyces na pszenicę Polkka.

Test doniczkowy, pod osłoną.

Obróbka	Kiełkowanie %	Odsetek całkowicie zdrowych	Wskaźnik chorobowy	Świeża masa
g/powt.	g/kiełek
Próbka kontrolna choroby (bez obróbki J76)	78,7	65,3	0,76	5,8	0,28
Sucha zaprawa J76 8 g/kg	81,3	76,0	0,55	10,1	0,46
Płynna zaprawa J76 10 cfu/ml	90,7	81,3	0,31	10,4	0,43

-KF - preparat - fazy stałej (Preparat 4)

Wskaźnik chorobowy:

zdrowe lekko dotknięte chorobą poważnie dotknięte chorobą niewykiełkowane

Tabela 13

Działanie ochronne preparatów J76 przeciwko grzybowi Fusarium culmorum w pszenicy Polkka. Test doniczkowy, torfjako podłoże. KF - wzrost na fazie stałej (Preparat 4),

R - hodowla z mieszaniem na podłożu płynnym (Preparat 1),

M - drobnoustrojów jako taki z hodowli na agarze.

Obróbka	Kiełkowanie %	Odsetek całkowicie zdrowych	Wskaźnik chorobowy	Świeża masa g/powt.
1	2	3	4	5
Zdrowe	91	84	0,37	16,2
Próbka kontrolna choroby	30	5	2,54	4,5
Płynna zaprawa J76 KF 40/931, 10 cfu/ml	72	44	1,17	14,0

179 895 ciąg dalszy tabeli 13

1	2	3	4	5
Płynna zaprawa J76 R 10/2 C 10⁶ cfu/ml	71	49	1,21	13,0
J76 M K^cfu/ml	76	58	0,99	14,8

Wskaźnik chorobowy:

zdrowe lekko dotknięte chorobą poważnie dotknięte chorobą niewykiełkowane

Tabela 14

Działanie J76 przeciwko grzybowi Pythium na ogórkach.

Wyniki podano jako średnie wartości trzech testów doniczkowych (pH 6,2, pH 6,9 i pH 7,4)

Obróbka	Odsetek żywych rozsad	Wskaźnik chorobowy (0-2)	Świeża mas g/powt.
Zdrowe	98	0,04	12,1
Próbka kontrolna choroby	47	0,63	5,4
Płynna zaprawa J76, 106 cfu/ml	58	0,52	6,9

Wskaźnik chorobowy:

zdrowe obumarłe niewykiełkowane

Tabela 15

Działanie ochronne szczepu grzyba J76 na kalafiory w glebie piaszczystej zanieczyszczonej grzybem Rbizoctonia solani.

Test doniczkowy w szklarni.

Obróbka	Odsetek kiełkowania	Odsetek całkowicie zdrowych	Świeża masa
g/powt.	g/kiełek
Bez obróbki	92,7	52,0	21,7	0,79
Płynna zaprawa J76 10 cfu/ml	94,7	72,0	24,1	0,83

Tabela 16

Działanie ochronne szczepu grzyba J76 na jęczmień “Kustaa” w glebie piaszczystej inokulowanej grzybem Fusarium nivale.

Test doniczkowy na wolnym powietrzu, pod osłoną.

Obróbka	Kiełkowanie %	Odsetek całkowicie zdrowych	Wskaźnik chorobowy (0 - 3)	Świeża masa g/powt.
Zdrowe	93,3	37,3	0,91	8,9
Próbka kontrolna choroby	73,3	29,3	1,43	7,8
Płynna zaprawa J76 KF, 10 cfu/ml	80,0	52,2	0,91	9,7
Płynna zaprawa J76, 106 cfu/ml	81,3	52,0	0,93	10,3

179 895

Wskaźnik chorobowy:

zdrowe lekko dotknięte chorobą poważnie dotknięte chorobą niewykiełkowane

Tabela 17

Działanie ochronne szczepu grzyba J76 przeciwko grzybowi alternaria brassicola na kalafiorach. Wyniki podano jako średnie wartości z doświadczeń w trzech różnych temperaturach (15°C, 10°C i 25°C).

Obróbka	Odsetek kiełkowania	Wskaźnik chorobowy (0-3)	Świeża masa g/powt.
Zdrowe	96	0,17	33,2
Próbka kontrolna choroby	50	2,01	21,8
Płynna zaprawa J76, 10 cfu/ml	96	0,22	35,4

Wskaźnik chorobowy:

zdrowe lekko dotknięte chorobą poważnie dotknięte chorobą obumarłe lub niewykiełkowane

Wyniki doświadczeń odnośnie ochronnego działania pięciu szczepów Nectria pityrodes według wynalazku (J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2) na F. culmorum na pszenicy przedstawiono w tabeli 18. Wyniki podano jako średnie wartości z dwóch doświadczeń: wjednym z nichjako podłoże zastosowano torf, a w drugim - glebę.

Tabela 18

Działanie ochronne pięciu szczepów Nectria pityrodes (J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2) na Fusarium culmorum na pszenicy. Wyniki podano jako średnie wartości z dwóch testów doniczkowych (torf i gleba).

Obróbka	Odsetek całkowicie zdrowych	Wskaźnik chorobowy (0-3)	Świeża masa g/powt.
Próbka kontrolna choroby	23	2,06	3,0
Płynna zaprawa J76, 10 cfu/ml	73	0,66	8,0
Płynna zaprawa J1431, 10 cfu/ml	80	0,51	8,5
Płynna zaprawa J1432, 10 cfu/ml	72	0,78	8,0
Płynna zaprawa MOS 1, 10 cfu/ml	76	0,66	8,8
Płynna zaprawa ROS2, 10 cfu/ml	76	0,66	8,3

(C) Sposób działania J76

W badaniach mikroskopowych i pewnych testach laboratoryjnych poczyniono wstępne obserwacje sposobu, poprzez który J76 działa jako antagonista innych grzybów.

Przy obserwowaniu interakcji strzępek J76 i grzyba F. culmorum stwierdzono, że pierwsze wyraźne reakcje zachodzą bardzo szybko. W punkcie styku grzybni komórki strzępek Fusarium

179 895 zaczynają ulegać wyraźnemu rozpadowi około godzinę po zetknięciu. Najpierw ściana komórkowa traci swój kształt, następnie komórki opróżniają się i wreszcie ściana komórkowa ulega całkowitemu rozpadowi. Z punktów zetknięcia rozpad grzybni Fusarium rozprzestrzenia się powoli dalej. Po kilku dniach wspólnej hodowli J76 i F. culmorum nie możnajuż w ogóle odnaleźć strzępek grzyba Fusarium. Również jego zarodniki (zarówno konidia, jak i chlamydospory) rozpadąjąsię pod działaniem J76, jednakże wolniej niż strzępki. Strzępki J76 układająsię zwykle luźno dookoła zarodników F usarium przed ich rozpadem. Obserwacje nie wskazująna to, żeby J76 istotnie penetrował do strzępek Fusarium.

Na podstawie obserwacji mikrospowych można stwierdzić, że J76 prawdopodobnie wydziela do otoczenia substancje biologicznie czynne. Mogą one działać podobnie jak enzymy lub antybiotyki. Ich wytwarzanie może stanowić główny mechanizm działania J76, ponieważ nie stwierdzono, aby J76 pasożytował bezpośrednio na innych grzybach, a jako że rośnie on powoli, nie może oczywiście zbyt skutecznie współzawodniczyć o substancje odżywcze. Również w teście celofanowym uzyskano ślady wytwarzania metabolitów wpływających na wzrost innych grzybów.

Kiedy J76 i F. culmorium rosną obok siebie na bardzo cienkiej warstwie podłoża wzrostowego, tworzy się strefa hamowania, w której ustaje wzrost Fusarium. Zjawiska tego nie obserwuje się na normalnej grubości warstwie podłoża. Prawdopodobnie związane jest to z małym stężeniem substancji ulegających dyfuzji do podłoża. Stwierdzono również, że substancje lotne wydzielane przez J76 wykazują słabe działanie hamujące wzrost F. culmorum.

Test celofanowy: na podłoże wzrostowe nałożono folie celofanową i hodowano na niej szczep J76. Po hodowli przez 10 dni usunięto folię, a wraz z nią szczep J76. Substancje wydzielone przez J76, które ulegały transportowi przez folię, pozostały w podłożu. Jako płytki kontrolne zastosowano takie płytki, na które nałożono cienką folię celofanową bez J76. Wyniki testu celofanowego przedstawiono w tabeli 19.

Tabela 19

Działanie metabolitów wytworzonych przez grzyb J76 na wzrost F. culmorum w teście celofanowym, szybkość wzrostu w mm/dzień.

J76	2,5
Kontrola	6,2

(D) Przeprowadzenie badania przesiewowego i ocena wyników

Test piaskowy

Podłoże wysiewu

Jako podłoże wysiewu zastosowano piasek o wymiarach ziaren 0,2-0,7 mm (Kauniston Sora Oy, Loimaa). Piasek zwilżono, dodając do 4 części piasku 1 część wody. Z seryjnej płyty doniczkowej (V efi-VP 96) wycięto płytę 5x7 doniczek (po 50 ml) i umieszczono ją w plastykowym pudełku. Doniczki wypełniono zwilżonym piaskiem tak, aby wystawało 1-1,5 cm ich górnego brzegu. Do każdej doniczki wysiano trzy ziarna jarej pszenicy “Luja”.

Obróbka

Zakażanie Fusaroim culmorum: F. culmorum hodowano na płytkach PDA w temperaturze pokojowej przez około 1 miesiąc (aż do pełnego wytworzenia zarodników). Grzybnie i zarodniki oddzielono od płytki i zmieszano z wodądestylowanąw homogenizatorze Ultra-T urrax. Ilość zarodników doprowadzono do 10⁶ na ml. Roztwór zamrażano w porcjach po 70 ml w torebkach Minigrip do temperatury -20°C. Do testu zamrożony roztwór poddawano rozmrożeniu i ponownemu mieszaniu. Roztwór stosowano jako taki (roztwór podstawowy) i w postaci rozcieńczenia 10'2. Patogenność szczepów Fusarium utrzymywano poprzez pasażowanie ich przez rośliny (ziarna pszenicy inokulowano zawiesiną Fusarium i patogen izolowano ponownie z zakażonych kiełków).

179 895

Zawiesina antagonisty: grudkę PDA, poddaną uprzednio głębokiemu zamrożeniu, zawierającąantagonistę, dzielono na trzy części i hodowano na trzech płytkach PDA. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej (w ciemności) przez około trzy tygodnie. Roztwór podstawowy zawiesiny antagonisty wytwarzano przez zeskrobywanie dwóch płytek antagonisty do 50 ml wody destylowanej. Dokonano mieszania homogenizatorze Ultra-Turrax. Z roztworu podstawowego wytwarzano rozcieńczenia 10'¹ i 10’3.

Obróbka ziarna: na ziarno wysiane na seryjną płytę doniczkową naniesiono najpierw pipetą 1 ml zawiesiny F. culmorum, a następnie na to 1 ml zawiesiny antagonisty. 15 ziaren w pięciu 50 ml doniczkach traktowano wszystkimi sześcioma kombinacjami gęstości zawiesiny zarodników (dwa rozcieńczenia zawiesiny F. culmorum razy trzy rozcieńczenia zawiesiny antagonisty).

Obróbka kontrolna: na każdą płytkę z doniczkami stosowaną do badania jednego szczepu grzyba przypadało dodatkowo 15 ziaren w pięciu doniczkach, traktowanych wyłącznie roztworem podstawowym badanego grzyba.

W teście piaskowym badano jednocześnie 15-20 szczepów grzybów. Każdego dnia, kiedy rozpoczynano badania, wysiewano również jedną oddzielną płytę doniczkową, służącądo sprawdzenia dobrostanu ziaren, jak również patogenności inokulum F. culmorum. Trzy próbki obróbki kontrolnej, wysiewane na oddzielne płytki, stanowiły: próbka nieinokulowana (tylko woda), inokulowana roztworem podstawowym F. culmorum i inokulowana rozcieńczeniem roztworu podstawowego F. culmorum (10’2). Na każdy z tych trzech rodzajów obróbki przypadało 30 ziaren wysiewanych do dziesięciu doniczek.

Warunki wzrostu: po naniesieniu pipetą zawiesiny grzybów ziarna pokrywano zwilżonym piaskiem. Pudełka zawierające płytki z doniczkami pakowano w przezroczystą folię plastykową i przenoszono do komory wzrostowej (10-15°C, dzień 14-godzinny).

Obserwacje

Po hodowaniu rozsad przez 16-18 dni płukano je do czysta pod bieżącą wodą z kranu i prowadzono obserwacje obecnych w nich objawów chorobowych. Kiełki, w których korzenie i komórki koleoptylowe nie ściemniały oraz niewykiełkowane ziarna, które pozostały twarde, uznawano za zdrowe. Kiełki wykazujące wyraźne objawy, lub niewykiełkowane ziarna, które zmiękły, uznawano za chore.

Najpierw badano rośliny poddane obróbce kontrolnej. Jeżeli z ziaren potraktowanych wodą rozwinęły się wyłącznie zdrowe rośliny, a w obu próbkach roślin traktowanych patogennem obserwowano wyraźne objawy chorobowe, to badanie akceptowano i czyniono obserwacje roślin poddanych obróbce badanymi szczepami grzybów.

W teście piaskowym stopień nadawany poszczególnym wyizolowanym szczepom grzybów był zależny od liczby roślin poddanych danemu rodzajowi obróbki i uznanych za chore. Jeżeli tylko w roślinach poddanych obróbce badanym grzybem kiełkowanie było istotnie zmniejszone w porównaniu ze zdrową kontrolą, lub jeżeli znajdowano inne objawy choroby, to stwierdzono, że grzyb nie nadaje się do dalszych badań. Jeżeli nie stwierdzono uszkodzeń, każda z sześciu kombinacji gęstości zarodników patogenu i gęstości zarodników badanego grzyba oceniano oddzielnie w następującej skali:

= wszystkie 15 roślin zdrowych = nie więcej niż 2 uszkodzone rośliny = 3-5 uszkodzonych roślin = 6-9 uszkodzonych roślin = 10-13 uszkodzonych roślin = nie więcej niż 1 zdrowa roślina

W zależności od sześciu wyżej wymienionych stopni spośród badanych szczepów grzybów pobierano szczepy do następnego etapu testu, tzn. do testu torfowego. Kwalifikowano do niego te szczepy, które uzyskały co najmniej trzykrotnie stopnie 0 i 1. Jeżeli dany szczep nie uzy179 895 skał ani razu stopnia 0, kwalifikowano do dalszych badań, jeżeli co najmniej czterokrotnie uzyskał stopień 1.

Test torfowy

Podłoże wzrostowe

Jako podłoże wzrostowe zastosowano torf poddany działaniu pary, nawieziony i z dodatkiem wapnia. Do jesieni 1992 stosowano nieprzesiewany, surowy torf z Torronsuo, a następnie stosowano przesiewany surowy torf z Eurajoki (Nawożenie: 800 g wapnia dolmitowego i 100 g torfu Y-lannos/1001 torfu (Y-lannos = nazwa handlowa fińskiego nawozu uniwersalnego). Zwilżony torfrozprowadzono w pudłach plastykowych (28,5 x 49,5 x 9,4 cm, pudła Weibulls Robusta “Mammut”, Muoviyhtyma Oy) warstwąo grubości około 5 cm. Dno pudeł było pokryte foliąplastykową.

Rodzaje obróbki

T = zdrowe, nieinokulowane ziano siewnej arej pszenicy ‘ ‘Luja”. Pod lewane wodą destylowaną.

F = ziarno inokulowane F. culmorum. Ziarno moczono w roztworze podstawowym F. culmorum (roztwór stosowano w nadmiarze) zawierającym około 106 zarodników/ml (hodowla Fusarium -por. tst piaskowy). Po obróbce ziarno pozostawiono do wyschnięcia przez noc, rozłożone na papierze.

F0 = inokulacja F. culmorum tak, jak w obróbce F. Po wysuszeniu ziarna zwilża się je roztworem podstawowym antagonisty. Roztwór podstawowy wytworzono, zeskrobując grzybnie i zarodniki z jednej płytki antagonisty do 25 ml wody destylowanej. Obróbkę przeprowadzono, mieszając ziarno siewne i roztwór antagonisty. Po przeprowadzeniu obróbki ziarno wysuszono na papierze.

F2 = inokulacja F. culmorum tak, jak w obróbce F. Obróbka antagonisty tak jak w obróbce F0, z zastosowaniem rozcieńczenia 10- roztworu podstawowego antagonisty.

Do torfu wysiano 10 rzędów po 30 ziaren/rząd. Kolejność wysiewu była następująca rząd ochronny, F, F0, F2, T, F, F0, F2, T, rząd ochronny. Po wysianiu ziarna pokryto torfem i pudełka zwilżono.

Warunki wzrostu

Zasiewy hodowano w szklarni w temerpaturze około 15°C. W ciemnych porach roku stosowano dodatkowe światło, wytworzone przy użyciu lamp multimetalowych, przez 12 godzin dziennie. W miarę potrzeby zasiewy podlewano wodą. Czas uprawy wynosił 18 dni.

Ocena

Kiełki umyto i przeprowadzono obserwacje objawów chorobowych w kiełkach, jak przy teście piaskowym. Na podstawie obserwacji z obróbki T i F decydowano, czy wynik testu może być zaakceptowany. W zdrowych roślinach kontrolnych (T) dopuszczano obecność co najwyżej 12 chorych roślin (spośród 60 wysianych ziaren), natomiast w kontroli patogenu (F) niezbędna była obecność co najmniej 52 chorych roślin (spośród 60 ziaren). Badany szczep grzyba dopuszczano do kolejnego etapu (testy glebowe), jeżeli spośród ziaren potraktowanychjednym z dwóch stężeń roztworu (po 60 ziaren) rozwinęło się nie mniej niż 19 chorych roślin.

Testy glebowe

Podłoże wysiewu

Zastosowana gleba (glina piaszczysta) pochodziła z poletek doświadczalnych w Jokioiinen. Glebę mielono ręcznie lub, zimą'92/’93, przesiewano przez sito 1x1 cm. Doniczki plastykowe 1,51 (o średnicy 14 cm) wypełniono w taki sposób, aby 3-4 cm od górnego brzegu pozostały wolne. Na dnie doniczki umieszczano papier filtracyjny.

Rodzaje obróbki

1. Zdrowe ziarno. Zwilżane samą wodą destylowaną.

2. Kontrola Fusarium. Ziarno zwilżano inokulum Fusarium (wytwarzanie - p. testy piaskowe) o zawartości ok. 106 zarodników/ml; roztwór stosowano w nadmiarze.

179 895

3. Inokulacja jak w próbce kontrolnej Fusarium. Po wyschnięciu ziarna poddawano je obróbce zawiesiną antagonisty, wytworzonąprzez zmieszanie grzybni i zarodników z jednej płytki z 25 ml wody destylowanej. Obróbkę prowadzono w butelce plastykowej, w której umieszczano 130 ziaren (120-150 ziaren) i 1 ml (lub 1,5 ml) zawiesiny antagonisty.

4. Kontrola środka grzybobójczego. Inokulacja jak w próbce kontrolnej Fusarium. Po wyschnięciu ziarna poddawano je obróbce 2 g proszku zaprawy Bayton I na kg ziarna. W okresach wcześniejszych stosowano również obróbkę środkami Ceresan i Tayssato S.

Poddane obróbce ziarno wysiewano do doniczek, 36 ziaren/doniczkę, 3 powtórzenia/rodzaj obróbki. Zasiewy pokrywano glebą. Warunki wzrostu-jak w teście torfowym. Czas uprawy - około 4 tygodni.

Kiełki płukano i oceniano stopień choroby:

Badanie i ocena = całkowicie zdrowe = niewielkie uszkodzenie Fusarium = średnie-znaczne uszkodzenia chorobowe = kiełki całkowicie zbrązowiałe - obumarłe.

Skuteczność testów szklarniowych

Latem'93 badano skuteczność sposobów selekcji według wynalazku wjednej, szeroko zakrojonej próbie terenowej. W próbie tej badano, czy do dalszych testów, w serii testów selekcyjnych przeprowadzonych między październikiem '91 a lutym '93, dobrano właściwe spośród wyizolowanych szczepów grzybów. Do obróbki ziarna dobrano arbitralnie 60 takich szczepów odrzuconych w testach piaskowych, dla których nie wykazano działania patogennego na pszenicę. Badaniom poddano również 92 szczepy odrzucone w testach torfowych. Do badań włączono także wszystkie 35 szczepów grzybów, wyselekcjonowanych do badań glebowych. 43 spośród nich w teście glebowym odrzucono, a 50 dobrano na podstawie tych testów do prób terenowych.

Oprócz wyżej wspomnianych 210 sposobów obróbki, do badania włączono również sześć sposobów obróbki kontrolnej: bez obróbki (K), zaprawa Baytan I (B) i cztery szczepy grzybów najczęściej badane w uprzednich testach, m. in. J76.

W próbie zastosowano pszenicę “Luja”, naturalnie zakażoną grzybem F. culmorum. Jednostkę obserwacji stanowił rząd kiełków o długości 1,4 m, do którego obsiania zastosowano 5,5 g ziarna. Dla każdego z 216 sposobów obróbki wysiano sześć powtórzeń. Randomizację badania przeprowadzono według modelu doświadczalnego regularnej sieci przestrzennej. W ten sposób zmniejszono wariację błędu, którą można by przypisać czynnikom związanym z glebą. Po około pięciu tygodniach od wysiania kiełki wykopano z gleby, zliczono i obserwowano w 'nich objawy chorobowe.

Wyniki badania przedstawiono w postaci czterech histogramów na fig. 3a do 3d. Nie stwierdzono różnic pomiędzy izolatami odrzuconymi w teście torfowym, a izolatami niepatogennymi, odrzuconymi w teście piaskowym. Stwierdzono, że test torfowy bardzo dobrze spełnił swoje zadanie. Szczepy dobrane do dalszych badań na podstawie tego testu wykazywały średnio wyraźnie lepsze działanie, niż szczepy grzybów odrzucone w tym teście.

W sumie, w testach piaskowych i torfowych, odrzucono stosunkowo mało szczepów grzybów, których nie należało odrzucać. Z drugiej strony, na postawie testu glebowego odrzucono znaczną liczbę bardzo dobrych izolatów, jednakże ze szczepów dobranych do prób terenowych jedynie dwa spośród 15 wykazywały niepełne działanie w warunkach naturalnych.

Z wyników można wyciągnąć wniosek, że możliwe jest wiarygodne dobranie najlepszych antagonistów do dalszych badań na podstawie testów piaskowego i torfowego, natomiast w testach glebowych nawet szczepy będące dobrymi kandydatami na antagonistów mogąulec odrzuceniu.

Badanie szczepu grzyba J1431 w testach selekcyjnych

Spośród szczepów grzybów według wynalazku J1431 badano we wszystkich trzech doświadczeniach selekcyjnych przeprowadzanych w szklarni.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J76 o numerze depozytu

7522.
2. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J1431 o numerze depozytu 8805.
3. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne J1432 o numerze depozytu 8806.
4. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne MOS1 o numerze depozytu 8807.
5. Biologicznie czysty szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne ROS2 o numerze depozytu 8808.
6. Środek grzybobójczy, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808.
7. Środek grzybobójczy, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden szczep, dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS 1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808, i nośniki i/lub środki dodatkowe korzystnie wybrane z grupy, do której należy krzemionka, mleko w proszku, karboksymetyloceluloza, sacharoza, kwas askorbinowy i skrobia.
8. Sposób otrzymywania środka grzybobójczego, znamienny tym, że hoduje się szczep grzyba Nectria pityrodes Montagne dobrany z grupy, do której należą szczepy grzybów J76, J1431, J1432, MOS1 i ROS2, o numerach depozytów, odpowiednio, DSM 7522, DSM 8805, DSM 8806, DSM 8807 i DSM 8808 w pożywce wzrostowej, korzystnie z dodatkiem krzemionki, oddziela się masę komórkową, korzystnie dodaje się do niej nośniki i/lub środki dodatkowe, a następnie masę tę suszy się i poddaje sproszkowaniu.