KR100236546B1

KR100236546B1 - R.solani에 길향력이 있는 세균 및 그를 이용한 식물병원균 구제용 미생물 제제

Info

Publication number: KR100236546B1
Application number: KR1019970026538A
Authority: KR
Inventors: 정영륜; 성기철; 정만훈; 성민기
Original assignee: 정영륜
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2000-01-15
Also published as: KR970070194A

Abstract

본 발명은 농작물의 생물학적 방제를 위하여 Rhizoctonia solani에 길항력이 있는 키틴분해 세균에 키틴(chitin) 또는 키토산(chitosan)을 전달 담체로한 미생물제제 농약과 식물 병원진균의 세포벽 구성성분인 키틴(chitin)을 분해할 수 있는 길항미생물들의 복합체를 대량적으로 배양하기 위하여 농수산폐기물인 새우 또는 게껍질과 왕겨를 이용하여 퇴비를 제조하고 그 퇴비를 이용하여 식물병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 식물 병원균 R. solani의 억제 미생물제제를 만들거나 퇴비화하여 새로운 형태의 환경친화적인 무공해농약을 개발할 수 있는 특징을 가진다.

Description

R. solani에 길항력이 있는 세균 및 그를 이용한 식물병원균 구제용 미생물제제

본 발명은 R. solani에 길항력이 있는 세균 및 그를 이용한 식물병원균 구제용 미생물제제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 키틴 분해성의 길항세균을 분리배양하고 그를 이용한 벼잎집무뉘마름병이나 무우, 오이 등의 모잘록병 및 뿌리썩음병의 생물학적 방제 방법에 관한 것이다.

Rhizoctonia solani는 불완전균류에 속하는 다범성 병원균으로서 약 250여종의 대부분 1년생 식물에 질병을 유발하며 불규칙한 모양의 갈색의 균핵을 형성하고 무성포자를 형성하지 않는 것으로 현재까지는 균사융합(anastomosis)여부에 따라 11개 그룹으로 분류되고 있다. 각 균사융합군 간에는 기주특이성이 인정되고 있으며 벼잎집무늬마름병은 AGI-IA에 속하며 기주에 따른 균주의 변이가 심하고 약제록병(damping-off)이나 뿌리썩음병(root rot)은 AG 그룹중 AG4에 속하며 대표적인 토양전염병으로서 대개 어린 식물의 땅가에 접한 줄기부분을 공격하여 식물체를 쓰러뜨린다. 본 발명은 이와 같은 벼잎집무뉘마름병이나 무우, 오이 등이 모잘록별 및 뿌리썩음병의 생물학적 방제를 위해 상기 식물병원균의 억제능력이 우수한 길항 미생물을 분히하여 제제화함으로써 새로운 형태의 환경친화형 미생물제제농약을 제조하는 방법에 관한 것이다. 대상이 되는 길항미생물로는 키틴(chitin), 키토산(chitosan) 분해능력이 우수하며 항생물질 생산을 할 수 있는 세균을 선발하고 선발된 길항세균의 동정 및 발명억제효과와 그 작용 메카니즘을 규명하였다. 본 발명의 또 다른 목적으로 키틴(chitin) 또는 키토산(chitosan)을 전달담체로 하여 농수산물페기물을 이용한 퇴비를 제조하는 방법을 제공한다.

종래의 길항미생물을 이용한 생물학적 방제는 해충뿐만이 아니라 식물병원체인 식물병원성 진균, 선층 및 virus 병의 방제와 넓게는 잡초방제하는 것이 공지되어 있으며 아울러 유전자 조작을 이용한 분자 생물학적 방제까지 공지되어 있다. 이들 공지된 문헌에 의하면 길항미생물에 의한 생물학적 방제의 원리는 이들이 생산하는 항생물질에 의한 항생작용, 세포벽분해효소에 의한 기생 또는 포식작용 그리고 영양물 경쟁이나 거점(niche) 경쟁 등을 통한 병원균의 밀도감소 또는 발병능력감소 및 비병원성 균주 또는 약병원성 균주를 이용하는 교차보호(cross protection)에 주된 작용기작을 두고 있다. 예컨데, Fluorescent pseudomonads에 의한 Rhizoctonia solani, Phthim ultimum, Fusarium spp. 및 Phytophthora sp.의 억제와 Bacillus sp., Streptomyces sp. 등을 이용한 이들 병원균들의 억제효과가 공지된바 있다. 진균에 의한 생물학적 방제는 예컨데, Trichoderma spp.와 Gliocladium spp.가 분비하는 항생물질 또는 Volatile compound, 독소, 특수한 inhibitors에 의한 진균병의 억제작용이 공지되어 있다.

한편, 기생 또는 포식작용에 의한 길항작용은 최근들어 활발하게 연구되고 있는데 길항세균들이 분비하는 진균의 세포벽 분해효소인 키티나제(chitinase), 글루카나제(glucanase), 셀룰라제(cellulase) 등에 의한 병원균의 용해작용이 주된 작용기작으로 알려져 있다. 본 발명은 이와 같은 길항작용에 착안하여 종래 Rhizoctonia solani에 의해 발병하는 벼잎집무늬마름병의 방제방법이 Validamucin, Flutolanil, Pencycuron 등 합성농약에 의한 화학적 방법외에 효과적인 방제방법이 없다는 점과 상기 진균에 의한 무우나 오이 등의 모잘록병 및 뿌리썩음병 방제 또한 토양살균제 처리에 의한 토양소독과 살균제에의 종자 침지 등 역시 합성농약에 의한 방법에 의존하고 있는 현 실정을 감안하여 합성농약의 계속적 사용으로 인한 인축 독성 문제발생과 생태계 파괴를 막고 결과적으로 환경 친화적인 새로운 방제 방법을 제공함을 그 목적으로 한다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 생태계 보존이라는 시대적 요망에 부응하고 인축독성의 사회적 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로 세균의 길항작용을 이용하여 식물병원균을 생물학적으로 방제하기 위한 방법으로서 우선 식물병원성 미생물 Rhizoctonia solani에 대한 억제능력이 있는 우수한 길항미생물을 분리하고 순수 배양하여 이를 미생물제제화 또는 퇴비화함으로써 새로운 형태의 환경친화형 무공해 농약 또는 퇴비를 제공한다.

이하 본 발명의 구체적 구성과 작용을 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 생물학적 방제 방법은 R. solani에 길항력이 있는 미생물을 분리하고 길항력을 검점하는 단계; 벼잎집무늬마름병에 걸린 벼의 줄기와 잎에서 병원균을 분리하는 단계; 키틴(Chitin) 분해력과 키토산(chitosan) 분해력의 검정 단계; 길항균의 항진균 범위조사 단계; 분리된 길항미생물의 제제화 및 퇴비화단계; 벼잎집무늬마름병 방제효과 및 무우 Rhizoctonia 모잘록병 억제효과 검정단계; 및 그 실용화 검정을 위한 길항미생물의 pot 및 환경내 동태조사 단계로 구성되어 있다.

이하 본 발명의 구성의 작용을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명한다.

[실시예 1]

길항세균에 의한 R. solani의 생물학적 방제 및 작용기작

[실험예 1]

길항미생물 분리 및 길항력 검정

R. solani에 길항력에 있는 미생물을 분리하기 위하여 경남 진주시, 진양군, 남해군, 밀양군과 전남 구례, 충북 청주등 14개 지역에서 토양 및 퇴비 시료를 채취하였다. 채취한 토양 5g과 멸균수 45㎖를 혼합하여 28℃에서 30분간 진탕한 후 토양희석한천평판법으로 10^-5배 까지 희석한 후 희석액 0.1㎖를 0.1 Tryptic Soy Agar(TSA, Difco)에 분주하여 배지 전면에 골고루 편 다음 28℃ 항온기에서 3일간 배양하였다. 배양후 자란 세균의 single colony를 순수 분리하여 TSA 및 PDA 사면 배지에 옮겨 4℃에서 보관하였다. 분리된 세균의 길항력 검정은 병원균과의 대치배양방법에 의하여 수행하였다.

[실시예 2]

R. solani 병원균 분리

벼잎집무늬마름병에 걸린 벼의 줄기와 잎을 채취하여 이병된 부위를 적당한 크기로 잘라 0.1% NaOCl용액에 수분간 침지하여 표면살균하였다. 표면살균된 식물체 조각을 멸균된 Wattman paper(No.2)에 올려 NaOCl용액을 흡수된시킨 다음 Streptomycin 과 Oxytetracycline을 각 50ppm 씩 함유한 PDA배지에 올려놓고 28℃에서 5일간 배양하여 자란 균사가 R. solani의 균사 형태임을 확인한 후 분리하여 보관하며 사용하였다. TSA와 PDA배양기 중앙에 R. solani 균사 disc(직경 8mm)를 놓고 양쪽에 순수 분리된 길항미생물을 도말하여 2일후 균사 성장 억제 정도를 측정함으로써 길항력을 검정하였고 세균의 colony형성 시기와 크기를 -~+++로 나누어 그 성장 속도를 비교하였다.

[실험예 3]

chitin과 chitosan 분해력의 검정

PDA배지에서 길항력을 나타내고 성장속도가 빠른 균주를 1차 선발하고 Basal medium(MgSO₄·7H₂O 0.5g, K₂HPO₄0.7g, KH₂PO₄0.3g, FeSO₄·7H₂O 0.01g, ZnSO₄0.001g, MnCl₂0.001g, pH 7.0, Agar 15g, D·W 1L)에 Swollen chitin 0.05%(w/v)를 혼합한 Colloidal chitin 배지와 0.1N HCl용액에 Chitosan을 녹인 후 Basal medium에 첨가하여 Chitosan 배지를 만들어 길항미생물을 도말하고 Clear zone의 형성 유무로 키틴분해 활성(chitinolytic activity)과 키토산분해 활성(chitosanolytic activity)을 검정하였다. 키틴분해활성이 가장 높은 #75균주를 선발하였다(표 1). #75 균주는 동정결과 Streptomyces sp. 75로 명명하고 1997. 6. 13. 한국과학기술원에 기탁번호 KCTC 8805P호로 기탁되었다.

[실험예 4]

길항균의 항진균력 검정

길항미생물의 항진균력 검정을 위하여 본 연구실에서 분리 또는 확보하여 보관 중인 Pythim ultimum, Rhizopus spp. Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Botryosphaeria dothidea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Thielaviopsis basicola를 이용하였다. TSA와 PDA 배지 중앙에 각 진균 균사 disc를 놓고 양쪽에 흡광도 0.5정도의 농도로 조성된 길항균 현탁액을 직경 5mm의 Paper disc에 50㎕씩 접종한 후 28℃ 항온기에서 2~14일 동안 배양하면서 길항세균에 의해 형성된 균사생장억제 거리를 측정하였다(표 1).

본 발명에서 특별히 중요한 길항세균 Streptomyces sp. 75(기탁번호 KCTC 8805P호)는 그램(+)의 방선균으로 PDA 및 ISP(International Streptomyces Project) No. 2, 3, 4, 5, 7 배지에서 whitish gray 색깔의 기중균사를 다량 형성하였으며, TSA와 NA, ISP No. 6 배지에서는 기중균사를 형성하지 않았다. ISP 방법에 따른 각종 배지상에서의 생육특성은 사용한 모든 배지에서 생육이 양호하였으며, 기질균사(substrate mycelium)는 대체로 약간 녹색을 띤 yellow 계열의 색깔이었고, 용해성 색소는 분비하지 않았다(표 2).

형태적 특성으로 포자사슬은 일직선의 recitiflexibile한 형태였고 포자표면은 smooth한 형태로 간균형이었다. 기중균사와 기질균사 모두가 생장하면서 fragmentation 되었다. 항산성 test와 anaerobic growth test에서는 negative였으며, catelase 활성을 나타내었다. 세포벽의 아미노산은 LL-diaminopimelic acid type으로 glycine을 포함하고 있었고, 당은 검출되지 않았다(표 3).

이상의 결과로부터 Bergey′s Manual of Systematic bacteriology에 의해 본발명균주는 Streptomyces 속으로 동정되었다. Streptomyces sp. 75의 당이용 산생성, 여러 탄수화물의 이용여부, 고분자 물질의 분해 등을 생리적 특성은 각각 표 4, 표 5, 표 6에 나타내었으며, 생장특성을 표 7에 나타내었다. 여러 당류 중 arabinose, cellobiose, galactose, maltose, trehalose, xylose는 본 발명균주에 의해 이용되어 산이 생성되었으며, adonitol외 다른 9종의 당류는 이용되지 않았다(표 4).

탄수화물 및 유기산 이용은 표 5와 같이 arabinose, azelate, cellobiose, crotonate, fumarate, galactose, glucose, iso-butyrate, malonate, maltose, rhamnose, trehalose, xylose는 이용되었으나 나머지 adonitol, fructose, glycerol, histisdine, histamine, mannitol, melezitose, myo-inositol, propionate, raffinose, sorbitol, suberate, succinate, sucrose는 이용되지 못한다.

고분자물질의 분해는 casein, chitin, chitosan, esculine, gelatin, hippurate, starch, tween 40, 60, 80은 분해하였지만 cellulose, hypoxanthine, tyrosine, xanthine은 분해하지 못했다(표 6).

항생제 저항성 실험에서는 조사한 항생제 ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, nalidixic acid, rifampicin, streptomycin 모두 100ppm의 농도에서 Streptomyces sp. 75균주는 전혀 생장하지 못했다(표 8).

세포의 지방산 조성분석 결과 탄소 14개부터 17개까지의 지방산을 함유하고 있었고, iso-15:0와 anteiso-15:0가 각각 35043%, 18031%로 주요 구성 지방산으로 나타났다(표 9). 그러나 기존에 알려진 다른 Streptomyces species의 주요 지방산은 iso-16:0이며, 공통적으로 methlation된 지방산을 함유하는데 비해 본 균주는 기존에 알려진 Streptomyces species와는 다른 cellular fatty acid 조성을 보였다.

[실험예 5]

길항미생물의 배양과 균체 수확

분리된 길항미생물 중 배양기내에서 길항력이 좋은 4종류의 세균(주세균:#75, #160, #224, #233)을 선발하여 제제화에 사용기전에 우선 각 길항미생물을 0.5TSB 5㎖에 접종하여 28℃에서 12시간 동안 진탕 배양하여 seed culture로 사용 하였다, 본 배양은 2L Erlenmeyer flask에서 0.5 TSB 500㎖에 28℃에서 2일 동안 진탕 배양(150rpm)하였다. 이 때의 각 길항미생물 밀도는 10⁸~10⁹cfu/㎖ 이었다. 배양액을 7,000g에서 15분간 원심 분리하여 상등액을 제거한후 가라앉은 균체를 수확하였다.

[실시예 6]

길항미생물의 제제화

길항미생물 제제는 세균균체, TSB, 키토산(chitosan) 용액을 혼합하여 조제하였다. 키토산 용해를 위하여 표 10과 같이 실험하였으며 Succinic acid를 사용하여 용액을 제조하였다. TSB가 혼합된 키토산용액 10㎖을 0.5 TSB 500㎖에서 2일간 배양한 각 길항미생물의 균체를 resuspend 하여 120℃에서 30분간 살균된 Peat moss 4g과 혼합하였다. 제제는 4℃에서 완전히 밀봉(sealing) 되지 않은 상태로 보관하면서 실험에 사용하였다.

[실험예 7]

벼잎집무늬마름병 방제 효과 검정

밀기울 75g, 왕겨 150g과 증류수 150㎖을 혼합하여 2L 삼각플라스크에 담고 121℃에서 1시간동안 멸균한 뒤 PDA에서 5일간 배양한 R. solani 균사 disc 20개를 접종하여 28℃에서 10일간 배양한 것을 그늘에서 건조후 분쇄하여 4℃에서 보관하면서 접종원으로 사용하였다. 한편 볍씨(진흥91)를 benomyl(5g/L)용액에 24시간 침지한 후 3시간 동안 그늘에서 말린 다음 25℃에서 하루동안 최아시키고 3겹의 cheese cloth를 깐 플라스틱 쟁반에 볍씨가 물에 잠길 정도로 하여 25℃의 유리 온실에서 10일 동안 발아시켰다. 상기 발아된 볍씨를 논흙을 담은 직경 5cm, 250㎖짜리 물 컵에 5립씩 옮겨 심었다. 벼와 3엽기가 될 때 요소질 비료(3g/L)를 적당히 시비하고 일주일 후에 실험을 수행하였다.

상기 실험에서 6에서 조제된 제제품 0.5g 접종한 1일 후에 병원균 0.5g을 접종하고 습실처리하여 90%이상의 습도를 유지시켰다. 28℃에서 3일간 발병을 유도하였으며 발병정도(disease severity)는 벼잎집무늬마름병의 이병 정도에 따라 0~4로 발병율을 나누어 조사하였다. 모든 실험을 3반복으로 수행하였다. 방제가는 하기식으로 평가하였다.

실험결과, 키토산을 2,500ppm과 5,000ppm 첨가하였을 때 각각 69.4%, 80.6%의 방제가를 나타냈고 1,250ppm 이하 온도에서는 22.2%이하의 낮은 방제가를 나타냈다(표 11).

또, 각 길항미생물 및 키토산, TSB, Peat moss의 혼합 조합별로 제제화하여 벼입집무늬마름병 방제효과를 조사한 결과, 4종류의 길항미생물과 TSB, 키토산을 사용한 제제가 92.5%로 가장 높은 방제가를 나타내었으며 길항미생물과 TSB, peat moss 모두가 혼합된 제제는 85.0%의 방제가 나타내었다. 제제화하지 않고 길항미 생물 현탁액만을 처리했을 때는 67.5%의 낮은 방제가를 나타내었으며 TSB와 키토산과 같은 부재를 첨가해 줌으로써 방제가가 5~25% 상승되었다(표 12). 그리고, 길항 미생물이 빠진 TSB, 키토산 및 peat moss만을 사용한 제제는 전혀 발병 억제를 하지 못했다. Peat가 빠진 제제는 액체상태였으므로 제제의 보관 도중 키토산이 겔상태로 쉽게 변하여 peat moss를 담체로 사용하였다.

한편, 본 발명제제에 사용한 네 길항미생물이 방제효과에 어느 정도 기여하는가를 알아보기 위하여 각 길항미생물의 조합별로 제제화하여 벼잎집무늬마름병 방제효과를 실험한 결과 네 길항미생물을 모두 혼합하여 사용하였을 때는 78.8%의 가장 높은 방제가를 보였으나(표 12) 본 발명균주, #224균주만을 사용하였을 때는 각각 57.6%, 54.5%의 방제가를 보였고, 다른 균주조합에서는 모두 50% 이하의 낮은 방제가를 나타내었다(표 13). 그러므로 본 발명 미생물제제가 벼잎집무늬마름병의 방제효과를 나타내는데 있어 본 발명균주가 가장 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있으며 토양 내에서의 억제작용은 1종류의 길항미생물보다는 여러 종류의 복합적 미생물에 의한 것일 가능성이 높다. 또 폿트 당 길항미생물 제제를 0.06, 0.12, 0.25, 0.50g으로 처리량을 증가시켰을 때 처리량이 늘어남에 따라 방제가가 50%에서 78%까지 증가하였다. 길항미생물제제의 효과지속정도를 알기 위하여 기간별로 방제효과를 조사한 결과 제제 처리 1일까지는 90%정도의 방제가를 나타내었고 3일 후부터 효과가 약간씩 감소하여 처리후 7일째는 65%의 방제가를 나타내었으며, 11일째는 방제가가 40%이하로 낮아졌다.

[실험예 8]

길항세균의 동정 및 환경내 동태

분리된 네 길항균을 ‘Bergey′s Manual Systematic bacteriology’의 동정방법에 따라 동정하였다. 세균의 동정에 필요한 형태학적, 생리 화학적 실험은 ‘Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria(2nd ed.)’와 ‘Method for General Bacteriology’에 기재된 방법으로 수행하였다. 길항균을 pot에 처리하고 일정 시간별로 밀도 변화를 조사하기 위하여 같이 항생제 내성균주를 선발, 실험하였다. Short wave lenght의 UV를 Mutagen을 사용하여 30cm의 거리에서 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30초 동안 노출시킨 본 발명균주, #160, #224, #233의 길항생물을 각각 Rifampicin(100ppm), Oxytetracycline(100ppm), Chloramphenicol(100ppm), Nalidixic acid(100ppm)가 첨가된 TSA에서 배양하였다. 여기서 자라 나온 colony를 계대배양함으로써 항생제 내성균주를 선별하였다. 선발된 균주의 발병 억제효과는 모균주와 차이가 없었으며, 돌연면이주를 이용하여 제제화한 다음, pot에 처리한 후 경과 일수에 따라 토양을 채취하여 희석한 후 각 항생제를 함유한 선택 배지에서 길항균의 밀도 변화를 조사하였다. 실험결과 항생제 내성균주를 이용한 길항미생물의 동태는 본 발명 제제 처리 전 밀도는 #224와 #233 10⁸cfu/㎖ 이상, 본 발명군주, #160균주는 10⁷cfu/㎖ 이었고 시간이 경과할수록 밀도가 감소하여 7일째에는 #224, #233 길항미생물은 평균 10⁵cfu/㎖, 본 발명균주, #160균주는 10⁴cfu/㎖ 밀도를 유지하였다. 그리고 11일째는 균주에 따라 약간 감소하거나 비슷한 밀도를 유지하였다. 본 발명 제제를 4℃에 보관하면서 벼잎집무늬마름병 방제효과유지 여부를 조사한 결과 143일째까지는 방제가 100%를 유지하였고 그 이후로 250일째에는 82%의 방제효과를 보였다. 따라서 본 발명 제제내에서는 각 길항미생물이 장기간 생존할 수 있는 것으로 확인되었다.

[실시예 2]

chitin 분해성 길항세균에 의한 무의 Rhizoctonia 모잘록병의 생물학적 방제

[실험예 9]

길항미생물 제제 방법

분리된 키틴(chitin) 분해 미생물중 키틴(chitin) 분해활성이 좋고 동시에 생장과 병원균에 대한 길항작용이 뛰어난 6균주(#75, #383,m #386, #387, #601, #630)를 선발하여 제제화에 사용하였다. 상기 균주들은 0.5 TSA 고체 배치상에서 활성화시킨 각 길항균을 5㎖의 0.5 TSB 액체배재에 1백금이씩 접종하여 28℃, 170rpm에서 12시간 배양하였다. 그리고, 이 배양액을 500㎖의 0.5 TSB 액체배지에 접종하여 동일 조건에서 3일간 본 배양을 실시하였다. 배양후 배양액을 6,000rpm에서 15분간 원심 분리하여 균체를 수확하고 멸균된 증류수로 2~3회 세척하여 제제화에 사용하였다. 길항미생물의 제제는 제제기제로서 Peat moss 또는 Vermiculite를 사용하고 상기 수확한 세균 균체를 TSB(0.3%, w/v)와 키토산(0.25%, w/v)용해액 10㎖에 잘 현탁시킨 다음 121℃에서 30분간 멸균한 카나다산 Peat moss 4g과 혼합하였다. 제제의 조제후 Aluminium foil을 사용하여 완전히 밀봉되지 않게 한후 4℃에 냉장 보관하면서 생물체 검정에 사용하였다.

[실험예 10]

접종원 농도별 발병 억제효과

50%의 발병도를 나타내는 ED₅₀값을 결정하기 위하여 상기 실험예 9에 따라 제조한 병원균 접종원의 접종량 별로 발병정도를 조사하였다. 즉, peat 식물 생육상토 또는 왕겨+새우껍질 퇴비(RHC)를 1:3 비율(v/v)로 섞은 상토 1ℓ당 접종원을 0, 1, 2, 4, 8g씩 각각 접종하고 발병정도를 조사하고, 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였다. 실험결과, 본 발명 미생물제제 구성물인 길항세균 균체, 키토산, TSA를 모두 혼합한 제제의 처리(1g/ℓ)구가 가장 발병 억제 활성이 높았다. 그리고 길항세균 단독 또는 키토산의 단독 처리구에서 역시 억제활성이 있었다(표 14).

또, 2종류의 길항미생물 제제를 기제 종류별로 첨가하여 발명억제효과를 실험한 결과는 표 15와 같다. peat에 길항미생물을 첨가하여 제제를 만들었을 때는 발병률이 13.2%로 RHC 퇴비를 peat 제제를 첨가했을 때 9.9%와 함께 대조구 60.1%에 비해 현저히 발병이 억제됨을 알 수 있었다. 그러나 버미큘라이트(vermiculite)를 사용하여 길항미생물을 제제화하고 발병 억제효과를 조사해 보았으나 발병률이 모두 40% 이상으로 발병 억제 양상은 나타나지 않았다(표 15). 이것은 버미큘라이트(vermiculite)가 유기물이 아니라 무기물이기 때문에 길항미생물의 생존이 어려웠을 것이라고 추정해 볼 수 있으며, 또 1~3개의 길항미생물 보다는 3개 이상의 복합미생물 제제가 발병 억제에 적합할 것으로 생각된 길항미생물을 peat에 처리한 제제(PF)를 첨가량 별로 발병 억제 정도를 조사한 결과는 peat배지와 부농 상토에 길항미생물 제제를 2.0g/ℓ 첨가한 처리구에서는 제제 첨가구가 13.25로 대조구의 60.1% 발병도에 비하여 약 78%이상의 방제가를 나타내었고(표 15), 총 10회의 억제효과 실험결과 그 중 7~8회에서 발병 억제효과가 나타났다.

[실험예 11]

길항미생물의 pot내 동태

선발된 6종의 길항세균 중 4균주(#75, #383, #386, #601)를 선택하여 항생제 내성균주를 만들어 처리기간 경과에 따른 생존 밀도를 조사하였다. 먼저 각 균주를 멸균수로 적절하게 희석한 뒤 TSA 배지상에 도말하고 clean bench의 short wave length 의 UV를 돌연변이원으로 사용하여 약 30cm이 거리에서 1분 가량 조사하였다. 그 후 28℃ 항온기에서 배양하여 자라난 각 길항균 집락을 최초 50rpm의 Rifampicin, Oxytetracycline, Nalidixic acid, Streptomycin, Kanamycin, Ampicillin이 첨가된 TSA 배지에 이쑤시개를 사용하여 계대배양하고, 여기서 다시 각 항생제에 대하여 내성이 있는 내성균주들을 100ppm의 항생제가 첨가된 배지에서 다시 선발하였다. 그 다음 각각 100ppm의 항생제가 첨가 배지에서 수차례 계대배양하여 내성을 확인하였으며 최종적으로 획득한 내성균주를 PDA 배지상에서 병원균과 대치배양하여 억제활성이 모균주와 차이가 나지 않는 균주를 사용하여 제제화하였다. 이 제제들을 식물 생육 상토에 처리한 뒤 경과 일수에 따라 배양토를 채취, 적절하에 희석하고 각 항생제를 함유한 TSA 선택 배지에서 자라난 길항균의 집락수를 계수하였다.

[실험예 12]

길항미생물과 농수산폐기물의 퇴비화

병원진균의 세포벽 구성성분잉 chitin을 분해할 수 있는 다양한 길항 미생물들의 복합체를 대량적으로 배양하기 위하여 농수산폐기물인 새우 또는 게껍질과 왕겨(RHC)를 이용하여 퇴비화 하였다. 퇴비화를 위하여 새우껍질과 게껍질을 왕겨와 1:1(v/v)로 혼합(RHC)하였다. 또한 생돈분을 육송 톱밥과 돈분(SDM)등의 재료별로 소형 굴삭기를 사용하여 혼합하였다. 각각의 재료를 혼합하면서 각 퇴비구의 수분함량이 약 50% 가량 되게 조정해주었으며 혼합후 지름 3m, 높이 2m정도의 정체식 야적 퇴비더미를 제조하였다. 더미 제조후 90일이 경과하는 동안 퇴비화 하면서 최초 7일째와 14일째에 한번씩, 그 후에는 2주 간격으로 각각 1번씩 2번을 뒤집기 하였다. 퇴비화가 진행되는 동안 필요에 따라 수분조정을 해주었으며, 일정 시간 간격으로 퇴비 표면으로부터 약 15cm 내부의 시료를, 각 퇴비구당 4곳에서 채취하여 퇴비의 발병억제효과를 조사한 결과, 최종 90일간 부숙시킨 퇴비의 발병 억제효과는 peat상토를 사용한 대조구에서는 1g/ℓ의 접종원 첨가구에서부터 약 85%의 높은 발병도를 나타내어 접종원의 농도가 증가할수록 발병도 또한 증가하였고 90일 부숙된 RHC 퇴비를 이 peat상토에 1/3(v/v)가량 첨가해 주었을때의 발병도는 1g/ℓ의 접종원 처리구에서 약 50%정도의 발병도를 나타내었고, 역시 접종원의 농도가 증가될수록 발병도 또한 증가하여 8g/ℓ를 첨가하였을 때는 peat만을 사용한 처리구와 유사한 발병도를 나타내었다. 이와 같은 결과에 따라 병원균 접종원 1g을 접종농도로 정하여 각각 네 퇴비구의 퇴비를 사용하여 퇴비 첨가량에 따른 발병도의 억제효과를 조사해본 결과 50%(v/v)까지 각 퇴비의 첨가비율이 증가할수록 발병 억제효과도 또한 증가하는 경향이 나타났다. 그 중에서 RHC퇴비의 첨가구가 약 18%의 병발생으로 가장 낮았고 나머지 세 퇴비구에서는 40%정도의 발병도를 보였다. 그러나 75%(v/v)로 퇴비의 첨가량을 증가시켰을 때는 오히려 RHC 퇴비구에서는 병발생이 약 30%로 오히려 증가하였으며, RHC 퇴비내의 염류농도(6.0ms/cm)가 높았든것에 원인이 있을것으로 생각되었다. 다시 말하면, 높은 염류 농도로 인하여 식물체의 종자가 많이 발아를 하지 못하였고 이것이 병의 조사시에 4의 등급(pre-emergence dampped-off)으로 rating되었기 때문인 것으로 생각된다. 이렇게 추측할 수 있는 근거는 50% 첨가시에도 식물생육이 대조구에 비하여 다소 억제받는 경향이 나타났으며 염류농도는 약 3.0ms/cm 정도로서 다소 높았기 때문이다. 그리고 90일이 경과한 퇴비를 고압살균기에서 살균한 후 식물 배양상토에 첨가하고 억제효과를 조사해 보았을때는 오히려 대조구에 비하여 훨씬 발병율이 놓았으며 이것은 퇴비에 의한 발병 억제효과는 퇴비내에 정착해 있는 길항미생물들에 의한 것임을 시사하는 결과라고 할 수 있다. 부숙 기간이 다른 RHC 퇴비를 25%(v/v) 첨가하여 발병 억제 정도를 조사한 결과도 일반적으로 부숙이 진행될수록 발병 억제효과 또한 증가하였다.

이상 설명한 실시예 1 및 실시예 2의 실험예에 다양한 조합별로 길항미생물을 제제화하여 벼잎집무늬마름병과 무우나 오이의 모잘록병과 뿌리썩음병의 방제효과를 측정한 결과 길항미생물 현탁액을 단독 처리할 때보다는 TSB, 키토산과 같은 부형제를 첨가해 줌으로써 방제효과가 5~25% 상승되는 시너지스트 효과가 있으며, 또 길항미생물을 이용한 퇴비의 경우에는 RHC 퇴비에 peat moss를 첨가하므로써 발병이 50% 이상 현저하게 억제되는 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명은 R. solani에 길항력이 있는 미생물을 분리하고 키틴 또는 키토산을 이용하여 식물병원균 억제 미생물제제를 제조하거나 키틴 또는 키토산을 함유하는 산업폐기물을 이용하여 퇴비를 제조함으로써 화학농약의 사용에 따르는 생태계 파괴와 인축독성 문제를 제거할 수 있을 뿐만 아니라 유기성 폐기물량의 급격한 증가와 이에 따른 무분별한 소각 및 매립 처리로 인한 환경오염을 방지할 수 있어서 신규한 유기농업, 농약산업 및 환경친화산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

토양에서 분리된 R. solani에 길항력이 있는 세균 Streptomyces sp. 75(기탁 번호 KCTC 8805P호).
제1항의 길항세균의 균체와 키틴 또는 키토산 용액, TSB를 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병원균 구제용 미생물제제.
제1항의 길항세균을 TSA 고체 배지상에서 활성화시킨 다음, 상기 길항균주를 TSB 액체배지에 접종하여 배양한 수 배양액을 원심 분리하여 균체를 수확하고, 이를 멸균된 증류수로 2~3회 세척하고 제제기제로 Peat moss 또는 Vermiculite를 사용하여 상기 수확한 세균균체를 TSB와 키토산용해액에 현탁시킨 다음 Peat moss과 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 식물병원균 구제용 미생물제제의 제조방법.