KR100537782B1

KR100537782B1 - 바실러스 리케니포미스를 포함하는 진균 방제용미생물제제 및 이를 이용한 생물학적 방제법

Info

Publication number: KR100537782B1
Application number: KR10-2003-0004916A
Authority: KR
Inventors: 문병주; 이재필; 김현주; 김철승
Original assignee: 학교법인 동아대학교; 문병주
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2005-12-20
Also published as: KR20040069366A

Abstract

본 발명은 식물병원성 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)를 이용한 미생물제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물제제에 관한 것이다. 본 발명의 미생물제제는 환경친화적인 미생물제제로 작물에 미치는 영향을 최소화하고, 잿빛곰팡이병을 포함한 식물의 병해를 방제하는 미생물농약 또는 비료로 사용하는데 효과적일 뿐만 아니라, 저비용으로 미생물제제를 제조하므로 들깨, 토마토, 오이, 딸기 및 결구상추 등과 같은 농작물의 병해 방제에 경제적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바실러스 리케니포미스를 포함하는 진균 방제용 미생물제제 및 이를 이용한 생물학적 방제법{Microbial agent containing Bacillus licheniformis to control plantpathogenic fungi and method for biological control using the same}

본 발명은 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주를 포함하는 미생물제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물병원성 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)를 포함하는 식물의 진균 방제용 미생물제제에 관한 것이다.

최근에 시설 재배를 이용한 채소, 과일 및 화훼의 재배 면적이 점차 증가하고 있다. 그러나, 우리나라의 시설재배는 대부분 소규모이고 영세하며 단경기에 높은 가격을 목표로 한 생산에 비중을 두고 있어 겨울철 난방비의 지출을 극도로 제한하기 때문에 환기 불량에 의한 시설 내의 다습조건으로 작물에 많은 병해가 발생되어 수량과 품질저하를 가져오는데, 주요 진균 병해로는 잿빛곰팡이병, 역병, 겹무늬병, 시들음병 등 18종이 보고되어 있다. 특히, 비닐하우스에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병이 많은 피해를 주고 있으며, 기주범위가 넓어 거의 모든 작물에 병을 일으키는데, 토마토뿐만 아니라 오이, 딸기 등의 시설원예작물과 화훼 및 과수에도 큰 피해를 주며, 특히 저장, 수송 중에 열매에 병이 한 번 발생하면 빠른 속도로 전파되어 그 경제적 손실이 매우 크다.

잿빛곰팡이병의 방제를 위해 재배환경을 개선해 주는 물리적 방법, 살균제를 이용한 화학적 방법 및 미생물을 이용한 미생물학적 방법 등으로 나누어 방제할 수 있다. 그러나, 물리적 방제만으로는 큰 효과를 기대할 수 없으며, 화학적 방제는 최근 약제 저항성 균의 출현으로 포장에서의 방제효과가 크게 저하되었을 뿐만 아니라, 화학농약의 다량 살포에 의한 인축에 대한 잔류 독성 및 잔류 농약에 의한 심각한 환경 오염으로 이의 대체 방안으로 미생물학적 방제에 관한 연구가 최근 활발하게 진행되어 오고 있으며, 환경친화적 농업을 위한 미생물농약에 관한 연구에 주목하고 있다.

현재 미생물농약으로 특허 등록된 살균제용 미생물로 세균류에는 바실러스 속(Bacillus sp. BS555, KCTC 8821P), 바실러스 폴리목사(Bacillus polymoxa B36, FERM BP-6068), 슈도모나스 오레오파시엔스(Pseudomonas aureofaciens B5, FERM BP-6067), 엔테로박터 클로아제(Enterobacter cloase B51(Enterobacter cloacae B51, FERM BP-6069) 및 항진균 물질을 분비하는 방선균인 스트렙토마이세스 속의 Bom1(제 KFCC 10992호), Bom2(제 KFCC 10993호)등이 있다. 또한, 병원성 진균에 대한 길항능력을 갖는 미생물으로 바실러스 서브틸리스 바 아밀오리크파시엔스(Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens KL114, KCTC 8913P), 알칼리진스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis KL1179, KCTC 8914P), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa KL1121, KCTC 8915P), 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca KL1326, KCTC 8916P), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 슈도모나스 플루오르레슨스(Psedomonas fluorescens) 등이 있으며, 방선균 스트렙토마이세스 속에 대한 길항능력을 갖는 균으로는 슈도모나스 플루오르슨스 바이오바 1(Psedomonas fluorescens biovar 1)가 있고, 곰팡이류는 트리코델마 하지아늄(Trichoderma harzianum), 페니실리움 속(Penicillium sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.), 중복기생 곰팡이균인 아크레모니움 스트릭튬 BCP(Acremonium strictum, KCTC 0639BP) 등이 연구중이다.

보트리티스 시네리아의 생물학적 방제를 위해 여러 가지 균류가 이용된 것으로 보고되어 있는데, 진균인 트리코델마 하지아늄(Trichoderma harzianum), 효모인 이스트(yeast), 세균인 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.), 바실러스 세레우스 WRD-1(Bacillus cereus WRD-1, KCTK 18030P) 및 바실러스 서브틸리스 CP220(Bacillus subtilis CP2201, KCTC 8831P)이 있다. 하지만, 바실러스 속 중에서도 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 균주를 이용한 생물학적 방제에 대한 연구는 거의 전무하고 제제화에 대한 보고는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 균 또는 진균에 대해 우수한 길항능력을 갖는 균주를 선별하였고, 상기 균주를 동정한 결과 신규한 바실러스 리케니포미스 균주임을 밝혔으며, 이를 이용한 미생물제제가 잿빛곰팡이병을 포함한 식물의 병해 방제에 효과적임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 리케니포미스를 포함하는 식물의 균 또는 진균 방제용 미생물제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 리케니포미스의 배양액에 생체고분자물질, 보호제 또는 영양물질을 첨가하여 제조되는 작물의 균 또는 진균 방제용 미생물제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 미생물제제는 항균 또는 항진균 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스를 포함하며, 구체적으로 바실러스 리케니포미스 N1(수탁번호 : KCTC 10319BP)을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 토양에서 분리한 미생물 중에서 잿빛곰팡이병원균의 균사생장 및 분생포자 발아 억제 효과가 큰 균주를 1차적으로 선발하였고, 상기 길항균들의 잿빛곰팡이병 억제 효과를 검정하여 발병억제 효과가 큰 균주를 최종 길항균으로 선발하였다(표 5, 표 6 및 표 7 참조). 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과가 확인된 상기 길항 균주를 동정하기 위하여 균주의 균학적 성질을 조사한 결과, 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성은 하기 표 1과 같다.

테스트	N1 균주	바실러스 리케니포미스
그람 염색	+^a	+
내생포자(Endospore)	+	+
세포 직경 > 1.0 ㎛	-	-
혐기성 성장(Anaerobic growth)	+	+
NaCl 2%에서 성장	+	+
NaCl 5%에서 성장	+	+
NaCl 7%에서 성장	+	+
5℃에서 성장	+	-
10℃에서 성장	-	-
30℃에서 성장	+	+
40℃에서 성장	+	+
50℃에서 성장	+	+
카세인의 가수분해	+	+
젤라틴의 가수분해	+	+
전분의 가수분해	+	+
질산염 환원(Nitrate reduction)	+	+
시트르산 이용(Utilization of Citrate)	+	+
보게스-프로사카우어 테스트(Voges-prosakauer test)	+	+

^a + : 90% 이상 일치, - : 90% 이상 불일치

또한, 상기 균주의 16S rRNA 서열을 분석한 결과 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖고 있으며, 상기 서열은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 99% 이상의 상동성을 보였다. 상기 동정 결과로부터 본 발명에서 분리한 항균 또는 항진균 활성을 갖는 균주를 바실러스 리케니포미스로 동정하였다. 본 발명에서는 상기 균주를 "바실러스 리케니포미스 N1"이라 명명하였으며, 이를 2002년 8월 3일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10319BP).

본 발명의 미생물제제에 포함된 바실러스 리케니포미스 N1는 식물병원성 진균에 대한 길항능력을 갖고 있으므로, 상기 균주를 포함하는 미생물제제는 식물의 병해를 방제하는데 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물제제는 균 또는 진균에 대한 방제 효과를 나타내며, 구체적으로 잿빛곰팡이병원균, 균핵병균, 밑둥썩음병, 검은무늬병 및 시들음병 등과 같은 균 또는 진균에 대해 방제효과를 나타낸다. 상기에서 잿빛곰팡이병원균은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)이다. 본 발명의 미생물제제를 적용할 수 있는 작물은 특별히 제한되는 것은 아니며, 토마토, 들깨, 오이, 딸기 또는 양상추 등의 농작물에 적용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 미생물제제는 여러 가지 형태로 제조될 수 있으며, 구체적으로 수화제, 액제 또는 유제의 형태로 제조될 수 있다.

상기 바실러스 리케니포미스는 글루코스, 전분, 솔비톨(sorbitol) 및 이노시톨(inositol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 탄소원을 첨가하고, 트립톤(tryptone), 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정(malt extract)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질소원을 첨가한 배지에서 배양하는 경우에 항균 또는 항진균 활성이 우수하게 나타난다(표 9 및 표 10 참조).

또한, 상기 바실러스 리케니포미스를 대량으로 배양할 경우에는 비지, 밀기울, 대두박, 깻묵, 볏짚 등의 농가 부산물 또는 농가 폐기물을 대량 배양용 기질로 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비지, 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강(Rice bran), 단술, 쌀가루 및 볏짚으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상을 포함하는 배지에서 바실러스 리케니포미스를 배양한다. 상기 배지 성분 중에서 비지를 포함하는 배지는 대량 배양시 길항 미생물의 밀도가 높고, 시중에서 비교적 쉽게 구할 수 있으며 염가여서 배지의 가격을 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 식물에 영양원이 되고 농약의 잔류 독성과 같은 환경 오염에 대한 우려도 없어 환경 보호 측면에서도 유리하다(도 6 참조).

또한, 본 발명의 미생물제제는 상기 바실러스 리케니포미스 배양액에 생체고분자물질, 보호제 또는 영양물질을 첨가하여 제조할 수 있으며, 생체고분자물질, 보호제, 영양물질은 각각 다른 비율로 혼합하여 사용할 수 있다.

상기에서, 생체고분자물질은 옥수수 전분, 감자 전분, 콩가루, 밀가루, 쌀가루 및 찹쌀가루로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 보호제는 콩기름, 옥수수 기름 및 올리브 기름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 영양물질은 설탕인 것이 바람직하며, 상기 설탕은 검은설탕, 흰설탕 또는 노란설탕일 수 있다.

본 발명의 미생물제제는 상기와 같이 배양한 바실러스 리케니포미스의 배양액에 옥수수전분을 첨가하는 것이 바람직하며, 여기에 추가로 올리브오일 또는 설탕을 첨가하는 것이 더욱 바람직하고, 옥수수전분, 올리브오일 및 설탕을 모두 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 옥수수 전분은 미생물제제가 식물체의 잎에 잘 부착되도록 하는 전착제 및 바인더의 역할뿐만 아니라 햇빛으로부터 세균을 보호하는 보호제 역할을 하며, 가루 형태(powder type)로 제조하기 쉽게 만들어 준다. 설탕은 길항 미생물의 영양원이 되며, 올리브 기름은 세균을 피막화시켜 자외선(UV)으로부터 세균을 보호할 뿐만 아니라 제제 성분들이 잘 섞이게 하는 유화제로서의 역할을 한다.

본 발명의 미생물 제제는 바실러스 리케니포미스의 배양액 1 리터에 대하여 옥수수전분 200 내지 1,000 g, 올리브오일 10 내지 100 ㎖ 및 설탕 10 내지 100 g을 포함하는 것이 바람직하고, 바실러스 리케니포미스의 배양액 1 리터에 대하여 옥수수전분 400 내지 600 g, 올리브오일 25 내지 75 ㎖ 및 설탕 20 내지 60 g을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 미생물제제는 액체형 미생물 전달매체 1 ㎖ 당 바실러스 리케니포미스를 2×10⁹ 세포 이상 포함하는 것이 바람직하며, 2×10⁹∼2×10¹¹세포/㎖로 포함하는 것이 바람직하고, 2×10¹¹∼9×10¹²세포/㎖로 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명의 미생물제제는 상기 미생물제제의 조성에 더하여 부형제(forming agents), 희석제(diluent), 규조토, 제올라이트, 화이트카본 등의 광물질 담체(carrier), 각종 첨가제 또는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 미생물제제는 기존의 화학농약 비하여 잿빛곰팡이병에 대해 더욱 우수한 방제효과를 보였고, 열매의 수량과 무게도 증가되는 효과를 보였다(표 13 내지 표 16 참조). 또한, 본 발명의 미생물제제는 4℃에서 7개월 이상 보관해 두어도 방제 효과에는 큰 차이가 없었으며 세균의 농도 및 항균 및 항진균 활성이 유지되어, 장기 보관이 가능한 것을 알 수 있다(표 18 참조).

본 발명의 미생물제제는 식물의 종자, 식물체, 식물체가 생장하고 있는 토양 중 적어도 하나에 대해 상기 미생물제제를 코팅, 혼합 또는 분무하여 처리할 수 있다. 본 발명의 미생물제제는 식물엽면살포제로서 식물 전체 또는 토양에 분무처리할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물제제의 살포시기는 식물에 따라 달라질 수 있고 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 토마토 작물에서 잿빛곰팡이병이 자연발생되는 3월 내지 5월경에 본 발명의 미생물제제를 처리하였다(도 11 및 도 12 참조).

또한, 본 발명의 미생물제제의 살포 횟수는 식물 및 병원균의 종류에 따라 달라질 수 있고 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 3일 간격으로 3회 살포하거나 7일 간격으로 2회 또는 3회 살포하였다(도 13 및 도 14 참조).

또한, 본 발명의 미생물제제는 단독으로 사용할 수 있으며, 화학농약과 혼합하거나 또는 교차하여 사용할 수 있다(도 17 및 도 18 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 잿빛곰팡이병원균 및 발병도 분석

본 발명자들은 잿빛곰팡이병원균으로 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) LVF12 균주(이하 "LVF12"라 약칭한다)를 사용하였으며, 상기 균주는 1997년과 1998년에 부산시 강동지역의 들깨 재배 하우스내에서 잎마름 증상 및 줄기 정단부의 잘록 증상을 띄는 들깨로부터 순수 분리한 것으로, 병원균의 특성과 병원성 검정 결과를 통해 들깨 잿빛곰팡이병원균으로 확인된 균주이다(도 1).

본 발명자들은 상기 LVF12 균주의 들깨에 대한 분생포자를 이용한 병원성 검정에 효과적인 포자부유액을 개발하기 위하여, 살균수, PDB(potato dextrose broth, Difco, USA) 및 10% 토마토 쥬스(상품명: 가야)에 PDA 배지(potato dextrose agar, Difco, USA)에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 부유하여 ㎖당 10⁶개의 농도로 조정한 포자부유액을 들깨에 접종하였다. 처리군 당 5주씩 들깨 잎에 분무접종하여 상대습도 90% 이상, 20±2℃ 생육상에 보관하였으며 처리 7일 후부터 발병도를 조사하였다.

그 결과, 살균수를 이용한 포자부유액에서는 발병이 전혀 일어나지 않았고, PDB 포자부유액에서는 76.0%의 발병도를 보인 반면, 10% 토마토 쥬스를 이용한 포자부유액에서는 85.0%의 높은 발병도를 보여 10% 토마토 쥬스를 영양원으로 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 나타났다(표 2).

분생포자 부유액	발병도(%)
살균수(SW)	0
감자액체배지(PDB)	76.0
10% 토마토쥬스(Tomato)	85.0
대조군(무처리)	0

이를 다시 토마토쥬스 농도별 또는 첨가원 농도별로 실험을 수행하여 토마토에서의 효과적인 분생포자 접종원을 최종 선발한 결과, 상기 들깨에서의 경우와 마찬가지로 살균수를 이용한 포자부유액에서는 전혀 병이 발생되지 않았으며, 토마토쥬스의 농도가 높아질수록 발병도가 증가하였다. 또한, 여기에 KH₂PO₄를 첨가할수록 빠른 병의 진전과 높은 병의 발생을 유도하는 것으로 나타나 이후 타작물의 병원성 실험과 방제효과 실험에 85.0%로 가장 발병도가 높았던 0.1M KH₂PO₄를 첨가한 20% 토마토쥬스를 영양원으로 한 분생포자 부유액을 최종선발하여 접종원으로 사용하였다(표 3).

분생포자 부유액^a	발병도(%)^b
감자액체배지(PDB)	43.0 c^c
10% 토마토쥬스(Tomato juice)	17.0 d
20% 토마토쥬스	21.0 d
30% 토마토쥬스	68.0 b
10% 토마토쥬스 + 0.1M KH₂PO₄	47.0 c
20% 토마토쥬스 + 0.1M KH₂PO₄	82.0 a
30% 토마토쥬스 + 0.1M KH₂PO₄	72.0 b
살균수(Sterilized water)	0 e
대조군(무처리)	0 e

^a파종 31일 후의 7엽 토마토식물

^b발병도(%) 는 접종 7일후에 조사

^c통계처리; 둘칸 다중 범위 테스트(Duncan's multiple range test) (P=0.05%)

<실험예 2> 들깨 품종간 저항성 검정

본 발명자들은 농가에서 많이 재배되면서 각종 형질이 우수한 광양, 구례3-13, 고성재래종, 진주재래종, 잎들깨 1호-1, 밀양, 추부종, 옥동, 경신, 하동, 구포 등 11 품종의 들깨를 이용하여 LVF12 균주에 의한 발병도를 조사하였다. 구체적으로, 품종간 저항성 정도를 검정하기 위하여 PDA 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 공시 병원균 LVF12 균주의 분생포자를 병원성 검정에 효과적인 포자부유액인 것으로 확인된 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 1×10⁶개의 농도로 조정한 것을 접종원으로 하여 품종별로 각 3주씩 들깨 잎에 접종한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에 보관하였으며 처리 8일 후 발병도를 조사하였다.

그 결과, 공시한 11 품종 모두 높은 발병도를 보여 상기 잿빛곰팡이병에 대한 품종간 저항성은 높지 않은 것으로 확인되었으며, 그 중에서도 밀양품종이 46.7%로 발병도가 가장 낮은 것으로 나타났다(표 4).

품 종	발병도(%)
옥동(Okdong)	61.7
구포(Gupo)	53.3
광양(Kwangyang)	83.3
페릴라1-1(Perilla 1-1(small))	76.7
밀양(Milyang)	46.7
추부(Chubu)	75.0
구례 3-13(Gurae 3-13)	80.0
경신(Kyungsin)	58.3
고성 재래(Gosung jerae)	78.3
하동(Hadong)	56.7
진주 재래(Jinju jerae)	78.3

<실시예 1> 잿빛곰팡이병원균에 대한 길항미생물의 선발

본 발명자들은 경남 김해지역의 들깨잎과 근권토양에서 분리한 미생물 250 균주를 공시하여 잿빛곰팡이병원균 LVF12 균주의 균사생장 및 분생포자 발아 억제 효과가 큰 균주를 1차적으로 우선 선발하였으며, 상기 길항균의 발병억제 효과를 검정하여 발병억제 효과가 큰 균주를 최종 길항균으로 선발하였다. 균사생장 억제효과는 감자한천평판(PDA) 배지상에서 공시 미생물과 LVF12 균주를 대치배양하여 저지대의 크기를 조사함으로써 결정하였다. 구체적으로, 포자발아 억제 효과는 공시 미생물을 영양배지(NB, nutrient broth, Difco, USA)에서 30℃로 5일간 진탕배양하고 원심분리한 상등액을 0.22 ㎛ 필터(밀리포어)로 여과한 배양여액에 LVF12 균주의 분생포자를 혼합한 후 물한천 배지(Water agar, Difco, USA)에 1 ㎖를 도말하고 12시간 및 48시간 후에 포자 발아율을 조사하였다. 배양여액 대신 살균수와 혼합한 것을 대조군으로 사용하여 비교하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로 여과한 배양여액을 PDA 배지상에 도말한 후 공시병원균의 균사절편을 치상하여 균사생장에 미치는 영향도 조사하였다. 1차적으로 선발된 길항균을 이용한 발병 억제효과를 생육상 내에서 포트검정하기 위하여, 감자한천평판(PDA) 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 10⁷개의 농도로 조정한 포자부유액과 영양 배지에서 5일간 진탕배양한 선발 길항균을 병원균과 비슷한 농도로 조정하여 같은 양을 혼합한 후 각 5주씩 들깨잎에 분무 접종한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에서 보관하면서 처리 7일 후 발병도를 조사하고 병원균만을 처리한 대조군과 비교하여 방제가를 환산하였다.

그 결과, 잿빛곰팡이병원균 LVF12에 대하여 길항능력을 갖는 6개의 균주를 선별하여, 이들을 각각 N1, N2, N3, N4, N5 및 N6라 명명하였다. 상기 균주들은 모두 우수한 균사생장 억제효과를 보였으며, 그 중에서도 N1 및 N4 균주에 의한 억제효과가 가장 높았다(표 5 및 도 2).

길항 미생물	생장 저지대 (㎜)^a
N1	35.0
N2	24.0
N3	22.0
N4	37.0
N5	25.0
N6	27.0

^a생육저지대; 배양 7일 후 조사

본 발명자들은 N1 및 N4 균주의 배양여액에 병원균 LVF12 균주의 분생포자를 혼합한 후 포자발아율을 조사한 결과, 길항세균을 처리하지 않은 살균수의 경우 분생포자 발아율은 처리 48시간 후에 90% 이었으나, N1 또는 N4 균주를 처리한 경우에는 발아가 100% 저지되었다(표 6). 또한 배양여액이 함유된 감자한천평판(PDA) 배지상에서는 균사생장은 매우 느렸고, 균사형태도 심하게 변형되었다(도 3). 균사생장 및 포자발아 억제효과가 높아서 일차적으로 선발된 세균 6균주에 의한 발병 억제효과를 생육상내에서 포트 검정한 결과 공시 6균주 모두 70%이상의 방제가를 보였으며, N1 균주에 의한 방제가 95.3%, N4 균주는 90.8%로 높은 방제가를 보였다(도 4). 따라서 가장 높은 방제효과를 보이는 N1 균주를 잿빛곰팡이병균에 대한 길항균으로 최종 선발하였다.

길항 세균	분생포자 발아율 (%±S.D)^a
길항 세균	12시간 후	48시간 후
N1	0	0
N4	0	3±2
물	72±4	90±4

^a분생포자발아율; 물한천배지상에서 현미경으로 관찰

<실시예 2> 선발 길항균에 의한 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과 검정

감자한천평판(PDA) 배지상에서 3주간 배양하여 형성된 LVF12 균주의 분생포자를 10% 토마토 쥬스에 부유하여 ㎖당 10⁷개의 농도로 조정한 포자부유액과 NB 배지에서 5일간 배양한 N1 및 N4 길항균을 병원균과 비슷한 농도로 조정하였으며, 병원균을 먼저 접종한 후 3일 동안 1일 간격으로 길항균을 접종하고 발병도를 조사함으로써 길항균에 의한 발병 치료 효과를 조사하였다. 또한, 길항균을 먼저 접종한 후 3일 동안 1일 간격으로 병원균을 접종하고 발병도를 조사하여 발병 예방 효과를 조사하였다. 각 5주씩 들깨잎에 처리한 후 상대습도 90% 이상, 20±2℃의 생육상에 보관하면서 처리 7일 후 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였으며, 방제가는 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.

그 결과, N1 및 N4 길항균과 병원균의 동시 접종은 물론, N1 및 N4 길항균을 병원균 접종 1∼3일전과 병원균 접종 1∼3일 후에 처리하여도 방제가가 N1 균주에서 100%, N4 균주에서는 100∼87.3%로 나타났다(표 7). 상기 결과로부터 N1 및 N4 균주 모두 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과가 뛰어남을 확인하였다.

세균접종 후 경과된 시간	발병도 (%)		방제가(%)
세균접종 후 경과된 시간	N1^a+Pa	Pa^b 단독	N1+Pa
3일 전	0.0	-	100
2일 전	0.0	-	100
1일 전	0.0	-	100
동시접종	0.0	73.3	100
1일 후	0.0	-	100
2일 후	0.0	-	100
3일 후	0.0	-	100

^aN1 : 길항세균 바실러스 리케니포미스 N1(Bacillus licheniformis N1)

^bPa 단독 : 병원균 단독 처리(Botrytis cinerea LVF12)

<실시예 3> 길항 세균의 동정

본 발명자들은 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 잿빛곰팡이병의 발병예방 및 치료효과가 확인된 N1 길항균을 동정하기 위하여, 광학현미경(x1,000) 및 전자현미경(SEM, Hitachi, Japan)으로 균주의 크기와 형태를 관찰하였으며, 버기스 메뉴얼(Bergey's manual)(Bergey's manual of Systematic Bacteriology. 1986. Williams & Wilkins)에 따라 생화학적, 배양적 및 생리적 특성을 조사하였고(표 1), 아울러 API 20E와 50CHB 킷트(bioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다.

그 결과, 상기 N1 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 살펴보면, 상기 균주는 그람 양성이고, 내생포자를 형성하며, 세포 직경은 1 ㎛ 이하이고, 혐기성에서도 성장하며, 2 내지 7% NaCl 농도에서도 성장하였다. 또한, 카세인, 젤라틴 및 전분을 가수분해하였고, 질산염 환원, 시트르산 이용 및 보게스-프로사카우어르 테스트에서 양성을 나타내어, 바실러스 리케니포미스와 동일한 특징을 갖는 것으로 나타났다(표 1).

동정의 정확성을 기하기 위하여 API 시스템으로 동정하여도 N1 균주는 바실러스 리케니포미스와 유사도가 88.8%로 버기스 메뉴얼에 의한 동정과 일치하였다. 또한 16S rRNA 분석 결과, 상기 균주는 1508 bp의 서열번호 1로 기재되는 서열을 갖고 있고, 상기 서열은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)와 99% 이상의 상동성을 보여, N1 균주는 바실러스 리케니포미스인 것으로 동정되었다.

본 발명자들은 상기에서 선별하고 동정한 N1 균주를 "바실러스 리케니포미스 N1"이라 명명하고, 이를 2002년 8월 3일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10319BP).

<실시예 4> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 탄소원이 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 영향을 주는 탄소원에 대하여 조사하였다. 길항균을 제제화하여 미생물제제를 만들기 위해 우선 균주의 길항력을 제고할 수 있는 탄소원과 질소원을 조사해야 하는데 먼저 바실러스 리케니포미스 N1에 의한 잿빛곰팡이병균의 균사생장 억제효과가 어느 탄소원에서 영향이 큰지를 조사하였다. 구체적으로, 콩가루 1%, FeSO₄·7H₂O 0.05%, MnCl₂·4H₂O 0.005%를 기본배지로 하고 여기에 공시 탄소원 1%를 첨가하여 멸균한 다음 길항세균을 접종하고 30℃에서 5일간 진탕배양하여 원심분리 하였다. 상기 상등액을 0.22 ㎛ 필터(밀리포어)로 여과한 후 5.0 ㎜ 페이퍼 디스크(paper disk)에 50 ㎕를 적시고 PDA 배지에 병원균과 페이퍼 디스크를 치상한 후 대치배양하여 병원균의 억제효과를 저지대로 표시하였다. 공시한 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 락토스, 말토스, 갈락토스, 전분(starch), 솔비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol) 및 글리세롤이며, 이를 각각 1%씩 첨가하여 길항세균을 접종한 후 30℃, 160 rpm에서 진탕배양하였다. 48시간 배양 후, 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 여과(Milipore filter, 0.22 ㎛, USA)하고, 살균 페이퍼 디스크(직경 5.0 ㎜)에 여과액 50 ㎕를 처리하고, 자연건조시켜 PDA 배지에 병원균 절편(직경 8.0 ㎜)과 대치배양하여 잿빛곰팡이병원균의 균사생장 저지대의 직경을 조사하여 탄소원 종류에 따른 균사생장 저지효과를 비교하였다.

그 결과, 글루코스를 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때 5.3 ㎜의 저지대를 보여 가장 높은 효과를 보였으며, 전분, 솔비톨 및 이노시톨을 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때에서 억제효과를 보였다. 그러나 프럭토스, 락토스, 말토스 및 갈락토스를 탄소원으로 사용하여 배양하였을 때에는 전혀 억제효과가 없었다(표 8).

탄소원(1.0%)	생육저지대 (㎜)
글루코스	5.3
프럭토스	-
락토스	-
말토스	-
갈락토스	-
전분	3.2
솔비톨	2.3
이노실톨	2.1
글리세롤	-

<실시예 5> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 질소원이 미치는 영향

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 길항력에 영향을 주는 질소원에 대하여 조사하였다. 구체적으로, 잿빛곰팡이병균의 균사생장 억제효과가 어느 질소원에서 영향이 큰가를 조사하기 위해 글루코스 1%, FeSO₄·7H₂O 0.05%, MnCl₂·4H₂O 0.005%를 기본배지로 하고 여기에 공시 질소원 0.5%를 첨가하여 멸균한 다음 본 발명의 N1 균주를 접종하고 30℃에서 5일간 진탕배양하여 여과하였다. 저지대 조사방법은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 공시한 질소원은 (NH₄)₂SO₄, 카자민산(casamino acid), 트립신, 쇠고기 추출물(beef extract), 맥아정(malt extract), 효모 추출물(yeast extract)이고, 이를 각각 0.5% 첨가하였다.

그 결과, 공시한 질소원 중에서는 트립신에서 4.5 ㎜의 저지대를 보여 가장 효과적이었고, 다음은 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정 순이었으나, (NH₄)₂SO₄및 카자민산에서는 전혀 억제 효과가 없었다(표 9).

질소원(0.5%)	생육 저지대(㎜)
(NH₄)₂SO₄	-
카자민산(casamino acid)	-
트립신	4.5
쇠고기 추출물(beef extract)	2.9
맥아정(malt extract)	2.3
효모 추출물(yeast extract)	2.8

<실시예 6> 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 대량배양

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주를 대량배양하여 항진균 활성물질의 생산이 최적인 배지를 선발하였다. 구체적으로, 250 ㎖의 플라스크에 증류수 100 ㎖를 넣고, 대량배양 배지로서 시중에서 쉽게 구할 수 있고 염가인 비지, 밀기울, 대두박, 깻묵, 볏짚 등의 농가 부산물 및 농가 폐기물을 각각 5%씩 첨가하고 여기에 영양배지(Nutrient broth, Difco, USA)에서 24시간 배양된 N1 균주 2 ㎖(1×10⁷ 세포/㎖)를 접종하였다. 30℃, 160 rpm으로 72시간 배양하여 4시간 간격으로 세균의 밀도를 흡광광도계(spectrophotometer, 660 nm)로 측정하여 세균의 밀도가 최고에 도달하는 시점에서 세균밀도를 측정하였다. 비지가루는 시장에서 폐기하는 비지를 구하여 오븐에서 수분을 완전히 제거하여 말린 것을 사용하였으며 옥수수전분, 쌀가루, 보리맥아, 밀기울 등은 시중에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였고, 미강, 볏집, 대두박 등은 농가에서 수집한 것과 수입품을 사용하였다. 간장생산부산물은 간장을 제조하고 남은 찌꺼기를 사용하였고, 어묵은 생선혼합물을 사용하였다. 단술을 제외한 모든 기질은 60℃에서 24시간 건조한 후 블랜더(Blender, Waring, USA)로 분쇄하여 사용하였다.

그 결과, 공시한 14종의 배지 중 비지 배지에서 10¹¹ 세포/㎖ 이상으로 세균 밀도가 가장 높았으며, 다음은 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강(Rice bran), 단술, 쌀가루 및 볏짚 등에서도 효과적이었다(도 6).

<실시예 7> 수화제형 미생물제제의 제조

본 발명자들은 바실러스 리케니포미스 N1 균주를 포함하는 미생물제제를 제조하였다. 구체적으로, 바실러스 리케니포미스 N1 균주를 비지배지에 접종하고, 7 ℓ 발효기에서 30℃, 300 rpm으로 72시간 배양하였다. 바실러스 리케니포미스 배양액 1 ℓ에 전착제, 보호제 및 영양원의 성분을 달리하여 N1A(옥수수 전분, 올리브 기름), N1B(옥수수 전분), N1C(옥수수 전분, 올리브 기름, 흰설탕), N1D(옥수수 전분, 올리브 기름, 흰설탕) 및 N1E(옥수수 전분, 올리브 기름, 흰설탕) 제제를 제조한 후(표 10), 이를 50℃ 오븐에서 48시간 건조하여 블랜더로 분쇄하고 200 메쉬(mesh) 체를 쳐 통과하는 분말을 수집하여 수화형 미생물제제로 제조하였다. 상기 미생물제제를 상온에서 유리병에 넣고 마개에 구멍을 뚫어 탈지면으로 봉한 후 공기가 통하게 하여 보관하면서 실험에 사용하였다.

대상 작물	제제명	구성성분/ 세균배양액 1 L
토마토딸기양상추	N1A 제제	옥수수 전분 600 g올리브오일 50 ㎖
	N1B 제제	옥수수 전분 600 g
	N1C 제제	옥수수 전분 600 g올리브오일 75 ㎖백설탕 50 g
	N1D 제제	옥수수 전분 400 g올리브오일 25 ㎖백설탕 50 g
	N1E 제제	옥수수 전분 400 g올리브오일 50 ㎖백설탕 50 g

<실시예 8> 생육상내에서의 방제 효과 검정

본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 미생물제제의 방제효과를 조사하였다. 구체적으로, 상기 N1A, N1B, N1C, N1D 및 N1E 등 5종류의 미생물제제 실험군으로 사용하고 토마토 잿빛곰팡이병에 품목고시된 이프로디온 수화제를 대조군으로 사용하여 방제 효과를 검정하였다. 본 발명의 각각의 제제(1×10⁹ 세포/g)는 수돗물에 100배 희석하였고, 이프로딘 수화제는 1,000배로 희석하였다. 병원균 LVF12 균주는 PDA 배지에서 15일간 25℃, 광암(12hr/12hr) 처리 하에서 배양하여 형성된 1.6 ×10⁶분생포자/㎖를 0.1 M KH₂PO₄를 첨가한 20% 토마토쥬스에 넣어 만든 포자 부유액을 접종원으로 사용하였다. 토마토(품종 : 광명)는 하우스 내에서 묘종상자에 종자를 파종하고 파종 10일째에 포트에 정식하여 자란 본엽 7엽기의 것을 사용하였으며, 20±2℃, 상대습도 90%, 광암(12hr/12hr) 조건인 생육상에 하루를 보관하고 24시간 후에 잎의 앞, 뒷면에 공시한 분생포자 부유액이 흘러내릴 정도로 분무 접종한 후 동일한 조건의 생육상에서 보관하였다. 토마토는 각 처리 당 5주씩 3회 반복 실시하였고, 병원균 접종 24시간 후에 25±5℃의 하우스에 옮겨 보관하면서 1일 간격으로 10일간 발병도를 조사한 후 수학식 1의 방제가로 환산하였다.

그 결과, N1A, N1B, N1C, N1D 및 N1E의 방제가가 각각 66.0, 66.0, 82.0, 74.0 및 92.0%로 나타나 N1E 제제의 방제 효과가 가장 높음을 확인하였으며, 이는 대조군으로 사용한 이프로디온 수화제의 방제가(80.0%) 보다 높은 수치이다. 또한, N1C 제제는 방제가가 82.0%로서 이프로디온 수화제의 방제의 경우와 유사하였다(표 11 및 도 7).

개발된 미생물제제	방제가 (%)
N1A 제제	66.0 c^*
N1B 제제	66.0 c
N1C 제제	82.0 b
N1D 제제	74.0 bc
N1E 제제	92.0 c
이프로디온 수화제(화학농약)	80.0 b
병원균 단독 처리	0.0 d

^*통계처리 : 5% 수준에서 DMRT

<실시예 9> 하우스내 폿트재배에서의 방제 효과 검정

본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 5종류의 제제 중 상기 실시예 8에서 생육상 내 검정에서 방제 효과가 확인된 N1C(10⁹ 세포/g) 및 N1E(10⁹ 세포/g) 제제와 대조군인 이프로디온 수화제를 사용하여 하우스 내에서의 방제 효과를 검정하였다. 각각의 제제는 수돗물에 100배 희석하였고 이프로디온 수화제는 1,000배 희석하였다. 병원균 LVF12 균주는 PDA 배지에서 15일간 25℃, 광암(12hr/12hr) 처리 하에서 배양하여 형성된 1.6 X 10⁶분생포자(conidia)/㎖를 0.1 M KH₂PO₄를 첨가한 20% 토마토쥬스에 첨가하여 포자 부유액을 제조하였다. 토마토는 본엽 7엽기의 것을 사용하였으며 잎에 제제와 이프로디온 수화제를 처리하고 24시간 후에 병원균 분생포자 부유액을 접종하였다. 하우스 내 조건은 상대습도 90%, 온도는 낮 25±5℃, 밤 15±2℃를 유지하였다. 토마토는 각 처리 당 5주씩 3반복으로 하였고, 병원균 접종 24시간 후부터 2일 간격으로 15일간 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였다.

그 결과, 접종 후 11일째에 N1C제제 및 N1E제제가 각각 91.7% 및 88.6%로 이프로디온 수화제(85.5%)보다 방제효과가 높게 나타났다(표 12).

미생물제제	방제가 (%)
N1C 제제	88.6 a
N1E 제제	91.7 a^a
이프로디온 수화제(화학농약)	85.5 a
병원균 단독 처리	0 b

^a통계처리: 5% 수준에서 DMRT

<실시예 10> 하우스내 토경 재배에서의 방제 효과 검정

본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 5종류의 제제 중 생육상 내 검정에서 방제 효과가 확인된 N1C(10⁹ 세포/g) 및 N1E(10⁹ 세포/g) 제제와 대조군으로 이프로디온 수화제를 사용하여 하우스 내에서의 방제 효과를 검정하였다. 각각의 제제는 수돗물에 100배 희석하였고 이프로디온 수화제는 1,000배 희석하였다. 병원균 LVF12 균주는 PDA 배지에서 15일간 25℃, 광암(12hr/12hr) 처리 하에서 배양하여 형성된 1.6 × 10⁶분생포자/㎖를 0.1 M KH₂PO₄를 첨가한 20% 토마토쥬스에 첨가하여 포자 부유액을 만들었다. 토마토는 본엽 3엽기(파종 25일 후)의 토마토를 하우스 내 포장에 옮겨 심어 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 처리하여 N1C와 N1E 제제의 방제 효과를 검정하였다.

그 결과, 접종 후 11일째에 방제가는 N1C 제제 및 N1E 제제가 각각 88.3%, 90.5%로 상기 실시예 9의 포트재배의 경우와 마찬가지로 N1E 제제의 방제효과가 가장 우수하였으며, 이프로디온 수화제를 사용한 경우의 86.9%보다 우수한 방제 효과가 나타났다(표 13 및 도 8).

미생물제제	방제가 (%)
N1C 제제	88.3 a^a
N1E 제제	90.5 a
이프로디온 수화제(화학농약)	86.9 a
병원균 단독 처리	0 b

^a통계처리: 5% 수준에서 DMRT

<실시예 11> 열매 수량과 무게 비교

본 발명자들은 상기 실시예 7에서 제조한 N1C 제제 및 N1E 제제와 대조군으로 사용한 이프로디온 수화제를 이용하여 하우스 내에서 방제 효과에 따른 토마토 열매의 수량과 무게를 비교 검정해 보았다. 각각의 제제는 수돗물에 100배 희석하여 사용하였고, 이프로디온 수화제는 1,000배 희석하여 사용하였다. 제제와 이프로디온 수화제는 병원균 접종 24시간 전에 처리하였고, 분생포자 접종원 부유액 처리는 상기 실시예 9 또는 실시예 10의 하우스 내 미생물제제의 방제 효과 검정 실험과 동일하게 수행하였는데, 각각 1화방과 2화방의 꽃과 꽃받침, 잎의 앞, 뒷면에 흘러내릴 정도로 분무 접종한 후 상대습도 90%, 온도는 낮 25±5℃, 밤 15±2℃를 유지하였다. 토마토는 하우스 내의 포장에 심어놓은(정식 거리 90×40 ㎝) 본엽 12엽기의 것을 사용하였으며 각 처리 당 5주씩 3회 반복으로 하였고, 병원균 접종 3일, 6일 후에 제제와 이프로디온 수화제를 2회 더 처리하였다. 병원균 접종 25일 후에 각각의 처리에서 수확한 토마토의 수량과 무게를 비교하였다.

그 결과, 열매의 수량 비교에 있어서 N1E 제제와 N1C 제제 처리시 각각 17개, 31개로 화학농약 처리시의 13개보다 많았으며, 병원균 단독처리에서의 11개보다도 월등히 수확량이 많았다(표 14, 도 9). 또한, 이들의 무게를 측정한 결과 N1E 제제가 N1C 제제 또는 화학농약 처리시보다 무거웠으며, 대조군에 비해 1.4배가 무거웠다. 상기 열매의 수확량과 무게의 차이는 미생물제제 N1E 제제가 포함하고 있는 천연물 재료인 옥수수전분, 올리브오일 그리고 백설탕에 의한 것으로서, 옥수수 전분은 전착제로서, 올리브 기름는 길항균의 보호제로서 그리고 백설탕을 길항균의 영양원으로 작용했기 때문이다. 하지만 N1C 제제는 옥수수 전분과 올리브 기름의 량이 N1E제제보다 다량 첨가되어 식물체 잎의 호흡에 곤란을 초래하여 결국 N1E 제제보다 낮은 방제효과를 보였다.

미생물제제	열매 총수량(수)	열매 총무게(g)
N1C 제제	17 ab	160.6 b^a
N1E 제제	31 a	319.0 a
이프로디온 수화제 (화학농약)	13 b	155.8 b
병원균 단독 처리	11 b	92.2 c
무처리	25 ab	230.4 ab

^a통계처리: 5% 수준에서 DMRT

<실시예 12> 토경재배한 토마토 잎에서의 N1E 제제의 경시적 방제 효과

본 발명자들은 방제 효과가 확인된 N1E 제제가 토마토 잎에서 나타내는 방제효과의 경시적 변화를 조사하였다.

그 결과, N1E 제제와 화학농약 이프로디온 수화제의 방제효과의 경시적 변화 패턴은 거의 유사하였는데, N1E 제제의 방제효과는 2일에서 17일까지는 98.8%에서 92.2%로서 90% 이상 유지되었으며, 20일째에 84.9%까지 저하되었다. 이는 이프로디온 수화제가 20일째에 79.9%인 것에 비하여 높은 것으로 나타났다(도 10).

<실시예 13> 자연병발생 포장에서의 미생물제제의 방제 효과 검정

<13-1> 미생물제제의 최적처리농도

본 발명자들은 잿빛곰팡이병이 자연발생되는 3월∼5월경 포장에서 토경재배된 토마토 작물에 N1E 제제를 배부식 살포기로 분무처리하고, 7일간격으로 3회 연속처리하여 최적처리농도를 결정하였다. N1E 제제를 농도별로 100배, 200배, 300배 또는 500배로 희석하여 토마토에 처리하고 21일 후에 진전된 발병율을 조사한 다음 방제가로 환산하였다. 화학농약인 디에토펜카브·가벤다 수화제는 폿트 및 온실 실험에 사용한 이프로디온보다 실제 농가에서 많이 사용되고 있으므로 비교 실험을 하기위해 디에토펜카브·가벤다 수화제(상품명; 깨끄탄)를 처리하였다.

그 결과, 100배 희석액의 방제가는 92.5%인데 반해 200배, 300배, 500배 희석액은 각각 81.7%, 74.7%, 61.8%의 방제가를 보여, 이들 중 방제효과가 가장 높은 100배 희석액을 최적처리농도로 선발하였다(도 11 및 도 12).

<13-2> 미생물제제의 최적살포횟수

본 발명자들은 잿빛곰팡이병이 자연발생된 토마토 작물에 N1E 제제의 최적처리농도인 100배 희석액을 처리 횟수별로 나누어 분무하고 매주 발병율을 조사하여 최적처리횟수를 결정하였다. 이때 미생물제제를 처리구별로 7일 간격 1회 단독살포, 3일 간격 2회 연속살포, 7일 간격 2회 연속살포, 3일 간격 3회 연속살포, 7일 간격 3회 연속살포로 처리하여 21일 후에 방제효과를 비교하여 가장 적합한 처리 횟수를 결정하였다.

그 결과, 3회 연속살포가 1회 단독살포나 2회 연속살포보다 높은 방제효과를 보여 주었으며, 7일 간격 3회 연속 살포한 경우 방제가가 87.5%로, 3일 간격 3회연속살포의 83.6%와 비교하여 유의차가 없었으나 약간 높은 방제가를 나타내어, 7일간격 3회 연속살포가 가장 적합한 처리횟수로 최종 결정되었다. 이는 미생물제제가 작물에서 오래 지속될수록 방제효과가 높아지기 때문인 것으로 판단된다(도 13 및 도 14).

<13-3> 미생물제제와 화학농약의 방제효과 비교

본 발명자들은 잿빛곰팡이병이 자연발생되는 3월∼5월경 포장에서 재배된 토마토에 각각의 미생물제제와 화학농약을 7일 간격으로 3회 연속처리하고 21일 동안 방제효과를 검정하였다. 앞서의 실험에서 효과가 우수하였던 미생물제제를 100배로, 화학농약인 디에토펜카브·가벤다 수화제는 1,000배로 희석하여 이들의 방제효과를 비교하였다. N1E 수화제는 7일 간격으로 3회 처리하였고, 처리 3주 후에 방제가를 조사하였다.

그 결과, N1E 수화제를 사용한 경우에는 방제가가 90.5%로, 화학농약인 디에토펜카브·가벤다 수화제의 방제가 77.0% 보다도 우수한 방제효과를 나타내었다. 상기 결과로부터, 토경재배 실험에서와 마찬가지로 자연병발생 포장의 경우에도 본 발명의 N1E 제제의 방제 효과가 우수함을 확인하였다(도 15 및 도 16).

<13-4> 열매 수량과 무게 비교

본 발명자들은 잿빛곰팡이병이 자연발생된 포장의 토경재배된 토마토에 본 발명의 미생물제제 N1E 제제의 처리시 열매 수량 증대 효과를 검정하고자 하였다. 이를 위하여 5화방까지 자란 열매를 7일 간격으로 수확하여 처리별로 평균 열매수를 조사하고 이들의 과장, 과폭, 과경을 조사하였으며 또한, 열매에 발생한 병의 발병도를 조사하여 이를 방제가로 환산하였다.

그 결과, 토마토 열매상에서의 미생물제제 N1E 제제의 방제가가 82.0%인 반면 농약은 48.3%로 낮은 방제효과를 보여 주었으며, 또한 수확한 평균열매수는 N1E 처리구에서 16.2개로 화학농약의 9.2개보다 많았다. 과중 역시 평균 열매수에 비례하여 N1E 제제가 가장 무거웠으며 대조군에 비하여 약 1.95배 무거웠다. 하지만, 열매의 과폭 또는 과장의 차이는 처리별로 유의차가 없는 것으로 나타났다(표 15).

제제	대조 값(%)	평균
제제	대조 값(%)	열매수 (개)	과중 (g)	과장 (㎝)	과폭 (㎝)
N1E^a	82.0a	16.2a	132.9a	5.4a	6.4a
D+C^b	48.3b	9.2b	121.9ab	5.1a	6.5a
대조군^c	1.0c	2.8c	68.3c	4.4a	5.0b

^aN1E 제제, 수화제형 미생물제제 (WP)

^bD+C: 화학농약 (diethofencarb+carbendazim)

^c무처리: 대조군 (병자연발생구)

^d통계처리: 5% 수준에서 DMRT

<13-5> 미생물제제와 화학농약의 교차시용 효과 검정

본 발명자들은 N1E 수화제와 화학농약 디에토펜카브·카벤다지움을 자연병발생된 토마토 작물에 단독 시용, 교차 시용, 혼합 시용으로 나누어 3일 간격 6회 살포하고 21일 후에 각 처리구의 방제효과를 비교 검정하였다.

그 결과, N1E 제제의 단독 시용시 21일 후까지 90%의 방제효과가 지속되었으나, 교차 시용시에는 N1E 3회 / DC 1회 / N1E 2회 처리구의 경우 방제가가 82.2%로 나타났으며, N1E 2회 / DC 1회 / N1E 2회 / DC 1회 처리구의 경우에는 방제가 80.5%로 나타나 교차 시용시에는 N1E를 단독으로 처리한 경우보다 방제가가 낮았으며, 혼합 시용시에도 N1E 단독처리보다 낮았다. 화학농약(DC)만을 처리하는 경우에는 시간이 경과할수록 방제효과가 감소하여 21일 후에는 56.5%로 가장 낮은 방제가를 보였으며, 가장 우수한 처리구는 91.1%의 방제가를 보인 N1E 단독 처리구였다(도 17 및 도 18).

<13-6> 열매 수량 증대 효과 비교

본 발명자들은 상기 실시예 <13-5>의 미생물제제 N1E 제제 단독시용 또는 화학농약과의 교차, 혼합시용시의 열매 수량 증대효과를 검정하고자 하였다. 토마토 열매는 5화방까지 자란 것들 중 3일 간격으로 출하용으로 수확한 열매로서 이들의 평균 수확 열매수, 과중, 과폭, 과장을 비교하고, 또한 열매에서의 발병도를 조사하여 방제가로 환산하여 비교 검정하였다.

그 결과, 상기 실시예 <13-3>의 미생물제제와 화학농약의 방제효과를 비교한 경우와 동일한 결과를 보였는데, N1E 제제 처리시 자연발생된 대조군에 비해 열매에서 병발생이 관찰되지 않아 바로 출하에 이용되었으며, 교차 또는 혼합 시용의 방제가가 농약 단독 처리구(DC)보다 다소 높았고 평균 열매수 역시 이와 동일한 결과를 보였다. 과중 과폭, 과경 역시 N1E 제제 단독 처리구에서 가장 높았으며 이를 제외한 나머지 처리구는 서로 유의차가 없었다(표 16).

제제	대조 값(%)	평균
제제	대조 값(%)	수량 (ea)	과중 (g)	과장 (㎝)	과폭 (㎝)
N1E^a	100 a	20.2 a^g	121.4 a	5.2 a	6.2 a
N1E3/DC1/N1E2^b	92.7 a	14.5 ab	69.9 b	4.4 b	5.1 b
N1E2/DC1/N1E2/DC1^c	76.0 b	12.5 ab	66.7 b	4.3 b	5.0 b
N1E2+DC1^d	80.2 b	13.8 ab	67.1 b	4.4 b	5.1 b
DC^e	68.8 c	11.0 ab	65.7 b	4.3 b	5.1 b
대조군^f	0.0 d	8.7 b	65.2 b	4.3 b	4.8 b

^aN1E 제제, 수화제형 미생물제제 (WP)

^b미생물제제(N1E)와 화학농약의 교호 살포

^c미생물제제(N1E)와 화학농약의 교호 살포

^d미생물제제(N1E)와 화학농약의 혼합 살포

^eD+C: 화학농약 (diethofencarb+carbendazim)

^f무처리: 대조군 (병자연발생구)

^g통계처리: DMRT at 5% level

<13-7> 미생물제제와 화학농약의 경시적 방제효과 비교

본 발명자들은 수화제형 N1E 제제를 잿빛곰팡이병 자연발생 포장의 토마토에 처리하고 방제효과의 경시적 변화를 3주까지 검정하였다.

그 결과, 본 발명의 미생물제제 N1E 제제는 3주까지도 90.5%로 지속적으로 높은 방제가를 유지하였으나, 화학농약인 디에토펜카브·카벤다지움은 75.6%로 시간이 경과함에 따라 서서히 방제효과가 감소하였다(도 19).

<실시예 14> 미생물제제의 온도별, 시기별 안정성

본 발명자들은 개발된 미생물농약의 안정성을 측정하기 위해 방제효과가 확인된 N1E 제제를 온도별, 시기별로 방치하였을 때 제제내에 생존된 길항세균의 수를 조사하여 이들의 활성 정도를 조사하였다. 7 ℓ 발효기에서 배양한 배양액으로 N1E 제제를 제조하여 4℃, 10℃, 25℃ 및 실온에 보관하면서 30일 간격으로 7개월 동안 제제내의 생세균수를 조사하였다.

그 결과, 4℃에서 보관한 제제의 세균수가 처음 제제 조제시의 세균수(7.5×10¹⁰ CFU/㎖)와 거의 유사하게 유지되어 제제 보관에 가장 안전하였다(표 17).

온도(℃)	세균수 [CFU(×10¹⁰)/㎖]
온도(℃)	1달 후	2달 후	3달 후	4달 후	5달 후	6달 후	7달 후
4℃	7.3a	6.5a	6.2a	5.0a	4.6a	4.1a	3.2a
10℃	5.0b	4.2a	3.3ab	2.5ab	2.2b	1.9ab	2.1ab
25℃	0.31c	0.12b	0.04b	0.02b	0.017c	0.011b	0.008b
실온	0.1.7c	0.07b	0.02b	0.01b	0.005c	0.008b	0.003b

통계처리: 5% 수준에서 DMRT

수화제 N1E 제제에 대하여 2001년 1월부터 2002년 4월까지 온도 차이에 따른 저장안정성을 조사한 결과, 미생물제제 내의 최초 세균수는 7.5×10¹¹cfu/㎖에서 1년 4개월이 경과하는 동안 6.0×10¹⁰cfu/㎖로서 매우 높은 수치의 세균수가 유지되는 것으로 보아 본 미생물제제는 매우 안정성이 높음을 확인하였다. 그러나, 보관상 온도별 유지되는 세균수에는 차이가 있었는데, 4℃ > 10℃ > 25℃ > 상온의 온도 순으로 세균수에 차이가 있으므로 미생물 제제의 보관은 4℃ 냉장보관이 가장 효과적인 것으로 조사되었다(도 20).

<실시예 15> 미생물제제의 약해·약효조사

상기 실시예를 통해 식물병 방제에 효과가 뛰어남을 확인한 본 발명의 미생물제제를 대상작물에 적용하기 위해 약해 및 약효를 조사하였다. 구체적으로, 본 발명의 적용 대상작물인 토마토, 딸기, 결구상추 및 상기 작물과 과와 종이 다른 5종의 육상식물(고추, 콩, 오이, 바랭이, 쇠비름) 그리고 3종의 수생식물(벼, 좀개구리밥, 미나리)에 농림부의 미생물농약 등록기준에 따라 수화제 N1E제제를 기준량인 100배와 배량인 50배로 희석하여 살포하고 약해 유무를 3일 간격으로 3회 조사하여 각 작물에 나타하는 약해를 조사하였다.

그 결과, 기준량과 배량으로 미생물제제를 처리한 모든 작물에서 약해증상은 나타나지 않았다. 반면, 미생물제제의 처리전과 처리후의 작물을 비교해 보면, 처리전보다 처리후가 작물의 생육이 촉진되었음을 알 수 있었고, 각 작물의 잎 표면이 다소 두꺼워졌으며 윤기가 흐르고 각 작물의 잎 색깔이 더욱 진해지는 것을 관찰하였다(표 18).

시험약제	시험작물	약해정도		비고
시험약제	시험작물	기준량 (100배 희석)	배량 (50배 희석)	비고
N1E제제	토마토	0	0	약해없음
	딸기	0	0	약해없음
	결구상추	0	0	약해없음
	벼	0	0	약해없음
	오이	0	0	약해없음
	고추	0	0	약해없음
	바랭이	0	0	약해없음
	쇠비름	0	0	약해없음
	미나리	0	0	약해없음
	좀개구리밥	0	0	약해없음

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 리케니포미스는 잿빛곰팡이병원균에 대하여 우수한 항진균 활성을 가지므로, 상기 균주를 포함한 미생물제제는 잿빛곰팡이병을 포함한 식물의 병해를 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라 저비용으로 미생물제제를 제조할 수 있으므로, 토마토, 오이 및 딸기 등의 농작물의 병해 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 의한 들깨 잎에서의 잿빛곰팡이병의 병징을 나타낸 사진이다.

A, B, C : 자연발생된 잿빛곰팡이병의 병징 모습,

D, E : 인공접종된 잿빛곰팡이병의 병징 모습

도 2는 본 발명에서 선별한 N1 및 N4 균주에 의해 잿빛곰팡이병원균의 생육이 억제된 것을 나타낸 사진이다.

A : N1 균주, B : N4 균주

도 3은 본 발명에서 선별한 N1 균주에 의해 잿빛곰팡이 병원균이 변형된 것을 현미경으로 관찰한 사진이다.

A : 정상적인 잿빛곰팡이병원균의 균사(X 400),

B : N1 균주에 의해 변형된 잿빛곰팡이병원균의 균사(X 400)

도 4는 들깨 포트재배에서 길항세균 종류에 따른 잿빛곰팡이병의 방제효과를 나타낸 사진이다.

N1, N2, N3, N4, N5, N6 : 본 발명에서 선별한 길항세균,

Pa : 보트리티스 시네리아

도 5는 본 발명에 따른 바실러스 리케니포미스 N1의 형태를 나타내는 전자현미경 사진이다.

막대 : 1 ㎛

도 6은 본 발명의 바실러스 리케니포미스 N1을 쌀가루(A), 미강(B), 밀기울(C), 대두박(D), 깻묵(E), 보리맥아(F), 볏짚(G), 비지(H), 어묵(I), 단술(J), 간장생산부산물(K), 사과껍질(L), 귤껍질(M) 또는 뉴트리언트 배지(N)에서 배양하였을 때의 세포 밀도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 생육상내에서 본 발명의 미생물제제의 방제효과를 나타낸 사진이다.

A : 대조군, B : 잿빛곰팡이병원균 단독 처리,

C : 잿빛곰팡이병원균 + N1E 처리,

D : 잿빛곰팡이병원균 + N1C 처리

도 8은 하우스내 토경재배에서 본 발명의 미생물제제의 방제효과를 나타낸 사진이다.

A : 잿빛곰팡이병원균 + N1C 처리, B : 잿빛곰팡이병원균 + N1E 처리,

C : 잿빛곰팡이병원균 단독 처리, D : 대조군(처리하지 않음)

도 9는 하우스내 토경재배에서 본 발명의 미생물제제 또는 화학농약으로 방제하였을 때 토마토 열매의 수량과 무게를 나타낸 사진이다.

A : 잿빛곰팡이병원균 단독 처리,

B : 잿빛곰팡이병원균 + N1C 처리,

C : 비교군

D : 대조군(처리하지 않음),

E : 잿빛곰팡이병원균 + N1E 처리,

F : 농약 처리

도 10은 하우스내 토경재배에서 본 발명의 미생물제제 또는 화학농약으로 방제한 방제효과의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.

도 11은 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제를 100배, 200배, 300배 또는 500배 희석하여 처리하였을 때 최적처리농도를 나타낸 그래프이다.

도 12는 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제를 100배, 200배, 300배 또는 500배 희석하여 7일 간격, 3회 살포로 처리하였을 때 최적처리농도를 나타낸 사진이다.

A: 100배 희석액, B: 200배 희석액, C: 300배 희석액,

D: 500배 희석액, E: 무처리한 대조구

도 13은 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제를 처리횟수를 달리하여 처리하였을 때 최적살포횟수를 나타낸 그래프이다.

도 14는 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제를 처리횟수를 달리하여 처리하였을 때 최적살포횟수를 나타낸 사진이다.

A: 7일간격 1회 살포, B: 3일간격 2회 살포, C: 7일간격 2회 살포

D: 3일간격 3회 살포, E: 7일간격 3회 살포, F: 무처리한 대조구

도 15는 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제와 화학농약의 방제효과를 비교한 그래프이다.

도 16은 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제와 화학농약의 방제효과를 발병도(%) 및 방제가(%)로 비교한 사진이다.

A: 미생물제제의 7일간격 3회 살포, B: 화학 농약의 7일간격 3회 살포,

C: 무처리한 대조구

도 17은 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제와 화학농약을 단독시용, 교차시용 또는 혼합시용하였을 때의 방제효과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제(a)와 화학농약(b)을 단독시용, 교차시용 또는 혼합시용하였을 때의 방제효과를 나타낸 사진이다.

A: 미생물제제의 3일간격 6회 연속살포(a→a→a→a→a→a),

B: 미생물제제와 화학농약의 3일간격 6회 교차살포(a→a→b→a→a→b),

C: 미생물제제와 화학농약의 3일간격 6회 교차살포(a→a→a→b→a→a),

D: 미생물제제와 화학농약의 3일간격 6회 교차살포(a→b→a→b→a→b),

E: 화학농약의 3일간격 6회 연속살포(b→b→b→b→b→b),

F: 자연병발생 대조구

도 19는 자연병발생 포장에서 본 발명의 미생물제제 또는 화학농약으로 방제한 경시적 방제효과를 나타낸 그래프이다.

도 20은 본 발명의 미생물제제의 온도에 따른 저장 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 21은 본 발명의 미생물제제의 육상식물에서의 약해·약효조사를 나타낸 사진이다.

A: 결구상추, B: 토마토, C: 딸기, D: 고추,

E: 오이, F: 바랭이, G: 쇠비름, H: 콩

도 22는 본 발명의 미생물제제의 수상식물에서의 약해·약효조사를 나타낸 사진이다.

A: 미나리, B: 벼, C: 좀개구리밥

<110> Dong-A University MOON, BYUNG-JU <120> Microbial agent containing Bacillus licheniformis to control plantpathogenic fungi and method for biological control using the same <130> 2p-07-20B <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1508 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis N1 <400> 1 agagtttgat tggctcaggc gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga 60 cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120 gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatagt tgtttgaacc 180 gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat 240 tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt 300 gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360 tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg 420 atcgtaaaac tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc caatagggcg gcaccttgac 480 ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat 600 gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa 660 gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt 720 ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac 780 aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt 840 ccgcccttta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag 900 actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc 1020 ttccccttcg ggggcagcgt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg 1140 gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200 atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa 1260 ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg 1320 actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag 1440 gtaacctttt ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa 1500 ggtagccg 1508

Claims

바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 배양액 1L에 대하여 옥수수전분 200 내지 1,000 g, 올리브오일 10 내지 100 ㎖ 및 설탕 10 내지 100 g을 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 식물의 진균 방제용 미생물제제.
제 1항에 있어서, 바실러스 리케니포미스 N1(수탁번호 : KCTC 10319BP)인 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 1항에 있어서, 상기 식물은 토마토, 들깨, 오이, 딸기 및 양상추로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 1항에 있어서, 상기 바실러스 리케니포미스는 글루코스, 전분, 솔비톨 및 이노시톨로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소원 및 트립톤, 쇠고기 추출물, 효모 추출물 및 맥아정으로 구성된 군으로부터 선택되는 질소원을 첨가한 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 1항에 있어서, 상기 배양액은 비지, 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강, 단술, 쌀가루 및 볏짚으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
제 5항에 있어서, 상기 배양액은 비지를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물제제.
삭제
삭제
삭제
삭제
식물의 곰팡이병원균 방제용 미생물제제의 제조방법에 있어서, 바실러스 리케니포미스 N1을 비지, 어묵, 밀기울, 대두박, 보리맥아, 깻묵, 미강, 단술, 쌀가루 및 볏짚으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상을 포함하는 첨가물이 첨가된 영양배지에 배양하고, 상기 배양액에 옥수수 전분, 올리브 오일 및 설탕을 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물제제의 제조방법.
제 11항에 있어서, 영양배지는 비지를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제의 제조방법.