KR100807403B1

KR100807403B1 - 식물 잿빛 곰팡이병 방제용 바실러스 아밀로리퀘페이션스ｌｐ03 균주 및 이를 이용한 미생물 제제의 제조방법

Info

Publication number: KR100807403B1
Application number: KR1020060070369A
Authority: KR
Inventors: 최용락; 이상철; 이용석; 김선희; 박인혜; 주우홍; 황철원
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2006-07-26
Filing date: 2006-07-26
Publication date: 2008-02-28
Also published as: KR20080010191A

Abstract

본 발명은 식물 잿빛 곰팡이병 방제용 바실러스 아밀로리퀘페이션스 LP03 균주 및 이를 이용한 미생물 제제의 제조방법에 관한 것으로, 식물병원성 곰팡이, 특히 잿빛 곰팡이병균에 대하여 우수한 길항활성을 가지는 농경지에서 분리 동정한 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03 균주를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 상기 균주를 이용하여 광범위한 항균력을 가지며, 활성의 지속성이 뛰어나고, 물리화학적으로 안전한 잿빛 곰팡이병을 포함하는 식물병원균의 방제를 위한 미생물 제제를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

식물 잿빛 곰팡이병, 바실러스 아밀로리퀘페이션스, 미생물제제, 항균활성, 농약

Description

식물 잿빛 곰팡이병 방제용 바실러스 아밀로리퀘페이션스 ＬＰ03 균주 및 이를 이용한 미생물 제제의 제조방법{Antifungal Bacillus amyloliquefaceins LP03 for controlling botrytis blight and a method for preparing microbial pesticide using the strain}

도 1은 본 발명 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaceins) LP03(수탁번호 : KACC 91257P) 균주의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 2는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaceins) LP03의 16S rDNA를 분석하여 계통분류를 나타낸 것이다.

도 3은 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaceins) LP03의 gyrA gene의 서열을 분석하여 계통분류를 나타낸 것이다.

도 4는 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaceins) LP03의 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria , 4(A)), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum, 4(B)) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 4(C))에 대한 항균활성을 나타낸 것이다.

도 5는 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaceins) LP03의 식물병 방제용 미생물 제제화 과정을 나타낸 것이다.

도 6은 바실러스 아밀로리퀘페이션스( Bacillus amyloliquefaceins) LP03에 의한 부추의 생육 촉진 및 잿빛 곰팡이 방제효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 식물 잿빛 곰팡이병의 방제를 위한 균주 바실러스 아밀로리퀘페이션스 LP03 및 이를 이용한 미생물제제의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 농경지에서 식물병원성 곰팡이, 특히 잿빛 곰팡이병균에 대하여 우수한 길항활성을 갖는 미생물을 분리 동정하고, 상기 미생물을 이용하여 광범위한 항균력을 가지며, 활성의 지속성이 뛰어나고, 물리화학적으로 안전한 잿빛 곰팡이병을 포함하는 식물병원균의 방제를 위한 미생물 제제의 제조에 관한 것이다.

현재 식물병원성 균은 잿빛곰팡이병(Botrytis cineria), 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum), 근부병(Fusarium oxysporum), 모잘록병(Rhizoctonia solani) 등 수많은 종류가 보고되어 있다.

작물의 생산량을 증가시키고, 상품가치를 향상시키기 위해서는 수많은 식물 병원성 균들을 방제해야 한다. 현재 식물병원성 균들을 방제하기 위해서, 다양한 합성 농약이 사용되어 지고 있다. 화학적으로 합성된 농약은 자연생태계 파괴, 인체 중독, 발암, 기형 및 각종 질환을 유발할 수 있기 때문에 세계적으로 사용을 제한하고 있는 추세이다.

따라서, 화학농약을 대체할 수 있는 환경친화적으로 식물병원균을 방제할 수 있는 방법이 절실히 요구되었다. 생물농약은 천적곤충·천적미생물·길항미생물 등 을 이용하여 화학농약과 같은 형태로 살포 또는 방사하여 병해충 및 잡초를 방제하는 약제이다. 생물농약에는 천적곤충제·천적미생물제와 같은 해충방제용 생물농약이 있으며, 천적미생물제와 같은 해충방제용 생물농약이 있으며, 천적미생물제에는 세균제제, 사상균제제, 사상균제제, 바이러스제제가 있다.

식물병원균 방제를 위한 많은 미생물제제 특히 세균제제가 많이 보고되어 있으며, 특히 바실러스 속의 균주들이 많이 보고되어 있다.

한국공개특허공보 특2001-OO72766(병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를 함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법)에는 바실러스 서브틸리스 버라이어티 아밀로리퀘페이션스(Bacillus subtilis var . amyloliquefacience KL1114 KCTC 8913P) 등의 미생물을 사용하여 다양한 식물병원성 균의 생육을 억제한 미생물제제 관한 것이 공개되어 있다.

한국공개특허공보 특2001-0015511(작물의 병해 방제용 균주, 이를 함유하는 미생물제제 및 그 용도)에는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) GB-017 KFCC-11070)의 배양액을 이용하여 식물의 잿빛곰팡이병, 잘로병, 입고병, 시들음병, 브라운 패취, 라지 패취 방제용 및 과채류 수확 후 선도유지용 살균제로 사용에 관한 것이 공개되어 있다.

한국등록특허공보 10-0431613(항진균 활성을 가지는 신규의 미생물 바실러스 서브틸리스 이비엠 31과 이를 함유하는 미생물농약)에는 바실러스 서브틸리스 EBM-31 KCTC 0985BP)를 함유하는 미생물 노약이 식물 병원성 진균인 벼도열병( Pyricularia oryzae), 입고병(Pythium ultimum), 벼문고병(Rhizoctonia solani), 사과부패병(Botryoshaeria dothidea), 깨씨무늬병(Bipolaris sorokniana), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 고추탄저병(Colletotrichum gloeosporioides), 벼도열병(Pyricularia grisea), 수박덩굴마름병(Mycosphaerella melonis), 고추역병(Phytophthora capsici), 토마토겹둥근무늬병(Alternaria solani), 근부병(Fusarium oxysporum), 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum), 버섯곰팡이병(Neurospora sp.), 그리고 특이적으로 동물 병원성 진균인 칸디다증(Candida albicans)에 항진균 활성 스펙트럼을 가지는 미생물이며, 이를 함유하는 병원성 진균 방제용 미생물농약(biopesticide)에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나 상기와 같은 바실러스 속의 균주로서 항진균 활성을 보이는 미생물방제제는 다수가 공개되어 있으나, 잿빛 곰팡이병(Botrytis cineria)균에 대해서는 그 활성이 다른 식물병원균에 비해 낮은 것이 단점이다.

따라서, 본 발명의 목적은 농경지에서 식물 잿빛 곰팡이병 방제에 효과가 있고, 다양한 식물병원성 균을 방제할 수 있는 미생물을 분리 동정하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 식물병원성 균의 효율적인 방제와 식물의 생육증진효과가 뛰어난 미생물 제제를 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 농경지에서 식물 잿빛 곰팡이병 방제에 효과가 있고, 다양한 식물병원성 곰팡이를 방제할 수 있는 미생물을 분리 동정하고, 상기 미생물의 분류학상의 위치를 확인하고, 상기 미생물의 항균활성을 조사하고, 상기 미생물을 이용하여 제조한 미생물 제제의 식물병원성 균의 효율적인 방제와 식물의 생육 증진에 대한 영향을 조사함으로써 달성하였다.

본 발명은 농경지에서 식물병원성 곰팡이를 방제할 수 있는 미생물의 분리 동정하는 단계; 상기 미생물의 분류학상의 위치 확인단계; 상기 미생물의 항균활성 조사단계; 및 상기 미생물을 이용하여 제조한 미생물 제제의 식물병원성 균의 효율적인 방제와 식물의 생육증진에 대한 영향 조사단계로 구성된다.

본 발명은 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03 KACC 91257P를 제공한다.

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03 KACC 91257P를 이용하여 제조하고, 식물병원성균의 효율적인 방제와 식물의 생육을 증진하는 미생물 제제를 제공한다.

상기 미생물 제제는 특히 부추의 생육을 촉진하고, 잿빛 곰팡이병 균을 방제하는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

[실시예]

실시예 1: 균주의 분리 및 동정

농경지에서 식물 잿빛 곰팡이병 방제에 효과가 있고, 다양한 식물병원성 곰팡이를 방제할 수 있는 미생물을 다음과 같이 분리 및 동정하였다.

균주의 분리

부산 인근의 경작지 토양을 채취하여, 생분해성 계면활성제 생성이 우수한 미생물을 분리하는 방법에 따라 항진균 활성이 뛰어난 미생물을 분리하기 위하여 탄소원이 결핍된 C-배지(Carbon-minimal medium, 배지의 조성: (NH₄)₂SO₄ 5g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.2g/L, KH₂PO₄ 1g/L, CaCl₂ 10mg/L, FeSO₄·7H₂O 10mg/L, NaCl 30g/L, 효모추출물 0.2g/L 및 트레이스 엘리먼트(trace element) 용액 2㎖ (MoO₃ 1mg/L, ZnSO₄·7H₂O 7mg/L, CuSO₄·5H₂O 0.5 mg/L, H₃BO₃ 1mg/L, CoCl₂·6H₂O 6mg/L, NiSO₄·6H₂O 1mg/L)를 함유하고 있으며, pH 7.0으로 조정함) 200㎖에 탄소원으로 원유(crude oil) 및 식용 오일이 1% 되게 첨가하여 37℃, 200rpm으로 7일간 진탕 배양한 후, 원유 분해능 및 유화제 생성능을 가진 세균이 생육하는 것을 확인하였다. 이렇게 3회 반복하여 생육한 균주를 LB-고체배지에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 선별된 단일 균주를 LB 액체배지에서 각각 전 배양시킨 후, 식물병원성 곰팡이 포자가 도말된 배지에 배양한 후 생육 저해존이 생성된 것을 우수한 균주로 보아 단일 콜로니를 선별하였다. 이 단일 콜로니들을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 전 배양시킨 후, 특히 잿빛 곰팡이병에 활성이 강하고 다양한 식물병원균에 대한 항진균 스펙트럼이 광범위한 LP03 선별하여 연구하였다.

균주의 동정

선별된 균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생리학적, 생화학적 특징을 조사한 후 세균학을 근거로 하여 1차적으로 동정하였으며, 좀 더 확실한 동정을 위하여 16S rDNA 그리고 gyrA gene의 분석을 기초로 하여 다른 종들과 유연관계를 통한 2차 동정하였다. 선별된 LP03의 동정을 위하여 그램 염색법, 형태학적 관찰 및 생화학적 실험을 수행한 결과를 표 1과 균주의 정확한 형태는 주사전자현미경으로 관찰한 것을 도 1에 나타내었다.

도 1에서 균주는 전형적인 바실러스(Bacillus) 형태의 간균으로 확인되었다. 그람 염색법에 의해서는 그람 양성균으로 확인되었으며, 현미경 관찰에서는 활발한 운동성을 가진 균주로 확인되었다.

생화학적 실험은 미생물 동정 키트인 API 20 NE Kit를 이용하여 세균학(Bergey's manual of systematic bacteriology)[참조: John, G. H. et al . 1994. Bergey's manual of systematic bacteriology (9th ed.) Williams and Wilkins, Baltimore]에 준하여 동정한 결과, 바실러스(Bacillus sp.)로 판명되었으나, 정확한 속명까지를 확인하고자 16S rDNA와 gyrA gene을 획득하여 염기서열을 확인하였다.

그 결과 16S rDNA의 경우 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 99%의 상동성을 나타내지만, 다른 바실러스 종들도 거의 99%정도의 상동성을 가진다. 반면에 바실러스에서는 종명을 더 확실히 구분할 수 있는 유전자 gyrA gene의 경우 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)와 90% 이상의 상동성을 나타내었다.

따라서, 항진균 활성이 우수한 균주는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03으로 명명하였고, 이를 농업생명공학연구원 한국농용미생물자원센터에 2006년 6월 22일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KACC 91257P를 얻었다.

한편, 다른 종들과의 유연관계는 도 2, 도 3에 나타내었다.

잿빛 곰팡이에 활성이 우수하며, 다른 식물병원성 곰팡이에도 우수한 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 본 발명 상기 균주가 처음이다.

원유 분해 세균, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 LP03의 형태적 생리적 특성

특성	바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03
형태 Gram stain Mobility Optimum temperature Growth in air	rod ＋＋ 37℃ +
생리적 특성
Ortho-nitrophenylβ-D-galactopyranoside Arginine dehydrolase Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Simmons citrate Production of H2S Urease Trytophane deaminase Indole Proteolysis of gelatin Glucose Maltose Lactose Ribose Glycerol Erythritol Mannitol Inositol Sorbitol Xylitol Cellobiose Rhamnose Saccharose Melibiose Amygdalin L(T)arabinose 2-Ketoguluconate 5-Ketoguluconate	＋－－－－－－－－＋＋＋＋＋＋－＋＋＋－＋－＋＋＋＋－－

＋: 양성반응, －: 음성반응

균주의 생육특성

상기 분리균 바실러스 아밀로퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03의 생육온도를 조사하기 위하여, 500㎖ 삼각플라스크에 오일(crude oil) 1%를 함유한 C-배지를 200㎖ 넣고, LB 액체배지에서 전 배양시킨 균주 1%를 접종하여 25℃, 32℃, 37℃ 및 42℃에서 각각 200rpm으로 진탕 배양하였다. 이때 배양시간에 따른 균체의 성장은 1, 3, 5일에 진탕 배양한 배양액을 일정량 취하여 UV-VIS spectrophotometer (U-1100, Hitachi, Japan)를 사용하여 600nm에서 흡광도(optimal density)를 측정하였다.

그 결과, 27℃, 32℃ 및 37℃에서 비슷한 양상으로 왕성한 생육상태를 보여주었다. 또한, LP03 균은 다양한 오일의 탄소원과 염분농도 3% 배지에서 성장이 비교적 양호하였으며, 3일 정도의 배양에서 최대성장을 보였다.

이러한 결과는 해양세균인 클레브실라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae ) L25는 염분농도 3.0 및 3.5%에서 최대의 성장을 보여주었으며, 아시네토박터(Acinetobacter sp.)의 염분농도는 3%, 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) M12 및 슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia ) N246은 3.0~3.5%로 보고된 것과 비슷하였다[참조: Lee, C. H. et al . 1997. Kor . J. Appl . Microbiol. Biotechnol. 25, 520-526]. 이러한 특성은 염해를 입는 농지에도 사용 가능성을 보여 주는 것이다.

또한, LP03는 아밀라아제, CMCase, 프로테아제, 자일라나아제 등의 다양한 효소를 분비하며, 바실러스 속에서 이러한 효소들은 직·간접적으로 항진균 활성에 관련이 있는 것으로 보고되어 있다. 그리고 바실러스에서 생산되는 리포펩타이드는 항진균 활성뿐만 아니라 유류분해 특성이 있어서, 토양의 기름 오염도 정화할 수 있는 중요한 자원이라 할 수 있다.

실시예 2: 바실러스 아밀로리퀘페이션스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) LP03의 항진균활성

식물병원성 진균의 생육을 저해하는 효과를 확인하기 위하여, 분리 균주를 효모추출물 아가 배지에 접종하고, 분리 균주에서 추출한 항균물질을 분리하고자 상기 균주 배양액을 원심분리한 배양 여액에 pH2이 될 때까지 농염산을 가하였다. 이 반응액을 4℃에서 O/N 반응시켜 침전시킨 후, 원심분리하였다. 생성된 침전물을 10배의 메탄올로 진탕하여 추출한 뒤, 감압 농축하여 암갈색의 조 추출물을 얻었다. 건조된 조 추출물은 녹여서 병원균의 길항능력을 확인하기 위한 저지대(inhibition zone) 시험에 사용하였으며, 트리티스 시네리아(Botrytis cineria), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항력 효과를 관찰하였다. 병원성 진균의 생육을 저해하는 효과를 확인한 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 28℃에서 수 일간 배양하면서 생육이 저해된 투명대 형성을 확인하였고, 잔디 등의 병원성 진균류인 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria, 도 4(A)), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum , 도 4(B)) 및 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 도 4(C))에 대한 항진균 활성이 뛰어남을 확인하였다.

실시예 3: 바실러스 아밀로리퀘페이션스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) LP03의 제제화 및 식물생육 촉진효과

본 발명의 미생물제제는, 먼저 100L 배양기에 각각 실시예 1에서 분리한 바실러스 아밀로리퀘페이션스 LP03 균주를 1%로 접종하고, 37℃, 250rpm, 1vvm 으로 진탕 배양한 후, 배양한 70L의 배양액에 증량제 스킴 밀크(skim milk) 750g을 넣어 교반하고, 16000rpm으로 집균한 후, 상기 집균된 균을 동결건조기에 동결건조함으로써 제조하였고, 미생물제제의 제조과정은 도 5에 나타내었다. LB-브로스를 사용하였으며, 배지의 조성은 효모추출물 5.0g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L를 함유하고 있으며, C-소스로는 폐식용유를 사용하였다. 본 발명에서 공시 작물로서 사용한 잿빛곰팡이병이 유발된 부추(Allium tuberosum Rotter)를 사각포트에 이식하고, 미생물 처리제를 살포한 후 3주 동안의 온실에서 재배하면서 항 잿빛곰팡이 억제력을 살펴보았다.

도 6에 나타난 바와 같이, 항 잿빛 곰팡이 효과를 확인하였으며 생육 또한 항 잿빛효과와 더불어 보전됨을 확인하였다. 도 6A는 대조구로 멸균수만 첨가한 것이고, 도 6B는 미생물 제제를 투여한 결과를 도시한 것이다.

상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 식물 잿빛 곰팡이병 방제용 바실러스 아밀로리퀘페이션스 LP03 균주 및 이를 이용한 미생물 제제의 제조방법에 관한 것으로, 식물병원성 곰팡이, 특히 잿빛 곰팡이병균에 대하여 우수한 길항활성을 가지는 농경지에서 분리 동정한 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03 균주를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 상기 균주를 이용하여 광범위한 항균력을 가지며, 활성의 지속성이 뛰어나고, 물리화학적 으로 안전한 잿빛곰팡이병을 포함하는 식물병원균의 방제를 위한 미생물 제제를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 미생물과 이를 이용한 미생물 제제는 식물병원균에 의한 식물병을 방제하는 데 사용되므로 농약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성 및 식물생육촉진 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) LP03균주 (기탁번호: KACC 91257P).
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