KR101288414B1

KR101288414B1 - 신규한 로도토루라 그라미니스 ｙ435 및 이를 포함하는 식물 저장병균 방제제

Info

Publication number: KR101288414B1
Application number: KR1020100133703A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 이영기; 원항연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2013-07-23
Also published as: KR20120071956A

Abstract

본 발명은 배 수확 수 저장, 유통중 발생하는 배 저장병을 방제 효과를 가지는 신규한 균주인 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis) Y435에 대한 것으로, 보다 상세하게는 상기 미생물, 상기 미생물을 포함하는 식물병원균 방제제 및 상기 방제제를 수확 후 저장, 유통 중인 배에 처리하여 푸른곰팡이병과 같은 배 저장병을 방제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 경우, 유용 미생물을 식물병원균 방제에 사용하여 친환경적 방제가 가능하고, 수확 수에도 처리할 수 있어 저장병해의 방제에 더욱 효과적이며, 농산물의 안전성 확보에도 기여할 수 있다.

Description

신규한 로도토루라 그라미니스 Ｙ435 및 이를 포함하는 식물 저장병균 방제제 {Novel Rhodotorula graminis Y435 and formulation for controlling plant postharvest disease containing same}

본 발명은 배 저장병 방제 효과를 가지는 신규한 균주 로도토루라 그라미니스 Y435에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수확 후 저장, 유통되는 과실류에 발생하는 병해에 대하여 발명 억제 물질의 생산이 아닌 병원균과의 영양원 경합에 의해 생물학적으로 병원균의 성장을 억제함으로써 생물학적인 방제가 가능하며, 항균성 물질을 생산하지 않고, 잔류 농약의 문제점이 없어 생물적 방제제로서 활용이 가능하고, 저장 중 과실의 품질 유지가 가능하다.

대부분의 저장 병해는 과수원에서 병원균에 의해 직접 침입을 받아 이병, 잠복 감염된 상태로 저장되거나, 과일 표면에 부생적으로 존재하다가 농작업, 수송 및 유통중 과일에 상처가 나면 침입하여 피해를 준다. 과일 저장병을 일으키는 병원균은 크게 4가지로 분류된다. 첫째, 수확 전 과수원에서 감염되어 잠복하다가 저장고의 관리가 소홀하여 온도가 높아지거나 출고 후 유통시 발병하는 경우, 둘째, 외관상으로는 건전하나 수확 전에 이미 감염되어 저장기간이 증가되면 피해가 심해지는 경우, 셋째, 푸른곰팡이병 또는 잿빛 곰팡이병과 같이 수확 전에는 과일에 부생적으로 존재하거나 공중에 부유하여 날아다니다가 상처 난 과일에 접촉하면 침입하여 병을 일으키는 경우로, 이들 두 병원균은 저온에서도 잘 자라고 많은 양의 병원균 포자를 만들기 때문에 과일 저장중에 큰 피해를 준다. 따라서 세 번째 경우, 장기간 저장시 과일에 큰 피해를 준다.

배 저장중 발생할 수 있는 저장병해는 겹무늬병(Botryosphaeria dothidea), 탄저병(Collectotrichum sp.), 검은무늬병(Alternaria alternata), 잿빛곰팡이병(Boytytis cinerea), 푸른곰팡이병(Penicillium sp.) 및 열매썩음병(Fusarium spp.) 등이 있다. 상기 병해를 방지하기 위하여는 가능한 저장 온도를 낮추고, 습도를 조절하는 등 환경을 제어하여 방제하는 방법이 가장 근본적이며 가장 확실한 방법이다. 또한, 수확 전 농약 안전 사용 기준을 준수하여 약제를 살포, 균의 밀도를 낮추는 방법을 사용하기도 한다.

상기 병원균 중, 푸른곰팡이병은 과실 저장 중 발생하는 것으로, 발병 초기에는 과피가 담홍색 및 수침상으로 연화되고, 서서히 확대되어 원형병반으로 된다. 처음에는 흰색의 균사가 밀생하고, 후에 분생포자를 형성 청색분상을 띤다. 병반 주위는 비교적 폭이 좁은 백색 균사체의 원이 형성되며, 심하면 과일전체가 부패하는 병으로, 과일 저장 중 가장 피해가 큰 병중의 하나이다. 푸른곰팡이병을 유발하는 병원체는 페니실리움 익스판섬(Pennicillium expansum)으로, 진균계의 불완전균에 속하며, 분생포자를 형성하고, 2 내지 33℃, 바람직하게는 27℃에서 생육한다. 토양중에서 여름을 보낸 분생포자는 공기전염에 의하여 과실의 상처로 침입하고, 저장 중 과일의 활력이 떨어지고, 온습도 조건이 적정한 경우 급격히 발생하며, 이병된 과일은 옆의 과일과 접촉하여 연쇄적으로 발생한다. 푸른곰팡이병은 과일 저장 2개월후에 피해가 크며, 일반적으로 생육기중에는 발병이 적지만, 성숙기에 비가 많이 오면 다소 발생한다. 상기와 같은 저장 병해로 인하여, 수확 후 저장 유통 중 부패율이 5~20%에 달한다. 특히 배와 같이 연중 한정된 시기에만 수확이 가능한 과일의 경우, 주년 공급을 위한 저장 시 그 피해가 더욱 크다고 할 수 있다.

그러나 상기와 같은 과일 저장 병해의 방제를 위하여, 국내의 경우, 수확한 농산물을 대상으로는 농약을 전혀 사용할 수 없는 실정상, 수확 전 농약을 처리하거나 온도, 습도 등의 환경제어에 의한 병 방제만을 수행하고 있는 실정이다. 그러나 수확 직전 화학 농약을 처리하는 방법 또한 인체에 유해할 수 있으므로 인체에 무해하면서 배 저장병을 효과적으로 방제할 수 있는 생물적 방제제를 수확 후 처리하여 과일 저장성을 높이는 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 배 수확후 저장 및 유통중 발생하는 병해를 친환경적으로 방제하기 위한 신규 균주를 연구하던 중, 효모의 일종이며 푸른곰팡이병 방제에 효과적인 Y435를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 배 저장병 억제 효과를 가지는 신규 균주 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis) Y435(기탁번호 KACC93113P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 로도토루라 그라미니스 Y435 균주 및 배양액을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물 병원균 방제제를 과실 수확 후 저장, 유통되는 과실에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 로도토루라 그라미니스 Y435 균주를 포함하는 생물 농약을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 따라서 본 발명의 목적은 배 저장병 억제 효과를 가지는 신규 균주 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis) Y435(기탁번호 KACC93113P)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 로도토루라 그라미니스 Y435 균주 및 배양액을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 식물 병원균 방제제를 과실 수확 후 저장, 유통되는 과실에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 로도토루라 그라미니스 Y435 균주를 포함하는 생물 농약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 배 저장병 억제 효과를 가지는 신규한 균주 로도토루라 그라미니스 Y435에 관한 것이다.

본 발명의 신규 균주는 효모와 유사한 성질을 가지며, 먹이 경합으로 인한 미생물 방제 효과를 가진다고 알려져 있다. 즉, 효모는 과일의 표면에 서식하면서 과일 표면에서 분비되는 양분을 이용하기 때문에 병원균과 양분 경합이 이루어지게 된다. 본 발명자들은 이러한 효모의 특성을 이용하여, 배 저장중 푸른곰팡이에 의해 유발되는 과일 저장병의 일종인 푸른곰팡이병을 효과적으로 방제하는 신규 효모 Y435에 관한 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 Y435 균주는 병원균의 생육저지물질을 생산하는 것이 아니라, 병원균과의 양분 경합을 통해 생물학적으로 병원균의 성장을 억제하여 생물학적인 방제가 가능한 것이다.

본 발명의 일실시예에서는 Y435를 비롯한 Y33, Y125, Y139, Y529를 함께 농가 저장고에 보관중인 배에 처리하여 배 저장병 발생 효과를 비교하였다. 그 결과, 처리 후 90일 경과 시, Y435에서는 0.8%의 과실에서만 병해가 발생하였고, 180일 경과 후에는 7.1%의 과실에서만 병해가 발생하여, 다른 균주에 비해 우수한 배 저장병 방제 효과를 가진다는 것을 알 수 있다. 또한, 농가 대형저장고에 처리하여 배 저장병 방제 효과를 상기와 동일한 방식으로 처리하였는데 여기에서는 더욱 우수한 배 저장병 방제 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 신규 로도토루라 그라미니스 Y435는 배 저장병 방제에 우수한 효과가 있다.

또한 본 발명은 상기 Y435 균주를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병원균 방제제에 관한 것이다.

본 발명의 식물병원균 방제제는 Y435 균주를 유효성분으로 포함하고 있으며, 상기 균주의 배양물 및 배양액을 함께 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 식물 병원균 방제제를 수확 후 저장, 유통되는 과실에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물병원균 방제방법에 관한 것이다.

일반적으로 식물병원균 방제를 위한 농약의 처리는 수확 전에 이루어지며, 이는 잔류 농약에 의한 인체에 대한 영향을 최소화하기 위한 것이다. 상기 본 발명의 신규 로도토루라 그라미니스 Y435 균주는 수확 후 저장, 유통시 과실에 처리되어 저장, 유통 중 발생할 수 있는 저장병인 푸른곰팡이병을 효과적으로 방제할 수 있다.

아울러 본 발명은 상기 로도토루라 그라미니스 Y435 균주를 포함하는 생물 농약에 관한 것이다.

생물농약은 농작물의 해충, 병원미생물 및 잡초를 방제하기 위하여 자연환경에서 분리 채집된 병원균, 기주 저항성 미생물, 천연물 농약 및 천적을 제품화한 것을 말한다. 생물 농약은 크게 미생물 농약, 페로몬을 포함한 생화학 농약, 식물 농약 의 3가지 계열로 나누고 있다.

본 발명에서는 상기 로도토루라 그라미니스를 생물 농약으로 활용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 배 수확 수 저장, 유통중 발생하는 배 저장병을 방제 효과를 가지는 신규한 균주인 로도토루라 그라미니스 Y435에 대한 것으로, 보다 상세하게는 상기 미생물, 상기 미생물을 포함하는 식물병원균 방제제 및 상기 방제제를 수확 후 저장, 유통중인 배에 처리하여 푸른곰팡이병과 같은 배 저장병을 방제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 경우, 유용 미생물을 식물병원균 방제에 사용하여 친환경적 방제가 가능하고, 수확 수에도 처리할 수 있어 저장병해의 방제에 더욱 효과적이며, 농산물의 안전성 확보에도 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 로도토루라 그라미니스 Y435 균주의 계통학적 위치를 나타낸 계통 분류도이다.
도 2는 본 발명의 Y435 균주의 생육 적정 pH를 조사하기 위하여, Y435의 다양한 pH 조건에서의 생육 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 대전의 농가 저장고에서 본 발명의 Y435 균주 및 타 균주 처리 시, 저장 기간별로 균밀도를 측정한 것이다.
도 4는 성환의 농가 저장고에서 본 발명의 Y435 균주 및 타 균주 처리 시, 저장 기간별로 균밀도를 측정한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

신규 로도토루라 그라미니스 Y435 의 분리, 배양 및 동정

전국의 배나무 잎을 채취하여 감자 한천 배지에 프린터법으로 균주를 분리하였다. 분리된 균주를 생물 검정을 통하여 푸른곰팡이병 방제효과가 우수한 다섯 균주를 선발하하고, 배 저장병 방제에 가장 우수한 효과를 나타난 Y435균주를 선발하였다.

상기 선발된 균주를 형태적, 생리적, 분자생물학적 방법을 통하여 하기와 같은 방법으로 동정하였다.

형태적 동정은 콜로니 형태, 색, 균사 유무와 포자크기를 비교하였고, 생리적 동정은 온도 및 pH 반응 등 다양한 생화학적 반응을 조사하였다.

분자생물학적 동정은 DNA를 분리하여 26S rDNA의 D1/D2 부위의 염기서열을 이용하였다. 이 때 프라이머로서는 NL-1 (5’ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) 및 NL-4 (5’ GGTCCGTGTTTAAGACGG 3’)을 사용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST 프로그램을 통해 유사도 분석을 수행하였다.

그 결과, Y435 균주는 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis)와 서열 유사성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 Y435 균주를 로도토루라 그라미니스로 분류하였다.

Y435 균주와 표준균주간의 유연관계를 분석하기 위하여 CLUSTAL W program (Thompson et al., 1994)을 이용하여 염기서열을 정렬하였다. 정렬된 데이터셋은 MEGA version 3.1 (Kumar et al., 2004)프로그램을 이용하여 진화계통수를 작성 하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, 본 발명의 균주 Y435는 로도토루라 그라미니스와 계통학적으로 유사한 위치에 있음을 알 수 있었다.

Y435균주의 생리 생화학적 특성은 API 20E와 20NE kit를 이용하였으며, 키트에 현택액을 접종한 후 28℃에서 7일간 배양한 후 제조자의 추천방법에 따라 결과를 판독하였다. 그리고 형태적 특성은 세포크기, 모양 등의 광학현미경을 이용하여 관찰하였고, 본 발명의 균주를 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis)로 동정하였다.

본 발명의 신규 균주 로도토루라 그라미니스 Y435는 하기 표 1의 형태적, 생화학적 특성을 가진다.

반응/효소	Y435 균주
콜로니의 색상 및 형태	적색 원형
Myceillium	No
Size of conidia(㎛)	6.3±0.4x3.3±0.2
Arginine dihydrolase	-
Lysine decarboxylase	-
Ornithine decarboxylase	-
Citrate utilization	+
H2S production	-
Urease	+
Tryptophane deaminase	+
Indole production	-
Acetoin production	-
Gelatinase	-
Acid production from
D-Glucose	-
D-Mannitol	W
Inositol	-
D-Sorbitol	+
L-Rhamnose	+
D-Sucrose	+
D-Melibiose	-
Amygdalin	W
D-Arabinose	-
Nitrate reduction	-
Esculin hydrolysis	+
PNPG (β-galactosidase)	-
Assimilation of
D-Glucose	-
L-Arabinose	W
D-Mannose	-
D-Mannitol	+
N-Acetyl-glucosamine	-
D-Maltose	+
Gluconate	+
Caprate	-
Adipate	W
Malate	+
Citrate	-
Phenyl-acetate	-

+, Positive; -, negative; W, weakly positive.

상기 선발된 로도토루라 그라미니스 적정 생육 조건을 결정하기 위하여 실험을 시행하였다. 먼저, 생육 적정 온도를 온도 구배 장치(Temperature Gradient Incubator TN2148, Advantec.)를 이용하여 MB 배지(Malt extract 10g, Yeast extract 2g, 증류수 1l)에서 조사하였다.

그 결과, 표 2에서 보듯이, 본 발명의 로도토루라 그라미니스 Y435균주는 2.5 내지 35.4℃ 범위에서 생육이 가능하며 바람직한 생육 적정 온도는 17.8～25.8℃인 것으로 나타났다.

온도 (℃)	배양시간별 흡광도		생균수 (×10⁵CFU/㎖)
	(Opticaldensity, O.D₆₀₀ _㎚)		생균수 (×10⁵CFU/㎖)
	24 hr	48 hr	24hr
2.5	0.033	0	0.09
5	0.035	0	0.07
7.2	0.027	0	0.13
9.2	0.045	0	0.26
11.4	0.048	0	0.39
13.5	0.065	0.348	1.33
15.6	0.172	1.686	3.22
17.8	0.325	2.087	19.83
19.7	0.529	2.093	22.5
21.7	0.821	10	27.5
23.6	1.217	10	73.33
25.8	1.159	10	51.67
27.5	0.432	10	0.45
29.6	0.091	0.331	0.07
31.5	0.036	0	0.04
34.2	0.036	0	0.04
35.4	0.037	0	0.02
37.5	0.033	0	0
39.5	0.03	0	0
41.6	0.031	0	0
43.9	0.038	0	0
46.7	0.023	0	0
49	0.025	0	0
51.6	0.022	0	0

상기 선발된 균주의 생육 적정 pH 범위를 알아보기 위하여, 로도토루라 그라미니스 Y435균주를 TSB배지(Tryptic soy broth 배지: pancreatic digest of casein 17g, enzymatic digest of soybean meal 3g, dextrose 2.5g, sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g, 증류수 1ℓ)에 25℃에서 120rpm으로 48시간 진탕 배양하여 그 배양액을 10배로 희석하였다. Microplate(100well)에 멸균된 TSB배지를 이용하여 pH 3.0부터 9.5까지 0.5단위로 배지를 조제하여 pH배지별 3반복으로 350㎕씩 분주하고, Y435균주를 배양한 희석액을 10㎕씩 접종하여 Bioscreen C(Growth Curves AB Ltd)에서 25℃에서 48시간 배양하여 흡광도(600nm)로 OD(optical density)를 조사하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 조사한 결과에서 Y435균주는 pH 3.0~9.5범위에서 생육이 가능하였고, 최적 pH는 5.0이었다

< 실시예 2>

배 저장병에 대한 방제 효과 조사

본 발명의 신규 균주 Y435의 배 저장병의 푸른곰팡이병 및 잿빛곰팡이병에 대한 방제 효과를 측정하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

신규 로도토루라 그라미니스 균주 Y435 균주를 MB(Malt extract broth) 배지를 이용하여 25℃에서 48시간 140rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 이용하여 배를 배양액에 침지 처리하여 대전과 성환에 위치한 농가저장고에 저장하였다. 또한, 방제 효과의 비교를 위해 무처리군 및 4종의 미생물을 상기 방법으로 동일하게 처리한 비교군을 함께 저장하였다. 저장 후 1개월 단위로 저장병 발생 정도를 알아보기 위하여 각각의 저장고에서의 이병과율을 조사하였으며, 처리한 미생물의 생존정도를 조사하기 위하여 균밀도를 측정하였다.

그 결과, 대전 농가 저장고에서는 표 3에서 보듯이, 150일 이후 본 발명의 균주인 435가 가장 낮은 이병과율을 보이고 있으며, 표 4에서 보듯이, 성환의 대형 농가 저장고에서도 처리 후 약 120일 경과 후부터는 본 발명의 균주를 처리한 군엔서 이병과율이 가장 낮은 것으로 조사되었다.

균주	저장기간별 이병과율(%)
균주	30	60	90	120	150	180
33	0.0a	0.0a	0.6a	4.4ab	7.9ab	18.8c
125	0.0a	0.0a	0.0a	1.6a	4.2a	9.2ab
139	0.0a	0.0a	0.0a	2.4ab	6.9ab	14.8abc
435	0.0a	0.0a	0.8a	2.3ab	3.1a	7.1a(60.1)
529	0.0a	0.0a	2.3a	5.5ab	7.9ab	9.9ab
CON	1.3a	1.3a	3.6b	6.6b	11.6b	17.8bc

균주	저장기간별 이병과율(%)
균주	30	60	90	120	150	180
33	0.0a	0.0a	0.6a	1.3a	2.0a	3.5ab
125	0.0a	1.0a	2.0a	2.0a	2.0a	2.0ab(60.8)
139	0.0a	0.9a	0.9a	2.8a	4.7a	6.6b
435	0.0a	0.9a	0.9a	0.9a	0.9a	0.9a(82.4)
529	0.9a	1.9a	1.9a	1.9a	2.0a	2.8ab
CON	2.4a	2.4a	3.4b	4.3a	4.3a	5.1ab

- ( ): 방제가.

또한, 미생물의 생존 정도를 알아보기 위한 균밀도 조사 결과, 도 3 및 도 4에서 보듯이, 대전 저장고에서 비교적 높은 균밀도를 가지는 것으로 조사되었고, 성환의 대형 농가 저장고에서의 균밀도 또한 비교적 높은 정도를 유지하는 것으로 조사되었다.

따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 균주는 수확한 배의 장기 저장 시, 배 저장병 방제에 효과가 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명은 배 수확 수 저장, 유통중 발생하는 배 저장병을 방제 효과를 가지는 신규한 균주인 Y435에 대한 것으로, 보다 상세하게는 상기 미생물, 상기 미생물을 포함하는 식물병원균 방제제 및 상기 방제제를 수확 후 저장, 유통중인 배에 처리하여 푸른곰팡이병과 같은 배 저장병을 방제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 경우, 유용 미생물을 식물병원균 방제에 사용하여 친환경적 방제가 가능하고, 수확 수에도 처리할 수 있어 저장병해의 방제에 더욱 효과적이며, 농산물의 안전성 확보에도 기여할 수 있다.

농업생명공학연구원

KACC93113P

20101119

Claims

배 저장병 억제 효과를 가지는 로도토루라 그라미니스(Rhodotorula graminis) Y435. (기탁번호 KACC93113P)
제1항의 로도토루라 그라미니스 Y435 균주 및 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 푸른곰팡이병원균 또는 잿빛곰팡이병원균 방제제.
제2항의 식물 병원균 방제제를 과실 수확 후 저장, 유통되는 과실에 처리하는 것을 특징으로 하는 푸른곰팡이병원균 또는 잿빛곰팡이병원균 방제방법.
제1항의 로도토루라 그라미니스 Y435 균주를 포함하는 생물 농약.