CN103484376B - 拮抗土传病害的木霉菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物防治领域的拮抗土传病害的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ZJSX5003CGMCC No.6480。本发明的木霉菌菌株的生长速度快、产孢量大，离体对峙病原菌抑制率分别达79.79%、73.68%、72.25%，病原菌孢子存活率均为0.00%，针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08%、66.67%，几丁质酶酶活为4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.8050U，胞外蛋白酶酶活为4.8503U，抗生性次生代谢物中起拮抗作用的聚酮类、萜烯类和羧酸类占总体比重的44.44%；本发明的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。

Description

拮抗土传病害的木霉菌菌株

技术领域

本发明属于生物防治领域，涉及一株木霉菌菌株，尤其涉及一种拮抗土传病害的木霉菌菌株。

背景技术

由于长时期的连年种植某一作物，造成土壤次生盐渍化严重和土传病害为害加剧，导致作物品质降低，产量下降，现已成为制约设施农业持续发展的重要障碍因子。植物土传病害是一类重要的植物病害,引起土传病害的病原物种类很多（真菌、细菌、线虫、病毒），它们通常侵染植物根部,引起植物根部乃至全株的病害,造成重大的经济损失。其中，土传病原真菌目前已成为农作物、蔬菜稳产、高产的主要制约因素之一。

以玉米茎腐病(Corn Stalk Rot)为例简要概述其造成经济损失，又称玉米青枯病，其分布广、危害重，世界玉米各产区均普遍发生，一般年份发病率为10～20%，严重时可达50%以上，导致玉米减产20～30%。引起玉米茎腐病的主要致病病原菌是腐霉菌、镰刀菌、干腐菌、炭疽菌和细菌等。再以黄瓜枯萎病为例，又叫蔓割病、萎蔫病,是土壤传播、根部侵入的一种维管束病害，一般发病率20%～30%,严重地块达80%～90%,甚至全部毁种，严重影响黄瓜生产产量。因此，为了有效防治土传病害、保证我国农作物、蔬菜产量稳定增长，必然需要进行综合防治。其中，由于生物防治绿色无害高效而广受政府、农庄及农户关注，生防微生物资源研究迫在眉睫。而作为国际公认生防菌的木霉菌，近年来优选菌株的应用效果卓著，寻找高效生防能力的木霉菌株资源非常重要。

发明内容

本发明的目的是通过离体对峙培养测定、病原菌孢子存活率测定、盆栽接种试验指标的筛选，提供一种新型拮抗土传病害的木霉菌菌株，本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药，能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

本发明涉及一种拮抗土传病害的木霉菌菌株，所述木霉菌菌株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ZJSX5003 CGMCC No.6480。

优选地，所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述菌株的Tef1-α序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的木霉菌菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；本发明菌株的信息为：棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ZJSX5003；保藏号为CGMCC No.6480；保藏日期为2012.8.28。

菌株培养特征包括：PDA上的最适合生长温度为30℃，30℃生长48h菌落半径约为31～47mm；30℃黑暗条件下生长期间每隔8h给予短暂的荧光照射，菌落能够形成5个同心轮纹结构，由密集的分生孢子组成，靠近中心部位的分生孢子为黑绿色，缺乏气生菌丝；不产生扩散性色素，无明显气味；菌落反面为奶油色，有皱褶或者有缠绕结构。

菌株形态特征包括：分生孢子簇呈垫状至半球状，直径为0.5～2mm，离散分布或者汇合，散布于整个菌落或者排列为2～3个同心轮纹；分生孢子聚合体为深绿色。在分生孢子簇内，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有两个或多个瓶梗，瓶梗宽度为2.8～5.4μm，主轴顶端下面生出的初次分枝常呈对生，与主轴的夹角为近90°；瓶梗典型地产生于初次、二次、三次分枝的顶端，较少直接产生于初次和二次分枝中部，2～3个瓶梗呈漩涡状排列；瓶梗直、安瓿形，仅在中部稍微加粗，长度为7.1～11.3μm，中部宽度为3.0～5.5μm，基部宽度为2.0～3.5μm，基部稍微有缢缩，与其母细胞夹角约为100°。分生孢子球形至亚球形或者卵圆形，大小为3.7～6.0μm×3.0～5.0μm，没有可见的基部脱落痕迹，有细刺结构，但有时很难观察到。

本发明采集中国南部地区农林土壤并于4℃保藏、分离纯化菌株、离体对峙病原菌抑制试验（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）、病原菌（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）孢子存活率测定、活体接菌防效试验，经过以上步骤反复筛选，最终选出高拮抗性、强专化性的杀土传病害的木霉菌菌株，编号为ZJSX5003。通过菌落及分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等形态特征鉴定以及内转录基因间区核酸序列测定和分析，确定了该菌株的分类地位：木霉属（Trichoderma Pers.ex Fr.），棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。本发明也进行了该菌株的生理生化测定，包括拮抗相关酶酶活（几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、胞外蛋白酶）检测、抗生性次生代谢物提取分析，以便更好地开发利用该菌株。

本发明提供的木霉菌菌株的ITS序列如序列表中的序列1所示（Genebank序列号：JQ617302），其Tef1-α序列如序列表中的序列2所示（Genebank序列号：JQ617305）。

本发明的有益效果如下：本发明提供的木霉菌菌株的生长速度快、产孢量大，离体对峙病原菌（尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌）抑制率分别达79.79%、73.68%、72.25%，病原菌（尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌）孢子存活率均为0.00%，针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08%、66.67%，几丁质酶酶活为4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.8050U，胞外蛋白酶酶活为4.8503U，抗生性次生代谢物中起拮抗作用的聚酮类、萜烯类和羧酸类占总体比重的44.44%。由上可知本发明提供的木霉菌菌株具有高拮抗性、强专化性的优点，应用该菌株生产的生物农药能够有效防治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定增长。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是本发明提供的ZJSX5003菌株中不同类型的抗生性次生代谢物分配比例图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明通过分离浙江省绍兴市大头菜蔬菜地土壤的886株野生木霉菌株，选取离体对峙尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、串珠镰刀菌作为初筛指标，然后选取病原菌孢子存活率作为复筛指标，最后通过活体接菌防效试验确定木霉菌菌株ZJSX5003。

实施例1、离体对峙抑菌试验

平板对峙培养法：用灭过菌的Φ6mm的打孔器打取培养4d左右的木霉菌和病原菌（串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）菌碟，病原菌菌碟分别置于直径90mm的培养皿平板一侧，另一侧接种木霉菌菌碟，两菌碟相距4cm，并以单独病原真菌为对照，3个重复，于28℃恒温培养。培养5d后，采用十字交叉法分别测量处理组和对照组的病原真菌菌落直径，分别计算出培养5d后抑制率。

菌落生长直径（mm）=菌落直径平均值－6.0mm；

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长直径－处理菌落生长直径）／对照菌落生长直径×100。

表1 菌株离体抑菌率的测定

由表1可以看出，ZJSX5003对三株病原菌（尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌）的抑制作用较好，分别为79.79%、73.68%、72.25%。

实施例2、病原菌孢子存活率测定

通过病原菌（尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、立枯丝核菌）与生防菌孢子悬液的充分接触作用，从活化5d的病原菌边缘打取4片直径5mm菌饼，将其浸入木霉菌孢悬液（10⁶个/mL）中30s，然后放在铺有3层湿滤纸的培养皿中过夜培养，以无菌水取代木霉菌孢子悬液为对照，次日将病原菌菌饼转接至含有1mg/L苯菌灵选择性培养基中，28℃恒温培养箱中培养，重复3次。第5d记录试验结果，最终以病原菌生长直径及存活率表示，每个处理取其平均值。观察病原菌的生存趋势从而判段生防菌的防治作用。

表2 ZJSX5003对病原菌孢子存活率的影响

由表2可以看出，ZJSX5003对三株病原菌（尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌）孢子存活率均为00.00%。

实施例3、温室活体防治试验

在PDA培养基中分别活化病原菌和木霉菌于28℃下培养7d，用无菌水分别冲洗培养基上病原菌孢子，菌液用已灭菌的滤纸过滤以除去菌丝，病原菌将滤液加适当蒸馏水稀释成孢子浓度为1×10⁶个/mL的悬浮液，木霉菌将滤液加适当蒸馏水稀释成孢子浓度为1×10⁷个/mL的悬浮液，备用。

（1）黄瓜枯萎病防治实验

将表面消毒的黄瓜种子于双层湿滤纸的培养皿中催芽，每皿6粒，重复3次。无菌水保湿培养数日，待种子萌发退去种皮后在温室内用花盆栽黄瓜幼苗，待黄瓜幼苗长出3～5片叶时，将无菌水制备的黄瓜枯萎病菌的孢子悬浮液灌溉到黄瓜幼苗的根部，每株黄瓜幼苗灌根15～20mL，保湿24h后观察发病情况；再将木霉菌孢子悬浮液灌溉到黄瓜幼苗的根部，以灌无菌水为对照，7d后观察防治效果。

黄瓜枯萎病病害分级标准：0级，无可见症状；1级，病斑面积占整个叶盘面积的5％以下；2级，病斑占整个叶盘面积的5％～25％；3级，病斑占整个叶盘面积的25％～50％；4级，病斑占整个叶盘面积的50％～75％；5级，病斑占整个叶盘面积的75％以上。

病情指数和菌株的防治效果计算方法如下：

病情指数=∑(各病级株数×各级代表值)/(调查总株数×最高一级代表值)×100

防效=(防治后病情指数×对照区前病情指数)/(防治前病情指数×对照区后病情指数)×100。

（2）玉米茎腐病防治实验

高压灭菌处理的无菌土中灌入病原菌孢悬液，密闭发病直到红色毛状物出现。试验采用盆栽进行，花盆用70%酒精消毒后装处理过的土壤至2/3处，然后每盆播经酒精消毒过的种子，再覆2cm无菌土，压实。出苗后每盆保苗2棵。苗期管理浇灌至3～4叶期时玉米植株发病后，再将木霉菌孢子悬浮液灌溉到玉米根部，以灌无菌水为对照，7d后调查植株根系的受害情种况及株高、根长、根数（胚根十次生根等）。

玉米苗期调查病情分级标准：0级，整株生长正常，无病；1级，地上地下部生长基本正常，根部可见少量病斑，病斑面积占根表总面积1/4以下，根群颜色白中有褐；2级，地上地下生长明显受阻，叶色变淡，株高仅及对照的3/4，侧根少而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4～1/2，根群颜色白、褐相当；3级，地上地下部生长极不正常，地上部可见青枯—黄枯状，株高仅及对照的1/2，侧根极小，病斑面积占根总面积的1/2～3/4，根群颜色褐中带白；4级，发芽，但不出苗，几乎窒息而死，病斑面积占根表总面积的3/4以上，根为褐色。

表3 菌株ZJSX5003处理对土传病害的防治效果

ZJSX5003对黄瓜和玉米生长都具有很好的促进作用，株高及根系发达程度均较显著。防效测定结果表明，针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08%、66.67%，显著降低了腐烂褐变，防效非常显著。

实施例4、几丁质酶酶活力检测

将木霉菌株接种到PDA培养基平板（直径90mm）上，在光照恒温恒湿培养箱25℃、60%湿度培养5d。把长满木霉的平板用灭菌水浸泡3～5min，用棉签轻轻刮洗下孢子及菌丝体，脱脂棉或4层纱布过滤除去菌丝体，滤液即为孢子悬浮液。根据血球记数板法进行计数，稀释后孢子悬浮液浓度为10⁶个/mL孢子量。

配制N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）（色谱纯，Sigma Chemical Co.P.O.，Germany）的1mg/mL的标准溶液，取7支25×250mm试管，按表4加入试剂，将各管混匀，在沸水中准确煮5min，取出后立即冷却至室温，再向各试管加入21.5mL蒸馏水，摇均。稀释后各管NAG的浓度依次为0、8、12、16、20、24、28（μg/mL）。先对7管样品通过紫外分光光度计在200～700nm范围进行全波扫描，得到其最大吸收值的波长。再对上述6支管在最大光吸收（OD）值的波长下按NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线。

表4 建立NAG标准曲线的试剂

	0(CK)	1	2	3	4	5
							NAG标准液（mg/mL）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于NAG量（mg）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水（mL）	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂（mL）	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

每瓶产几丁质酶发酵液(培养基组分：NH₄NO₃3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O0.6g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，胶体几丁质5g/L粉状，pH5～6，1000mL蒸馏水)接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r/min、28℃培养。采取DNS比色法测几丁质酶活：取0.5mL发酵液，加入0.05M pH6.0磷酸盐缓冲液2mL，再加入0.5mL胶体几丁质，每样品三个重复，一个对照，反应在25×250mm试管里进行；然后立即在恒温水浴锅（37℃下准确保温水浴1h，再迅速在4℃下11000g离心10min，取上清液2mL，加入DNS试剂1.5mL，沸水浴准确煮沸10min，取出后立即冷却至室温。对照为0.5mL发酵液，加0.05M pH6.0磷酸盐缓冲液2mL，混合液在沸水浴中煮10min，取出后用冷水冷却至室温，再加入0.5mL胶体几丁质，然后11000r/min离心10min，其它操作同上。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定，通过紫外分光光度计在530nm处测定光吸收（OD）值，把测得的OD值与NAG标准曲线对照，定量几丁质酶的活性。

几丁质酶酶活：一个几丁质酶酶活单位(1U)定义为在特定条件下（37℃、pH6.0），每分钟酶催化胶体几丁质反应释放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

表5 菌株ZJSX5003不同培养天数的几丁质酶酶活

天数（d）	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活（U）	0.5757	2.4799	4.0783	2.9416	2.2665	1.8462	1.1871	0.8305

由表5可以看出，随着培养天数的增加，ZJSX5003几丁质酶酶活力呈先上升再下降的趋势；几丁质酶酶活力在第5d时最高，为4.0783U。

实施例5、β-1,3-葡聚糖酶酶活力检测

葡萄糖标准曲线的制作，参照杨艳红的方法（杨艳红．华山松疱锈病原菌重寄生菌的筛选及其作用机理初步研究[D].昆明：西南林学院，2004），按表6加入试剂，取1mg/mL标准葡萄糖溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，再各加入蒸馏水补足至2mL，然后分别加入0.75mL DNS溶液充分混匀，于沸水浴中准确反应15min后，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，再加入5mL蒸馏水充分混匀。于722型分光光度计540nm处测定光吸收值，以标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表6 建立葡萄糖标准曲线的试剂

	0(CK)	1	2	3	4	5
							葡萄糖标准液	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
相当于葡萄糖量（mg）	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
							蒸馏水（mL）	2.0	1.9	1.8	1.7	1.6	1.5
DNS试剂（mL）	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75

每瓶TLE产酶诱导培养液（成分：1g细菌用蛋白胨，0.3g尿素，2g KH₂PO₄，1.4g(NH₄)₂SO₄，0.3g MgSO₄.7H₂O，0.3g glucose，0.005g FeSO₄，0.0017g MnSO₄，0.0014g ZnSO₄，0.002g CaCl₂，1000ml蒸馏水）接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r·min^-128℃培养。培养3d后的发酵液样液2mL纱布过滤，4℃5000r/min下离心20min，上清液即为粗酶液。参照Bara的方法并稍加改动测酶活，吸取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/mL的昆布多糖溶液1mL，50mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）0.5mL，混匀．于40℃下准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀，再于沸水浴中准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃下放置2min，再加入5mL蒸馏水充分混匀。

上述反应液混匀，取1mL反应混合液分别于第3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d测定β-1,3-葡聚糖酶酶活，通过紫外分光光度计在540nm处测定光吸收（OD）值，所测得OD值与标准曲线对照，定量β-1,3-葡聚糖酶的活性，根据标准曲线求出样品中葡萄糖含量，每个处理三次重复。

β-1,3-葡聚糖酶酶活：一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位（1U）定义为，在特定40℃、pH5.0条件下，1h催化分解昆布多糖产生lμg葡萄糖的酶量。

表7 菌株不同培养天数的β-1,3-葡聚糖酶酶活

天数（d）	3	4	5	6	7	8	9	10
									酶活（U）	0.4517	0.8050	0.3312	0.1915	0.0847	0.0655	0.0490	0.0490

由表7可以看出，随着培养天数的增加，ZJSX5003 β-1,3-葡聚糖酶酶活力呈先上升再下降的趋势；β-1,3-葡聚糖酶酶活力在第4d时最高，为0.8050U。

实施例6、胞外蛋白酶酶活力检测

牛血清白蛋白（BSA）标准曲线的制作：按表8加入试剂，取0.1mg/mL标准牛血清溶液0，20，40，60，80，100μL，再各加入蒸馏水补足至20μL，然后分别加入0.02mL SK5031-1溶液A和0.98mL SK5031-2溶液B充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μL Folin-酚试剂迅速混匀，室温下静置30min,于紫外分光光度计750nm处测定光吸收值，以标准牛血清白蛋白溶液的浓度为横坐标，以对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

表8 建立BSA标准曲线的试剂

	0（CK）	1	2	3	4	5
							BSA标准溶液（μL）	0	20	40	60	80	100
蒸馏水（μL）	200	180	160	140	120	100
							BSA终浓度（mg/μL）	0	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05

每瓶MYG产酶诱导培养液（成分：10.0g葡萄糖，5.0g麦芽糖，5.0g酵母膏，1000mL蒸馏水）接种5mL孢子悬浮液，置于恒温摇床以180r/min、28℃培养。发酵液每天取样，样液2mL经离心（10000r/min，4℃，20min）后，上清液于-20℃保存备用。

采用Lovrien的方法（Lovrien RE，Gusek T，Hart B.Cellulase and proteasespecific activities of commercially available cellulase preparations.J ApplBiochem，1985，7：258-272）进行蛋白酶酶活测定。取各样品蛋白酶溶液200μL，分别加入0.02mL SK5031-1溶液A(该溶液为本领域的常规选择，源于型号为SK5031的Folin-Phenol Reagent福林酚蛋白浓度测定试剂，购自生工生物工程（上海）有限公司，SK5031-2溶液B、Folin-酚试剂与之来源相同)和0.98mL SK5031-2溶液B充分混匀，于室温下静置准确反应10min后，立即加入100μL Folin-酚试剂迅速混匀，室温下静置30min,取1mL反应混合液于紫外分光光度计750nm处测定光吸收值，分别于第1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d测定胞外蛋白酶酶活。每个处理三次重复测定。

胞外蛋白酶酶活力：以每分钟催化分解蛋白质生成1g牛血清白蛋白的酶量为一个酶活性单位（Pu）。

表9 菌株不同培养天数的胞外蛋白酶酶活

天数（d）	1	2	3	4	5	6	7	8
									酶活（U）	4.7398	4.8503	1.7309	1.2574	0.9501	0.9758	1.2389	1.3216

由表9可以看出，随着培养天数的增加，ZJSX5003胞外蛋白酶酶活力呈先上升再下降的趋势；蛋白酶酶活力在第2d时最高，为4.8503U。

实施例7、木霉菌分生孢子中抗生物质的提取

用50倍体积的CH₂C1₂于4℃低温浸提6g干燥的分生孢子2d，浸提液经5％活性炭振荡吸附2h，用已灭菌的四层纱布过滤除杂，上清液加入等体积的3％碳酸钠溶液萃取，重复一次，将碳酸钠溶液合并后留取CH₂Cl₂部分，用少许CH₂C1₂洗涤回收后并人洗涤液，洗涤液加无水硫酸钠脱水，再用快速滤纸进行过滤，最后将脱水洗涤液于40℃下真空减压浓缩后得到1mL的粘稠状含抗生物质的粗提物。

实施例8、提取物化学成分GS-MS分析

采用气相色谱-质谱联用仪对提取物成分进行分析，仪器型号为Agilent6890-5973NGC-MS，参数设置为：离子源为EI，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为280℃，质量扫描范围为290amu-500amu，起始柱温50℃，恒温5min后以5℃/min升温到300℃，汽化室温度为300℃，载气为氦气，分流比为10：1，进样量为1μL。

采用气相色谱-质谱联用仪进行定性分析，结合计算机检索技术对化学成分进行分离鉴定，应用气相色谱峰面积归一化法测定各成分的相对含量。

表10 菌株抗生性次生代谢物分析结果

由表10可知，木霉菌菌株ZJSX5003抗生性次生代谢物物质较多，共检测分析到78馏分，抗生性次生代谢物类型分类汇总如图1所示，其中萜烯类比重最大，其次是烷烃类、羧酸及其衍生物物质较多，醇类、醛类最少。总体来看，菌株ZJSX5003中起主要拮抗作用的抗生性次生代谢物即萜烯类、聚酮类和羧酸及其衍生物类共占总比重的40.40%。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (1)

1.一种拮抗土传病害的木霉菌菌株，其特征在于，所述木霉菌菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003CGMCC No.6480；

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003CGMCC No.6480的最适生长温度为30℃；

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003CGMCC No.6480的离体对峙尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌的抑制率分别达79.79％、73.68％、72.25％，尖孢镰刀菌、串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌的孢子存活率均为0.00％；

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003CGMCC No.6480针对黄瓜枯萎病、玉米茎腐病的活体防效分别为85.08％、66.67％；

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJSX5003CGMCC No.6480的几丁质酶酶活为4.0783U，β-1,3-葡聚糖酶酶活为0.8050U，胞外蛋白酶酶活为4.8503U，抗生性次生代谢物中起拮抗作用的聚酮类、萜烯类和羧酸类占总体比重的44.44％；

所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；

所述菌株的Tef1-α序列如SEQ ID NO.2所示。