CN108203694B - 诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解酶及抗茎枯病品种的筛选方法 - Google Patents

诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解酶及抗茎枯病品种的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解酶及抗芦笋茎枯病品种的筛选方法，属于生物技术领域。本发明提供的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌为天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi，保藏编号为：CGMCC No.13874。本发明提供的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌可以诱导芦笋诱导分泌高含量防细胞壁降解酶，为抗病新品种选育和抗病品种合理布局服务。

Description

诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解 酶及抗茎枯病品种的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种诱导分泌高含量防御酶的芦笋茎枯病菌。
背景技术
芦笋(Asparagus officinalis L.)为天门冬科天门冬属多年生草本植物，以嫩茎供食，具有极高的营养和保健价值，富含天冬酰胺、皂苷、黄酮、硒和植物多糖等多种活性成分，能抗肿瘤、抗氧化和降血脂，被誉为“蔬菜之王”、“世界十大名菜”之一(Jaiswal etal.，2014；Nishimura et al.，2013)。同时，芦笋加工产业链长，可生产出芦笋抗癌药、芦笋茶、酒和饮料等高附加值产品，在食品、医药等领域应用开发前景广阔。目前，我国芦笋种植及加工发展迅速，已成为世界第一大生产和出口国，种植面积超过95000公顷，约占全球的43％。病害是芦笋生产的重要制约因子，主要包括芦笋茎枯病、褐斑病和根腐病等，其中茎枯病危害最为严重，极易造成毁灭性影响。该病害在全球芦笋产区广泛存在；美国、希腊和澳大利亚等国均有报道，中国、日本和泰国等亚洲主产区因湿热气候和舶来品种生态适应性差导致病害发生十分严重；近年来，我国平均发病率居高不下，一般导致减产30％以上，严重时甚至引起成片绝收(陈光宇，2013；陈光宇，2010；Lu et al.，2008)。目前，生产上缺乏高抗茎枯病的芦笋栽培品种，主要依赖于化学农药或温室设施避雨栽培技术防控，不仅提高了生产成本，同时极易造成产品和环境的污染，加剧土壤质量严重退化。因此，茎枯病危害已成为制约我国芦笋生产可持续发展的突出问题。
天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)是引起芦笋茎枯病的病原真菌。目前，有关其致病接种方法、病害分级指标和病情评价体系已相对成熟 (Takahiro，1997)。前期研究表明，天门冬拟茎点霉为半活体营养寄生型 (Hemibiotrophs)丝状病原真菌，病菌无性分生孢子呈α(5.0～12.5× 1.8～3.8微米)、β(17.5～26.0×1.0～2.0微米)和中间型(12.0～17.0× 2.5～4.5微米)，α型占绝对优势，通常内含1～2个油球，主要危害嫩茎，也可侵染枝梗和拟叶，分生孢子接种后5～7天可获得明显病斑，病斑初呈水渍条状、后渐变成暗黑色梭条形，中部赤褐色凹陷，其上散生大量小黑点，为分生孢子器，随后病株枯死并迅速传染相邻植株，病菌以分生孢子(器) 或菌丝体越冬，适宜条件下进行初侵染和再侵染(Zhang et al.，2012；张岳平等，2012；Udayanga et al.，2011；陈光宇，2010；陈光宇，2005)。此外，芦笋茎枯病菌所属的天门冬拟茎点霉属(Phomopsis)真菌，该属是腔孢纲球壳孢科真菌中的一个大属，含有100多个不同的种，可寄生于70多种不同科的植物。该属病原菌地域分布广泛，引起植物的叶枯、枝枯、烂茎、溃疡及果腐等严重病害，造成重大经济损失。目前，一些主要作物的拟茎点霉属真菌病害在发生特点、致病症状及特性、生活周期循环、病害生化防控及病菌生物学特性方面等取得了一定的研究进展。芦笋茎枯病菌作为拟茎点霉属中重要成员，具备该属病原真菌的重要生物学特性，包括通过分生孢子器产孢、分生孢子内含1～2个油球、菌丝细胞壁成分相对复杂(Zhang Yueping et al.,Stressphysiology and virulence characterization of Phomopsis asparagi(Sacc.)Bubákisolated from asparagus in Jiangxi province,China,Agricultural science&technology,2012,13(7):1502-1508)。迄今为止，国内外对防御酶与芦笋茎枯病菌之间的关系研究报道较少。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的国内外对防御酶与芦笋茎枯病菌之间的关系研究报道较少缺陷，从而提供一种诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解酶及抗芦笋茎枯病品种的筛选方法。
为此,本发明提供如下技术方案：
一种诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌，为天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi，保藏编号为：CGMCC No.13874。
分离与筛选如下：
(1)从采集芦笋茎枯病标本，于4度冰箱保存，以备分离；
(2)将马铃薯葡萄糖琼脂培养基于121度高压灭菌后，按10毫升每个的量倒平板，冷却后备用；
(3)将步骤(1)冰箱保存的标本于病健交界处剪下5毫米×5毫米的小块，置于75％酒精中消毒1分钟，转到0.1％升汞中消毒30秒，再转到 75％酒精中消毒1分钟，然后转到无菌水中洗涤2次，最后置于吸水纸上吸干水；
(4)将吸干水的小块转到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，然后置于 25到28度培养箱中培养，2天后，将长出的菌落接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上进行纯化；
(5)筛选获得能够诱导分泌高含量细胞壁降解酶的保藏编号为： CGMCCNo.13874的芦笋茎枯病菌强致病力菌株XT2。
一种芦笋茎枯病菌细胞壁降解酶，由保藏编号为：CGMCCNo.13874的天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi诱导产生。
制备方法如下：
(1)培养液配制
培养液配比：KNO3 2.0克，KCl 0.5克，FeSO4 0.01克，K2HPO4 1.0克， MgSO4·7H2O0.5克，VB1 0.2毫克，L-天冬酰胺0.5克，柑橘果胶(Pectin, Sigma)或羧甲基纤维素钠盐(CMC)10.0克，蒸馏水1000毫升；将培养液调至pH 5.0后经121℃高压灭菌20分钟；
(2)细胞壁降解酶的提取与纯化
病菌在步骤(1)的培养液中静置培养8天，过滤除去菌丝，得到的培养滤液在60％饱和度的(NH4)2SO4中4度过夜，然后4度、1,1000转每分下离心20分钟，得到沉淀，用50毫摩尔每升的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0) 溶解沉淀，在同样缓冲液中4度透析24小时，期间更换透析液2次，得到的酶液置于-20度保存备用；
(3)酶浓度测定
按照0.2毫升酶液+0.8毫升的0.9％NaCl溶液、0.4毫升的酶液+0.6 毫升的0.9％NaCl溶液和0.6毫升酶液+0.4毫升0.9％NaCl溶液的比例配制3管酶溶液，加5毫升考马斯亮蓝G-250溶液后测定A595值，将A595值代入牛血清白蛋白标准曲线函数，计算出酶浓度，取3个数值的平均值；
(4)细胞壁降解酶活性测定
采用DNS法测定β-1,4-内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,Cx)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase,PMG)和滤纸酶(filter paper enzyme,FPA) 的活性。采用的DNS用量为1.5毫升，加蒸馏水定容到10毫升后测定OD540 值，酶活单位(U)为50度下每分钟催化底物释放1微克还原糖所需酶量。利用NaOH滴定法计算酶作用后所释放的羧基的数量来计算果胶甲基酯酶 (pectinmethylesterase,PE)活性。在232纳米利用232纳米处测定的反应混合液的消光值计算多聚半乳糖醛酸反式消除酶 (polymethylgalacturonase trans-eliminas,PGTE)和果胶甲基反式消除酶(pectin methyltrans-eliminase,PMTE)的活性，30度下每分钟催化底物释放1微摩尔不饱和醛酸所需酶量为一个酶活单位。所有酶活测定均重复3次。
一种抗芦笋茎枯病品种的筛选方法，采用所述的保藏编号为： CGMCC No.13874的天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi诱导产生芦笋茎枯病菌分生孢子悬浮液或细胞壁降解酶液。
所述抗芦笋茎枯病品种的筛选方法包括如下步骤:
(1)病原菌的培养：将芦笋茎枯病菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，用打孔器打孔将一菌丝块转接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，得芦笋茎枯病菌株；
(2)分生孢子的培养：将步骤(1)所得芦笋茎枯病菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化，生长，打孔，接种到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，再置于黑光灯下诱导产孢培养，产生分生孢子器；
(3)孢子悬浮液的配制：刮下分生孢子器，加入无菌水，捣碎，使分生孢子释放，过滤，并加无菌水调节到105个每毫升的浓度；
(4)接种和培养：用10微升量程的微量注射器将3-5微升芦笋茎枯病菌孢子悬浮液或诱导的细胞壁降解酶溶液注入芦笋茎秆，接种20-50天后，筛选发病面积占病斑所在平面面积＜25％的植株。
接种时的保湿方法如下：
(1)用无菌水喷湿5～10毫米厚的吸水纸，以无水珠流下为准；
(3)用剪刀沿侧面剪开直径20～40毫米长50～80毫米的塑料管，并从开缝处插入接种后的芦笋茎秆，使其环绕茎秆；
(4)用封口膜在塑料管与茎秆交界处粘贴。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌为天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi，保藏编号为：CGMCC No.13874，可以诱导芦笋诱导分泌高含量细胞壁降解酶。
2.本发明提供的芦笋茎枯病菌细胞壁降解酶当达到一定含量时刻有效防止芦笋茎枯病。
3.本发明提供的抗芦笋茎枯病品种的筛选方法可以有效筛选出抗芦笋茎枯病的芦笋品种。
病原菌保藏信息：
病原菌株名称：天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)XT2
菌株分类：天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi
保藏编号为：CGMCC No.13874
保藏日期：2017年6月9日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)
保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
(1)病原菌的分离与筛选
分离步骤：
(1)从江西、福建、海南、山东、山西、河北等6省采集芦笋茎枯病标本，于4度冰箱保存，以备分离。
(2)制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，121 度高压灭菌后，按10毫升每个的量倒平板，冷却后备用。
(3)将标本于病健交界处剪下5毫米×5毫米的小块，置于75％酒精中消毒1分钟，转到0.1％升汞中消毒30秒，再转到75％酒精中消毒1分钟，然后转到无菌水中洗涤2次，最后置于吸水纸上吸干水。
(4)将吸干水的小块转到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，然后置于 25到28度培养箱中培养。2天后，将长出的菌落接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上进行纯化。
(5)筛选获得能够诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌强致病力菌株XT2(保藏编号：CGMCC No.13874)。
芦笋茎枯病菌致病力菌株XT1、XT2、FJ2、FJ3和FJ5由本实验室分离与保存，经测定XT2为强致病力菌株，选为接种菌株，并于2017年6月9 日，藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，藏编号为：CGMCC No.13874。
(2)病原菌的培养
将芦笋茎枯病菌株XT2从保存的试管斜面或培养皿平板上挑一块5mm 直径的菌丝块，转接到在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上、25℃培养3～5 天后。用5mm打孔器打孔，将一菌丝块转接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，同时转接到试管平面4度冰箱短期保存。
(3)病原菌的保存
病菌保存采用芦笋组织保存法。将直径为5毫米的菌块(马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养基)1块，于无菌操作台上用接种针接入灭菌的芦笋组织中(将芦笋的茎杆基部切成5毫米的方块)，在25～28度下培养7～10天后，在30度下风干7天，之后在冰箱中(4度或-20度)及超低温冰箱中(-70 度)保存。
(4)分生孢子的培养
将芦笋茎枯病菌株XT2从保存的试管斜面或培养皿平板上挑一块5mm直径的菌丝块，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化，生长3～5天后，用5 毫米直径的打孔器在菌落边缘打孔，用接种针挑取菌丝块接种到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上。将接有菌丝块的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板置于黑光灯下，25～28℃全天黑光灯诱导产孢培养，共培养10～16天，使之产生分生孢子器。
(5)孢子悬浮液的配制
用载玻片刮下分生孢子器，用纱布包裹，置于8厘米直径的玻璃研钵中，加入30毫升无菌水，用研杵轻轻捣碎，使分生孢子释放。三层纱布过滤后，用血球计数板测定孢子浓度(105～109个每毫升)，并加无菌水调节105个每毫升的浓度。
(5)接种培养
ⅰ用无菌水喷湿5～10毫米厚的吸水纸，以无水珠流下为准；
ⅱ用10微升量程的微量注射器将3～5微升芦笋茎枯病菌孢子悬浮液注入芦笋茎秆；
ⅲ用剪刀沿侧面剪开直径20～40毫米长50～80毫米的塑料管，并从开缝处插入接种后的芦笋茎秆，使其环绕茎秆；
ⅳ用封口膜在保湿装置与茎秆交界处粘贴，进一步防止水分挥发。
实施例2 对比多种病原菌诱导产生细胞壁降解酶的效果
将芦笋茎枯病菌致病力菌株XT1、XT2、FJ2、FJ3和FJ5都接种到芦笋茎秆上，比较诱导产生的细胞壁降解酶的种类和数量件表1
表1几种芦笋茎枯病菌致病力菌株接种到芦笋茎秆上诱导产生的细胞壁降解酶的活性(以1％羧甲基纤维素钠作为诱导底物)
表2几种芦笋茎枯病菌致病力菌株接种到芦笋茎秆上诱导产生的细胞壁降解酶的活性(以1％果胶作为诱导底物)
实施例3 品种筛选
(1)将保藏编号为：CGMCC No.13874的天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi接种到芦笋茎秆上，接种20～50天后，根据如下所列5级分级标准调查，发病情况：
5级分级标准如下
0级：无发病；
1级：发病面积占病斑所在平面面积的10％以下；
2级：发病面积占病斑所在平面面积的10.1％～30％；
3级：发病面积占病斑所在平面面积的30.1％～50％；
4级：发病面积占病斑所在平面面积的50.1％～70％；
5级：发病面积占病斑所在平面面积的70％以上。
表3芦笋茎枯病严重度分级及其症状描述
(2)病情指数计算
按下列公式计算病情指数：
病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)
(3)抗性品种评价
统计同一品种不同重复的鉴定结果，将病情指数小于25的品种定为抗病，大于25、小于50的
品种定为中抗，大于50、小于75的品种定为中感，大于75的品种定为感病。
表4芦笋茎枯病抗性评价指标
抗感性 病情指数
感病Susceptible(S) ＞75％
中感Moderately susceptible(MS) 50％～75％
中抗Moderately resistant(MR) 25％～49.9％
抗病Resistant(R) ＜25％
(4)抗病品种的筛选
筛选江西省农业科学院蔬菜花卉所芦笋创新团队提供的31个芦笋种质资源：
在31个种质资源中，野生天门冬的病情指数均为0，为免疫种质资源；杂交一代TX-4/SD的病情指数较低，为44.20，为抗病品种；其次较抗病的是硕丰和UC157，病情指数分别为46.39和47.70；Pacific Peak、JG701、 Patron、Jersey Giant和B3的病情指数较高，病情指数分别为86.81、72.19、 71.60、70.99和70.90，为易感品种(表5)。
表5.芦笋种质资源抗性鉴定
注：表中数据为3次重复的平均值，采用Duncan氏新复极差法(DMRT) 进行差异显著性分析，数据后具有不同字母者表示在5％水平(P＝0.05)上差异极显著。Notes:Data inthis table,representing the average of three replicates,were analyzed forsignificant difference by using Duncan's Multiple Range Test(DMRT),the datawith the different letters are significantly difference at 5％level(P＝0.05).
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌，其特征在于，为天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)菌株XT2，保藏编号为：CGMCC No.13874，由以下步骤分离和筛选：
（1）从采集芦笋茎枯病标本，于4度冰箱保存，以备分离；
（2）将马铃薯葡萄糖琼脂培养基于121度高压灭菌后，按10毫升每个的量倒平板，冷却后备用；
（3）将步骤（1）冰箱保存的标本于病健交界处剪下5 毫米×5毫米的小块，置于75%酒精中消毒1分钟，转到0.1%升汞中消毒30秒，再转到75%酒精中消毒1分钟，然后转到无菌水中洗涤2次，最后置于吸水纸上吸干水；
（4）将吸干水的小块转到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，然后置于25到28度培养箱中培养，2天后，将长出的菌落接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上进行纯化；
（5）筛选获得能够诱导分泌高含量细胞壁降解酶的的芦笋茎枯病菌强致病力菌株XT2。
2.根据权利要求1所述的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌，其特征在于，诱导产生一种芦笋茎枯病菌细胞壁降解酶，所述芦笋茎枯病菌细胞壁降解酶的制备方法如下：
(1)培养液配制
培养液配比：KNO3 2.0克，KCl 0.5克，FeSO4 0.01克，K2HPO4 1.0克，MgSO4·7H2O 0.5克，VB1 0.2毫克，L-天冬酰胺0.5克，柑橘果胶或羧甲基纤维素钠盐10.0克，蒸馏水1000毫升；将培养液调至pH 5.0后经121℃高压灭菌20分钟；
(2)细胞壁降解酶的提取与纯化
病菌在步骤（1）的培养液中静置培养8天，过滤除去菌丝，然后在60%饱和度的(NH4)2SO4中4℃过夜，然后于4℃、1,1000 转每分钟下离心20分钟，得到沉淀；用50 毫摩尔每升的pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解沉淀，在pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中4℃透析24小时，期间更换透析液2次，得到的酶液置于-20℃保存。
3.一种抗芦笋茎枯病品种的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）病原菌的培养：将权利要求1所述的保藏编号为：CGMCC No.13874的天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)菌株XT2在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，用打孔器打孔将一菌丝块转接到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，得芦笋茎枯病菌株；
（2）分生孢子的培养：将步骤（1）所得芦笋茎枯病菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化，生长，打孔，接种到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，再置于黑光灯下诱导产孢培养，产生分生孢子器；
（3）孢子悬浮液的配制：刮下分生孢子器，加入无菌水，捣碎，使分生孢子释放，过滤，并加无菌水调节到105个每毫升的浓度；
（4）接种和培养：用10微升量程的微量注射器将3~5微升芦笋茎枯病菌孢子悬浮液或诱导的细胞壁降解酶溶液注入芦笋茎秆，接种20~50天后，筛选发病面积占病斑所在平面面积＜25%的植株。
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