CN113881576B - 一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用 - Google Patents

一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用，属于农业微生物技术领域。所述爪哇虫草(Cordyceps javanica)菌株Bd01，其于2021年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23078保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。所述爪哇虫草菌株Bd01从罹病死亡的咖啡灭字脊虎天牛幼虫僵虫虫体上分离得到，以该菌体的活体或其孢子悬浮液作为活性成分制备生物制剂，实现了防治咖啡灭字脊虎天牛以及由咖啡灭字脊虎天牛引起的病害的目的，利于提高咖啡的产量和品质。

Description

一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，特别是涉及一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用。
背景技术
咖啡树是属茜草科多年生常绿灌木或小乔木，日常饮用的咖啡所用的咖啡豆就是源于咖啡树果实里面的果仁，随着人们消费观念的改变，人们对于咖啡的需求逐年增多。而云南省作为中国小粒咖啡的主要产区，供应着全国各地以及贸易出口所需的咖啡，但是由于近些年小粒咖啡单一大面积的种植，导致危害咖啡的害虫形成一个稳定的生态系统，严重危害了咖啡的产量和品质，对于市场需求造成了一定的影响。危害咖啡的害虫有多种，世界上报道达360多种，我国初步调查有94种，而危害咖啡的天牛据记载有60多种，我国危害咖啡的种类的天牛主要有咖啡灭字脊虎天牛、咖啡旋皮锦天牛、海南灰天牛等，而云南省小粒咖啡种植区主要受咖啡灭字脊虎天牛危害较重。目前，用于防治咖啡灭字脊虎天牛的方法主要以化学防治、物理防治或两者结合的方式，但是都未见明显成效。
随着国家对于多种剧毒农药的禁用，以及由于长期大量使用化学农药造成天敌昆虫大量死亡、破坏生态系统、农药残留造成环境污染等问题的日益突出，寻求非化学手段的防治已成为解决问题的关键。而微生物因其能够制备成高效、安全、无残留的生物农药，一直被科研者大力追求，也为消费者带来福音，目前虽然有用于防治鞘翅目害虫的微生物报道，但是目前能够高效用于防治咖啡灭字脊虎天牛的微生物很少，而用爪哇虫草菌防治咖啡灭字脊虎天牛的报道更是鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用该菌可以防治鞘翅目害虫咖啡灭字脊虎天牛，有效减少该害虫对于咖啡的危害以及减少有该害虫引起的咖啡病害，利于咖啡产量的提高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株爪哇虫草(Cordyceps javanica)菌株Bd01，其于2021年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23078；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还提供爪哇虫草或其孢子悬浮液在防治咖啡灭字脊虎天牛方面的应用，所述爪哇虫草为所述的爪哇虫草菌株Bd01。
本发明还提供爪哇虫草或其孢子悬浮液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛的生物制剂中的应用，所述爪哇虫草为所述的爪哇虫草菌株Bd01。
本发明还提供爪哇虫草或其孢子悬浮液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛引起的咖啡病害的生物制剂中的应用，所述爪哇虫草为所述的爪哇虫草菌株Bd01。
本发明还提供一种防治咖啡灭字脊虎天牛的生物制剂，包括所述的爪哇虫草或其孢子悬浮液。
本发明还提供一种防治咖啡灭字脊虎天牛引起的咖啡病害的生物制剂，包括所述的爪哇虫草或其孢子悬浮液。
本发明化提供一种爪哇虫草孢子悬浮液的制备方法，包括：
将所述的爪哇虫草菌株Bd01接种于PPDA培养基中，在恒温恒湿培养箱中黑暗培养2周；
将培养2周完全产孢的爪哇虫草菌株Bd01用含0.1％吐温-80无菌水洗出，磁力搅拌器搅拌均匀，经血球计数板计数后，配成所需浓度孢子悬浮液。
优选的是，所述PPDA培养基由以下方法制备：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL。
优选的是，所述恒温恒湿培养条件：温度为26℃，湿度≥85％。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的爪哇虫草菌株是从自然罹病死亡的咖啡灭字脊虎天牛幼虫中分离的，以爪哇虫草菌株活体或其孢子悬浮液制备生物制剂，应用于防治咖啡灭字脊虎天牛幼虫，其致死率可达95.83％，感染率达93.61％；致死中浓度LC50为4.56×105孢子/mL。此外，还能防治由咖啡灭字脊虎天牛引起的咖啡病害，降低该害虫或其引起的病害对咖啡产量和品质的影响，进而利于咖啡产量和品质的提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同培养基对爪哇虫草Bd01菌株生长的影响；
图2为不同培养基对爪哇虫草Bd01菌株产孢量的影响；
图3为不同温度对爪哇虫草Bd01菌株生长的影响；
图4为不同湿度对爪哇虫草Bd01菌株生长的影响；
图5为不同紫外光照时长对爪哇虫草Bd01菌株生长的影响；
图6为爪哇虫草Bd01菌株系统发育进化树。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
爪哇虫草Bd01菌株的分离纯化以及鉴定
一、菌株的分离纯化
从自然罹病死亡的咖啡灭字脊虎天牛幼虫僵虫虫体上分离，该咖啡灭字脊虎天牛幼虫采集于普洱市思茅区南岛河村咖啡种植基地，该种植基地从未使用过相关微生物农药。采用如下步骤进行分离纯化：
1、首先，将罹病死亡的咖啡灭字脊虎天牛幼虫虫体以75％酒精漂洗，再用无菌水漂洗3次，最后用灭菌后的滤纸吸干水分备用。
2、灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30min。
5、培养基的配制
分离纯化用培养基：PDA培养基，包括：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL。
倒平板，每个培养皿倒大约15mL的培养基，平放静置，待冷却备用。
6、接种：消毒后的虫体接种于PDA培养基平板上，接种3皿，并在皿底做上标记。
7、培养：倒置平皿于26℃无光照培养箱中培养1-2周。
8、菌的纯化：采用单孢分离法，在无菌条件下用接种针将PDA培养基上长出的孢子挑取于PDA培养基上纯化培养；纯化3-4次得2株单一菌落，命名为LV和Bd01。
二、生物测定
分别选取16头形态大小一致健康的咖啡灭字脊虎天牛幼虫分别浸入浓度为1×108孢子/mL的不同菌株的孢子悬浮液中30s后，接入指形管(1.2×5cm)，0.1％吐温-80无菌水处理作对照，每个处理重复3次，置于26℃，RH＝80％的培养箱。逐日定时观察记载幼虫死亡情况。虫尸保湿培养，并每天检查，虫体表面长出白色菌丝或分生孢子时用显微镜检查以确定是否为该菌菌感染致死。统计死亡率、感染率，筛选出对咖啡灭字脊虎天牛幼虫有较高致病力的菌株。
Figure BDA0003331285850000041
Figure BDA0003331285850000042
经生物测试发现，在1×108孢子/mL浓度下，Bd01菌株对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致病力较强，7d后，校正死亡率为95.83％，感染率为93.61％，LT50为4.62d。
表1不同菌株对咖啡灭字脊虎天牛幼虫的致病力(接种7d后)
Figure BDA0003331285850000051
三、Bd01菌株鉴定
(1)菌株的培养特征的鉴定
将上述分离的菌株接种于PDA固体培养基上，在26℃无光照培养箱培养1-2周，观察菌株的菌落特征。
结果发现：菌株Bd01在PDA培养基上菌丝质地绒状，呈放射性生长，培养早期为白色，背面为米白色，成熟菌落为棕色。分生孢子梗长短不一，产孢细胞基部膨大，产孢端细，孢子椭圆形或圆形。
(2)菌株的序列分析
将培养一周的爪哇虫草菌落菌丝挑到灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，按照天根(北京)生物科技有限公司真菌DNA提取试剂盒的提取方法，提取上述菌体基因组DNA，并用真菌引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增。
PCR扩增体系：
1x TSINGKE Master Mix 45uL
ITS1 2uL
ITS4 2uL
gDNA 1uL
PCR扩增条件：
Figure BDA0003331285850000052
并将扩增产物擎科生物公司进行双向测序，测定该片段序列，结果表明测得上述所得菌株的ITS序列(SEQ ID NO：1)为：
GCGGAGGGATCATTAACGAGTTTTTTCAACTCCCTAACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGCGTCCGGACGGCCCTGCGCCGCCCGCGACCCGGACCCAGGCGGCCGCCGGAGACCCACAAATTCTGTTTCTATCAGTCTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACACCCCTTCGGGGGAGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCATACCGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACTCCAACGCGCACCGGGAACCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT
再通过BLAST软件进行序列对比分析，并构建菌株进化树(见图6)。
通过上述培养特征及ITS测序分析，鉴定本发明上述分离所得Bd01菌株为爪哇虫草Cordyceps javanica。
实施例2不同环境条件对菌株营养生长的影响
将爪哇虫草菌株接种于PDA培养基上培养2周，用于以下各条件的优化。
1、不同培养基对爪哇虫草菌株营养生长和产孢的影响
采用PDA、PPDA、SDAY、SMAY、Czapek五种培养基对菌株进行培养，每2天测量一次菌落直径，共测量10d，同时观察记载在不同培养基上的初始产孢时间，14d后测定产孢量。用直径为5mm的打孔器取菌落(距离培养皿中心相同位置)3块于2mL含0.1％吐温-80的无菌水中，充分振荡，用血球计数板测定孢子数，计算产孢量，选择出最适于生长、产孢的培养基。每个处理取3皿，共9块。其中，上述具体培养基组成如下：
PDA培养基：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL
PPDA培养基：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL。
SDAY培养基：新鲜蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母膏2g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。
SMAY培养基：新鲜蛋白胨10g，麦芽糖40g，酵母膏2g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。
Czazpek培养基：NaNO3 3g，K2HPO3 1g，MgS04·7H2O 0.5g，KCL0.5 g，FeS04·7H200.01g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
如图1可知，爪哇虫草菌株在PPDA培养基上生长速度最快，培养10d后菌落直径最大为5.23cm。
如图2可知，培养14d后，Czapek培养基产孢量最大为8.02×107孢子/mL，其次是PPDA培养基产孢量为7.73×107孢子/mL，两种培养基产孢量无显著差异。从培养结果来看，PPDA培养的菌株菌落紧密、厚实，具有良好的营养条件，所以可以认为PPDA培养基最适合Bd01菌株的生长。
2、不同温度下菌株营养生长
将菌株接种于PPDA培养基中心，分别培养在20℃、24℃、26℃、28℃和30℃，RH＝80％、无光照培养10d，每2天测定菌落直径并记录，每个处理3个重复。
如图3可知，其中26℃条件下最适宜生长，10d后菌落直径达5.47cm。
3、不同湿度下菌株营养生长
将菌株接种于PPDA培养基中心，将菌株接种于PPDA培养基上，置于湿度为100％、85％、75％和65％，温度为26℃，无光照培养l0 d，每2d测量菌落直径并记录，每个处理3个重复。
如图4可知，培养10d后，相对湿度在85～100％之间有利于Bd01菌株的生长。在相对湿度为100％条件下菌落生长最快，菌落直径达到5.2cm，其次是相对湿度为85％条件，菌落直径达到4.9cm。
4、不同紫外光照时长下菌株的营养生长
将菌株接种于PPDA培养基中心。在超净工作台内距30W紫外线灯20cm下，分别照射5min，40min，15min，30min，60min以正常培养为对照，放入培养箱中(26℃，RH＝80％，无光照)培养10d，每2d观察爪哇虫草Bd01菌株菌落生长情况并记录，每个处理3个重复。
如图5可知，Bd01菌株在实验室范围内紫外光照射30min以上营养生长会受到影响。
根据上述条件的筛选和优化得出，本发明分离得到的爪哇虫草Bd01菌株最佳培养基为PPDA培养基，其包括以下成分：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL。最佳培养条件为：26℃，湿度≥85％，无光照培养。
实施例3不同环境条件对菌株致病力的影响
孢子悬浮液的制备：按实施例2筛选条件，将爪哇虫草菌株Bd01接种于PPDA培养基中，在26℃恒温培养箱中培养2周；
将培养2周完全产孢的爪哇虫草菌株Bd01用含0.1％吐温-80无菌水洗出，磁力搅拌器搅拌均匀，经血球计数板计数后，配成所需浓度孢子悬浮液。
1、不同温度下菌株致病力
分别选取20头形态大小一致健康的咖啡灭字脊虎天牛幼虫，分别浸入浓度为1×108孢子/mL的孢子悬浮液中30s后，接入指形管(1.2×5cm)，每个处理3次重复。分别放入以上温度、湿度的培养箱，逐日定时观察记载幼虫死亡情况，统计死亡率，感染数及LT50。
如表2所示，温度对菌株的侵染力有明显影响，各温度条件下菌株对幼虫的校正死亡率和感染率各不相同，26～28℃条件下Bd01菌株对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致病力最强。
表2温度对菌株Bd01侵染力的影响(10d)
Figure BDA0003331285850000081
2、不同湿度下菌株致病力
分别选取20头形态大小一致健康的咖啡灭字脊虎天牛幼虫，分别浸入浓度为1×108孢子/mL的孢子悬浮液中30s后，接入指形管(1.2×5cm)，每个处理3次重复。分别放入以上湿度、温度的培养箱，逐日定时观察记载幼虫死亡情况，统计死亡率，感染数及LT50。
由表3所示，菌株Bd01对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致病力随湿度升高而增强，相对湿度在85％～100％之间Bd01菌株对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致病力最强。
表3湿度对Bd01菌株致病力的影响(10d)
Figure BDA0003331285850000091
3、不同紫外光照时长下菌株的致病力
配制浓度为1×108孢子/mL的孢子悬浮液，取5份相同量的孢子悬浮液，放在超净工作台内距30W紫外线灯20cm下，分别照射5min，40min，15min，30min，60min，然后分别选取20头形态大小一致健康的咖啡灭字脊虎天牛幼虫，浸入紫外光照射时长不同的孢子悬浮液中30s后，接入指形管(1.2×5cm)，每个处理3次重复，孢子悬浮液未经紫外光照射处理组为对照。分别放入26℃，RH＝80％的培养箱，逐日定时观察记载幼虫死亡情况，统计死亡率，感染数及LT50。
由表4可知，在实验室范围内Bd01菌株被紫外光照射60min以后对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致病力减弱。
表4湿度对Bd01菌株致病力的影响(10d)
Figure BDA0003331285850000092
Figure BDA0003331285850000101
实施例4爪哇虫草Bd01菌株致死中浓度(LC50)的确定
用0.1％吐温-80溶液将其配成5种浓度的孢子悬液，分别为：1×104、1×105、1×106、1×107和1×108孢子/mL，以0.1％吐温-80溶液为对照，每处理3次重复，每重复20头供试幼虫。置于26℃，湿度＝80％的培养箱，逐日调查记录。采用机率值分析法计算毒力回归方程和致死中浓度(LC50)，并对各处理的校正累积死亡率进行方差检验，比较各处理间的差异显著性。
如表5所示，咖啡灭字脊虎天牛幼虫接菌10d后，不同浓度孢子悬浮液对咖啡灭字脊虎天牛幼虫致死率差异显著，当浓度为1×104孢子/mL时，校正死亡率为17.28％；当浓度为1×108孢子/mL时，校正死亡率达94.91％。通过剂量回归方程算出Bd01菌株的LC50为4.56×105个孢子/mL。
表5 Bd01菌株对咖啡灭字脊虎天牛幼虫的LC50(接种10d)
Figure BDA0003331285850000102
实施例5爪哇虫草Bd01菌株对咖啡灭字脊虎天牛的防治
选择云南省临沧市某小粒咖啡种植区5年生正常结果的小粒咖啡树进行田间实验，选择30棵树，随机分为两组，第一组用浓度1×108孢子/mL的爪哇虫草Bd01菌株孢子悬浮液处理咖啡灭字脊虎天牛，第二组用浓度1×108孢子/mL的爪哇虫草LV作为对照，同时以不添加任何孢子悬浮液的培养基作为空白对照。
14天后，第一组的累计死亡率为51.43％，第二组的累计死亡率为6.51％，并且第一组咖啡树明显没有引起其他的咖啡病害，而第二组由于咖啡灭字脊虎天牛的存在导致咖啡被啃食严重，咖啡树叶片明显出现花叶。因此，本发明公开的爪哇虫草Bd01菌株可以有效的防治咖啡灭字脊虎天牛及其引起的病害，利于咖啡产量和品质的提高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 云南农业大学，富民县进出口有限公司
<120> 一株爪哇虫草菌株Bd01及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggagggat cattaacgag ttttttcaac tccctaaccc tttgtgaaca tacctatcgt 60
tgcttcggcg gactcgcccc ggcgtccgga cggccctgcg ccgcccgcga cccggaccca 120
ggcggccgcc ggagacccac aaattctgtt tctatcagtc tttctgaatc cgccgcaagg 180
caaaacaaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240
cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 300
acgcacattg cgcccgccag cattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc 360
tcgacacccc ttcgggggag tcggcgttgg ggaccggcag cataccgccg gccccgaaat 420
acagtggcgg cccgtccgcg gcgacctctg cgtagtactc caacgcgcac cgggaacccg 480
acgcggccac gccgtaaaac acccaacttc tgaacgttga cctcggatca ggtaggacta 540
cccgctgaac ttaagcatat 560

Claims (9)

1.一株爪哇虫草(Cordyceps javanica)菌株Bd01，其特征在于，所述菌株Bd01的保藏编号为：CGMCC No.23078。
2.爪哇虫草或其孢子悬浮液在防治咖啡灭字脊虎天牛方面的应用，其特征在于，所述爪哇虫草为权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01。
3.爪哇虫草或其孢子悬浮液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛的生物制剂中的应用，其特征在于，所述爪哇虫草为权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01。
4.爪哇虫草或其孢子悬浮液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛引起的咖啡病害的生物制剂中的应用，其特征在于，所述爪哇虫草为权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01。
5.一种防治咖啡灭字脊虎天牛的生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01或其孢子悬浮液。
6.一种防治咖啡灭字脊虎天牛引起的咖啡病害的生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01或其孢子悬浮液。
7.一种爪哇虫草孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的爪哇虫草菌株Bd01接种于PPDA培养基中，在恒温恒湿培养箱中黑暗培养2周；
将培养2周完全产孢的爪哇虫草菌株Bd01用含0.1％吐温-80无菌水洗出，磁力搅拌器搅拌均匀，经血球计数板计数后，配成所需浓度孢子悬浮液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述PPDA培养基由以下方法制备：去皮马铃薯200g，切块加水煮沸20min，双层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂15～20g，融化后加水补足体积至1000mL。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述恒温恒湿培养条件：温度为26℃，湿度≥85％。
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