CN114164135B - 一种抗香蕉枯萎病化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的第四个方面是提供一种尼菲霉素C的制备方法，从永兴链霉菌发酵液中分离得到，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp.nov.，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。本发明首次采用永兴链霉菌发酵分离得到尼菲霉素C，该化合物能有效拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种，破坏菌丝结构，抑制菌丝生长，能够显著降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中可溶性总糖含量、可溶性总蛋白含量、脂肪含量等。本发明为制备尼菲霉素C提供的新的思路，为枯萎病等植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

Description

一种抗香蕉枯萎病化合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种化合物的制备方法及其应用，尤其涉及一种抗香蕉枯萎病化合物的制备方法及其应用

背景技术

香蕉(Musa spp.)是世界上产量和贸易量最大的水果(FAOSTAT，2017)，也是世界十大主食之一。香蕉受到枯萎病(FW)的严重威胁，该病被认为是历史上最具破坏性的植物病害之一(Liu et al.,2020)，是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的一种土传性真菌病害，该真菌病原菌在土壤中停留时间极长，可感染木质部，诱导枯萎并杀死香蕉植株(Liu et al.,2020)。根据不同寄主对Foc的敏感性不同，将Foc分为4个生理小种，其中4号小种(Foc TR4)的寄主范围非常广泛，包括“Cavendish”和所有易受1号小种(Foc TR1)和2号小种(Foc TR2)感染的品种，是比其他小种更具毒性的病原真菌，它可以在胁迫和非胁迫条件下感染香蕉(Zuo，2013)。除少数抗病/耐性品种外，对该病原菌还没有特异性效果的防治措施。

放线菌是微生物中化合物产物最大生产者，放线菌产生的化合物约占已知抗菌化合物总量的45％(约10000个化合物)(Genilloud,2017)。在这些化合物中，有75％来自链霉菌，25％来自稀有放线菌(Olano,et al.,2009)。链霉菌是一类革兰氏阳性、丝状、产孢的放线菌，其基因组中(G+C)％含量较高，是放线菌中最大的属。链霉菌也是生物活性物质的关键来源，可以产生抗菌、抗真菌、杀虫、抗肿瘤、抗炎药、抗寄生虫、抗病毒、防污、除草和促进植物生长等多种生物活性化合物，被普遍认为是是农业和工业最重要的微生物资源(Ramesh et al.,2009；Pimentel Elardo et al.,2010；Hong et al.,2009)。大约3/4已知抗生素来自链霉菌，用于农业的抗生素约有60％来自链霉菌属，从链霉菌中也获得了几个重要的农用抗生素(Subramani et al.,2012)。因此，链霉菌是农用生物杀真菌剂或生物肥料的重要资源。

发明内容

本发明以香蕉枯萎病4号生理小种(Foc TR4)为靶标病原菌，对一株链霉菌新种进行发酵，萃取获得活性粗提物浸膏，采用Diaion HP20大孔吸附树脂、ODS反向硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备HPLC等现代色谱分离技术对活性次级代谢产物进行研究。共分离得到了1个抗香蕉枯萎病活性单体化合物，采用1D-NMR，2D-NMR和HR-MS等现代波谱技术，结合文献报道数据信息，对其结构进行了鉴定。

本发明的第一个方面是提供永兴链霉菌在制备尼菲霉素C(niphimycin C)中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensissp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2021303。

本发明的第二个方面是提供永兴链霉菌发酵液在制备尼菲霉素C(niphimycin C)中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensissp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2021303。

本发明的第三个方面是提供永兴链霉菌发酵液正丁醇提取物在制备尼菲霉素C(niphimycin C)中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为StreptomycesYongxingensis sp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。

其中，所述永兴链霉菌发酵液正丁醇提取物为永兴链霉菌发酵液加入乙醇萃取过滤后的上清液中加入正丁醇萃取浓缩正丁醇相得到的。

其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

其中，正丁醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

本发明的第四个方面是提供一种尼菲霉素C(niphimycin C)的制备方法，从永兴链霉菌发酵液中分离得到，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为StreptomycesYongxingensis sp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：(1)将永兴链霉菌接种到发酵培养液中发酵培养，获得发酵液；(2)向发酵液中加入适量乙醇萃取，过滤后取上清液，适当浓缩后加入适量正丁醇萃取，取正丁醇相，浓缩得到正丁醇提取物；(3)采用Diaion HP20大孔吸附树脂分离正丁醇提取物，用MeOH/H₂O(v/v:1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)流动相体系进行梯度洗脱，将得到的各个组分进行抗菌性测试，以Foc TR4为靶标病原菌，经TLC-direct bioautography抑菌活性检测，得到活性组分Fr.MN；(4)将活性组分Fr.MN经过ODS反向硅胶柱，以MeOH/H₂O(5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)为流动相洗脱后，以Foc TR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得到活性组分Fr.HA5；(5)Fr.MN5经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用CH₂Cl₂/MeOH(2:1)洗脱剂进行洗脱，以FocTR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得活性组分Fr.HA5-2；(6)Fr.MN5-2组分经过ODS-C18反向硅胶柱，以MeOH/H₂O(85:15)为流动相洗脱后，以Foc TR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得活性组分Fr.MN5-2-2；(7)将活性组分Fr.MN5-2-2通过RP-HPLC反复分离纯化，得到尼菲霉素C(niphimycin C)。

进一步优选地，步骤(1)中，所述发酵培养液为M6液体培养基，接种量为5％，28℃180r/min振荡培养8d。

其中，乙醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

其中，正丁醇的加入量本发明不作特别限定，本领域技术人员根据经验添加即可。

本发明的第五个方面是提供尼菲霉素C(niphimycin C)在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种中的应用。

本发明的第六个方面是提供尼菲霉素C(niphimycin C)在制备防治香蕉枯萎病菌4号生理小种所致病害中的应用。

本发明的第七个方面是提供尼菲霉素C(niphimycin C)在降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中可溶性总糖含量、和/或可溶性总蛋白含量、和/或脂肪含量中的应用。

本发明以香蕉枯萎病4号生理小种(Foc TR4)为靶标病原菌，对永兴链霉菌(下文简称“链霉菌2-11”)进行发酵，萃取获得活性粗提物浸膏，采用Diaion HP20大孔吸附树脂、ODS反向硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备HPLC等现代色谱分离技术对活性次级代谢产物进行研究，最终分离得到了1个抗香蕉枯萎病活性单体化合物，采用1D-NMR，2D-NMR和HR-MS等现代波谱技术，结合文献报道数据信息，对其结构进行了鉴定，为尼菲霉素C(niphimycin C)，进一步研究发现，该化合物能有效拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种，破坏菌丝结构，抑制菌丝生长，EC₅₀、EC₇₅和EC₉₅分别为21.35μg/mL、57.76μg/mL和241.88μg/mL，能够显著降低香蕉枯萎病菌4号生理小种菌体中可溶性总糖含量、可溶性总蛋白含量、脂肪含量等。本发明为制备尼菲霉素C(niphimycin C)提供的新的思路，为枯萎病等植物病害的防治拓展新领域，具有广阔的发展空间和良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株2-11在高氏1号培养基上培养14天后扫描电镜观察结果，标尺为2μm。

图2为基于16S rRNA邻接法构建系统发育树。

图3为链霉菌2-11发酵活性成分对植物病原真菌的抑菌活性鉴定结果。

图4为链霉菌2-11对香蕉叶绿素含量的影响结果。

图5为菌株2-11对香蕉鲜重和干重的影响结果。

图6为链霉菌2-11正丁醇浸膏化学成分分离与纯化流程图。

图7为化合物M1的结构。

图8为化合物M1对Foc TR4菌丝生长的抑制作用。

图9为扫描电镜下化合物M1对Foc TR4菌丝的形态变化影响，左图为CK，右图为化合物M1处理。

图10为透射电镜下化合物M1对Foc TR4的分生孢子形态变化影响，A、B、C为CK，D、E、F为化合物M1处理。

图11为透射电镜下化合物M1对Foc TR4的细胞超微结构变化影响，A为对照，B和C为化合物A7处理。

图12为活性化合物M1对Foc TR4菌体内N-乙酰葡萄糖胺含量的影响。

图13为活性化合物M1对香蕉枯萎病4号小种菌体内总糖的影响。

图14为活性化合物M1对香蕉枯萎病4号小种菌体内可溶性蛋白含量的影响。

图15为活性化合物M1对香蕉枯萎病4号小种菌体内脂肪含量的影响。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、永兴链霉菌

永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensissp.nov.，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2021303，地址在中国武汉的武汉大学。本发明的链霉菌从采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N，112°20′22"E)附近海域的小月柳珊瑚(Menella woodin)样品中分离得到。

1试验材料

①供试样品：小月柳珊瑚(Menella woodin)样品，采自中国南海西沙群岛东部永兴岛(16°49′53″N，112°20′22"E)附近海域。

②供试培养基：所用主要培养基见表1-1、表1-2和表1-3。

表1-1分离培养基的成分

表1-2培养特征观察培养基

表1-3生理生化特征观察培养基

③主要试剂：所用主要试剂见表1-4。

表1-4主要生化试剂及来源

④实验仪器与设备：所需主要仪器与设备见表1-5。

表1-5仪器和设备

⑤供试病原菌

香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)(Foc TR4)；香蕉枯萎病菌1号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 1(ACCC 76244)(Foc 1)；辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum Simmonds(ATCC 56815)；香蕉长形斑病菌Curvulatia fallax(ATCC 38579)；黄瓜枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cucumerinum(ATCC204378)；芒果炭疽病菌Colletotrichum musae(ATCC 96167)；水稻稻瘟病菌Pyriculariaoryzae Cavara(ATCC 62355)；胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides(Penzig)Penzig et Saccardo(ATCC MYA-456)；小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe(ATCC MYA-4620)；苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea(ATCC 208828)；草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae Brooks(ATCC 58718)；灰葡萄孢霉病菌Botrytis cinereaPersoon(ATCC 11542)。

⑥分析软件：使用的数据分析软件见表1-6。

表1-6分析软件及网址

2试验方法与结果

2.1软珊瑚共附生放线菌的分离

称取5g新鲜的珊瑚样品，无菌海水冲洗3次，以去除表层附着的细菌，充分研磨。研磨后的匀浆样品，溶于45mL的无菌水中，置于180r/min的摇床上振荡30min，充分混匀得到悬浮液。采用10倍连续稀释法进行稀释，配制成10^-1、10^-2、10^-3的悬浮液，取每个梯度的悬浮液100μL涂布于6种特异性分离培养基(M1-M6)，28℃倒置培养2-4周，每个梯度设置3个重复，待菌落长出后，挑取形态特征不同的单菌落在YE培养基进行划线纯化。筛选到1株代谢产物活性最好的菌株2-11。

2.2活性菌株的表型特征分析

2.2.1形态特征扫描电镜观察

菌株采用插片法(Park et al.,2004)进行形态学观察。活性菌株被接种在高氏1号培养基上，将灭菌的玻片(5mm×5mm)以45°斜插在接有活性菌株的高氏一号培养基上，28℃培养7-10天。将附着有孢子和菌丝的玻片经过固定、漂洗、脱水、置换、干燥和喷金后，用扫描电镜观察各菌株的菌丝和孢子链等形态特征。结果见图1，菌株2-11在Gause’s no.1培养基上产生浅黄色基内菌丝，随着年龄增长颜色加深；形成灰白色气生菌丝，气生菌丝分化为螺旋状孢子链；产生灰黑色气生孢子团，孢子具皱纹状纹饰。

2.2.2培养特征观察

参照《链霉菌鉴定手册》和《放线菌快速鉴定与系统分类》，采用国际公认及规定的七种培养基(Shirling et al.,1966；Williams et al.,1983)进行菌落及培养特征观察。采用平板划线法将菌株分别接种于ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7、PDA和Gause’s no.1培养基上，28℃倒置培养7-15d，观察并记录菌株的培养特征，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素及生长状况。颜色与ISCC COLOR CHARTS色谱进行比对(Kelly,1964)。结果显示，菌株2-11在8种培养基上均能正常生长，且不产生色素，在ISP2、ISP4、ISP7和Gause’sno.1培养基上生长良好，气生菌丝较发达，呈灰色和白色，基内菌丝丰富多样，颜色由白到淡黄，再到亮黄。

2.2.3生理生化特征分析

参照Shirking与Gottlieb(Shirking et al.,1966)的方法对活性菌株进行生理生化特征鉴定。

结果显示，菌株2-11可利用α-乳糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-苯丙氨酸、棉子糖、蜜二糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、可溶性淀粉、麦芽糖等碳源。菌株2-11可利用L-丝氨酸L-苯基丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、L-羟基脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、硝酸铵、氯化铵、L-天门冬酰胺、酪氨酸、蛋氨酸、色氨酸等氮源，不能利用L-精氨酸、L-半胱氨酸、硫酸铵、草酸铵和醋酸铵。菌株2-11具有多种酶学活性，可使明胶液化和硝酸盐还原，可产生过氧化氢酶、纤维素酶、淀粉酶、酯酶和脲酶。菌株2-11不能产生H₂S，MR和VP试验均为阴性。菌株2-11耐受pH值范围为5-9，最适生长pH值为6；在NaCl中耐受范围为0-9％，最适生长盐浓度范围为5-8％；可耐受温度范围为15-40℃，最适生长温度为30℃。

采用药敏纸片法测定菌株2-11对抗生素的敏感性，结果表明，菌株2-11对万古霉素、青霉素、红霉素、诺氟沙星(氟哌酸)、卡那霉素、庆大霉素和头孢曲松表现为高敏，多粘菌素B和头孢呋辛表现为中敏。

2.3分子生物学鉴定

(1)放线菌基因组DNA的提取

采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)进行放线菌总DNA的提取。

(2)16S rRNA的测序和分析

以放线菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F(5′-AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG-3′)和1492R(5′-TACG GCTACCTT GTTA CGAC TT-3′)进行PCR的扩增。PCR的反应体系见表1-7，PCR扩增的反应条件见表1-8(Himaman et al.,2016；Sabdono et al.,2019)。

表1-7 16S rRNA序列PCR反应体系

表1-8 16S rRNA序列PCR扩增反应条件

②PCR产物的电泳检测：

PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株PCR产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。结果得到了一条约1500bp的条带。

③测序及序列比对分析：

将菌株PCR产物进行序列测定。将测得的16S rRNA基因序列与保存在公共数据库GenBank和EzBiocloud服务器(https://www.EzBiocloud.net/identify)(Kim et al.，2012)中已知的16S rRNA序列进行同源性比较，选取25株同源性较高的标准菌株，利用MEGAversion X软件中的neighbor-joining方法构建系统发育树(Kumar,et al.,2019)。

结果见图2，菌株2-11确定为链霉菌属(Streptomyces)，与标准菌株Streptomycesrapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)和Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862)显示最高的同源性，分别为99.15％和98.46％，且在系统发育树中形成一个独立、稳定的大分支，分支自展值为62％，亲缘关系最近，结合形态特征、培养特征和生理生化特征结果，可以初步判断菌株2-11为Streptomyces属新种。

2.4基因组测序及多相分类鉴定

由北京BioMarker生物科技有限公司在Hiseq X平台上，采用配对末端测序法，在覆盖深度为100x(Illumina，San Diego，CA，USA)处对菌株2-11进行全基因组测序。对每个基因组原始数据进行过滤，Reads过滤后，高质量的成对Reads被组装，基因组组装后，供试菌株Scaffold数据与标准菌株Scaffold数据使用ANI计算平台(https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI)计算平均核苷酸一致性(ANI)(Yoon et al.,2017)，标准菌株基因组数据从EzBioCloud公共基因组数据库(https://www.ezbiocloud.net/search？tn＝Nocardioides)下载。

菌株2-11经过二代和三代测序及组装，共获得101969条基因序列，基因组由一条881804812bp完整的环状染色体组成，基因组N50长度为13335bp，序列大小与已提交的链霉菌属测序结果基本吻合。基因组组装后，由1个contigs和1个Scaffold组成，Contig N50和Scaffold N50长度均为11310836bp，基因组G+C含量为71.26％，与同属菌株相近，属于高G+C含量放线菌。基因组数据见表1-9。

从EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/search？tn＝Nocardioides)公共基因组数据库下载最高同源性标准菌株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)和Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862)的基因组数据，提交至ANI计算平台(https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI)计算平均核苷酸一致性(ANI)，结果显示，菌株2-11的(G+C)mol％含量为71.26％，Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491的(G+C)mol％含量为71.04％，Streptomyces iranensis HM 35的(G+C)mol％含量为70.93％(表1-10)。菌株2-11与标准菌株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491(T)(EF408733)比对的ANI值为94.29(≤95％)；与标准菌株Streptomyces iranensis HM 35(T)(FJ472862)比对的ANI值为94.38(≤95％)(表1-11)。基于上述鉴定分析，可以确定菌株2-11是一个Streptomyces属新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp.nov.(永兴链霉菌)。

表1-9链霉菌2-11基因组序列数据

表1-10菌株2-11的基因组和(G+C)mol％含量数据

表1-11 ANI比对结果

2.5广谱抗真菌活性研究

(1)对12种植物病原真菌的抑制作用

为了评估链霉菌活性，采用琼脂孔扩散法(Ashokvardhan et al.,2016；Sharmaet al.,2016)对12种植物病原菌进行广谱抗真菌活性测定。用打孔器取下新鲜的12种植物病原菌的菌饼(Φ＝5mm)，接种于PDA平板中央，分别在距病原菌菌饼2.5cm处的四个点处打孔(Φ＝6mm)，将过滤除菌后的代谢产物(溶解在水中配制成20mg/mL的浓度)加入孔中，以加入等量的溶剂为空白对照，每个处理重复3次。于28℃培养5-7d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径及抑菌带大小，按照下面的公式计算抑菌率(Albuquerqueet al.,2006)：

Inhibition rate(％)＝[(R1-R2)/R1]×100

式中：R1是对照组的病原菌菌落直径，R2是处理组的病原菌菌落直径。

活性物质对12种植物病原真菌的广谱抑菌活性，如图3和表1-12所示。抑菌率都在70％以上，对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)、芒果炭疽病菌(ATCC 96167)和灰葡萄孢霉病菌(ATCC 11542)的抑菌活性最好，三者无显著性差异，抑菌率分别为90.57％、90.49％和90.07％(P＜0.05)；对Foc TR4病菌的抑菌活性次之，抑菌率为86.17％，而对苹果轮纹病菌(ATCC 208828)的抑菌活性最小，抑菌率为70.29％。

表1-12活性成分对植物病原真菌的抑菌活性

表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

(2)对12种植物病原真菌孢子萌发的抑制作用

采用Tzortzakis et al(2007)的方法测定孢子萌发率。取12种病原真菌孢子悬浮液(10⁶CFU/mL)0.1mL，加入0.1mL活性成分，充分混匀，取20μL加在凹玻片上，将含有孢子的载玻片于28℃潮湿的培养室内孵育6～8h，无菌水和孢子的混合物作为对照，每个处理重复3次。待对照孢子萌发率大于90％以上时，在电子显微镜(mag＝200×lens)下观察孢子萌发，孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。每个处理计数200个孢子，用血球计数器测定孢子萌发数，并计算孢子萌发率(PSG)(Sharma et al.,2017)：

式中：A为对照组孢子萌发率，B为处理组孢子萌发率。

结果见表1-13。结果表明，过滤除菌后的活性成分对12种植物病原菌分生孢子的萌发具有显著的抑制作用(P＜0.05)。其中对辣椒炭疽病菌(ATCC 56815)和芒果炭疽病菌(ATCC 96167)分生孢子萌发抑制率最高，分别为83.11％和83.26％，两者无显著性差异，而对苹果轮纹病菌(ATCC 208828)分生孢子萌发抑制率最小，为65.15％。

表1-13对植物病原真菌孢子萌发的影响

表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

2.6盆栽实验

盆栽实验于2019年8-10月在中国热带农业科学院热带生物科学与生物技术研究所进行。温室条件为28℃，湿度70％，自然光照。从海南省儋州市采集蕉园健康土壤，20目过筛。选取生长一致、3-4片叶子的香蕉幼苗，无菌水冲洗干净，切下第二条主根，种植于装有1400g土的塑料盆中，每个处理30株。实验设4个处理组：B(未接种Foc TR4-GFP，施无菌水)；F(接种Foc TR4-GFP，施无菌水)；M(接种Foc TR4-GFP，施无菌FM1培养基)；S(接种Foc TR4-GFP，接种菌株2-11，1.0×10⁷cfu/g土)。每个处理三次重复。

Foc TR4-GFP接种：挑取新鲜培养的Foc TR4-GFP菌丝接种于PDA固体培养基上，28℃培养5d。无菌水洗脱孢子，两层无菌Mira布过滤，收集病原菌孢子悬浮液，血球计数板计数后，无菌水稀释，取100毫升孢子悬浮液接入土壤中，使得土壤中Foc TR4-GFP孢子数量为1.0×10⁵cfu/g土。

S处理组链霉菌接种：新鲜培养的链霉菌种子液按5％接种量，接入FM1液体培养基中，28℃振荡(150rpm)培养7d，稀释平板涂布法计数后，无菌水稀释，取100毫升链霉菌发酵液接入土壤中，使得土壤中链霉菌数量为1.0×10⁷cfu/g土。

根据Chen et al.(2018)方法测定了香蕉幼苗移栽42天的生理指标，包括叶绿素含量、鲜重和干重。

①香蕉苗叶绿素含量的测定

通过SPAD-502便携式叶绿素测定仪进行测定，选取香蕉苗顶上第二展开叶，分别测量叶片两侧底部、中部、上部边缘的叶绿素含量。结果如图4所示，与清水处理(B)叶绿素含量相比较，病原菌+清水(F)和病原菌+培养基(M)处理的叶绿素含量明显降低，但两者无显著性差异，叶绿素分别为38.90mg/g和39.17mg/g，这是由于香蕉幼苗受到枯萎病菌的侵染，叶绿素遭到破坏，合成受阻，含量迅速下降。而接种病原菌后用菌株2-11处理的S组，叶绿素含量显著高于清水对照B，叶绿素为58.77mg/g，这是由于链霉菌产生的生物活性物质抑制了病原菌的蔓延，及对叶片叶绿素的伤害，且菌株2-11也具有明显的促生作用，可有效提高叶片叶绿素含量，增强植株的光合作用效率，促进植株的健康生长。

②香蕉苗的鲜重和干重

将香蕉苗用清水洗净，于报纸上晾干，测量香蕉苗的鲜重。将称完鲜重后的香蕉苗置于烘箱中，80℃烘干3d，取出进行称重。盆栽实验中，用菌株2-11(S组)处理的香蕉植株平均鲜重和干重均显著高于其他组(图5)。S处理的鲜重为74.80g，比对照组B增加31.07％；干重为6.71g，比对照组B增加39.05％。而病原菌处理的F和M处理，鲜重和干重均显著低于对照组B。结果表明，菌株2-11处理后，香蕉幼苗干物质积累量显著增加，且高于正常值(p＜0.5)。因此，菌株2-11对香蕉植株具有促生长作用。

二、尼菲霉素C分离鉴定

1试验材料

1.1供试菌株

永兴链霉菌(下文简称“链霉菌2-11”)。

1.2供试病原菌

香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4(ATCC 76255)(Foc TR4)。

1.3供试培养基

本章研究中所用主要培养基见表2-1。

表2-1发酵培养基及配方

1.4主要试剂

1.4主要试剂

本研究使用的主要试剂见表2-2。

表2-2主要生化试剂及来源

1.5主要仪器

本研究所用部分主要仪器见表2-3。

表2-3主要仪器

2试验方法和结果

所有实验一式三份进行，设置三个重复，数据结果表示为平均值±标准偏差(SD)。通过方差分析(ANOVA；SAS 9.2)评估每个处理中获得的平均值之间的差异，p<0.05表示统计学上差异显著。

2.1链霉菌发酵及代谢产物提取

将链霉菌2-11接入ISP2液体培养基中，于28℃、180r/min条件下，震荡培养4d。按5％的接种量，将新鲜的菌液接入装有1L M6液体培养基的5L三角瓶中，于28℃180r/min振荡培养8d，获得发酵液120L。以1:1(v/v)比例与无水乙醇混合，超声萃取1h，过滤并收集上清液，45℃条件下减压浓缩所10L。用正丁醇以1:1(v/v)体积超声萃取5次(2L/次，30min)，合并正丁醇相，45℃条件下减压浓缩，除去正丁醇，得到正丁醇浸膏131.15g。经活性检验，正丁醇浸膏对Foc TR4病原菌具有明显的抑菌活性。

2.2 TLC检测

TLC分析方法，用0.3mm毛细吸管吸取样品，距离GF254硅胶板底部lcm处点样，待溶剂挥发干后进行展开。采用直立上行展开法对样品进行展开，在层析缸中预先加入展开剂，20min后置入薄层层析板，进行层析，当展开剂的前沿距离硅胶板边缘1.0cm时取出硅胶层析板，并标记溶剂前沿的位置，在紫外分析仪254nm处观察结果并计算Rf值。

2.3 TLC-bioautography生物活性测定

以香蕉枯萎病4号生理小种(Foc TR4)为靶标病原菌，采用TLC-生物自显影法(TLC-bioautography)进行代谢产物抑菌活性检测。配置PDA培养基，接入Foc TR4，于24℃下培养7-10d，加入10mL无菌水洗脱孢子，制备分生孢子悬浮液，加入适量PDB液体培养基，配成浓度为3.0×10⁵孢子/mL的孢子悬浮混合液。粗提物溶解在甲醇中配制成20mg/mL的浓度，使用标定的毛细管在TLC板上点4μL和8μL的样品，在TLC板上均匀喷洒(Foc TR4)孢子悬浮液(3.0×10⁵孢子/mL)三次，将TLC板置于湿润的盒子里，于25℃培养箱中12h光照，12h黑暗，昼夜交换培养4d，当TLC板上出现空白区，表明真菌生长受抑制，该粗提物中含有抗真菌成分，并记录抑菌圈直径。

2.4正丁醇浸膏大孔树脂Diaion HP20柱层析

大孔树脂95％乙醇浸泡后，湿法装柱(80mm×1000mm)，纯水冲柱至无醇。为防止大孔树脂上浮飘起，大孔树脂上层铺加一层玻璃珠或石英砂。正丁醇浸膏用超纯水溶解、过滤后进行湿法上样。上样后静置24h，待样品被大孔树脂充分吸附。用MeOH/H₂O(v/v:1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)流动相体系进行梯度洗脱，收集流分，每瓶收集100ml，经TLC检测合并得流分。

菌株2-11正丁醇浸膏经过Diaion HP20大孔吸附树脂，以MeOH/H₂O(1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)梯度洗脱，得到10个组分(Fr.M1-Fr.M10)。经TLC-directbioautography抑菌活性检测后，Fr.M8-Fr.M10对Foc TR4表现出较强的抑菌活性，合并Fr.M8-Fr.M10，得活性组分Fr.MN(7.2855g)。

2.5正丁醇活性组分ODS柱层析

ODS用100％甲醇浸泡4h，甲醇混悬，使其膨胀，湿法装柱(30mm×500mm)，纯水冲柱至无醇，活性组分Fr.MN用超纯水溶解、过滤后上样。上样后静置24h，待样品被ODS充分吸附。用MeOH/H₂O(5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)流动相体系进行梯度洗脱，收集流分，每瓶收集100ml，结合TLC化学检测及TLC-bioautography生物活性检测合并得组分。

将活性组分Fr.MN经过ODS反向硅胶柱，以MeOH/H₂O(5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,MeOH)为流动相洗脱后，收集70管流分，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得1.4859g活性组分Fr.MN5。Fr.MN5经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用CH₂Cl₂/MeOH(2:1)洗脱剂进行洗脱，共收集32管流分，由TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，合并得3个组分，得活性组分Fr.HA5-2(1.0183g)。Fr.MN5-2组分经过ODS-C18反向硅胶柱，以MeOH/H₂O(85:15)为流动相洗脱后，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，合并得Fr.MN5-2-1(0.1722)；Fr.MN5-2-2(0.5720)；Fr.MN5-2-3(0.1057)三个组分，其中Fr.MN5-2-2为活性组分，进行后期的RP-HPLC纯化。

2.6活性组分RP-HPLC分离纯化

高效液相色谱半制备条件为：Agilent 1100，UV/RID检测器，柱温30℃；色谱柱为YMC Pack ODS-A(250×10mm，5μm)；流动相为MeOH/H2O；检测波长分别为210，230,254和305nm；手动进样，进样量为50μL；流速为0.2mL/min。

活性组分Fr.MN5-2-2经过RP-HPLC反复分离纯化(RID A:Refractive IndexSignal；λ＝230)，得到高纯度单体化合物M1(20mg,MeOH:H₂O＝75:25,2mL/min,tR＝39min)；及其他组分Fr.MN5-2-2-2(9.1mg)，Fr.MN5-2-2-3(3.2mg)，Fr.MN5-2-2-4(15.3mg)。经抑菌活性检测，确定单体化合物M1具有较强的抑菌活性，用CD₂OD溶解后，送600M核磁进行谱图扫描及结构鉴定。

化合物M1为白色粉末，分子式C₅₉H₁₀₃N₃O₁₈，核磁共振谱显示一个共轭1,3-二烯体系，两个非共轭烯烃双键，13个含氧甲氧基，8个脂肪甲氧基，16个亚甲基，8个脂肪族甲基，1个氨基甲基和五个非质子化碳信号(包括一个δC 99.9处的半缩碳，δC 158.2处的一个胍基碳，以及171.4-176.9处的三个羧基或酯羰基)。从C-1到C-46，通过C-17和线性聚酮链的延伸，H-16a/H-16b与C-17/C-18，H-2与C-1，H 2-46/H 3-56与胍基碳C-55启用两个大片段连接，并且在C-46上有一个甲基胍基。此外，H-35与C-1的长区域相关性导致由36元环内酯环的组装。因此，根据化合物¹H-NMR、¹³C-NMR和DEPT谱，查阅文献比对，发现化合物M1波谱数据与文献中报道一致，确定化合物M1为niphimycin C(Hu et al.,2018)。通过2D-NMR图谱解析出化合物的平面结构，如图7所示，该化合物核磁数据见表2-4。

表2-4化合物M1的NMR数据(J单位：Hz)

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¹H-NMR代表600MHz；¹³C-NMR代表150MHz。

2.7活性成分M1对Foc TR4菌丝生长的抑菌作用

链霉菌代谢产物对香蕉枯萎病菌丝生长的抑制活性通过生长速率法进行评估(Sharma et al.,2016；Sharma et al.，2017)。将溶于无菌水(10.0mg/ml)的活性成分M1添加到45-50℃的PDA培养基中，采用2倍连续稀释法制备不同活性成分浓度的PDA平板，平板终浓度分别为100.0、50.0、25.0、12.5、6.25、和3.125μg/mL，以添加等量的无菌水为对照。将Foc TR4的真菌菌饼(Φ＝5mm)接种到每个平板中央，于28±2℃下培养，直到对照菌丝到达平板边缘。测定各菌落垂直直径的平均值。每个处理重复3次。菌丝生长抑制率的计算公式如下(Nimaichand et al.,2015)：

式中：C是对照组菌落平均直径，T是处理组菌落平均直径。

采用生长速率法，测定100.0、50.0、25.0、12.5、6.25和3.125μg/mL浓度下活性成分M1对靶标病原菌Foc TR4菌丝生长的影响，如图8所示。通过测量菌落直径和模型计算，求得毒力回归方程，如表2-5所示，计算得化合物M1的EC₅₀、EC₇₅和EC₉₅分别为21.35μg/mL、57.76μg/mL和241.88μg/mL。活性成分浓度与菌丝生长抑制呈正相关，浓度越大，抑制作用越强。

表2-5化合物M1对Foc TR4的抑菌作用

2.8活性成分M1对Foc TR4病原菌形态及细胞内超微结构的影响

分别采用扫描电镜和透射电镜观察法，研究链霉菌活性成分M1对Foc TR4病原菌菌丝、病原菌分生孢子及病原菌细胞内超微结构的致畸作用。

(1)扫描电镜观察Foc TR4病原菌菌丝体变化

用打孔器在靶标病原菌Foc TR4菌落边缘取0.5cm菌饼接入含活性成分M1平板中央。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5％(w/v)戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、50％、70％、90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

从图9可观察到，对照组的菌丝表面致密光滑，形状均匀、饱满，完整性良好，菌丝周围产生大量小孢子。而经活性成分处理后，病原菌菌丝表面粗糙、不平整，菌丝萎缩、变细，完整性遭到破坏，发生断裂和破裂的现象，分生孢子产生受到抑制。通过本实验可以发现化合物M1能够破坏病原菌的菌丝结构，进而抑制了病原菌的生长和分生孢子的产生。

(2)扫描电镜观察Foc TR4病原菌分生孢子变化

制备Foc TR4孢子悬浮液(1×10⁶CFU/mL)，取5μL孢子悬浮液置于载玻片，用5μLEC₅₀浓度的活性成分M1处理，用无菌水处理作为对照，培养24h。载玻片用2.5％戊二醛4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、50％、70％、90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，最后用乙酸异戊酯洗脱乙醇两次，每次30min，真空干燥后喷金观察。

链霉菌2-11的活性成分M1对Foc TR4病原菌分生孢子的作用通过扫描电镜进行观察，如图10所示。SEM图像显示经活性成分处理的病原菌，孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿大，且完整性遭到破坏，发生断裂与破裂的现象(图10D,E,F)。而对照组孢子饱满，表面光滑，孢子形态完整(图10A,B,C)。通过本实验可以发现化合物M1能够破坏病原菌的分生孢子结构，进而抑制了病原菌的生长。

(3)透射电镜观察Foc TR4病原菌细胞超微结构的变化

用打孔器在靶标菌菌落边缘取0.5cm菌饼接入含活性成分M1平板的正中心。28℃培养5d后，在菌落边缘用刀片切取菌丝尖端并尽量切去培养基，用2.5％(w/v)戊二醛溶液4℃固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后用30％、50％、70％、90％的乙醇逐级脱水一次，100％乙醇脱水两次，每次20min，再将样品浸入环氧丙烷置换2次，每次20min。将样品在环氧丙烷：环氧树脂(1:1)溶液中浸泡1h进行包埋后，用钻石刀将包埋物切成70nm超薄切片。切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色30min，用透射电子显微镜进行观察(Phillips etal.,2003)。

链霉菌2-11的活性成分M1对Foc TR4病原菌细胞超微结构的影响如图11所示。透射电镜观察对照组病原菌细胞形态丰满，结构完整，细胞器种类齐全，细胞壁完整，细胞质均匀，线粒体形态规整，体型均匀(图11A)。经活性化合物处理后，Foc TR4病原菌细胞壁明显变薄，细胞器溶解消失，细胞组织崩解，细胞空泡形成，囊泡出现(图11B)；细胞质电子密度增加，线粒体数量明显增多，线粒体形态异常，表现出表面粗糙塌陷、缺乏基质、内外膜清晰可见，嵴肿胀和结构无序(图11C)。

2.9活性成分M1对Foc TR4病原菌生理代谢的影响

(1)活性成分M1对Foc TR4病原菌细胞壁几丁质酶的影响

N-乙酰葡萄糖胺标准曲线：配制100μg/mL的N-乙酰葡萄糖胺标准液，稀释为20，40，60，80，100μg/mL的梯度标准液。取1mL梯度标准液加入试管，再加入0.5mL硼酸钾(0.8mol/L再加入0.5mL硼酸钾溶液(0.8mol/L)，沸水浴3min，冷却后加入3mL质量分数为1％的DMAB(对二甲氨基苯甲醛)，36℃保温20min，冷却，紫外分光光度仪于波长544nm处测定吸光度。以N-乙酰葡萄糖胺含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分M1(浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，水洗3次后待测。称取1.0g菌丝，加入5mL Tris-HCl，冰浴中研磨，10000r/min，4℃离心，取上清液于-20℃保存备用。向洁净的试管中加入不同处理的菌体上清液1.0mL，再加入0.5mL硼酸钾溶液(0.8mol/L)，沸水浴3min，冷却后加入3mL质量分数为1％的DMAB(对二甲氨基苯甲醛)，36℃保温20min，冷却，用紫外分光光度仪于波长544nm处测定吸光度。通过标准曲线计算N-乙酰葡萄糖胺含量。

活性成分对Foc TR4病原菌细胞内N-乙酰葡萄糖胺含量变化影响如图12所示。随着活性化合物M1浓度升高，N-乙酰葡萄糖胺含量呈现逐渐上升趋势。化合物M1处理组在0～25μg/mL浓度区间，N-乙酰葡萄糖胺含量急剧上升，增长斜率较大。而在25～50μg/mL浓度区间，N-乙酰葡萄糖胺含量上升趋势变缓，增长斜率变小。因此，25μg/mL为化合物M1处理的浓度节点，此浓度N-乙酰葡萄糖胺含量为61.30μg/g。几丁质是病原菌细胞壁的主要组成成分，N-乙酰葡萄糖胺是几丁质水解的终产物，N-乙酰葡萄糖胺的变化能够反映病原菌细胞壁的变化。N-乙酰葡萄糖胺含量随处理浓度上升而增加，说明活性组分浓度升高，导致几丁质水解程度增大，细胞壁遭到了破坏，且破坏程度不断加重。链霉菌2-11的活性化合物通过分解病原菌的细胞壁，进而降低病原菌的生存能力，达到抑制病原菌生长的目的。

(2)活性化合物M1对Foc TR4病原菌总糖、蛋白质和脂肪含量的影响

在250mL三角瓶中加入100mL PDB培养基，接入Foc TR4病原菌，同时加入不同浓度梯度的活性成分A7(浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL)，于180r/min，28℃振荡培养5d，5000r/min离心15min收集菌丝，并用无菌水冲洗菌丝，并干燥。

①总糖(DNS法)含量的测定：配置2mL终浓度为0，40，80，120，160，200μg/mL葡萄糖溶液，加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)试剂。混匀后置100℃恒温水浴保温5min，冷却至室温，加蒸馏水稀释至20mL，混合均匀，于540nm波长处测定吸光度。葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。称取制备好的菌丝1.0g置于预冷的研钵中，加入6mLTris-HCl浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000r/min离心10min。取1mL上清夜加入2mL HCl(6mol/L)，沸水浴30min，流动冷却，用NaOH(6mol/L)溶液中和至中性加入1.5mL DNS，沸水浴5min，取2mL上清液加1.5mL DNS，沸水浴5min。取出后冷却至室温，加蒸馏水稀释至20mL，混匀。于波长540nm处测定吸光度，通过标准曲线计算总糖含量(Rivers et al.,1984)。

从图13可以看出，经活性化合物M1处理，Foc TR4病原菌菌体中可溶性总糖含量随着活性成分浓度的增大而逐渐降低，对照相比，低浓度处理无显著差异，高浓度处理差异显著。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物M1处理后，Foc TR4病原菌总糖含量分别为1.65±0.04mg/g、1.62±0.05mg/g、1.53±0.03mg/g、1.29±0.03mg/g、1.14±0.04mg/g，对照的为1.70±0.06mg/g，3.125μg/mL浓度处理与对照差异不显著；而相比于对照，处理组可溶性总糖含量分别降低了2.94％，4.90％，10.78％，22.16％，32.75％。糖类是微生物代谢的主要碳源和能源储备物质，当活性成分浓度增大时，香蕉枯萎病菌生长代谢速率减慢，合成能源物质速率也同时减缓，能源消耗速率加快，使得总糖含量同比减少。结果显示，活性化合物处理后，Foc TR4病原菌总糖含量在25μg/mL处出现急剧下降，此浓度为该化合物的EC₅₀值的区域范围。

②蛋白质含量的测定：称取制备好的菌丝1.0g置于预冷的研体中，加入6mLTris-HCl浸提液，冰浴中研磨至匀浆，4℃，10000r/min离心10min。取0.1mL上清夜，加入0.9mL蒸馏水，再加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，静置5min，于波长595nm测定吸光度，对照标准曲线，计算蛋白质含量(Bradford,1976)。

由图14可知，经活性化合物M1处理，Foc TR4病原菌菌体中蛋白质含量均随活性成分浓度的增大而逐渐减小。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物M1处理后，Foc TR4病原菌总蛋白含量分别为2.54±0.14mg/g、2.35±0.09mg/g、2.23±0.09mg/g、2.08±0.07mg/g、1.84±0.11mg/g，对照的为2.71±0.10mg/g，3.125μg/mL浓度处理与对照差异不显著，其他浓度差异显著；而相比于对照，处理组可溶性总糖含量分别降低了6.30％，13.23％，17.88％，23.39％，32.17％。

③脂肪含量的测定：脂肪含量的测定参文献(陈毓荃，2002)的方法进行：精确称取菌丝0.5g于滤纸筒中，封好纸筒两端，置于索氏脂肪抽提器中。连接已恒重的抽脂瓶，从冷凝器上端加入无水乙醚(沸程30～60℃)。在50～60℃水浴上加热提取12～16h。提取完毕后，在水浴锅上蒸去残留乙醚，再于100～105℃烘箱中干燥8h至恒重。计算公式如下：

活性化合物M1对Foc TR4病原菌菌体中脂肪含量的影响结果如图15所示。浓度为3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL的化合物M1处理后，Foc TR4病原菌脂肪含量分别为5.47％，5.07％，4.56％，3.73％和2.92％，而对照组为5.54％，化合物M1处理下，3.125μg/mL和6.25μg/mL低浓度处理，脂肪含量与对照差异不显著；而在25μg/mL和50μg/mL较高浓度处理时，病原菌体内脂肪含量降低明显，分别降低了32.73％和47.35％。因此，25μg/mL浓度的活性化合物对靶标病原菌生物合成可以造成显著的影响。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.永兴链霉菌在制备尼菲霉素C（niphimycin C）中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp. nov. ，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。

2.永兴链霉菌发酵液在制备尼菲霉素C（niphimycin C）中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp. nov. ，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。

3.永兴链霉菌发酵液正丁醇提取物在制备尼菲霉素C（niphimycin C）中的应用，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensis sp. nov. ，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021303。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述永兴链霉菌发酵液正丁醇提取物为永兴链霉菌发酵液加入乙醇萃取过滤后的上清液中加入正丁醇萃取浓缩正丁醇相得到的。

5.一种尼菲霉素C（niphimycin C）的制备方法，其特征在于，从永兴链霉菌发酵液中分离得到，所述永兴链霉菌为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces Yongxingensissp. nov. ，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021303。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将永兴链霉菌接种到发酵培养液中发酵培养，获得发酵液；

（2）向发酵液中加入适量乙醇萃取，过滤后取上清液，适当浓缩后加入适量正丁醇萃取，取正丁醇相，浓缩得到正丁醇提取物；

（3）采用Diaion HP20大孔吸附树脂分离正丁醇提取物，用MeOH/H₂O流动相体系进行梯度洗脱，MeOH/H₂O的体积比依次为H₂O：MeOH= 1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1，将得到的各个组分进行抗菌性测试，以Foc TR4为靶标病原菌，经TLC-direct bioautography抑菌活性检测，得到活性组分Fr.MN；

（4）将活性组分Fr.MN经过ODS反向硅胶柱，以MeOH/H₂O 为流动相洗脱后，MeOH/H₂O的体积比依次为H₂O：MeOH= 5:5、6:4、7:3、8:2、9:1，以Foc TR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得到活性组分Fr.HA5；

（5）Fr.MN5经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用体积比为2：1的CH₂Cl₂/MeOH洗脱剂进行洗脱，以Foc TR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得活性组分Fr.HA5-2；

（6）Fr.MN5-2组分经过ODS-C18反向硅胶柱，以 体积比为85:15的MeOH/H₂O为流动相洗脱后，以Foc TR4为靶标病原菌，结合TLC和TLC-direct bioautography抑菌活性测定结果，得活性组分Fr.MN5-2-2；

（7）将活性组分Fr.MN5-2-2通过RP-HPLC反复分离纯化，得到尼菲霉素C（niphimycinC）。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵培养液为M6液体培养基，接种量为5%，28℃ 180 r/min振荡培养8d。

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