CN114956993B - 一种源于钩状木霉的抑菌化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种源于钩状木霉的抑菌化合物及其应用。属于微生物技术领域。本发明利用一种从贵州辣椒根际土壤中分离得到的具有解磷特性的钩状木霉菌MHT1134，经过菌种活化，发酵培养，菌液收集，有机溶剂萃取、提取、层析、分离纯化获得一种新化合物MHT1134‑3‑4，该化合物分子式为C9H9O4，且它的水溶物在低质量浓度0.1mg/mL与0.01mg/mL时对辣椒枯萎病病原菌的抑制率分别为57.30％和37.90％，对靶标病原菌有较好的抑制作用，可通过提高质量浓度加大抑菌活性，本发明也为直接利用该单体化合物开发微生物杀菌剂奠定了基础。

Description

一种源于钩状木霉的抑菌化合物及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种源于钩状木霉的抑菌化合物及其应用。
背景技术
生防真菌可以通过产生抗菌素类物质直接或间接抑制病原菌生长，真菌可以产生的抗菌类物质主要有溶解酶类、抗生素、水溶化合物及抗菌肽等次级代谢产物。目前利用生防菌所产生的具有抗生作用的次级代谢产物已经研制出了多种抗生素类杀菌剂，如市场上常用的井冈霉素、阿维菌素、宁南霉素、多杀菌素等均是来源于放线菌类的次生代谢产物。真菌类来源的以木霉菌研究较多。木霉菌能够产生抗生素等次级代谢产物来抑制微生物的生长。至今为止，人们从木霉中发现了丰富的次生代谢产物，这些具有抗菌作用的次生代谢化合物主要结构类型包括萜类(环橙花烷倍半萜、胡萝卜烷倍半萜、杜松烷倍半萜、菖蒲烷倍半萜、heptelidic acid及衍生物等)、聚酮类(蒽醌、吡喃酮、trichodenones、丁烯酸内脂等)、氮杂环结构的生物碱类以及肽类(二酮哌嗪、peptaibols)等。
木霉属中很多种类都能产生丰富的次生代谢产物或溶解酶类从而对植物病原菌产生抗菌促生或是寄生溶菌作用等。目前已经报道的木霉抑菌活性物质研究主要集中在木霉菌中的哈茨木霉菌(T.harzianum)、棘孢木霉菌(T.asperellum)、里氏木霉菌(T.mareesei)、长枝木霉菌(T.longibrachiatum)及绿色木霉菌(T.viride)等分类种。而当前对钩状木霉菌所产生的抑菌活性物质研究还相对较少。随着木霉菌次级代谢产物的应用潜力在植物病害防控中逐渐被挖掘，明确生防菌中有效抑菌活性物质的种类、性状特征甚至化合物结构更有利于生防木霉菌的进一步开发利用，也为木霉类生物农药产品开发提供理论支撑。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种源于钩状木霉的抑菌化合物及其应用。本发明提供一种来源于钩状木霉菌MHT1134的抑菌新化合物、制备方法及其应用，以补充解决上述现有技术的问题。分离出的这种新化合物对辣椒枯萎病菌的抗菌效果较好，这为直接利用该单体化合物开发新颖微生物源杀菌剂以及以此为基础开发新的具有抑菌防病功能的化合物奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明前期试验中对钩状木霉菌(Trichoderma hamatum)MHT1134菌株的平板拮抗测定及发酵液抑菌活性测定中发现，无论是钩状木霉菌MHT1134菌体本身还是其发酵液都对辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)有很好的拮抗作用。并且通过显微观察发现，受钩状木霉菌MHT1134发酵液的影响，辣椒枯萎病病原菌菌丝在PDA平板上的生长出现了明显的隘缩、皱缩甚至断裂等现象，而钩状木霉菌MHT1134在与辣椒枯萎病病原菌对峙培养后经扫描电子显微镜观察发现交界处的病原菌菌丝除了被钩状木霉菌MHT1134的菌丝缠绕、穿插及重寄生外，还被其紧紧贴附且菌丝体出现明显的皱缩现象。因此推测该菌株在生长或发酵过程中代谢产生了某些抑菌活性物质。
一种源于钩状木霉的抑菌化合物，所述化合物的分子式为C9H9O4，分子结构式如下：
Figure BDA0003634849170000021
上述源于钩状木霉的抑菌化合物在防治辣椒枯萎病中的应用。
上述源于钩状木霉的抑菌化合物的制备方法，挑取钩状木霉菌MHT1134进行发酵培养，发酵液经分离纯化后即可；
钩状木霉菌MHT1134已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:M2018709，分类命名为钩状木霉，拉丁文学名为Trichoderma hamatum，保藏日期：2018年10月24日，保藏地点：中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
进一步的，具体步骤如下：
(1)孢子母液的制备：将钩状木霉菌MHT1134活化后进行摇床发酵培养，过滤后得孢子母液；
(2)液体发酵培养：在液体发酵培养基中接种孢子母液，之后进行摇床发酵培养，过滤后得发酵液；
(3)分离纯化：用乙酸乙酯对发酵液进行萃取后得发酵液粗提物，分离纯化后得所述化合物。
进一步的，步骤(1)的具体操作为：将钩状木霉菌MHT1134接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化生长3d，之后打取菌饼接种到马铃薯葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min的摇床中发酵培养7d后，用双层无菌纱布过滤得到孢子母液。
进一步的，步骤(2)的具体操作为：每1000mL液体发酵培养基中接种1mL浓度为1×106cfu/mL的孢子母液，然后放于25℃、150r/min的摇床中发酵培养5d，用双层无菌纱布过滤，批量收集发酵液备用；
所述液体发酵培养基包括如下质量浓度的组分：果糖20.59g/L、酪氨酸1.04g/L、KCL 0.50g/L、MgSO4·7H2O 0.50g/L和FeSO40.01 g/L，pH值调为5.9。
进一步的，步骤(3)的具体操作为：用乙酸乙酯对发酵液进行多次萃取，并将乙酸乙酯萃取相进行旋蒸，得到发酵液粗提物后利用薄层层析以及高效液相色谱联合分析，分离纯化得到所述化合物
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：一是本发明提供了一种新化合物MHT1134-3-4，该化合物对辣椒枯萎病病原菌有较强的抑制作用；二是本发明提供了新化合物MHT1134-3-4的制备方法，为今后新的农用杀菌剂开发增添了新途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物的TLC图谱(a)及HPLC图谱(b)；
图2附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物6种质量浓度下对辣椒枯萎病病原菌不同的抑菌活性，其中，图中上排从左到右为空白对照、二甲亚砜阴性对照、发酵液粗提物含量0.001mg/mL及0.005mg/mL；下排从左到右为发酵液粗提物含量0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL及0.5mg/mL；
图3附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物液相制备图谱；
图4附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物中各组分TLC分析，其中，左图为荧光下的观察图，右图为直接观察图；
图5附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物中发酵液1号提取组分(a)、发酵液2号提取组分(b)、发酵液3号提取组分(c)、发酵液4号提取组分(d)组分对辣椒枯萎病菌的抑制作用，其中，每一幅图中左边为阴性对照，右边为分离组分处理过的试验组；
图6附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液1、2号提取组分的HPLC及TLC图谱，注：a为1号提取组分的HPLC图谱，b为2号提取组分的HPLC图谱，c为1、2号提取组分的TLC图谱；
图7附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液3号提取组分的HPLC图谱；
图8附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134发酵液4号提取组分的HPLC图谱；
图9附图为本发明实施例1钩状木霉菌MHT1134-3组分中4个提取组分的HPLC图谱，其中，图中从左到右从上到下顺序分别是MHT1134-3-1、MHT1134-3-2、MHT1134-3-3、MHT1134-3-4组分；
图10附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)高分辨质谱；
图11附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)13C NMR谱；
图12附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)1H NMR谱；
图13附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)1H-1H COSY图谱；
图14附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)HSQC图谱；
图15附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)HMBC图谱；
图16附图为本发明实施例1中MHT1134-3-4(C9H9O4)结构式。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
1钩状木霉菌MHT1134发酵液中抑菌活性物质的分离和鉴定
1.1钩状木霉菌MHT1134发酵液及其粗提物的制备
将钩状木霉菌MHT1134接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上活化生长3d，然后用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，将钩状木霉菌MHT1134的菌饼接种到马铃薯葡萄糖培养基(PD)中，在装有300mL PD培养基的500mL三角瓶中接种6个菌饼，放于25℃、150r/min的摇床中发酵培养7d后，用双层无菌纱布过滤留菌液，在显微镜下用无菌水将孢子浓度调整为1×106cfu/mL，以此作为钩状木霉菌MHT1134的孢子母液。每1000mL液体发酵培养基中(每1000mL水中加入果糖20.59g、酪氨酸1.04g、KCL 0.50g、MgSO4·7H2O 0.50g和FeSO40.01 g，pH值调为5.9。)接种1mL浓度为1×106cfu/mL的孢子母液，然后放于25℃、150r/min的摇床中发酵培养5d，用双层无菌纱布过滤，批量收集36L发酵液备用。分别用1.5倍体积的乙酸乙酯对36L的发酵液进行萃取，共萃取3次，将发酵液的乙酸乙酯萃取相收集到一起后放入大旋转蒸发仪中，设定转速35r/min，温度38℃的条件进行旋蒸，直至有机溶剂蒸干后，转入小型旋转蒸发仪，设定转速55r/min，温度38℃结合真空泵旋干样品中的水分，最终得到钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物，然后利用智能型快速制备纯化仪结合薄层层析(TLC)以及高效液相色谱(HPLC)作初步分析。
用36L钩状木霉菌MHT1134的发酵液制备得到13.7g发酵液粗提物，呈深棕色膏状物，并且对发酵液粗提物进行硅胶板薄层色谱分析(TLC分析)后发现，分别用1﹕1，1.5﹕1及2﹕1不同配比的二氯甲醇﹕乙酸乙酯作为展开剂(每1ml展开剂中加入3滴冰乙酸)时薄层板上显色点数量和颜色的丰富度有所差别，二氯甲烷﹕乙酸乙酯配比为1.5﹕1时延展度和显色最好(图1-a)，因此确定TLC展开体系为二氯甲醇﹕乙酸乙酯＝1.5﹕1(每1ml展开剂加入3滴冰乙酸)，显色剂为香草醛-浓硫酸。HPLC分析的标准程序为：0～15min，甲醇﹕酸水＝40％﹕60％～100％﹕0(依次增加甲醇的浓度至100％)，以此程序分析得到的HPLC图最直观和具有代表性(图1-b)。
1.2发酵液粗提物抑菌活性的有效低浓度测定
用二甲亚砜作为溶剂将得到的发酵液粗提物制备成质量浓度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.50mg/mL、1mg/mL、5mg/mL的6种不同质量浓度梯度的溶液，然后制作PDA培养基，在100mL容量的三角瓶中用量杯定量量取9mL PDA装于其中灭菌备用，分别取1mL上述质量浓度的发酵液粗提物溶液加入到9mL定量的PDA培养基中倒板，以制成含发酵液粗提物质量浓度分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL及0.5mg/mL的平板，在各质量浓度平板中央接种直径为5mm的靶标病原菌(辣椒枯萎病病原菌)菌饼，每个质量浓度设3次重复，以加入等量的二甲亚砜为阴性对照平板。将各处理平板置于温度为25℃，黑暗的培养箱中倒置培养5d后测量菌落直径，利用各处理与阴性对照的菌落直径生长差异计算含化合物平板的抑菌率。抑菌率计算方法：
抑菌率(％)＝(阴性对照菌落半径-处理菌落半径/阴性对照菌落半径)×100
在含有发酵液粗提物为0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL及0.5mg/mL的6种不同质量浓度的平板上辣椒枯萎病病原菌生长均受到影响，但不同质量浓度平板上靶标病原菌受抑制程度不同，当PDA平板中发酵液粗提物含量为0.05mg/mL及以上时辣椒枯萎病病原菌生长完全受到抑制，PDA平板中发酵液粗提物含量分别为0.001mg/mL、0.005mg/mL及0.01mg/mL时辣椒枯萎病病原菌菌丝能勉强生长，以加有等量二甲亚砜的菌落直径作为阴性对照计算各质量浓度抑菌率发现随着平板中发酵液粗提物含量的增加，对靶标病原菌的抑制作用也随着增强(图2)，在受试的6个质量浓度中，发酵液粗提物设定的最低质量浓度为0.001mg/mL时的靶标病原菌平均生长直径7.36mm，而加了等量二甲亚砜为阴性对照的平板上靶标病原菌菌落直径为25.77mm，抑菌率仍能达到71.44％(表1)。最终确定在受试的几个梯度质量浓度中发酵液粗提物抑菌活性的有效低浓度为0.001mg/mL，可作为进一步分离组分的抑菌活性测试浓度。
表1不同质量浓度的发酵液粗提物对辣椒枯萎病病原菌生长的影响
Figure BDA0003634849170000071
1.3发酵液粗提物中有效化合物的提取分离及鉴定
(1)发酵液粗提物中化合物组分的分离
用少量甲醇将萃取得到的所有发酵液粗提物溶解为糊状，加入100目的硅胶拌匀后放到小型旋转蒸发仪上旋蒸，旋蒸温度38℃、转速30r/min，直至将甲醇蒸干，然后加上真空泵继续将硅胶抽干成沙状，将处理过的发酵液粗提物放到硅胶柱层析分离，用智能型快速制备纯化仪结合不同甲醇含量的洗脱剂进行梯度洗脱分离，本实验所用洗脱剂为甲醇﹕酸水＝5％﹕95％～100％﹕0，其中甲醇浓度依次增加，酸水浓度依次降低(酸水为三氟乙酸﹕水＝0.5﹕1000)。根据洗脱剂极性并经薄层层析(TLC)及高效液相色谱(HPLC)分析后合并得到最终的分离组分，分别将各组分用旋转蒸发仪蒸干得到各粗提组分。
将钩状木霉菌MHT1134发酵液粗提物用液相制备机制备，从图3可以看出发酵液粗提物可分出5个主峰和其他13个组分，共初步分离得到18个组分。其中，5个主峰出峰时的洗脱剂中甲醇浓度分别为：5％、5％-10％、38％-36％、40％-47％和100％。然后对每个组分进行TLC分析，将硅胶板上相同紫外吸收和显色的样品试管进行合样(图4)，最终分离得到14个化合物组分。
(2)具抑菌活性的有效组分筛选
根据1.2中明确的发酵液粗提物抑菌活性的最低有效浓度，将各组分用二甲亚砜稀释溶解，然后按组分溶液﹕PDA＝1﹕10的比例制备含各组分(上述分离得到的14个化合物组分)的培养基，使平板最终浓度为最低有效浓度，用直径5mm的打孔器打取辣椒枯萎病病原菌菌饼接种在平板中央，每种组分的处理重复3次，以加同等量二甲亚砜的平板为阴性对照。然后将接种辣椒枯萎病病原菌后的各处理平板放于25℃黑暗条件下培养5d，观察各组分是否有抑菌活性，并通过十字交叉法测量菌落直径以计算各组分化合物的抑菌率。抑菌率计算方法同1.2。
14个化合物组分溶液加入到PDA培养基后被制成质量浓度为0.001mg/mL的平板，各组分对辣椒枯萎病病原菌的抑菌活性有明显差异，14个组分中仅1、2、3、4这4个组分(命名为MHT1134发酵液1号提取组分、MHT1134发酵液2号提取组分、MHT1134发酵液3号提取组分、MHT1134发酵液4号提取组分)对靶标病原菌有抑菌活性(图5-a、b、c、d)，说明这4个组分中存在对靶标病原菌具有抑菌活性的物质，且4个组分对辣椒枯萎病病原菌的抑菌率均在65％以上(表2)。
表2有抑菌活性的化合物组分对辣椒枯萎病病原菌生长的影响
Figure BDA0003634849170000081
Figure BDA0003634849170000091
(3)有效组分中活性化合物的提取分离及鉴定
选取有抑菌活性的组分(MHT1134发酵液1号提取组分、MHT1134发酵液2号提取组分、MHT1134发酵液3号提取组分、MHT1134发酵液4号提取组分)作进一步的化合物分离和抑菌活性筛选，将有抑菌活性组分的样品用少量甲醇溶解，放到离心机中12500r/min离心2min，取上清液过凝胶柱，用100％液相色谱甲醇进行洗脱，用试管接样，然后对每个试管进行TLC分析，将在硅胶板上相同紫外吸收和显色的硅胶板所对应的试管合样，然后旋干。利用有效组分中再次分离到的组分按照(2)的方法进行抑菌活性检测，选取具有活性的组分，利用二氯甲烷﹕乙酸乙酯＝1.5﹕1同时加冰乙酸为展开剂，通过数次刮大硅胶板结合HPLC分析和TLC分析达到提纯分离的目的，将目的条带对应样品刮下后用20mL二氯甲烷：甲醇(10﹕1)冲5遍，经旋转蒸发仪蒸干后得到较纯化合物组分，将所得到的较纯组分用制备高效液相色谱分析仪进一步制备提纯后得到单体化合物，利用核磁共振仪器结合质谱解析单体化合物的结构，并且利用含毒介质法测定单体化合物的抑菌活性(参见方法1.2)。
1)4种活性组分的HPLC及TLC分析
对这4个组分进行高效液相色谱HPLC分析和薄层层析TLC分析(图6-8)，从图4-a、b、c中可以看出发酵液提取物1号组分和发酵液提取物2号组分中物质相近，因此我们将其合为一个组分，因发酵液提取物3号组分(MHT1134-3)有369.70mg，且物质种类丰富，选择MHT1134-3进行下一步的化合物分离。
2)活性组分MHT1134-3中的单体化合物分离提取和鉴定
组分MHT1134-3用制备高效液相色谱分析仪制备后分出4个组分，分别为MHT1134-3-1、MHT1134-3-2、MHT1134-3-3、MHT1134-3-4，4个组分的HPLC分析图谱如图9所示，其中组分MHT1134-3-3和MHT1134-3-4相对较纯，组分MHT1134-3-3为已知化合物，组分MHT1134-3-4制备提纯后得到样品4.30mg，将分离出的MHT1134-3-4化合物利用核磁共振及高分辨质谱进行结构解析。
MHT1134-3-4化合物，黄色油状，易溶于甲醇，通过高分辨质谱可以确定其分子式为C9H9O4(图10)；结合一维13C-NMR和二维HSQC核磁谱可以确定化合物中含有两个羰基[δC204.9(C-6)，166.8(C-1)]、一个sp2杂化的非质子碳[δC 166.2(C-4)]、三个sp2杂化的次甲基[δC 136.0(C-5)，135.8(C-3)，128.1(C-2)]、一个sp3杂化的连氧次甲基碳[δC 76.9(C-8)]、一个sp3杂化的亚甲基碳[δC 55.8(C-7)]和一个连氧甲基碳[δC 41.1(C-OCH3)]。1H-NMR谱给出三个烯氢信号[包括一个单峰烯氢δH 6.58(s，H-5)和两个反式共轭的烯氢δH 7.47(d，J＝16.0Hz，H-3)，6.50(d，J＝16.0Hz，H-2)]，一个次甲基信号δH 4.87(d，J＝6.0，H-8)，一个前手性亚甲基信号δH 2.70(dd，J＝6.0，18.4Hz，H-7a)，2.37(dd，J＝1.8，18.4Hz，H-7b)和一个连氧甲基信号δH 3.29(s，H-OCH3)(图11-14)。在二维HMBC谱中连氧甲基与C-8的相关信号确定了甲氧基与C-8相连(图15)。至此，MHT1134-3-4化合物的结构得以确定，如图16所示，并且MHT1134-3-4化合物为一个新化合物。
3)MHT1134-3-4单体化合物抑菌活性检测
将提取得到的MHT1134-3-4单体化合物用无菌水溶解，利用梯度稀释得到化合物的两种不同稀释质量浓度(0.1mg/mL与0.01mg/mL)溶液，用含药介质法(参见1.2方法)进行辣椒枯萎病的抑菌活性检测。结果显示MHT1134-3-4单体化合物在两种相对较低的浓度下对靶标病原菌的抑制率分别为57.30％和37.90％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种源于钩状木霉的抑菌化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为C9H9O4，分子结构式如下：
Figure FDA0003634849160000011
2.如权利要求1所述的化合物在防治辣椒枯萎病中的应用。
3.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，挑取钩状木霉菌MHT1134进行发酵培养，发酵液经分离纯化后即可；
钩状木霉菌MHT1134已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO:M2018709，分类命名为钩状木霉，拉丁文学名为Trichoderma hamatum，保藏日期：2018年10月24日，保藏地点：中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
4.如权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)孢子母液的制备：将钩状木霉菌MHT1134活化后进行摇床发酵培养，过滤后得孢子母液；
(2)液体发酵培养：在液体发酵培养基中接种孢子母液，之后进行摇床发酵培养，过滤后得发酵液；
(3)分离纯化：用乙酸乙酯对发酵液进行萃取后得发酵液粗提物，分离纯化后得所述化合物。
5.如权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：将钩状木霉菌MHT1134接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化生长3d，之后打取菌饼接种到马铃薯葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min的摇床中发酵培养7d后，用双层无菌纱布过滤得到孢子母液。
6.如权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：每1000mL液体发酵培养基中接种1mL浓度为1×106cfu/mL的孢子母液，然后放于25℃、150r/min的摇床中发酵培养5d，用双层无菌纱布过滤，批量收集发酵液备用；
所述液体发酵培养基包括如下质量浓度的组分：果糖20.59g/L、酪氨酸1.04g/L、KCL0.50g/L、MgSO4·7H2O 0.50g/L和FeSO40.01 g/L，pH值调为5.9。
7.如权利要求4所述的化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：用乙酸乙酯对发酵液进行多次萃取，并将乙酸乙酯萃取相进行旋蒸，得到发酵液粗提物后利用薄层层析以及高效液相色谱联合分析，分离纯化得到所述化合物。
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