CN112521261B - 银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物及其抑菌用途 - Google Patents

银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物及其抑菌用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物。所述代谢产物为9α‑羟基二氢脱氧卷线孢菌素。9α‑羟基二氢脱氧卷线孢菌素除对青枯菌有抑制作用外，还对常见的典型革兰氏阴性食源性致病菌大肠杆菌、典型的革兰氏阳性食源性致病菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有很好的抑制作用，其作用与抗生素硫酸链霉素效果相当，在农业生防和食品防腐方面具有重要的应用。

Description

银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物及其抑菌用途
技术领域
本发明属于真菌代谢物研究技术领域，具体涉及一种银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物及其抑制姜青枯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的用途。
背景技术
银杏是我国特有的树种，银杏各组织均含有抑菌物质，其提取物具有抗青枯病、黄瓜炭疽病等功能，其提取物中的抗菌成分有很多并非植物体分泌，而是银杏内生真菌次级代谢产物，因此，不同生长环境下生长的银杏，其提取物的抗菌性由于内生真菌种类和数量的差异而呈现差异，导致银杏提取物的药效呈现差异，因此，分离银杏组织的共生真菌，研究其活性分泌物，成了本领域研究的一个热点。
在本发明的前期工作中，发明人筛选到一株银杏内生真菌，具有抗青枯菌的活性，经鉴定为球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)，命名为球黑孢菌Gbh45 (Nigrosporasphaerica Gbh45)，于2018年11月05日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2018755。该菌种具有抗青枯菌的活性，但一直未筛选到其活性抗菌物质是什么物质，有待于进一步详细研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物及其抑制及其抑制姜青枯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的用途。
一种银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物，所述代谢产物为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素。
所述银杏内生真菌球黑孢菌Gbh45次级代谢产物的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)取银杏内生球黒孢菌Gbh45接种到PDA平板上，28℃培养待菌丝生长3～5天，挑取菌丝接种至PDB液体培养基体积中，置恒温振荡培养箱中，28℃条件下发酵培养5～7d，待发酵液呈红色时终止培养，收集发酵液，4000-6000 g离心8-12min，收集上清；
(2)将收集的上清液用萃取剂进行萃取，收集浓缩，制成。
所述萃取剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。
所述银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物在抑制青枯菌中的应用。
所述银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物在抑制大肠杆菌中的应用。
所述银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物在抑制金黄色葡萄球菌中的应用。
所述银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物在抑制枯草芽孢杆菌中的应用。
本发明的有益效果：本发明银杏内生真菌发酵液中的次级代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素除对青枯菌有抑制作用外，还对常见的典型革兰氏阴性食源性致病菌大肠杆菌和典型的革兰氏阳性食源性致病菌金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌具有很好的抑制作用，其作用与抗生素硫酸链霉素效果相当。因此，9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对细菌具有广谱的抑菌效果，在农业生防和食品防腐方面具有重要的应用。
附图说明
图1为二氯甲烷和乙酸乙酯萃取液薄层层析图；
图中，A：二氯甲烷萃取浸膏；B：乙酸乙酯萃取浸膏。
图2为二氯甲烷萃取浸膏柱层析分离活性成分HPLC谱图。
图3为乙酸乙酯萃取浸膏柱层析分离活性成分HPLC谱图。
图4为银杏内生真菌球黑孢菌Gbh45发酵液的乙酸乙酯萃取液硅胶柱层析。
图5为化合物的氢谱图。
图6为化合物的碳谱图。
图7为化合物的HMBC谱图。
图8为化合物的ROESY谱图。
图9为生姜青枯菌体外抑制效果图。
图10为目标活性抑菌物抑制效率与浓度的关系。
图11为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对大肠杆菌的抑制作用；
图中，A、B为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素；C为阴性对照，蒸馏水；D 为阳性对照，硫酸链霉素；E，空白对照，溶剂，二甲基亚砜。
图12为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对金黄色葡萄球菌的抑制作用
图中，A、B为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素；C为阴性对照，蒸馏水；D 为阳性对照，硫酸链霉素；E，空白对照，溶剂，二甲基亚砜。
图13为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对枯草芽孢杆菌的抑制作用
A、B为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素；C为阴性对照，蒸馏水；D为阳性对照，硫酸链霉素。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1活性次级代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素的分离
发明人在之前的工作中，筛选到一株银杏内生真菌，具有抗青枯菌的活性，经鉴定为球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)，命名为球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaericaGbh45)，于2018年11月05日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国.武汉.武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO:M 2018755。
取-80℃保存的球黒孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45)接种到PDA 平板上，28℃培养待菌丝生长旺盛(约3～5天)，即完成菌株的活化。
挑取少量菌丝接种至装有100mL PDB液体培养基体积500mL三角瓶中，置恒温振荡培养箱中，28℃，200rpm条件下发酵培养5～7d，待发酵液呈红色时终止培养，收集约2L发酵液，5000g离心10min，收集上清，用于活性代谢物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素(9α-hydroxydihydrodesoxybostrycin)的分离。
将收集的球黒孢菌Gbh45菌株的发酵上清液分成三份，分别用正丁醇、乙酸乙酯和二氯甲烷进行萃取，对包括萃余液在内的四个组的萃取液进行收集浓缩，浓缩液于低温下保存，用于抑菌活性测试。
采用牛津杯法对收集的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷萃取液以及萃余液进行抑菌测试，发现乙酸乙酯和二氯甲烷萃取液对青枯菌均有抑菌活性，同时薄层层析发现，二者图谱基本一致(见图1)。因此，认为二者成分基本一致，合并分离鉴定。
对红色点部分刮板进行HPLC分析，发现二者主峰的保留时间基本一致(见图2-3)。
分析HPLC流动相：A相为浓度0.1M的pH 6.50乙酸钠溶液，B相为乙腈：水＝4：1溶液。分析采用等度洗脱的方法，B相浓度维持在60％，分析10 min，流速1mL/min。
因目标抑菌化合物呈红色，因此使用硅胶柱层析分离纯化抑菌物质。采用石油醚-乙酸乙酯5:1为起始梯度对硅胶层析柱进行洗脱，待红色目标化合物(图 4)出现后，以石油醚-乙酸乙酯(1:1)加0.5％甲酸洗脱，最后乙酸乙酯和甲醇卸柱，收集不组段洗脱组分，共收集到A-H八个时间段成分，发现八个组段的组分对青枯菌均有抑菌活性，合并处理。
对收集的A-H组段成分，采用甲醇(有机相)和0.1％的甲酸(水相)作为流动相对目标活性物区段进行半制备HPLC纯化，按照等度洗脱的方法，B 相(甲醇)30％浓度，流速4mL/min，色谱柱(Zorbax SB-C18，250mm×9.4mm， 5μm)，对目标组分进行半制备纯化，分离单体成分，并采用分析HPLC验证组分纯度，收集对应保留时间处的组分，浓缩备用。
半制备HPLC以甲醇(B相)和0.1％的甲酸(A相)作为流动相，等度洗脱，维持B相(甲醇)30％浓度，流速4mL/min，使用色谱柱(Zorbax SB-C18， 250mm×9.4mm，5μm)对目标段进行纯化获得单体。
将分离得到的目标单体化合物干燥过夜，样品进行预处理后，通过Bruker AVIII-600核磁共振仪进行H谱、C谱、HMBC谱和ROESY谱分析，鉴定化合物结构。
图5所示氢谱中给出一个五取代苯环(δH 6.43，1H，br s，H-6)、两个连氧次甲基(δH 4.73，1H，d，J＝10.0Hz，H-9；δH 3.45，1H，dd，J＝11.7,3.5Hz， H-3)、一个甲氧基(δH3.88，3H，s，OCH3-12)、两个次甲基(δH 2.35，1H，m， H-1a；δH 2.35，1H，m，H-4a)、两个亚甲基(δH 2.28，1H，dt，J＝12.8,3.7Hz，1.65，1H，m，H-4；δH 2.15，1H，dq，J＝4.2,12.0Hz，1.32，1H，m，H-1) 和一个甲基信号(δH 1.31，3H，s，CH3-11)。
碳谱(图6)给出16个碳信号，结合HSQC数据，可以归属为一个裸露羰基(δC 203.8，C-10)，三个连氧苯环碳(δC 159.8，C-5；δC 157.0，C-7；δC 138.8， C-8)，两个不连氧苯环碳(δC 128.7，C-9a；δC 109.3，C-10a)，一个苯环次甲基碳(δC 100.2，C-6)，两个连氧次甲基碳(δC 75.5，C-3；δC 73.8，C-9)，一个连氧季碳(δC 71.6，C-2)，一个甲氧基碳(δC 56.7，C-12)，两个次甲基碳(δC 47.7，C-4a；δC 42.3，C-1a)，两个亚甲基碳(δC 42.3，C-1；δC30.2，C-4)，一个甲基碳(δC 27.2，C-11)。由此确定化合物分子式为C16H20O7，计算有7个不饱和度。以上碳氢数据与文献完全一致。
图7所示HMBC谱中，H-6与C-5、C-7、C-8、C-10a相关，证明了五取代苯环A环的存在。H-9与C-8、C-9a、C-10a及H-6与C-10的远程相关，证实B环与A环相连。CH3-11与C-1、C-2、C-3相关，H-4与C-2、C-3、C-1a、 C-4a相关，证实了C环的存在。H-9与C-1、C-4a，H-4与C-10的相关，证实了C环与B环的连接。由此确定化合物的平面结构，与文献报道一致。
图8所示ROESY谱中，H-9与H-4a、CH3-11相关，H-3与H-4a、CH3-11 相关，证明H-3、H-9、H-4a、CH3-11位于同侧，为β构型。δH 1.32与H-9、 H-3相关，δH 1.32为1位β氢，δH 2.15为1位α氢。H-1α与H-4α、H-1a相关，H-4α(δH 1.65)与H-1α、H-1a相关，证实H-1a为α构型。由此确定化合物的相对构型，与文献数据一致。
综合化合物的数据分析，此类蒽醌化合物具有对苯二酚结构，由此确定化合物为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素。
实施例2 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对青枯菌的抑制作用
菌种活化：将-80℃保存的接种到已灭菌的NA液体培养基(蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，dd H2O 1L，琼脂20.0g，配置好后调节pH至 7.4±0.2)中，30℃、200rpm培养过夜。
抑制效率和MIC及IC50浓度的测定：在超净工作台中取培养好的青枯菌发酵液吸取一部分测定其OD600值，而后用灭菌的NA培养基调整菌液OD600值至0.1。将目标抑菌活性物用DMSO溶解，然后使用配置好的与其相应的培养液进行2倍量的稀释，使化合物的浓度分别达到50μg/mL，25μg/mL，12.5 μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL(DMSO<1％)。
药物空白组OD600的测定。因目标抑菌活性物为红色，在600nm处有光吸收，因此需测定浓度50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL 目标抑菌活性物质的OD600值，其结果见表1。
表1目标抑菌活性物质的背景吸收
Figure RE-GDA0002897950080000071
取无菌96孔板置于超净工作台上，在样品测试组每孔加入100μL菌悬液和100μL不同浓度的目标抑菌活性物溶液，阳性对照组每孔加入100μL菌悬液和100μL不同浓度的阳性药物(硫酸链霉素)溶液，生长对照组每孔加入 100μL菌悬液和100μL无菌水，空白对照组每孔加入200μL NA液体培养基。将96孔板以封口膜密封，于30℃条件下培养24h，用酶标仪600nm下测定 OD600值，结果如图9和表2。
使用酶标仪对96孔板进行OD600值的测定，结果见表2。
表2目标抑菌活性物对青枯菌生长的影响
Figure RE-GDA0002897950080000081
因为目标抑菌物质在600nm处有光吸收，因此在计算抑制效率时需要扣除药物的背景吸收，按照式(1)计算抑制率。
Figure RE-GDA0002897950080000082
按照抑制率的计算公式，分别计算50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25 μg/mL，3.125μg/mL浓度下的抑制效率，结果见图10和表3。
表3不同浓度目标抑菌活性物质抑制青枯菌的抑菌效率
Figure RE-GDA0002897950080000083
从上表可以看出，目标抑菌活性物质在25μg/mL以上时，既可以完全抑制青枯菌的生长。通过GraphPad Prism 8软件对表中的数据进行非线性拟合，得出拟合方程。
按照式(2)计算抑制率。
Figure RE-GDA0002897950080000091
按照公式(2)，计算不同浓度抑菌活性物质的抑制效率，然后用GraphPad Prism 8软件拟合曲线，计算IC50(菌体生长抑制率为50％时的药物浓度)和 MIC值(菌体生长抑制率为95％时的药物浓度)。
通过软件拟合的方程如下：
Figure RE-GDA0002897950080000092
Y：抑制率(％)；X：log(目标抑菌物浓度)
通过GraphPad Prism 8软件计算，得出IC50＝8.974μg/mL，IC50即抑制率达到50％时的药物浓度；目标抑菌物质抑制青枯菌95％时的浓度定义为最小抑菌浓度(MIC)，通过计算，MIC浓度为23.32μg/mL。
阳性对照硫酸链霉素对青枯菌的抑制效率：
对培养24h后，96孔板阳性对照硫酸链霉素浓度为3.2μg/mL，1.6μg/mL， 0.8μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL的空的OD600值进行测定，结果如下。
表4硫酸链霉素对青枯菌生长的影响
Figure RE-GDA0002897950080000093
因为硫酸链霉素溶液在600nm处无吸收，所以硫酸链霉素对青枯菌的抑制效率按照公式，
Figure RE-GDA0002897950080000094
分别计算3.2μg/mL，1.6μg/mL，0.8 μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL浓度下的抑制效率，结果见表5。
表5硫酸链霉素对青枯菌的抑制效率
Figure RE-GDA0002897950080000101
从上表可以看出，目标抑菌活性物质在3.2μg/mL以上时，基本完全抑制青枯菌的生长。同理，按照目标抑菌活性物质MIC的分析方法，通过GraphPad Prism 8软件对表中的数据进行非线性拟合，得出硫酸链霉素对青枯菌的半数抑制浓度，即IC50浓度为0.7881μg/mL，抑制青枯菌95％时的浓度定义为最小抑菌浓度(MIC)，通过计算，链霉素MIC浓度为3.36μg/mL。
通过对实验数据进行分析和计算，目标抑菌活性物质的MIC浓度为8.974 μg/mL，硫酸链霉素的MIC浓度为0.7881μg/mL。从分析结果可以看出，目标抑菌活性物质对青枯菌具有很好的抑菌效果，MIC浓度为23.32μg/mL时，基本能完全抑制青枯菌的生长，与3.36μg/mL的硫酸链霉素相当；在8.974μg/mL 时，对青枯菌的抑制效率达到50％，与0.7881μg/mL的硫酸链霉素的浓度相当。
实施例3 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对常见食源性致病菌大肠杆菌的抑制作用
采用牛津杯法研究了球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45)次生代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素典型的食源性革兰氏阴性致病菌大肠杆菌的抑制作用。
(1)菌种的活化
从保藏的斜面菌株上用接种环刮取少量供试菌株大肠杆菌菌体，接种到灭菌的LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min)中，培养12h，即完成活化。
(2)牛津杯法抑菌实验
A、分别取活化后的大肠杆菌培养液100μL，稀释100倍后，取100μL涂布于LB平板，分别标记样品、阳性对照(25μg/L硫酸链霉素)、阴性对照(无菌蒸馏水)和空白对照(溶剂二甲基亚砜)区域，用灭菌后的牛津杯(6mm) 摆放至相应的区域。
B、将分离到的单体物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素用少量二甲基亚砜溶解，然后用无菌水调整其浓度至50μg/mL，用无菌移液器吸取150μL缓慢加至标记为样品的区域摆放的牛津杯中；同时，吸取150μL无菌蒸馏水缓慢加至阴性对照区域摆放的牛津杯中，吸取150μL硫酸链霉素溶液缓慢加至阳性对照摆放的牛津杯中，吸取150μL甲醇缓慢加至空白对照摆放的牛津杯中。
C、将上述平板在37℃恒温培养箱培养24h，观察结果和测量抑菌圈直径，见图11和表6。
表6 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用
Figure RE-GDA0002897950080000111
从上述结果可以看出，(Nigrospora sphaerica Gbh45)发酵液中的次级代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素除对青枯菌有抑制作用外，还对常见的典型革兰氏阴性食源性致病菌大肠杆菌具有很好的抑制作用，其作用与抗生素硫酸链霉素效果相当。
实施例4 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对常见食源性致病菌的金黄色葡萄球菌的抑制作用
采用牛津杯法研究了球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45)次生代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素典型的食源性革兰氏阳性致病菌金黄色葡萄球菌的抑制作用。
(1)菌种的活化
从保藏的斜面菌株上用接种环刮取少量供试菌株金黄色葡萄球菌菌体接种到灭菌的LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水 1L，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min)中，培养12h，即完成活化。
(2)牛津杯法抑菌实验
A、分别取活化后的大肠杆菌培养液100μL，稀释100倍后，取100μL涂布于LB平板，分别标记样品、阳性对照(25μg/L硫酸链霉素)、阴性对照(无菌蒸馏水)和空白对照(溶剂二甲基亚砜)区域，用灭菌后的牛津杯(6mm) 摆放至相应的区域。
B、将分离到的单体物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素用少量二甲基亚砜溶解，然后用无菌水调整其浓度至50μg/mL，用无菌移液器吸取150μL缓慢加至标记为样品的区域摆放的牛津杯中；同时，吸取150μL无菌蒸馏水缓慢加至阴性对照区域摆放的牛津杯中，吸取150μL硫酸链霉素溶液缓慢加至阳性对照摆放的牛津杯中，吸取150μL甲醇缓慢加至空白对照摆放的牛津杯中。
C、将上述平板在37℃恒温培养箱培养24h，观察结果和测量抑菌圈直径，见图12和表7。
表7 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用
Figure RE-GDA0002897950080000121
Figure RE-GDA0002897950080000131
从上述结果可以看出，球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45)发酵液中的次级代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素除对青枯菌有抑制作用外，还对常见的典型革兰氏阴性食源性致病菌大肠杆菌具有很好的抑制作用，其作用与抗生素硫酸链霉素效果相当。
实施例5 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对枯草芽孢杆菌的抑制作用
采用牛津杯法研究了球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45)对枯草芽孢杆菌的抑制效果。
(1)菌种的活化
从保藏的斜面菌株上用接种环刮取少量菌体接种到灭菌的LB液体培养基 (蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min)中，培养12h。
(2)牛津杯法抑菌实验
A、活化后的枯草芽孢杆菌菌液100μL，稀释100倍后，取100μL涂布于 LB平板，分别标记样品、阳性对照(25μg/L硫酸链霉素)和阴性对照(无菌蒸馏水)区域，用灭菌后的牛津杯(6mm)摆放至相应的区域。
B、将分离到的9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素用少量二甲基亚砜(DMSO) 溶解，然后用无菌水调整其浓度至50μg/mL，用无菌移液器吸取150μL缓慢加至标记为样品的区域摆放的牛津杯中；同时，吸取150μL无菌蒸馏水缓慢加至阴性对照区域摆放的牛津杯中，吸取150μL硫酸链霉素溶液缓慢加至阳性对照摆放的牛津杯中。
C、将上述平板在37℃恒温培养箱培养24h，观察结果和测量抑菌圈直径，见图13和表8。
表8 9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素枯草芽孢杆菌的抑制作用
Figure RE-GDA0002897950080000141
从实施例3、4、5可以看出，球黑孢菌Gbh45(Nigrospora sphaerica Gbh45) 发酵液中的次级代谢产物9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素除对青枯菌有抑制作用外，还对常见的典型革兰氏阴性食源性致病菌大肠杆菌具有很好的抑制作用以及枯草芽孢杆菌具有很好的抑菌效果，其作用与抗生素硫酸链霉素效果相当。因此，9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素对细菌具有广谱的抑菌效果，在农业生防和食品防腐方面具有重要的应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.银杏内生真菌球黑孢菌次级代谢产物在抑制枯草芽孢杆菌中的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为9α-羟基二氢脱氧卷线孢菌素。
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