CN106434372B - 珊瑚来源真菌土曲霉菌株c21-10的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株珊瑚来源真菌土曲霉（Aspergillus terreus）菌株C21‑10的应用，尤其是在抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性方面的应用。该菌株于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60004。该菌株分离自珊瑚，利用该菌株能够制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物，可以很好的应用于抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶等方面。因此，该菌株在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的制剂方面，以及在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物方面，都具有很好的应用前景。

Description

珊瑚来源真菌土曲霉菌株C21-10的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株珊瑚来源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10的应用。

背景技术

随着海洋天然产物和海洋药物研究的不断深入，海洋共附生微生物。海洋中存在有大量的海洋微生物，且海洋微生物由于所处环境特殊，具有与陆源微生物所不具有的一些特异遗传和代谢特性，不仅可适应高盐、低温、高压、寡营养等海洋特殊环境，同时生长周期短、代谢易调控、菌种易选育、可通过大规模发酵实现产业化等特点，在农业生物制剂和医药等领域开发利用中具有独特优势，具有十分重要的研究价值和广阔的应用前景，并已有许多相关专利与成功事例。

珊瑚是刺胞动物门(Cnidaria)珊瑚虫纲(Anthozoa)海生无脊椎动物，珊瑚代谢产物种类繁多、结构新颖，是海洋天然产物三大来源之一。大量研究表明，珊瑚共附生微生物可能是这些代谢产物的真正产生者。

因此，在寻找新颖结构的活性化合物以及新的珊瑚共附生微生物的相关研究具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株珊瑚来源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10的应用，尤其在抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从徐闻珊瑚保护区的普哥滨珊瑚中分离得到一株土曲霉菌株C21-10，该菌株于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60004。

利用所述土曲霉菌株C21-10能够制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物，因此，该菌株在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的制剂方面，以及在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物方面，都具有很好的应用前景。

优选地，所述抗菌是指抗金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和/或大肠杆菌(Escherichia coli,E.c)。

所述土曲霉菌株C21-10的形态特征如下：菌株C21-10在PDA培养基上，菌落土褐色至肉桂色，反面呈暗黄色至棕褐色，丝绒状菌丝上有丰富的粉末，菌丝呈放射状，无皱纹，边缘丝绒状，无渗出液或可溶性色素。

所述土曲霉菌株C21-10的显微形态特征如下：显微观察，菌株C21-10分生孢子头初为疏松球形，继而成为致密的球形，分生孢子梗生自基质，孢梗径短，120-160μm×4-4.3μm，有些弯曲，无色，壁光滑；顶囊半球形，直径为15-18μm，约有3/4表面可育；产孢结构双层；梗基8.6-9.5μm×2.5-3μm，瓶梗7-8μm×1.3-1.5μm，排列密集、向上；分生孢子近球形，2.4μm，壁光滑。

另外，本发明分离得到四种具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物，分别为化合物8、化合物11、化合物12和化合物13，其结构式分别如下所示：

所述化合物8在制备具有抗氧化和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的物质或制剂方面的应用，所述化合物11、12和/或13在制备具有抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的物质或制剂方面的应用，都在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抗菌是指抗金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和/或大肠杆菌(Escherichia coli,E.c)。

另外，所述化合物11为一种新构型的丁内酯Ⅶ的化合物，其结构如上所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明分离获得了一株珊瑚来源真菌土曲霉(Aspergillus terreus)菌株C21-10。利用该菌株能够制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物，该菌株可以很好的应用于抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶等方面。

因此，该菌株在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的制剂方面，以及在制备具有抗氧化、抗菌和/或抗乙酰胆碱酯酶活性的化合物方面，都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为菌株C21-10在PDA培养基上的菌落菌苔特征；A-B：菌落3d时正面(A)和反面形态(B)；C-D：菌落7d时正面(A)和反面形态。

图2为菌株C21-10的分生孢子梗和分生孢子；1-2：产孢结构；3-4：分生孢子头；5-6：分生孢子。

图3为菌株C21-10的ITS-rDNA序列系统发育树。

图4为化合物11的核磁共振氢谱图(¹H-NMR图谱)。

图5为化合物11的核磁共振碳谱图(¹³C-NMR图谱)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株C21-10的分离鉴定

1、菌株分离

(1)样品：采集自徐闻珊瑚保护区的普哥滨珊瑚。

(2)样品处理：样品用无菌海水快速清洗3次后，用灭菌的剪刀、解剖刀、研磨棒在无菌操作台内将珊瑚样品磨碎，放入灭菌的研钵内研磨至浆状，用灭菌的药匙取10g左右于90mL无菌海水中，然后玻璃珠振荡3min，静置20min，取上清液制成10^-2、10^-3的稀释液。

(3)菌株分离：吸取100μL各稀释液，用灭菌涂布棒均匀涂布到相应的分离培养基平板上，于28℃恒温培养箱培养3～5d。待菌丝长出后，挑取不同形态菌落，纯化，共分离到23株菌，挑取单菌落于PDA斜面上，培养并保存。

其中的一个命名为C21-10的菌株具有抗氧化、抗菌和抗乙酰胆碱酯酶活性。

2、菌株鉴定

(1)形态鉴定

如附图1所示，菌株C21-10在PDA培养基上，菌落土褐色至肉桂色，反面程暗黄色至棕褐色，丝绒状菌丝上有丰富的粉末，菌丝呈放射状，无皱纹，边缘丝绒状，无渗出液或可溶性色素。

(2)显微形态特征

如附图2所示，显微观察发现，菌株C21-10分生孢子头初为疏松球形，继而成为致密的球形，分生孢子梗生自基质，孢梗径短，120-160μm×4-4.3μm，有些弯曲，无色，壁光滑；顶囊半球形，直径为15-18μm，约有3/4表面可育；产孢结构双层；梗基8.6-9.5μm×2.5-3μm，瓶梗7-8μm×1.3-1.5μm，排列密集、向上；分生孢子近球形，2.4μm，壁光滑。

(3)分子鉴定

对上述分离得到的菌株C21-10进行ITS-rDNA序列分析。

利用ITS通用引物ITS1F和ITS4经PCR分别从真菌中提取DNA，得到长约600bp的单一PCR片段，对纯化的PCR产物进行DNA测序分析。

经BLAST对比分析和MEGA 5.0构建系统发育树，如附图3所示。

上述鉴定结果显示，菌株C21-10属于土曲霉(Aspergillus terreus，JQ717327)，命名为土曲霉菌株C21-10，并于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：60004。

实施例2利用菌株C21-10分离活性化合物

1、化合物的分离

将土曲霉菌株C21-10在发酵培养基中发酵培养，获得发酵液和菌丝体，用乙酸乙酯分别萃取发酵液和菌丝体，得到的浸膏用氯仿：甲醇(1：1)溶解后上凝胶(Sephadex LH-20)，洗脱溶剂氯仿：甲醇(1：1)，收集后分别点板，展开剂石油醚：乙酸乙酯(2：1)根据点板结果分别合并样品，一共获得13种化合物。

具体分离方法如下：

(1)珊瑚真菌土曲霉C21-10的菌种活化：用PDA斜面培养基在28℃下活化培养2-3代。

(2)珊瑚真菌土曲霉C21-10发酵液和菌丝体的制备

按8％的接种量将活化好的菌株接种到含有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于28℃，150r/min摇床发酵培养6d。发酵条件为：最适pH7.0-7.5，最适温度28℃、接种量8％，150r/min摇床培养6d。

其中，所述发酵培养基配方为：1％麦芽糖、2％可溶性淀粉、0.02％N_aH₂PO₄、0.04％K₂HPO₄。

然后采用抽滤的方法处理发酵产物，从而得到发酵液和菌丝体。

(3)珊瑚真菌土曲霉C21-10发酵粗提物

A、发酵液萃取物的制备

准确量取发酵液，用等量体积的乙酸乙酯溶液充分萃取3次，将萃取的有机相进行合并，旋转蒸发浓缩，最后得到发酵液乙酸乙酯提取物。

B、菌丝体萃取物的制备

菌丝体用乙酸乙酯超声处理30min，放在室温下，浸泡48h左右进行抽滤，除去菌丝体残余物，减压浓缩干燥后，最后得到菌丝体乙酸乙酯提取物。

经薄层层析(TLC)分析上述A、B得到的发酵液乙酸乙酯提取物和菌丝体乙酸乙酯提取物的成分相似，合并提取物。

将提取物用氯仿、甲醇溶解后上凝胶(Sephadex LH-20)，洗脱溶剂氯仿：甲醇(1:1)，收集后分别点板，展开剂石油醚:乙酸乙酯(2:1)，根据点板结果分别合并样品，一共获得13种化合物。目前9种化合物结构已确定，还有4种化合物结构仍在鉴定中。

2、化合物的鉴定

(1)对获得的化合物进行核磁共振分析鉴定，根据¹H-NMR图谱和¹³C-NMR图谱等结果，结合相关参考文献的信息，分析出化合物的化学式和结构式，如表1所示。

表1化合物结构信息

(2)其中，化合物11是黄色油状物，核磁共振谱数据归属如下表2所示。

表2化合物11核磁共振谱数据归属

(3)对化合物11进行核磁共振分析鉴定的谱图，如附图4和5所示。

实施例3化合物活性测定

1、抗氧化活性

实验参考文献《Evaluation of antioxidant property of extract andfractions obtained from a red alga》采用体外1,1-二苯基-苦基肼(DPPH)抗氧化模型进行化合物抗氧化活性评价。用酶标仪在96孔板上筛选样品在100μM时的DPPH自由基清除率，计算平均值，阳性对照为维生素C计算各浓度下的抑制率后，对其中有活性的的单体化合物，再进行定量分析，梯度稀释，平行测定三次，并用SPSS软件计算当DPPH达到50％清除率时的浓度，即半效应浓度(EC₅₀)。

结果如下表3所示：化合物8，化合物11，化合物12，化合物13都显示出了抗氧化活性，其中化合物12，化合物13显示出了明显的抗氧化活性，甚至高于阳性对照维生素C。化合物8，化合物11显示了中等强度的抗氧化活性。其余化合物抗氧化活性均不明显。

表3单体化合物的DPPH自由基清除活性(X±S，n＝3)

备注：“-”表示没有活性(12和13，活性比阳性对照好)

2、抗细菌

抗菌实验参考临床实验室标准化协会(CLSI)推荐《需氧菌释法抗菌药物敏感试验方法》(M7-A7)研究分离得到的单体化合物的抗菌活性。测试对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus,S.a)，革兰氏阴性菌副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)，大肠杆菌(Escherichia coli,E.c)，铜绿假单胞(P.Aeruginosa)，SL1(FJ404757.1,Pseudoalteromonas sp.)的抗菌活性。

结果如表4，对照阳性实验环丙沙星，其中化合物11对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌副溶血弧菌有抑菌活性，但活性并不是很强。化合物12，化合物13对金黄色葡萄球菌有强抑菌活性，对大肠杆菌有弱的抑菌活性。

表4部分单体化合物的抗菌活性

3、抗乙酰胆碱酯酶活性

阿尔茨海默氏病(Alzheimer，s disease,AD)是发生在老年和老年前期以进行性神经退化为特征的大脑退化性病变，又称早老性痴呆症。在各种病理理论中，胆碱能假说是目前被广泛接受的。因此乙酰胆碱酯酶抑制剂是目前研究比较广泛的应用在AD中的药物。本实验采用乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选模型，对几种化合物进行抗乙酰胆碱酯酶的活性进行探究。

对几种化合物通过改进的Ellman法进行乙酰胆碱酯酶活性的测定，几种化合物中抑制效果最明显的的是化合物8，在100μM时的抑制率达到51.31％，对乙酰胆碱有一定的抑制作用，其他几种化合物没有抑制乙酰胆碱酯酶的活性，阳性对照为石杉碱甲。

表5单体化合物的抑制乙酰胆碱酯酶的活性(X±S，n＝3)

4、综上所述，化合物活性汇总如表6所示。

表6化合物活性汇总

备注：+：有活性；-：没有活性。

Claims (2)

1.珊瑚来源真菌土曲霉菌株C21-10在制备具有抗氧化和抗菌双重作用的制剂方面的应用，其特征在于，所述土曲霉菌株C21-10于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60004，所述抗菌是指抗副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)。

2.珊瑚来源真菌土曲霉菌株C21-10在制备具有抗氧化和抗菌双重作用的化合物方面的应用，其特征在于，所述土曲霉菌株C21-10于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60004，所述抗菌是指抗副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)；所述化合物为化合物11和化合物12，其结构式分别如下所示：

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