CN104962507A - 一株粘细菌菌株及其抗肿瘤活性代谢产物 - Google Patents

Abstract

一株粘细菌菌株及其抗肿瘤活性代谢产物，是粘球菌属STXZ72，Myxococcussp.STXZ72，菌种保藏号为CCTCC NO：M2015353。本发明还包括粘球菌的抗肿瘤活性代谢产物的分离纯化方法。利用以上分离纯化方法所得Myxococcussp. STXZ72的代谢产物，经抗肿瘤活性测定，证明：具有高效抑制多种肿瘤细胞活性，同时对正常人脐静脉上皮细胞毒性极小。

Description

一株粘细菌菌株及其抗肿瘤活性代谢产物

技术领域

本发明涉及一株粘细菌菌株及其抗肿瘤活性蛋白，尤其是涉及一株高效抗肿瘤野生型菌株（Myxococcus sp.STXZ72）及其活性假想蛋白的分离与应用。

背景技术

粘细菌(Myxobacteria)是一类呈革兰阴性单细胞杆状，严格好氧的化能异养型原核微生物。Dawid报道粘细菌更倾向于分布在低纬度，温度稍高，气候温和的地区。在土壤中它可以休眠体的形式存活数年以上，在合适的营养条件下能重新萌发形成营养细胞，进行营养生长。近年来的研究表明，土壤已成为分离粘细菌的主要源材料。

目前已知的大多数抗生素之类的药物基本都取自于为数不多的几种微生物，其中有大约65%来自于放线菌，其余的基本上来自于杆状菌属、假单胞菌属、真菌和霉菌。而这些菌属自50多年前就开始被用于抗生素的提取，时至今日，再想从这些微生物中筛选得到新的活性物质已经相当困难。但粘细菌中可以分离抗菌、抗真菌、抗肿瘤生物活性物质无疑拓宽了选择范围。

癌症是严重威胁人类生命和健康的主要疾病之一，传统的抗癌抗生素对肿瘤的治疗常因缺乏特异性而导致治疗效果不佳或毒副作用大，从微生物中寻找新型抗肿瘤药物成为了热点。粘细菌是一类重要的资源微生物，能产生多种抗肿瘤活性极高的代谢产物，是抗肿瘤新药物的重要来源。

目前从粘细菌中己发现大约600多种生物活性物质。根据已发现的天然产物数量排名，粘细菌排在放线菌之后，假单胞杆菌之前，而与芽胞杆菌相当。但粘细菌产生活性物质的阳性菌几率却是最高，几乎所有的纤维堆囊菌属能产生抗菌或抗肿瘤活性次级代谢产物，其中目前最受关注的是由纤维堆囊菌产生的Epothilones，它抑制微管解聚，引起肿瘤细胞凋亡，被认为是能替代紫杉醇的重要化合物，同时由于其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抑制效果且对作用过程更温和，目前已进入临床应用阶段。

近年来，已经从Sorangium cellosum、Myxococcus stipitatus、Chondromyces、Myxococcus xanthus、Archangium gephyra、Byssovorax cruenta、Myxococcus fulvus等粘细菌中分别分离得到了Epothilones、Disorazoles、Phoxalone、Sorangicin、Spirodienal，Rhizododin，Apicularens A、Apicularens B，Myxohelin A、Saframycin，Archazolid A、Archazolid B、Tubulysin，Cruentaren，Myxothiazol等大环内酯类、噻唑大环类、大环聚酮类、杂环醌类、烯酸酯类、罗缩酮类等抗肿瘤活性物质。2012年Marijke H 等研究发现一种蛋白SC3对小鼠S180实体瘤具有治疗效果，说明对于蛋白类物质抗肿瘤的研究与小分子相比同样有重要意义。近年来，对粘细菌的代谢产物的研究主要集中在其小分子化合物的鉴定及活性研究方面，从粘细菌Sorangium cellulosum中分离的Epothilones，Disorazoles通过抑制肿瘤细胞有丝分裂引起细胞凋亡；从橙色粘球菌Myxococcus fulvus 中分离到Myxothiazol作用于细胞色素bC1 C2复合物及细胞色素C2氧化还原酶，从而抑制肿瘤细胞的呼吸，导致肿瘤细胞死亡。而对于粘细菌中抗肿瘤活性蛋白的研究还未见报道。Marijke H 等研究发现一种蛋白SC3对小鼠S180实体瘤具有治疗效果，分子量为100 kDa左右，已发现的具有抗肿瘤活性的蛋白类物质分子量大小在4 kDa-200 kDa之间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株具有广谱高效抗肿瘤活性的粘细菌菌株及其抗肿瘤活性代谢产物。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

本发明之粘细菌菌株，是粘球菌属STXZ72（Myxococcus sp.STXZ72），该菌种于2015年 6 月4日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2015353。

本发明之粘球菌属STXZ72（Myxococcus sp.STXZ72）的分离鉴定：采用灭活大肠杆菌诱导子实体分离法，从牛粪便周边土样中直接分离得到一株具有粘细菌性状的细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Myxococcus属，命名为粘球菌STXZ72（Myxococcus sp.STXZ72）。

抗肿瘤生物活性：

利用优化的MD1（酪蛋白胨培养基）液体培养基进行Myxococcus sp. STXZ72发酵培养，按接种量3%接种发酵培养7 d，离心收集上清，进行肿瘤细胞毒性实验。

抗肿瘤活性物质分离纯化：

将Myxococcus sp. STXZ72接种于MD1（酪蛋白胨培养基）液体培养基，于30℃，180 rpm/min，振荡培养7 d后，8000－12000 rpm/min离心15min；收集发酵上清液，收集硫酸铵浓度50%-80%的沉淀，在蛋白质纯化仪上进行分离，收集具有生物活性的组分。蛋白质纯化仪上所用凝胶柱优选为Sephadex G75 葡聚糖凝胶柱；流动相：水；流速0.5 mL/min；上样量：100 μL（微升）。

利用以上分离纯化方法所得Myxococcus sp. STXZ72的代谢产物，经抗肿瘤活性测定，证明：具有高效抑制多种肿瘤细胞活性，同时对正常人脐静脉上皮细胞毒性小。

LC-MS/MS鉴定显示以上分离纯化方法所得Myxococcus sp. STXZ72的抗肿瘤活性代谢产物为一种假想蛋白。

本发明中的抗肿瘤活性物质为蛋白质，分子量为74.5 kDa，通过氨基酸序列分析发现其380-660位氨基酸组成蛋白酶活性结构域，此蛋白酶结构域与其抗肿瘤效果有关。

微生物保藏情况说明

本发明之粘细菌菌株，是粘球菌属STXZ72（Myxococcus sp.STXZ72），该菌种于2015年 6 月4日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2015353。

附图说明

图1是菌株Myxococcus sp. STXZ72的形态特征图；A，WAX平板上菌落形态；B，革兰氏染色营养细胞；

图2是菌株Myxococcus sp. STXZ72生长曲线图；

图3是Myxococcus sp. STXZ72菌株发酵上清对多种肿瘤细胞的抑制效果图；（a为加入发酵培养基作用后人乳腺癌细胞MCF-7的形态，b为加入发酵上清液作用后人乳腺癌细胞MCF-7的形态； c为加入发酵培养基作用人乳腺癌细胞MDA-MB-231的形态，d为加入发酵上清液作用后人乳腺癌细胞MDA-MB-231的形态；e为加入发酵培养基作用后小鼠乳腺癌细胞4T1的形态，f为加入发酵上清液作用后小鼠乳腺癌细胞4T1的形态；g为加入发酵培养基作用后小鼠黑色素瘤细胞B16的形态，h为加入发酵上清液作用后小鼠黑色素瘤细胞B16；i为加入发酵培养基作用后人肝癌细胞Hep-3B的形态，j为加入发酵上清液作用后人肝癌细胞Hep-3B的形态；k为加入发酵培养基作用后人人宫颈癌细胞Hela的形态，l为加入发酵上清液作用后人宫颈癌细胞Hela的形态）；

图4是硫酸铵沉淀和丙酮沉淀对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（A是硫酸铵沉淀处理发酵上清液后收集的上清， C是丙酮沉淀处理发酵上清液后收集的上清；B是硫酸铵沉淀处理发酵上清液后收集的沉淀， D是丙酮沉淀处理发酵上清液后收集的沉淀）；

图5是温度对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（图标数字代表不同的温度）；

图6是蛋白酶K对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（A是5 μL培养基作用后人乳腺癌细胞的形态， D是10 μL培养基作用后人乳腺癌细胞的形态；B是5 μL发酵上清液作用后人乳腺癌细胞的形态， E是10 μL发酵上清液作用后人乳腺癌细胞的形态；C为5 μL蛋白酶K处理的发酵上清液后作用后人乳腺癌细胞的形态，F为10 μL蛋白酶K处理的发酵上清液后作用后人乳腺癌细胞的形态）；

图7是粗分离蛋白在AKTA  Purifier 10的分离色谱图；

图8是AKTA  Purifier 10分离的各单峰组分对肿瘤细胞的抑制效果图；

图9是 SDS-PAGE检测分离蛋白纯度图（M：marker；1：纯化蛋白）；

图10是Myxococcus sp. STXZ72分离抗肿瘤活性蛋白对多种肿瘤细胞及人正常脐静脉上皮细胞的抑制率测定图；

图11是Myxococcus sp. STXZ72分离抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

①本实施例之粘球菌属STXZ72（Myxococcus sp. STXZ72），该菌种于2015年6月4日在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2015353。

②本实施例之粘球菌STXZ72（Myxococcus sp.STXZ72）菌株分离过程：采集北纬29.73，温度范围在0-37℃的牛粪周边土壤，风干，研磨，取150目筛过滤后粉末3 g，加入卡那霉素8 mg/mL；庆大霉素30 mg/mL；氨苄青霉素30 mg/mL共2 mL，放线菌酮（15 mg/mL）1 mL，55℃放置10 min，常温下放置过夜。收集生长至对数期的大肠杆菌，115℃，30 min灭菌备用。20μg/mL的放线菌酮Wax培养基，加20μL浓的大肠杆菌。滴加约1 mm直径的上述处理后的土样至大肠杆菌滴边缘，30℃倒置培养，3天后每天连续观察子实体生长情况。接种针灼烧后在体视显微镜下挑取单颗子实体至新的Wax平板上，反复多次转接至大肠杆菌周围未出现杂菌为止，将其挑取转接到MD1（酪蛋白胨）液体培养基中，30℃，150 r/min摇床震荡培养。菌液与甘油混匀，甘油的终浓度在10%，放置-80℃保藏。

③体式显微镜和光学显微镜观察：

图1是菌株Myxococcus sp. STXZ72（简称S72）经分离纯化后的形态特征。其中A和B分别是其在WAX平板上和MD1液体培养基中培养5 d后的菌落形态和营养细胞形态特征。在WAX平板上，表现为粘稠扩展黄色不透明菌落，边缘整齐，湿润有粘性，有光泽。B是对该菌营养细胞进行的革兰氏染色，革兰氏染色为阴性杆状细菌，两端尖细。菌落形态和营养细胞革兰氏染色现象显示符合粘球菌菌落形态特征。

                                                

④Myxococcus sp. STXZ72 的生长曲线测定：

MD1（酪蛋白胨）培养基：Casein Peptone（酪蛋白胨） 0.6%，可溶性淀粉 0.2%，MgSO₄ 7H₂O 0.2%，CaCl₂ 2H₂O 0.04%，pH7.2；

具体实施过程：菌保液1 mL接种至30 mL MD1酪蛋白胨培养基，30℃，180r/min培养3 d。按3%接种量接种上述菌种于MD1酪蛋白胨培养基，30℃，180r/min，振荡培养，每12 h取样，测定OD₆₀₀值。

Myxococcus sp. STXZ72生长曲线如图2所示，Myxococcus sp. STXZ72的生长延滞期为12 h，12-60 h为对数生长期，68-72 h为稳定期，72 h之后进入衰亡期。生长曲线测定结果说明Myxococcus sp. STXZ72菌株的生长周期与已知粘细菌生长周期基本一致，同时参照其生长周期与生物活性研究可知该菌株抗肿瘤活性物在衰亡期大量积累。

⑤Myxococcus sp. STXZ72菌株16S rRNA基因同源序列分析：

具体实施过程：从MD1酪蛋白胨液体培养基中取菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按操作步骤进行全基因组提取。根据粘细菌16S rRNA基因序列设计通用引物:

序列Bf-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 

序列Bf-R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'

引物由上海invetrogen有限公司合成。

反应体系（30μL）：无菌双蒸水，21.5 μL；Buffer，3 μL；dNTP，2 μL；Mf-R（10 μM），1 μL；Mf-F（10 μM），1 μL；基因组模板，1 μL ；Pyrobest DNA Polymerase，0.1 μL。

反应程序：预变性 94℃ 4 min，变性 94℃ 45 s，退火 60℃ 45 s，延伸 72℃ 90 s，30次循环，延伸 72℃ 10 min。

PCR产物经多功能DNA纯化回收试剂盒纯化，与适量引物一起送交上海英骏生物技术有限公司测序。将测得的Myxococcus sp. STXZ72的16S rRNA基因序列，与在美国国家生物技术信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中Blast得到的粘细菌相似度较高的16S rRNA基因序列进行同源性比对分析，并构建系统发育树(Replications=1000，Bootstrap值取百分比)。

在NCBI数据库BLAST分析结果表明该菌株与黄色粘球菌Myxococcus xanthus strain KYC1200具有最高相似性，序列相似性为99%，通过BLAST比对发现其16S rRNA序列有3个碱基的差异性。利用MEGA4.1的Kimura-2-Parameter模型，运用邻接（NJ）构建系统发育树。结合菌株的形态、16S rRNA序列分析以及生理生化结果，将S72菌株命名为Myxococcus sp. STXZ72。

 ⑥Myxococcus sp. STXZ72菌株的抗肿瘤活性测定

具体实施过程：Myxococcus sp. STXZ72在MD1培养基中培养7 d（发酵的过程与生长曲线的测定过程一样）的菌液8000 r/min离心15 min，过0.22μm滤膜得到无菌发酵上清液。在96孔板中加入细胞数量为1×10³个/孔的细胞悬液100 μL， 37℃，5% CO₂细胞培养箱，培养24 h至细胞贴壁。加入所得无菌发酵上清液5 μL，对照组加入5 μL的MD1酪蛋白胨培养基。

图3是倒置显微镜观察Myxococcus sp. STXZ72的发酵培养液对肿瘤细胞MCF-7， MDA-MB-231，4T1，B16，Hep-3B，Hela的生长抑制作用效果图。a为加入发酵培养基（酪蛋白胨培养基）作用后人乳腺癌细胞MCF-7的形态，b为加入发酵上清液作用后人乳腺癌细胞MCF-7的形态； c为加入发酵培养基作用人乳腺癌细胞MDA-MB-231的形态，d为加入发酵上清液作用后人乳腺癌细胞MDA-MB-231的形态；e为加入发酵培养基作用后小鼠乳腺癌细胞4T1的形态，f为加入发酵上清液作用后小鼠乳腺癌细胞4T1的形态；g为加入发酵培养基作用后小鼠黑色素瘤细胞B16的形态，h为加入发酵上清液作用后小鼠黑色素瘤细胞B16；i为加入发酵培养基作用后人肝癌细胞Hep-3B的形态，j为加入发酵上清液作用后人肝癌细胞Hep-3B的形态；k为加入发酵培养基作用后人人宫颈癌细胞Hela的形态，l为加入发酵上清液作用后人宫颈癌细胞Hela的形态。

加入酪蛋白胨培养基的对照培养12h后上述肿瘤细胞保持贴壁，细胞呈现伸展，透亮的状态，而加入Myxococcus sp. STXZ72的发酵上清液5 μL培养12 h后，肿瘤细胞变圆，贴壁不紧，轻晃易结团漂浮，细胞颜色偏暗无光泽。说明与细胞贴壁有关的物质受到影响，可能是细胞表面的糖蛋白，糖脂等物质受到影响，另外，也有可能是从细胞内部引发的细胞皱缩状态。本发明之Myxococcus sp. STXZ72的发酵上清液对肿瘤细胞具有抑制活性。

 ⑦Myxococcus sp. STXZ72菌株的抗肿瘤活性物质成分测定

具体实施过程：

硫酸铵沉淀丙酮沉淀的沉淀和上清的细胞毒性分析：

Myxococcus sp. STXZ72菌株发酵7天后，取50 mL发酵液离心取上清，加入固体硫酸铵（缓慢加入，边搅拌边加入）至得到80%硫酸铵浓度，4℃静置盐析4 h，12000 r/min离心10 min，收集沉淀，用水复溶，并透析48 h除去盐离子。沉淀和上清分别用细胞毒性试验检测抗肿瘤活性，以无菌水为阴性对照。丙酮沉淀 S72菌株发酵7天后，取发酵上清液，12000 r/min离心去菌体，与4倍于上清液体积的冰丙酮混溶，4℃静置1h后，离心收集沉淀，待丙酮蒸发后用水复溶。13500r/min离心20 min取上清液，细胞毒性实验检验活性。

温度梯度处理发酵液上清后的细胞毒性分析：

取1 mL发酵上清液于1.5 mL离心管中，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的温度下放置30 min，13500 r/min离心收集上清液。得到的不同温度处理后的样品用于后续的活性检测。

蛋白酶K处理发酵液上清后的细胞毒性分析：

取100 μL发酵上清液于1.5 mL离心管中，加蛋白酶K至终浓度为20 μg/mL，放置于37℃，30 min，对照为10μL MD1培养基加相同浓度的蛋白酶K。得到的蛋白酶K处理后的样品用于后续的细胞毒性检测。

不同条件处理发酵液后抗肿瘤活性的变化实验操作方法：在96 孔板中接种B16，胰酶消化离心后对其进行血球计数板计数，调整细胞密度为1×10³个/100 μL每孔，置于5% CO2培养箱中，37℃培养12 h，待细胞贴壁后，实验组加入10 μL不同条件下处理发酵液后得到的样品，对照组加入10 μL的无菌水，每组做3个重复。

 图4是硫酸铵沉淀和丙酮沉淀对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（A是硫酸铵沉淀处理发酵上清液后收集的上清， C是丙酮沉淀处理发酵上清液后收集的上清；B是硫酸铵沉淀处理发酵上清液后收集的沉淀， D是丙酮沉淀处理发酵上清液后收集的沉淀），硫酸铵沉淀和丙酮沉淀发酵上清液后上清无细胞毒性，沉淀表现出明显细胞毒性，用沉淀处理12h后细胞全部漂浮；

图5是温度对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（图标数字代表不同的温度处理发酵上清液后对肿瘤细胞的毒性，）；

图6是蛋白酶K对Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性影响图（A是5 μL培养基作用后人乳腺癌细胞的形态；B是5 μL发酵上清液作用后人乳腺癌细胞的形态，C为5 μL蛋白酶K处理的发酵上清液后作用后人乳腺癌细胞的形态，D是10 μL培养基作用后人乳腺癌细胞的形态；E是10 μL发酵上清液作用后人乳腺癌细胞的形态； F为10 μL蛋白酶K处理的发酵上清液后作用后人乳腺癌细胞的形态）；

研究结果显示：硫酸铵沉淀和丙酮沉淀的上清无细胞毒性，沉淀有细胞毒性；高温处理后和蛋白酶K处理后无细胞毒性。以上结果可知Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液中的主要抗肿瘤活性物质为蛋白类物质。

 ⑧AKTA Purifier 10分离Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性蛋白：

具体实施过程：粘细菌S72菌株发酵7 d后，取发酵上清液，12000 r/min离心去菌体，500 mL上清液中加入固体硫酸铵（缓慢加入，边搅拌边加入）至硫酸铵质量浓度为30%，4℃静置4h，离心14000 r/min 10 min收集沉淀。往上清液加入固体硫酸铵至硫酸铵质量浓度50%，离心收集沉淀。再往上述所得上清液中加入固体硫酸铵至硫酸铵质量浓度80%，离心收集沉淀。将上述三种不同梯度硫酸铵沉淀分别用水复溶，用截留分子量为3.5 KDa规格的透析袋去除盐离子后，得到粗提蛋白。分子筛层析：选用sephedax G75色谱柱，流动相为超声除气泡的无菌水，在AKTA色谱仪上，将色谱柱装好后，以0.5 mL/min的流速平衡色谱柱，待基线平稳后将上述全蛋白100 μL注入上样孔，保持流速0.5 mL/min进行洗脱。检测波长为280 nm，在对应出峰时间时收集样品。

图7是粗提蛋白在AKTA  Purifier 10的分离色谱图。显示在34 min, 37.5 min, 41 min处出现明显三个色谱峰。图8是收集的对应产品峰1，峰2，峰3对肿瘤细胞的抑制效果图，结果显示:峰1，峰3均未发现对肿瘤细胞生长抑制效果，而峰2出现明显的抑制肿瘤细胞生长的活性，细胞变圆聚集且变黑，伪足消失。说明峰2为目的峰。

 ⑨Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性蛋白的质谱鉴定

具体实施过程：

取峰2处分离所得的组分共2 mL冻干至20 μL，进行SDS-PAGE检测；准备无菌的1.5 mL离心管，无菌针头切下目的条带。加入280 μL 100 mM NH₄HCO₃和120 μL的乙腈，室温放置至胶块透明，去上清，冻干。加90 μL 100 mM NH₄HCO₃和10 μL 100 mM DTT，56℃ 温育30 min。除去上清后加100 μL乙腈，放置5 min。吸去上清加70 μL 100 mM NH₄HCO₃和30μL 200 mM IAA，暗处室温放置20 min。去上清，加100 μL 100 mM NH₄HCO₃，室温15 min。去上清，加入100 μL乙腈，放置5 min，冻干。冻干后加5 μL 10ng/μL Trysin溶液，置于4℃冰箱30-60 min，使胶块充分吸胀，Trysin的量与需分析的蛋白质量比为1:20-1:100。加30 μL pH 7.8-8.0 50 mM NH4HCO3，37℃孵育20h。收集蛋白酶解液至新离心管中，原管加60 μL乙腈，0.1 μL三氟乙酸，39.9 μL水，超声3次，每次15 min，且每次换新鲜的上述溶液，合并冻干。

图9是SDS-PAGE检测峰2所得组分，峰2为明显单一条带；对此单一蛋白条带进行质谱鉴定。质谱结果在数据库中比对发现其与黄色粘球菌Myxococcus xanthus DK 1622的hypothetical protein MXAN_3676氨基酸序列比对分数最高，MXAN_3676假想蛋白氨基酸数目为697个，但目前并没有相关的功能研究。

 ⑩Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性蛋白的广谱高效抗肿瘤活性分析：

具体实施过程：

用BradFord法对分离纯化的活性组分进行定量，将活性组分稀释成4个不同浓度，稀释倍率为5倍。在96 孔板中接种小鼠黑色素瘤细胞、鼠乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人肝癌细胞等肿瘤细胞和正常细胞HUVEC（人脐静脉上皮细胞），每孔1×10³ cells/100 μL，置于5% CO2培养箱中，37℃培养12 h，待细胞贴壁后，分别加入1 μL不同浓度的样品，每一个浓度做3个重复，空白对照加入1 μL无菌水，加样后37℃孵育24h。样品作用24h后移除培养基，每孔加入10 μL MTT和90 μL新鲜培养基，CO2细胞培养箱中继续培养4h。每孔加入100 μL Formanzan溶解液，轻轻振荡10 min。在酶联免疫检测仪上测定吸光度（检测波长490 nm）。同时设置调零孔和对照孔。以上使用方法参照MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒使用说明进行操作，检测各样品对肿瘤细胞的抑制率。半抑制率浓度IC50采用如下方法进行计算Xm：lg最大剂量，I：lg（最大剂量/相临剂量），P：抑制率之和，Pm：最大抑制率，Pn：最小抑制率。。

图10是分离Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液抗肿瘤活性蛋白的对多种肿瘤细胞的抑制率测定，采用MTT法检测了分离的蛋白类物质对多种肿瘤细胞HeLa（人宫颈癌细胞）、4T1（小鼠乳腺癌细胞）、Hep-3B（人肝癌细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、B16（小鼠黑色素瘤细胞）、HT-29（人结肠癌细胞）、HCT-116（人结肠癌细胞）、H460（人肺癌细胞）和正常细胞HUVEC（人脐静脉上皮细胞）的生长抑制率，结果表明其对4T1（小鼠乳腺癌细胞）抑制率最高，达到65%以上，对H460（人肺癌细胞）抑制率也有很高的抑制活性，达到60%，对上述肿瘤细胞抑制率均在35%以上，而对正常细胞HUVEC的抑制率低于10%，对正常人脐静脉上皮细胞毒性极小，明显小于肿瘤细胞。

⑩Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性蛋白的抗肿瘤活性分析

具体实施过程：

大量制备此抗肿瘤活性物质，流式细胞检测活性蛋白对B16细胞的周期阻滞作用：培养瓶中B16细胞贴壁后，换新鲜培养基5 mL，加入活性蛋白至终浓度2.5 μg/mL分别培养24 h和48 h，收集细胞后用1 mol/L磷酸盐缓冲液洗2遍，加入冰的乙醇固定。样品送至鼎国生物公司进行细胞周期阻滞检测。

图11是Myxococcus sp. STXZ72发酵上清液的抗肿瘤活性蛋白对B16肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用，表2是Myxococcus sp. STXZ72分离抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用结果。结果表明： B16肿瘤细胞G1期比率明显增加，同时G2期和S期细胞比率明显减少，推测蛋白作用后细胞可能被阻滞于G1期。

 

Claims (5)

1.一株粘细菌菌株，其特征在于，是粘球菌属STXZ72，Myxococcus sp.STXZ72，菌种保藏号为CCTCC NO：M2015353。

2.如权利要求1所述粘细菌菌株发酵液中活性代谢产物的分离纯化，其特征在于，包括以下步骤：

将Myxococcus sp. STXZ72接种于酪蛋白胨培养基液体培养基，于30℃，180 rpm/min，振荡培养7 d后，8000－12000 rpm/min离心15min；收集发酵上清液，收集硫酸铵浓度50%-80%的沉淀，在蛋白质纯化仪上进行分离，收集具有生物活性的组分。

3.根据权利要求2所述粘细菌菌株发酵液中活性代谢产物的分离纯化，其特征在于，分离纯化抗肿瘤活性代谢产物时，蛋白质纯化仪上所用凝胶柱为Sephadex G75 葡聚糖凝胶柱。

4.如权利要求1所述粘细菌菌株的代谢产物在抗肿瘤方面的应用。

5.如权利要求2或3所述分离纯化的代谢产物在抗肿瘤方面的应用。