CN110129231B - 一株链霉菌sx033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用 - Google Patents

一株链霉菌sx033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用 Download PDF

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Abstract

一株链霉菌SX033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用，本发明之链霉菌SX033，为链霉菌SX033，Streptomyces sp.SX033，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019113。本发明之链霉菌SX033的抗肿瘤活性代谢产物，其制备方法包括以下步骤：将链霉菌SX033接种到发酵培养基中，26‑30℃，150‑180rpm发酵培养10‑12天后，即得发酵液。本发明之链霉菌的代谢产物具有抗肿瘤活性。

Description

一株链霉菌SX033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用
技术领域
本发明涉及链霉菌SX033(Streptomyces sp.SX033)及其活性代谢产物ATPase a与抗肿瘤的应用。
背景技术
放线菌是一类重要的微生物，能产生具有生物活性的代谢产物，如抗生素、免疫抑制剂、抗氧化剂和抗肿瘤化合物等，具有重要的药物开发价值。链霉菌许多次级代谢产物在抗肿瘤、抗菌、杀虫等领域广泛应用，具有良好的研究前景。由于天然活性药物具有低毒、高效的特点，得到许多人的信赖，而化疗作为肿瘤治疗的重要手段，副作用较大，可导致人体免疫功能下降、消化障碍、骨髓抑制等，所以人们希望从自然界分离纯化更多抗肿瘤活性产物，近几年，天然活性药物的筛选成为一个热点，从微生物中分离抗肿瘤活性产物，开发更多抗肿瘤药物，是一种必然趋势。
早期研究表明：Mo R等研究报道ATPase作为一种新型触发器，在体外和体内控制抗癌药物释放。Biswas等表明ATPase促进纳米载体发生构象改变，选择性地释放药物，增强细胞毒性和细胞凋亡。Salvestrini V等研究显示ATPase可用于治疗急性髓性白血病，而正常的干细胞不受影响。Srivastava P等的研究表明ATPase通过膜透化促进细胞膜肿胀，诱导细胞凋亡等。总之，ATPase作为一种重要的生命体能源物质，可以调节机体生命活动，调节肿瘤组织的代谢，为抗肿瘤药物的研究及开发提供新策略，因此，研究ATPase在肿瘤发生发展进程中的生物学功能具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株链霉菌SX033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之链霉菌SX033，为链霉菌SX033(Streptomyces sp.SX033，简称SX033)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019113。
本发明之链霉菌SX033的分离鉴定：采用水浴加热和稀释平板涂布等方法，从湖南省长沙市岳麓区岳麓山采集的土样中直接分离得到一株具有链霉菌性状的细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Streptomyces属，命名为链霉菌SX033。
本发明之链霉菌SX033的抗肿瘤活性代谢产物，其制备方法包括以下步骤：
将链霉菌SX033接种到发酵培养基中，26-30℃，150-180rpm发酵培养10-12天后，即得发酵液。
发酵培养基的成份优选为(/L)：葡萄糖30g，可溶性淀粉5g，棉籽粉11.25g，豆饼粉2.5g，玉米浆3.5g，酵母粉1.0g，碳酸钙2.5g，油酸甲酯21mL，微量元素2.5mL，pH 6.8-7.5。
蛋白质ATPase a的分离纯化，包括以下步骤：
(1)将发酵液于8000-9000rpm/min离心20-30min，取发酵上清液，在发酵上清液中加入固体硫酸铵(优选在冰浴下边搅拌边缓慢加入)，至发酵上清液中固体硫酸铵质量浓度为70-80％，4℃静置6-8h，离心收集沉淀；将沉淀用水复溶，用分子截留量为14kDa规格的透析袋除盐，获得粗提蛋白；
(2)利用AKTA avant25将粗提蛋白进行分离，所用色谱柱为sephadex75(优选上海索莱宝公司，Sephadex G-75medium葡聚糖凝胶G-75)，流动相为超纯水(过滤超声)，流速为0.8mL/min，检测波长为：210nm，254nm，280nm。按出峰时间收集活性蛋白组分，即得。
利用以上分离纯化方法所得链霉菌抗肿瘤活性代谢产物，经LC-MS/MS质谱鉴定为ATPase a，ATPase a基因序列通过四代基因组测序获得，细胞毒性检测显示ATPase a具有良好的抗肿瘤活性。
ATPase a基因DNA序列如下：
Figure BDA0002066777690000031
本发明中ATPase a编码的氨基酸序列如下(ATPase a基因序列中含有终止子)：
Figure BDA0002066777690000041
Figure BDA0002066777690000051
将ATPase a进行抗肿瘤体外实验，为了进一步验证ATPase a的抗肿瘤活性，将ATPase a目的基因克隆到真核表达载体，将其转染至HeLa细胞，检测ATPase a在HeLa细胞的表达及对HeLa细胞的影响；最后从活体动物水平验证了ATPase a的抗肿瘤作用。
附图说明
图1为粗提蛋白的分离纯化图；
图2为各蛋白组分对HeLa细胞形态影响图；
图3为活性蛋白SDS-PAGE检测图；
图4为ATPase a对HeLa半抑制浓度测定图；
图5为ATPase a对HeLa增殖的影响图；
图6为真核表达载体pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)-ATPase a的构建流程图；
图7为ATPase a在HeLa细胞的表达图；
图8为pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)-ATPase a转染HeLa细胞后形态观察图；
图9为ATPase a对荷瘤裸鼠体重的影响图；
图10为ATPase a对HeLa实体瘤重量的影响图；
图11为ATPase a对HeLa实体瘤体积的影响图；
图12为H&E染色观察ATPase a对小鼠肿瘤组织影响图。
微生物菌株保藏情况说明
链霉菌SX033(Streptomyces sp.SX033)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019113。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
①本实施例之链霉菌SX033(简称SX033)，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019113。
本实施例之链霉菌SX033的分离鉴定：采用水浴加热和稀释平板涂布等方法，从湖南省长沙市岳麓区岳麓山采集的土样中直接分离得到一株具有链霉菌性状的细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Streptomyces属，命名为链霉菌SX033。
②本实施例之链霉菌SX033抗肿瘤活性产物ATPase a的分离纯化：
发酵培养基的成份为(/L)：葡萄糖30g，可溶性淀粉5g，棉籽粉11.25g，豆饼粉2.5g，玉米浆3.5g，酵母粉1.0g，碳酸钙2.5g，油酸甲酯21mL，微量元素2.5mL，pH 6.8-7.5。
具体过程：将链霉菌SX033接种到发酵培养基中，30℃，180rpm发酵培养12天后，即得发酵液；
将发酵液于8000rpm/min离心30min后，取发酵上清液，往发酵上清液中加入固体硫酸铵(在冰浴下边搅拌边缓慢加入)，至发酵上清液中固体硫酸铵质量浓度为70-80％，4℃静置6-8h，离心收集沉淀；将沉淀用水复溶，用分子截留量为14kDa规格的透析袋除盐，获得粗提蛋白；
利用AKTA avant25将粗提蛋白进行分离，所用色谱柱为sephadex75(上海索莱宝公司，Sephadex G-75 medium葡聚糖凝胶G-75)，流动相为超纯水(过滤超声)，流速为0.8mL/min，检测波长为：210nm，254nm，280nm。按出峰时间收集蛋白组分，即得A峰产物和B峰产物。图1是菌株Streptomyces sp.SX033粗提蛋白的分离纯化图。
ATPase a基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。ATPase a编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
③各蛋白组分对HeLa细胞形态影响
将传代的HeLa细胞铺入96孔板，每孔100μL(1×104个/孔)，进行细胞毒性实验。铺板时96孔板最外面一周加入100μL的PBS防止细胞培养基的蒸发。铺板12h后，分别加入A峰产物和B峰产物蛋白组分(0.22μm)处理细胞，每个样品3个重复，对照组用PBS处理，将处理后的细胞放入37℃、5％CO2培养箱培养，处理24h后倒置显微镜下观察细胞的形态。图2为各蛋白组分对HeLa细胞形态影响，其中A峰为活性峰，可使HeLa细胞变圆，漂浮，表明ATPase a对HeLa细胞具有抗肿瘤作用。
④活性蛋白的SDS-PAGE检测和质谱鉴定
将活性蛋白组分进行SDS-PAGE检测，泳道1代表SX033发酵上清液，泳道2代表ATPase a纯化蛋白，结果显示活性蛋白大小为30kDa(图3)，切取胶条进行质谱鉴定，明确该物质为ATPase a(表1)。
表1 质谱鉴定纯化蛋白
Figure BDA0002066777690000081
⑤CCK-8细胞活力测定
收集对数期HeLa细胞，加入DMEM细胞培养基中，调整细胞密度，得HeLa细胞液，然后每孔加入100μL HeLa细胞液，进行铺板，边缘用无菌PBS填充。过夜后加入不同浓度梯度的ATPase a蛋白，每个梯度3个重复。在5％CO2，37℃培养箱培养24h，倒置显微镜观察并拍照。往加入HeLa细胞的孔中每孔加入10μL CCK-8溶液。另选一孔作为空白对照1：加100μLDMEM细胞培养基和10μLCCK-8，但不加HeLa细胞。再另选一孔作为空白对照2：加100μL DMEM细胞培养基、10μLPBS和10μLCCK-8(空白对照)，但不加HeLa细胞(检测缓冲液对细胞活力的影响)。继续培养4h，酶标仪检测OD450nm吸光值。根据公式：细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100，A(加药)：具有HeLa细胞、CCK-8溶液和ATPase a蛋白药物溶液的孔的吸光度，A(空白)：具有细胞培养基和CCK-8溶液而没有HeLa细胞的孔的吸光度，A(0加药)：具有DMEM细胞培养基、CCK-8溶液、PBS缓冲液的溶液的孔的吸光度。图4为ATPasea对HeLa细胞半抑制浓度测定，ATPase a对HeLa细胞的半抑制浓度为140.8μL/mL。
⑥ATPase a对HeLa细胞增殖的影响
将HeLa细胞接种于六孔板，每孔1000个细胞，培养24h，将孔内培养基吸走，对照组加2mL新鲜培养基，处理组加2mL新鲜培养基和140.8μg/mL的ATPase a，每隔三天换一次新鲜培养基，共培养十天。再用PBS洗涤细胞3次，2mL 4％的多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗三次，1mL结晶紫染色1h，PBS洗三次，拍照观察增殖情况，图5为ATPase a对HeLa增殖的影响图，与对照组相比，处理组克隆形成数明显减少，表明ATPase a可抑制HeLa细胞的增殖。
⑦真核表达载体pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)-ATPase a的构建
根据基因序列设计引物，并将其酶切连接至真核载体pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)上。引物设计如下：
F(5'-3')：GGGGTACCATGGTGTGGTCGTTCCTCTTCGA
R(5'-3')：CCGCTCGAGGTGGGCTTCTTCGAGCGCCT
收集含pcDNA5-FRT/TO-Flag质粒的过夜菌株，使用小提试剂盒提取质粒，通过KpnI和Xho I两种酶，将质粒以及ATPase a PCR产物分别进行双酶切，随后分别切胶回收，回收产物按一定比例连接过夜，热转，涂板。在含氨苄霉素100mg/mL的LB固体培养基上随机挑取3个转化子于1.4mL LB培养基中(含Amp 50mg/mL)，37℃，800-900rpm，培养12h后，取500μL菌液做菌保，剩余菌液提取质粒，用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行双酶切鉴定，挑取其中单克隆阳性转化子，测序结果显示基因未发生突变，表明表达载体pcDNA5-FRT/TO-Flag-ATPase a成功构建，且没有发生碱基突变(图6)，可用于下一步转染实验。
⑧ATPase a在HeLa细胞中的表达及PARP凋亡检测
收集活化过夜含pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)-ATPase a质粒的TOP10菌株，使用去内毒素小提试剂盒提取质粒，Nanodrop 2000仪器测质粒浓度。通过lipmax将一定浓度的重组质粒与EGFP质粒一起转染进HeLa细胞中，8h后可见绿色荧光，24h后荧光强度较好表明转染成功且转染效率较好，显微镜观察24h、48h时ATPase a对HeLa细胞形态影响，结果显示，与空载相比，实验组细胞皱缩变圆，细胞漂浮(图7)。转染48h后收集细胞，PBS洗涤3遍，加5xSBbuffer沸水处理5-15min后的样品用于western blot检测。结果显示空白对照(泳道1)，空载pcDNA5-FRT/TO-Flag(N)对照(泳道2)没有检测到30kDa的蛋白，实验组泳道3检测到在30kDa附近处有明显蛋白条带，与预测实验结果一致，结果表明ATPase a蛋白可以在HeLa细胞中较好的表达。而在空白对照和空载对照中的PARP显示113kDa的PARP蛋白条带，而在ATPase a转染实验组中PARP及其剪切片段蛋白也被检测到，可以推论ATPase a蛋白能诱导HeLa细胞发生凋亡(图8)。
⑨ATPase a对HeLa细胞异种移植瘤生长影响的研究
按照国际实验动物福利伦理标准，并在湖南师范大学动物伦理委员会监督下进行活体研究。BALB/c小鼠饲养于SPF环境的动物房约7天使其适应新环境。培养HeLa细胞，待其铺满培养皿底70-80％后，胰酶消化，加入新鲜培养基，重悬细胞，离心收集细胞，PBS洗3次，调整细胞密度度至1×107个/mL，置于冰上待用。注射1×107/100μL HeLa细胞于小鼠右前肢的背部靠腋窝位置，构建HeLa荷瘤小鼠模型。
当小鼠肿瘤体积约100mm3时，将小鼠随机分为两组，对照组(PBS)和实验组(40mg/kgATPase a蛋白)，荷瘤小鼠分别通过瘤内注射纯化的蛋白及相同体积的无菌PBS，每2天一次，共注射7次。在整个实验过程中，每两天对各组小鼠进行称重，测量肿瘤最长径和垂直最大直径，计算肿瘤体积。实验结束后，处死小鼠，解剖分离对照组、实验组小鼠的肿瘤经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于H&E染色(图9-12)。根据公式计算肿瘤体积，即肿瘤体积V＝ab2/2(a、肿瘤长径，b、肿瘤垂直横径，V、肿瘤体积，单位、mm3)。用于评估ATPase a对荷瘤裸鼠的影响，结果表明ATPase a对小鼠体重没有明显影响，小鼠体重趋于稳定，说明ATPase a对荷瘤裸鼠相对安全。然而ATPase a注射小鼠后，小鼠肿瘤体积明显减小，肿瘤重量也明显减轻，说明ATPase a可抑制HeLa肿瘤生长。对肿瘤组织进行H&E染色，结果显示处理组肿瘤组织细胞皱缩，细胞核破裂，染色质降解，出现不同程度的坏死，对照组的肿瘤组织形态完整，说明ATPase a具有明显的抗肿瘤作用。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120>一株链霉菌SX033及其抗肿瘤活性代谢产物与应用
<160>2
<210>1
<211> 828
<212> DNA
<213>链霉菌SX033（Streptomyces sp. SX033）
<220>
<400>1
atgcagaagg agctcttggt gactgacgcc cagacgctcg ccttcgagac gaactgccac 60
ctgttcaagg actgtgggtt ccatgccccc agcgtgtggt cgttcctctt cgagccgctc 120
ttcaccattg ggcctgtcga gttcaacaag cccatgctgc tcgcgatcat cggcacgttc 180
gcgatcctgg ccttcttctg ggccggtttc tcgaagccca aggtcgttcc gggcaagctg 240
cagatggttg ccgaggcgct gtacgacttc gtccaccggg gcatctccaa agaggtcatc 300
ggcaagaagg gcgagccctt cgttccgctg ctggtctcgc tgttcttctt cgtctggatc 360
ctgaacctct gggccatcat tccgctcgcc cagttcccgg tcagctccgt catcgcctat 420
cccgtcggcc tggccctggt ggtctgggtg acgtacatga cggtgacgtt ccggacgaac 480
ggattcgtcg gaggcatccg caacctctgc gtcccgagtg gtctgcccaa gccgatctac 540
gtgctgctga cgccgctgga gttcatctcc aacgtcttcg tccggccgtt cacgctggcg 600
gtgcgactct tcgcgaacat gttcgcgggc cacatcctga tcctgatctt caccatcgcc 660
acctggtaca tgctcggcac cgtcctgggc acggtctacg cgggcgcgtc gttcatcatg 720
acgctggtcc tgaccgtgtt cgagatgttc atccaggccc ttcaggccta cgtgttcacg 780
gtgctgaccg ccacgtacct ttcccaggcg ctcgaagaag cccactga 828
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213>链霉菌SX033（Streptomyces sp. SX033）
<220>
<400>2
Met Gln Lys Glu Leu Leu Val Thr Asp Ala Gln Thr Leu Ala Phe Glu
1 5 10 15
Thr Asn Cys His Leu Phe Lys Asp Cys Gly Phe His Ala Pro Ser Val
20 25 30
Trp Ser Phe Leu Phe Glu Pro Leu Phe Thr Ile Gly Pro Val Glu Phe
35 40 45
Asn Lys Pro Met Leu Leu Ala Ile Ile Gly Thr Phe Ala Ile Leu Ala
50 55 60
Phe Phe Trp Ala Gly Phe Ser Lys Pro Lys Val Val Pro Gly Lys Leu
65 70 75 80
Gln Met Val Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Phe Val His Arg Gly Ile Ser
85 90 95
Lys Glu Val Ile Gly Lys Lys Gly Glu Pro Phe Val Pro Leu Leu Val
100 105 110
Ser Leu Phe Phe Phe Val Trp Ile Leu Asn Leu Trp Ala Ile Ile Pro
115 120 125
Leu Ala Gln Phe Pro Val Ser Ser Val Ile Ala Tyr Pro Val Gly Leu
130 135 140
Ala Leu Val Val Trp Val Thr Tyr Met Thr Val Thr Phe Arg Thr Asn
145 150 155 160
Gly Phe Val Gly Gly Ile Arg Asn Leu Cys Val Pro Ser Gly Leu Pro
165 170 175
Lys Pro Ile Tyr Val Leu Leu Thr Pro Leu Glu Phe Ile Ser Asn Val
180 185 190
Phe Val Arg Pro Phe Thr Leu Ala Val Arg Leu Phe Ala Asn Met Phe
195 200 205
Ala Gly His Ile Leu Ile Leu Ile Phe Thr Ile Ala Thr Trp Tyr Met
210 215 220
Leu Gly Thr Val Leu Gly Thr Val Tyr Ala Gly Ala Ser Phe Ile Met
225 230 235 240
Thr Leu Val Leu Thr Val Phe Glu Met Phe Ile Gln Ala Leu Gln Ala
245 250 255
Tyr Val Phe Thr Val Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Glu
260 265 270
Glu Ala His
275

Claims (1)

1. 一株链霉菌SX033，其特征在于，为链霉菌 SX033，Streptomyces sp. SX033，该菌种于2019年2月25日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019113。
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Citations (3)

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