CN114288399B

CN114288399B - 一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用

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Publication number: CN114288399B
Application number: CN202210066460.9A
Authority: CN
Inventors: 张同存; 刘家兴; 祝海川; 史江舟
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2042-01-20
Also published as: CN114288399A

Abstract

本发明提出了一种嵌合型抗原受体联合抗肿瘤药物组合物，所述嵌合型抗原受体包括能够识别肿瘤细胞表面磷脂酰丝氨酸的单链抗体ScFv，所述抗肿瘤药物为可以增加肿瘤细胞系或者原代肿瘤细胞表面磷脂酰丝氨酸表达的化疗药物。本发明将以磷脂酰丝氨酸为靶点的嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面磷脂酰丝氨酸阳性的肿瘤的治疗，尤其对尤文肉瘤、急性淋巴瘤/白血病、急性髓系白血病和乳腺癌杀瘤效果显著。

Description

一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T-Cell)，原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3-ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重新编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。CAR-T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。

磷脂酰丝氨酸(PS)是双层细胞膜的重要组成部分，通常存在于内部小叶中。PS自然暴露于肿瘤细胞、未成熟的肿瘤血管系统和肿瘤来源的微泡上，与树突状细胞、巨噬细胞和T细胞上的受体结合来阻止免疫反应。PS与巨噬细胞上的受体结合，促进巨噬细胞由促炎性M1样表型向原癌M2样表型分化，从而分泌抗炎细胞因子IL-10和TGF-β，通过抑制肿瘤抗原呈现达到抑制肿瘤的免疫反应；PS也可以抑制T细胞反应的激活。因此，PS暴露引起的免疫反应及其在肿瘤微环境中的免疫抑制作用具有复杂的机制。阻断肿瘤细胞的PS会抑制吞噬作用和T细胞介导的杀伤作用。因此，靶向PS被认为是一种很有前途的癌症治疗策略。

尽管目前PS靶向治疗显示出潜在的抗肿瘤活性，但是CAR-T细胞治疗肿瘤中存在肿瘤的高度异质性导致的脱靶以及靶点的单一性导致治疗效果不佳等问题，致使CAR-T疗法的局限性，限制了治疗效果。PS的靶向治疗与化疗药物联合使用，使得化疗药物能够引起肿瘤细胞表面PS的过度表达，激活T细胞的抗肿瘤能力，是作为肿瘤治疗和预后很关键性的技术手段。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种以磷脂酰丝氨酸(PS)为靶点治疗广谱性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)，携带靶向PS的ScFv序列的CAR-T细胞可以有效的杀伤表面表达PS的肿瘤细胞，拓展了杀伤肿瘤的广谱性，提高了化合物的杀伤能力。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种嵌合型抗原受体联合抗肿瘤药物组合物，所述嵌合型抗原受体包括能够识别肿瘤细胞表面磷脂酰丝氨酸的单链抗体ScFv或者蛋白序列，所述单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗肿瘤药物为可以增加肿瘤细胞系或者原代肿瘤细胞表面磷脂酰丝氨酸表达的化疗药物。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽磷脂酰丝氨酸、单链抗体ScFv、StrepII+G4S、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述抗肿瘤药物为紫杉醇、顺铂、阿霉素和地塞米松中的一种。

在以上技术方案的基础上，优选的，还包括重组嵌合型抗原受体的基因载体，所述重组嵌合型抗原受体的基因载体以病毒载体PTK881-EF1α为骨架，EF1α为启动子，插入上述嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或转座子载体中的一种载体得到。

在以上技术方案的基础上，优选的，还包括嵌合型抗原受体的免疫细胞，所述嵌合型抗原受体的免疫细胞由上述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或重组嵌合型抗原受体的基因载体转染免疫细胞得到。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞中的一个。

本发明还提供了一种嵌合型抗原受体联合抗肿瘤药物组合物在制备治疗和预防肿瘤药物中的应用。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述肿瘤为尤文肉瘤、急性淋巴瘤/白血病、急性髓系白血病、恶性神经胶质瘤和乳腺癌中的一种。

本发明的一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明提供的PS为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体ScFv或者蛋白，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面PS阳性的肿瘤的治疗，尤其对尤文肉瘤、急性淋巴瘤/白血病、急性髓系白血病、乳腺癌杀瘤效果显著。

(2)本发明提供的CART细胞与抗肿瘤药物联合受用，杀瘤效率得到显著提高。其中以AnnexinA5为靶向PS的蛋白制备的嵌合型抗原受体联合紫杉醇治疗效果最佳。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中A1-CAR、A2-CAR、A3-CAR的DNA片段的示意图；

图2为实施例中PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3质粒图谱；

图3为JURKAT细胞系在经过紫杉醇处理后磷脂酰丝氨酸的表达量变化示意图；

图4为CAR-T细胞对尤文肉瘤细胞系TC71、6647体外杀伤结果示意图；

图5为CAR-T细胞对急性淋巴母细胞性淋巴瘤细胞系JURKAT、MOLT-4体外杀伤结果示意图；

图6为CAR-T细胞对急性髓细胞白血病细胞系和乳腺癌细胞系MOLM-13、MCF-7的体外杀伤裂解图；

图7为CAR-T细胞与尤文肉瘤细胞系TC71、6647体外共孵育后细胞因子IFN-γ释放的结果示意图；

图8为CAR-T细胞与急性淋巴母细胞性淋巴瘤细胞系JURKAT、MOLT-4体外共孵育后细胞因子IFN-γ释放的结果示意图；

图9为CAR-T细胞与急性髓细胞白血病细胞系和乳腺癌细胞系MOLM-13、MCF-7的体外共孵育后细胞因子IFN-γ释放的结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1抗PS的ScFv和靶向PS的蛋白选择

为了选择合适的能够靶向PS的蛋白结构，我们选择了两种已经进入临床实验的两种已知的抗体的ScFv，分别命名为A1(US_2016_0015826_A1)、A2(US_2018_0289771_A1)，又为了添加能与PS结合的非抗体蛋白序列的比较，选择最为常见的AnnexinA5蛋白，命名为A3。A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；A3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。调研结果表明3个抗PS的scFv或者蛋白均具有较高的亲和力，可用于后续的CAR-T细胞的构建。

实施例2质粒的构建

1、分别人工合成片段A1、A2、A3，人工合成PS、StrepII+G4S-CD8 hinge-CD28TM+ICD-4-1BB-CD3ζ片段。

2、采用Overlap PCR扩增分别以PS、A1/A2/A3和StrepII+G4S-CD8 hinge-CD28TM+ICD-4-1BB-CD3ζ为模板，获得带有酶切位点EcoR I和BamH I的A1-CAR、A2-CAR、A3-CAR，A1-CAR、A2-CAR、A3-CAR的结构示意图如图1所示；

其中，信号肽(PS)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；StrepII+G4S的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.13，核苷酸序列如SEQ ID NO.14；CD28ICD的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，核苷酸序列如SEQID NO.20所示。

3、将质粒PTK881-EF1α-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于Eppendorf管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，测定产物的纯度和浓度。

4、将片段以1:2摩尔比加入Eppendorf管加入ExnaseⅡ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5h；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL soc培养基37℃、220rpm培养2h；2h后将Eppendorf管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12h；在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12h。

5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3；送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行含质粒PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3的大肠杆菌DH5α菌株保种。PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3的完整图谱示意图如图2所示。

实施例3质粒的制备与测序

1、质粒的制备

将含质粒PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3、的大肠杆菌DH5α菌种分别接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。

取出EndoFree plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。

向离心瓶中加120mL Buffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。

向离心瓶中加120mL Buffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。

向QIAfilter Cartridge倒入50mL Buffer FW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。将混合液抽滤入已标记好对应的玻璃瓶中。

向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。

将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffers QBT平衡，重力作用使之流尽。

将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mL Buffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。

再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。

向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。

超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid mega kit中的Buffer TE放入烘箱内预热。

在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。

在烘箱内拿出Buffer TE，在超净工作台内向每管加入1mL Buffer TE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。

在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的EP管中。吸出2μL，用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的EP管上，获得质粒PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3。

2、目的基因测序

分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。

实施例4慢病毒载体的制备与活滴检测

1、PTK881-EF1α-A1、PTK881-EF1α-A2、PTK881-EF1α-A3慢病毒载体的制备

在多层细胞培养瓶(Hyperflask)接入130.0～140.0×10⁶数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO₂培养箱中培养24h。分别将混有320μg质粒(PTK881-EF1α-A1/PTK881-EF1α-A2/PTK881-EF1α-A3：BZ1质粒:BZ2质粒:BZ3质粒＝12:10:5:6)的DMEM完全培养基加入960μg PEI管中，漩涡震荡，室温平衡10min。分别将上述35mL PEI与质粒的混合液与525mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO₂培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。

分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6个h后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，标记为Lenti3-A1-CAR、Lenti3-A2-CAR、Lenti3-A3-CAR并置于-80℃保存备用。

2、慢病毒载体活性滴度检测

原理：anti-StrepII+G4S抗体上标记有荧光素，而anti-StrepII+G4S抗体能与CAR中StrepII+G4S特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反映了CAR在293T细胞中的表达情况。

方法：在6孔板中接入5.0×10⁵个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO₂培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到Lenti3-A1-CAR、Lenti3-A2-CAR、Lenti3-A3-CAR慢病毒浓缩液活性滴度。

目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×10⁸～10×10¹⁰(TU/mL)范围内，检测分析结果见表1。表明各个慢病毒载体均能获得较高的活性滴度，可用于后续的嵌合抗原受体免疫细胞的制备。

表1慢病毒活性滴度检测分析结果

样品编号	活性滴度(TU/mL)
		Lenti3-A1-CAR	3.1×10⁸
Lenti3-A2-CAR	3.8×10⁸
		Lenti3-A3-CAR	3.9×10⁸

实施例5A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞的制备

1、CAR-T细胞制剂制备：

采集健康供者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3 MicroBeads，human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×10⁶个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizer^TMCTS^TMT-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizer^TMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每10⁶个细胞加入25μL Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。

48h后，按MOI为3分别加入Lenti3-A1-CAR、Lenti3-A2-CAR、Lenti3-A3-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO₂培养箱孵育，4h后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。

慢病毒转导24h后将转导后的细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×10⁶/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×10⁶/mL。

2、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞转导效率检测

取1.0×10⁶个转导后T细胞，与1μg/mL FITC-anti-StrepII室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-T细胞在总细胞中的比率。A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞转导效率检测结果如表2所示。

表2 CAR-T细胞转导效率检测结果

编号	转导类型	转导效率
			1	A1CAR-T	45.0％
2	A2CAR-T	58.6％
			3	A3CAR-T	60.2％

实施例6、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞的增殖能力以及体外功能检测

1.细胞增殖能力检测

在CAR-T细胞应用于科学研究或者治疗时，细胞的增殖能力是一项非常重要的指标，细胞具有良好的增殖能力才能够保证获得足够量的CAR-T细胞。

PKH26是一种对细胞脂染色的红色荧光染料，其与细胞结合能力较好，荧光较强且不易淬灭，广泛用于细胞标记与追踪，T细胞经PKH26标记分裂增殖后，每增殖一代，荧光强度减弱一半，因此比作为对照的未刺激分裂的T细胞荧光强度明显减弱，可用流式细胞术在FL2检测通道进行分析。

分析步骤如下：采集健康供血者外周血100mL，采用Fioll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，计数后，使用适量CD3 MicroBeads，human分选CD3阳性细胞，并以1.0×10⁶个/mL密度在T细胞完全培养液中培养，同时按每10⁶个细胞加入25μl Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。

活化24h后，按MOI＝1加入Lenti3-C1-CAR、Lenti3-C2-CAR、Lenti3-C3-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO₂培养箱孵育，4h后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。

取1×10⁶个细胞，加入不含血清的培养基进行清洗，1500rpm离心5min，弃去上清，加入1ml稀释液C轻轻吹打混匀，制成细胞悬液。

将3μL PHK426染液加入1mL稀释液C中，充分混匀制成染色液，迅速将细胞混悬液加到染色液中，立即混匀，在37℃的细胞培养箱中避光孵育5min，每隔2min摇匀一次。

加入2mL的血清静置1min终止反应，取5mL的完全细胞培养基与细胞混合，1200rpm离心6min，重复洗涤3次，用完全细胞培养基重悬细胞；另外，取1×10⁶个未转染的T细胞经PKH26标记作为母代，用4％多聚甲醛固定，4℃避光保存，备用。

荧光标记后的T细胞与PS胞外域(终浓度5μg/mL)孵育进行激活处理，每组设置三个复孔，在细胞培养箱中混合培养10天，未标记染色的T淋巴细胞作为空白对照。

收集细胞，PBS洗涤一遍，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。细胞增殖结果见表3。

表3 CAR-T细胞激活增殖结果

结果显示，相较于未转染的T细胞，转染嵌合抗原受体的T细胞的增殖能力在接受到活化信号后都得到了显著提升，出人意料的是，A1-CAR-T、A2-CAR-T的增殖能力明显弱于A3-CAR-T，不受理论限制地，由于所选择的抗PS的蛋白性质的不同而导致了CAR-T细胞的增殖能力的显著差异，因此，基于CAR-T细胞疗法对CAR-T细胞的需求，优选包含A3的蛋白序列构建的CAR-T进行后续应用。

2.体外肿瘤细胞系在化疗药物处理后磷脂酰丝氨酸(PS)的表达检测：

取适量的靶细胞，常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁶/mL，24孔板中每孔加入0.5×10⁶/mL个细胞，分别加入混合有顺铂(CDDP)和紫杉醇(PTX)的细胞培养基，紫杉醇最终浓度为2×10^-3μg/μL，37℃孵育2～3h。孵育完成后取细胞，细胞系分别染色7-AAD和Annexin V测细胞表面PS的变化。细胞系JURKAT细胞表面PS的变化如图3所示。结果显示JURKAT细胞系在紫杉醇处理后，磷脂酰丝氨酸(PS)的表达量由原来的7.1％提高到97.2％，显著提高了其PS的表达量。

3.体外杀瘤检测：

采用钙黄绿素检测法分别对T、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞进行体外杀瘤功能检测。

靶细胞在尤文肉瘤(EWS)，急性淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(T-ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，恶性神经胶质瘤(Malignant Gliomas)和乳腺癌(Breast Cancer)这五种肿瘤的细胞系中进行筛选，选用细胞系如表4所示。

表4 anti-PS CAR-T细胞的靶细胞系的选择

取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.5×10⁵/mL个细胞，按25:1的效靶比分别加入T、A1CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞，37℃孵育2～3h。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。

与上述实验操作平行地，取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.5×10⁵/mL个细胞，按25:1的效靶比分别加入混合有顺铂和紫杉醇的T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞，紫杉醇最终浓度为2×10^-3μg/μL，37℃孵育2～3h。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照。

T、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞单独及联合化疗药对尤文肉瘤细胞系TC71、6647，急性淋巴母细胞性淋巴瘤细胞系JURKAT、MOLT-4，急性髓细胞白血病细胞系和乳腺癌细胞系MOLM-13、MCF-7的体外杀伤裂解的结果分别如图4-6所示。结果显示，单独添加PTX对细胞裂解能力与T、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞相比对不同的肿瘤细胞系有不同程度的提高，说明其具有对尤文肉瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性髓细胞白血病、乳腺癌细胞系的体外杀伤性功能；虽然A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞对各肿瘤细胞系均无杀伤能力，但在A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX、A3 CAR-T+PTX对TC71、6647、JURKAT、MOLT-4、MOLM-13、MCF-7共孵育体系中，A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX、A3 CAR-T+PTX细胞的靶向性裂解能力要明显高于PTX的非特异性裂解能力，其中，在这些细胞系中，A3 CAR-T+PTX的裂解能力最强；不受理论限制地，不同ScFv/蛋白的嵌合抗原受体对癌症细胞裂解能力的差异可能是源于其识别不同的PS抗原表位和或ScFv/蛋白自身特性的差异。

如图5结果所示，T细胞对JURKAT和MOLT-4的杀伤效率约为3％，PTX细胞对JURKAT和MOLT-4的杀伤效率约为20％，A1 CAR-T、A2 CAR-T和A3 CAR-T细胞对JURKAT和MOLT-4的杀伤效率约为5％；A1 CAR-T+PTX和A2 CAR-T+PTX对JURKAT和MOLT-4的杀伤效率约为50％，A3 CAR-T+PTX对JURKAT和MOLT-4的杀伤效率约为95％。由此可以看出，A1-CAR-T细胞和A2-CAR-T细胞与PTX联合用药对靶细胞JURKAT和MOLT-4的裂解作用具有明显的协同作用，明显提高了CAR-T细胞和抗肿瘤药物单独使用时的杀瘤效果，且A3-CAR-T细胞与PTX联合用药效果最佳。

由以上体外杀瘤结果可知，A1、A2、A3构建的A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T细胞与化疗药物联合治疗的方式，优选的A3 CAR-T细胞与化疗药物联合用于治疗肿瘤。

4.体外细胞因子检测：

取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.05×10⁵/mL个靶细胞，按25:1的效靶比加入T、PTX、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T、A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX、A3 CAR-T+PTX细胞，PTX最终浓度为2×10^-3μg/μL，200g离心30秒，37℃孵育18h。孵育完成后取上清，测量其中IFN-γ的浓度。

T、PTX、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T、A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX、A3 CAR-T+PTX细胞与尤文肉瘤细胞系TC71、6647体外孵育后IFN-γ分泌结果如图7所示，与急性淋巴母细胞性淋巴瘤细胞系JURKAT、MOLT-4体外孵育后IFN-γ分泌结果如图8所示，与急性髓细胞白血病细胞系和乳腺癌细胞系MOLM-13、MCF-7的体外孵育后IFN-γ分泌结果如图9所示，与杀瘤结果一致，IFN-γ的浓度结果显示，A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX、A3 CAR-T+PTX实验组分泌的IFN-γ与T细胞、PTX、A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T各实验组相比均显著提高，说明其特异性识别PS，具有对化学药物处理后的尤文肉瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性髓细胞白血病、乳腺癌细胞系的体外杀伤性功能。并且，在与肿瘤细胞系TC71、6647、JURKAT、MOLT-4、MOLM-13、MCF-7共孵育体系中，A3 CAR-T+PTX实验组细胞分泌的IFN-γ的释放量要明显高于A1 CAR-T+PTX、A2 CAR-T+PTX实验组；同样地，不受理论限制地，不同ScFv/蛋白的嵌合抗原受体对刺激细胞因子释放能力的差异可能是源于其识别不同的PS抗原表位和或ScFv/蛋白自身特性的差异。

与图5杀瘤结果一致，图8中T细胞与JURKAT和MOLT-4分别孵育后细胞因子IFN-γ释放量约为20pg/mL，PTX细胞与JURKAT和MOLT-4分别孵育后细胞因子IFN-γ释放量约为20pg/mL，A1 CAR-T、A2 CAR-T和A3 CAR-T细胞与JURKAT和MOLT-4分别孵育后细胞因子IFN-γ释放量约为100pg/mL；A1 CAR-T+PTX和A2 CAR-T+PTX与JURKAT和MOLT-4分别孵育后细胞因子IFN-γ释放量约为3200pg/mL，A3 CAR-T+PTX与JURKAT和MOLT-4分别孵育后细胞因子IFN-γ释放量约为6300pg/mL。由此可以看出，A1-CAR-T细胞和A2-CAR-T细胞与PTX联合用药对靶细胞JURKAT和MOLT-4的裂解作用具有明显的协同作用，明显提高了CAR-T细胞和抗肿瘤药物单独使用时的杀瘤效果，且A3-CAR-T细胞与PTX联合用药效果最佳。

由以上结果可知，PTX对尤文肉瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性髓细胞白血病、恶性神经胶质瘤、乳腺癌的治疗具有一定的作用；A1 CAR-T、A2 CAR-T、A3 CAR-T的与PTX联合使用能够显著提高尤文肉瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性髓细胞白血病、乳腺癌细胞系的裂解能力，具有更精准的靶向性和更强的杀瘤能力；其中A3 CAR-T的对各肿瘤的杀瘤能力高于A1 CAR-T和A2 CAR-T。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉科技大学

<120> 一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用

<130> 2021

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Trp Thr Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val

115 120 125

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Met Arg Ala Pro

145 150 155 160

Ala Gln Ile Leu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Phe Pro Gly Thr Arg Cys

165 170 175

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

180 185 190

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser

195 200 205

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

210 215 220

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

225 230 235 240

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

245 250 255

Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Ser Ser Pro Pro

260 265 270

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

275 280

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggatgga cctggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gagaagcctg gcgcttcagt gaagctatcc 120

tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaacatga actgggtgaa acagagccat 180

ggaaagagcc ttgaatggat tggacatatt gatccttact atggtgatac ttcctacaac 240

cagaagttca ggggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgtaaa ggggggttac 360

tacgggcact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgatggacat gagggctcct 480

gcacagattt tgggcttctt gttgctcttg tttccaggta ccagatgtga catccagatg 540

acccagtctc catcctcctt atctgcctct ctgggagaaa gagtcagtct cacttgtcgg 600

gcaagtcagg acattggtag tagcttaaac tggcttcagc agggaccaga tggaactatt 660

aaacgcctga tctacgccac atccagttta gattctggtg tccccaaaag gttcagtggc 720

agtaggtctg ggtcagatta ttctctcacc atcagcagcc ttgagtctga agattttgta 780

gactattact gtctacaata tgttagttct cctcccacgt tcggtgctgg gaccaagctg 840

gagctgaaac gg 852

<210> 3

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Glu Trp Ser Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala

130 135 140

Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Pro Cys Ser Gly Ser Ser

145 150 155 160

Ser Asn Ile Gly Gly Asn Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly

165 170 175

Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn His Gln Arg Pro Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

195 200 205

Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Ala Trp Asp Asp Ser Leu Gly Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Thr Val Leu

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgatt actactggag ttggatccgc 120

cagcccccag ggaagggtct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgagctctgt gactgccgca gacacggccg tgtattactg tgccagatct 300

gagtggtccc tagcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcaggt 360

ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgcagcctgt gctgactcag 420

ccaccctcag cgtctgggac ccccgggcag agggtcacca tcccttgttc tggaagcagc 480

tccaacatcg gaggtaatga tgtatactgg taccagcaag tcccaggaat ggcccccaaa 540

ctcctcatct atcggaatca tcagcggccc tcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600

aagtctggca cctccgcctc cctggccatc agtgggctcc ggtccgagga tgaggctgat 660

tattattgtg cagcgtggga tgacagcctg ggtggggtgg tgttcggcgg agggaccaag 720

gtcaccgtcc ta 732

<210> 5

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp

1 5 10 15

Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly

20 25 30

Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala

35 40 45

Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp

50 55 60

Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu

65 70 75 80

Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu

85 90 95

Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu

100 105 110

Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val

115 120 125

Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp

130 135 140

Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn

145 150 155 160

Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala

165 170 175

Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu

180 185 190

Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys

195 200 205

Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr

210 215 220

Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val

225 230 235 240

Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr

245 250 255

Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val

260 265 270

Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe

275 280 285

Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr

290 295 300

Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp

305 310 315 320

<210> 6

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcacagg ttctcagagg cactgtgact gacttccctg gatttgatga gcgggctgat 60

gcagaaactc ttcggaaggc tatgaaaggc ttgggcacag atgaggagag catcctgact 120

ctgttgacat cccgaagtaa tgctcagcgc caggaaatct ctgcagcttt taagactctg 180

tttggcaggg atcttctgga tgacctgaaa tcagaactaa ctggaaaatt tgaaaaatta 240

attgtggctc tgatgaaacc ctctcggctt tatgatgctt atgaactgaa acatgccttg 300

aagggagctg gaacaaatga aaaagtactg acagaaatta ttgcttcaag gacacctgaa 360

gaactgagag ccatcaaaca agtttatgaa gaagaatatg gctcaagcct ggaagatgac 420

gtggtggggg acacttcagg gtactaccag cggatgttgg tggttctcct tcaggctaac 480

agagaccctg atgctggaat tgatgaagct caagttgaac aagatgctca ggctttattt 540

caggctggag aacttaaatg ggggacagat gaagaaaagt ttatcaccat ctttggaaca 600

cgaagtgtgt ctcatttgag aaaggtgttt gacaagtaca tgactatatc aggatttcaa 660

attgaggaaa ccattgaccg cgagacttct ggcaatttag agcaactact ccttgctgtt 720

gtgaaatcta ttcgaagtat acctgcctac cttgcagaga ccctctatta tgctatgaag 780

ggagctggga cagatgatca taccctcatc agagtcatgg tttccaggag tgagattgat 840

ctgtttaaca tcaggaagga gtttaggaag aattttgcca cctctcttta ttccatgatt 900

aagggagata catctgggga ctataagaaa gctcttctgc tgctctgtgg agaagatgac 960

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60

ccc 63

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactggagcc acccccagtt cgagaagggc ggtggcggaa gc 42

<210> 11

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 12

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 13

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 14

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 15

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 16

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 18

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

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gaactg 126

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims

1.一种嵌合型抗原受体联合抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽，单链抗体ScFv A1、ScFv A2或蛋白A3，StrepII+G4S，CD8 hinge，CD28跨膜区，CD28胞内结构域，胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链；

所述单链抗体ScFv A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述单链抗体ScFv A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体ScFv A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述单链抗体ScFv A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述蛋白A3的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述蛋白A3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO .7所示，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO .8；所述StrepII+G4S的氨基酸序列如SEQ ID NO .9所示，所述StrepII+G4S的核苷酸序列如SEQ ID NO .10所示；所述CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO .11所示，所述CD8hinge的核苷酸序列如SEQ ID NO .12所示；所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13，所述CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO .14；所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO .15所示，所述CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO .16所示；所述胞内共刺激域4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO .17所示，所述胞内共刺激域4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO .18所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO .19所示，所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQID NO .20所示；

所述抗肿瘤药物为紫杉醇。

2.如权利要求1所述的一种嵌合型抗原受体联合抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为尤文肉瘤、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性髓细胞白血病和乳腺癌中的一种。