CN110615847B

CN110615847B - TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN110615847B
Application number: CN201910875313.4A
Authority: CN
Inventors: 张同存; 祝海川; 张子健
Original assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110615847A

Abstract

本发明公开了一种TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4‑1BB和CD3ζ链，所述单链抗体ScFv能够识别肿瘤细胞表面的TCRγδ。该TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能有效地杀伤任何表面表达TCRγδ的肿瘤细胞。

Description

TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体是指一种以TCRγδ为靶点治疗γδT细胞淋巴瘤/白血病的嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

CAR-T细胞疗法成为近年来最为火热和有效的肿瘤治疗手段之一，CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell),原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。CAR-T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。

T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)是高度恶性且复发率侵袭性淋巴瘤，主要高发于男性群体，在小儿和成人非霍奇金淋巴瘤中分别占30％和2％左右。依据T细胞抗原受体(TCR)类型差异，通常将成熟的T细胞分为γδT细胞亚型和αβT细胞亚型。在T细胞淋巴瘤/白血病中，一些特定的肿瘤细胞起源于γδT细胞，因此肿瘤细胞表面均会强表达TCRγδ，例如皮肤γδT细胞淋巴瘤，肝脾T淋巴细胞瘤及一部分外周T细胞淋巴瘤，亲上皮性肠道T淋巴细胞瘤等淋巴瘤疾病。γδT细胞淋巴瘤在临床上面临着没有特定药物靶点从而导致治疗效果差，复发率高和死亡率高等现象。然而，并未见以TCRγδ为靶点有效治疗肿瘤方法。

因此，寻找合适的γδT细胞淋巴瘤特异性靶点有助于临床上改善该类肿瘤的治疗。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种以TCRγδ为靶点治疗γδT细胞淋巴瘤/白血病的嵌合抗原受体(CAR)，携带广谱性识别各亚型TCRγδ的ScFv序列的CAR-T细胞可以有效的杀伤任何表面表达TCRγδ的肿瘤细胞。

本发明提供一种嵌合型抗原受体，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、胞内结构域，胞内结构域包括胞内信号刺激域，所述单链抗体ScFv识别并结合肿瘤细胞表面的TCRγδ。

进一步地，嵌合型抗原受体的胞内结构域还包括共刺激结构域，共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83中的一种或多种，优选为CD28和4-1BB；所述胞内信号刺激域选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a，优选为CD3ζ。

在本发明的一些实施例中，嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv由重链可变区V_H、连接多肽Linker、轻链可变区V_L组成；优选地，所述重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，优选地，所述重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一些实施例中，嵌合型抗原受体的嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv由重链可变区V_H、连接多肽Linker、轻链可变区V_L组成；优选地，所述重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，优选地，所述重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

在本发明的另一些实施例中，嵌合型抗原受体从N端到C端顺次再拼接F2A、IL-7、F2A、CCL19，优选地，所述F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，更优选地，所述F2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述IL-7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述CCL19的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。胞内结构域还包括共刺激结构域，共刺激结构域为CD28和4-1BB，胞内信号刺激域为CD3ζ。更优选地，嵌合型抗原受体，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、共刺激结构域CD28、4-1BB、胞内信号刺激域CD3ζ、F2A、IL-7、F2A、CCL19。其中，单链抗体ScFv的重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二目的是提供一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，以慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、转座子载体或非病毒瞬时表达载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体核苷酸序列；优选地，以病毒载体PTK881-EF1α为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体核苷酸序列。

本发明的第三目的是提供一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，由上述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列或上述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、CD4+T细胞，CD8+T细胞，优选为外周血来源的αβT细胞；嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv结合肿瘤表面的TCRγδ；优选地，CRISPR、RNA干扰技术联合嵌合型抗原受体原件的表达。

本发明的第四目的是提供上述表达嵌合型抗原受体的核苷酸序列、上述的重组嵌合型抗原受体基因载体、上述的表达嵌合型抗原受体免疫细胞的用途，包括制备治疗、预防、诊断肿瘤的药物或试剂盒，优选地，所述肿瘤为γδT细胞淋巴白血病。

本发明的第五目的是提供上述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的联用，包括：

1)与抗肿瘤药物、抗体和/或溶瘤病毒的联用，所述抗肿瘤药物选自糖皮质激素、阿糖胞苷、顺铂、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、Rapamycin、利妥昔单抗、伊马替尼、来那度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、波尼松龙、阿糖胞苷、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、左旋门冬酰胺酶、甲氨碟呤、长春新碱、达沙替尼中的一种或多种，优选地，权利要求3所述的嵌合型抗原受体转化T细胞得到的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞与糖皮质激素联用；所述抗体选自PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4抗体，所述溶瘤病毒选自呼肠孤病毒、腺病毒、单纯性孢疹病毒、水泡型口炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒；

2)其他靶标联合TCRγδ的双靶或多靶标表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，所述其他靶标选自BCMA、HER2、MUC1、EGFR、EGFR vIII、Mesothelin、FAP、B7H3、CS-1、CD19、CD7、CD4、CD8、CD3、CD5、TCRαβ、CD1a。

本发明的有益效果在于：1、本发明提供的TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体ScFv，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面TCRγδ阳性的肿瘤的治疗，尤其对γδT细胞淋巴白血病杀瘤效果显著。2、本发明提供的嵌合抗原受体在CD3ζ链后添加IL-7、CCL19其杀瘤效率得到显著提高。3、C3-2-CAR-T和糖皮质激素联合使用，对TCRγδ阳性靶细胞Loucy、PEER的裂解产生了协同效应，取得了1+1＞2的效果。

附图说明

图1为C3-1-CAR、C3-2-CAR的DNA片段的示意图；

图2为C4-CAR的DNA片段的示意图；

图3为PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2质粒图谱；

图4为PTK881-EF1α-C4质粒图谱；

图5为不同靶细胞系TCR类型及表达水平；

图6为C-3-1-CAR-T、C-3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞转导效率检测结果示意图；

图7为C-3-1-CAR-T、C-3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞体外杀瘤实验结果示意图；

图8为C-3-1-CAR-T、C-3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞体外与靶细胞共孵育后细胞因子释放的结果示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2、PTK881-EF1α-C4质粒的构建

1、人工顺次合成SEQ ID NO.3、连接多肽Linker核苷酸序列、SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段构成SP-C3-1。人工顺次合成SEQ ID NO.7、连接多肽linker核苷酸序列、SEQ IDNO.8所示的核苷酸片段构成SP-C3-2。连接多肽Linker为氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，核苷酸序列为ggcggtggcggtagcggtggcggtggctctggtggtggtggcagc。

2、以人的cDNA文库为模板，设计引物PCR分别扩增片段CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ、IL-7、CCL19，以引物互补方式得到Strep tag Ⅱ、F2A短片段。采用Overlap PCR技术将SP-C3-1与片段Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C3-1-CAR，采用Overlap PCR技术将SP-C3-2与片段Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C3-2-CAR，C3-1-CAR、C3-2-CAR结构示意图如图1所示；同样地，用Overlap PCR技术将SP-C3-1与片段Strep tag Ⅱ、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ、F2A、IL-7、F2A、CCL19顺次扩增连接成带有酶切位点EcoR I和BamH I的C4-CAR，结构示意图如图2所示。

其中，C3-1-CAR、C3-2-CAR为能够识别肿瘤细胞表面的TCRγδ的具有信号肽的单链抗体ScFv。单链抗体ScFv：SP-C3-1：重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；单链抗体ScFv：SP-C3-2：重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，重链可变区V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，Strep tag Ⅱ的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，CD8 hinge的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CD28跨膜结构域和CD28胞内域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，F2A的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，IL-7的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，CCL19的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

3、将质粒PTK881-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于Eppendorf管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。

4、将上述载体回收片段分别与C3-1-CAR、C3-2-CAR、C4-CAR以1:2摩尔比加入Eppendorf管加入Exnase Ⅱ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CE Ⅱ buffer，37℃反应0.5小时；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL soc培养基37℃、220rpm培养2小时；2小时后将Eppendorf管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12小时；分别在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。

5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2、PTK881-EF1α-C4，送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行含质粒PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2、PTK881-EF1α-C4的DH5α菌株保种。PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2的完整图谱示意图如图3所示，PTK881-EF1α-C4的完整图谱示意图如图4所示。

实施例2、质粒的制备与测序

1、质粒的制备

将含质粒PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2、PTK881-EF1α-C4的DH5α菌种分别接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。

取出EndoFree plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。

向离心瓶中加120mL Buffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。

向离心瓶中加120mL Buffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。

向QIAfilter Cartridge倒入50mL Buffer FW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。将混合液抽滤入已标记好对应的玻璃瓶中。

向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。

将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffers QBT平衡，重力作用使之流尽。

将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mL Buffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。

再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。

向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。

超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid mega kit中的Buffer TE放入烘箱内预热。

在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。

在烘箱内拿出Buffer TE，在超净工作台内向每管加入1mL Buffer TE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。

在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的EP管中。吸出2μL，用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的EP管上，获得质粒PTK881-EF1α-C3-1、PTK881-EF1α-C3-2、PTK881-EF1α-C4。

2、目的基因测序

分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。

实施例3、Lenti3-C3-1-CAR、Lenti3-C3-2-CAR、Lenti3-C4-CAR慢病毒载体的制备与活滴检测

1、慢病毒载体的制备

在多层细胞培养瓶(Hyperflask)接入130.0～140.0×10⁶数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO₂培养箱中培养24小时。分别将混有320μg质粒(PTK881-EF1α-C3-1：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)、混有320μg质粒(PTK881-EF1α-C3-2：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)、混有320μg质粒(PTK881-EF1α-C4：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)的DMEM基础培养基加入960μg PEI管中，漩涡震荡,室温平衡10min。将上述35mL PEI与质粒的混合液与525mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO₂培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。

分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6个小时后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，分别标记为Lenti3-C3-1-CAR、Lenti3-C3-2-CAR、Lenti3-C4-CAR并置于-80℃保存备用。

2、慢病毒载体活性滴度检测

原理：anti-Strep tag Ⅱ抗体上标记有荧光素，而anti-Strep tag Ⅱ抗体能与CAR中Strep tag Ⅱ特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。

方法：在6孔板中接入5.0×10⁵个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO₂培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到Lenti3-C3-1-CAR、Lenti3-C3-2-CAR、Lenti3-C4-CAR慢病毒浓缩液活性滴度。

目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×10⁸～10×10⁸(TU/mL)范围内，检测分析结果见表1。

表1 Lenti3-C3-1-CAR、Lenti3-C3-2-CAR、Lenti3-C3-3-CAR、Lenti3-C4-CAR慢病毒活性滴度检测分析结果

样品编号	活性滴度(TU/mL)
		Lenti3-C3-1-CAR	2.3×10<sup>8</sup>
Lenti3-C3-2-CAR	2.1×10<sup>8</sup>
		Lenti3-C4-CAR	1.3×10<sup>8</sup>

实施例4、C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞的制备

1、CAR-T细胞制剂制备：

采集健康供者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3 MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×10⁶个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizer^TMCTS^TMT-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizer^TMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每10⁶个细胞加入25μl Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。

24小时后，按MOI为3分别加入Lenti3-C3-1-CAR、Lenti3-C3-2-CAR、Lenti3-C4-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO₂培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。

慢病毒转导24小时后将转导后C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×10⁶/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×10⁶/mL。

根据预计细胞用量收集C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞制剂成品。

2、CAR-T细胞转导效率检测

取1.0×10⁶个转导后T细胞，与1ug/mL FITC-Protein-L室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-T细胞在总细胞中的比率。C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞转导效率检测结果分别如图5所示。图5表明成功制备了C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞。

实施例5、不同T细胞淋巴瘤/白血病TCR分型及表达水平检测

分别取1.0×10⁶个Loucy、PEER、Jurkat、Molt-4靶细胞系，分别加入1ug/mL PE-anti-TCRγδ和FITC-anti-TCRαβ抗体及其对应的Isotype室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪分别检测FITC和PE荧光信号，测量FITC和PE阳性细胞比率，反映了不同T细胞淋巴瘤TCR分型及表达水平，结果汇总至图6。由图6可以看出Loucy和PEER细胞系为TCRγδ阳性细胞，Jurkat和Molt-4为TCRγδ阴性细胞。

实施例6、CAR-T细胞的体外功能检测

1.体外杀瘤检测：

采用钙黄绿素检测法分别对T、C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞进行体外杀瘤功能检测。分别选取γδT细胞淋巴白血病的细胞系Loucy和PEER，以及T细胞淋巴白血病(非γδT细胞淋巴白血病)细胞系Jurkat、Molt-4细胞系进行CAR-T体外杀瘤实验，上述细胞系TCR类型见表2。

表2.T细胞淋巴瘤/白血病细胞系TCR类型

取适量的上述Loucy、PEER、Jurkat、Molt-4靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.5×10⁵/mL个细胞，按4:1的效靶比分别加入T、C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。靶细胞裂解百分数结果如图7所示，结果显示，C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞均能明显促进TCRγδ阳性靶细胞(Loucy、PEER)裂解，而对TCRγδ阴性靶细胞(Jurkat、Molt-4)几乎没有杀伤效果。并且C3-1-CAR-T、C4-CAR-T细胞促进TCRγδ阳性靶细胞(Loucy、PEER)裂解效果优于C3-2-CAR-T。

与上述实验操作平行地，取适量的靶细胞Loucy、PEER，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入靶0.05×10⁵/mL个细胞，按4:1的效靶比加入C3-2-CAR-T细胞，再加入糖皮质激素使糖皮质激素终浓度为2×10^-3ug/μl，37℃孵育2～3小时。200g离心30秒，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞Loucy、PEER裂解百分数，分别为82.1％，83.8％。

与上述实验操作平行地，取适量的靶细胞Loucy、PEER，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.05×10⁵/mL个靶细胞，加入糖皮质激素使糖皮质激素终浓度为2×10^-3ug/μl，37℃孵育2～3小时。200g离心30秒，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞Loucy、PEER裂解百分数，分别为5.8％，8.1％。

由以上结果可知，C3-2-CAR-T和糖皮质激素联合使用，靶细胞Loucy、PEER的裂解产生了协同效应，取得了1+1＞2的效果。

2.体外细胞因子检测：

取适量的上述Loucy、PEER、Jurkat、Molt-4靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.05×10⁵/mL个靶细胞，按4:1的效靶比加入T、C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞，200g离心30秒，37℃孵育18小时。孵育完成后取上清，测量其中IFN-γ的浓度。T、C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞对Loucy、PEER、Jurkat、Molt-4细胞系的IFN-γ的浓度结果如图8所示，结果显示，C3-1-CAR-T、C3-2-CAR-T、C4-CAR-T细胞针对TCRγδ阳性淋巴瘤细胞系Loucy、PEER的IFN-γ的浓度均较高，而针对TCRγδ阴性淋巴瘤细胞系Jurkat、Molt-4的IFN-γ的浓度均较低，进一步说明其可以杀伤γδT细胞淋巴白血病细胞，其变化趋势与上述体外杀瘤检测结果一致。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 武汉波睿达生物科技有限公司

<120> TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly

20 25 30

Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Tyr

35 40 45

Ile Gly Arg Phe Asn Pro Tyr Asn Gly Glu Thr Leu Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val

65 70 75 80

His Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Gly Arg Ser Gly Asn Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Ile Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaggttc agctgcagca gtctggacct gagctggtga agcctggggc ttcagtgaag 60

atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctact ttatgaactg ggtgaagcag 120

agccatggaa agagccttga gtatattgga cgttttaatc cttacaatgg tgaaacttta 180

tataaccaga agttcaaggg caaggccaca ttgactgtag acaaatcctc tagcacagtc 240

cacatggagc tcctgagcgt gacatctgag gactctgcag tctattattg tggaagaagc 300

ggtaacgacg atgcgatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 360

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gttggtacca gcagaaacca 120

ggaaatattc ccaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacaataa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacatatta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 5

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Glu Trp Met Ser Tyr Trp Tyr Trp Pro Arg Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Leu Met Ser Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 7

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgcgg cgagcggctt taccgtgagc agcagcagca ttcattgggt gcgccaggcg 120

ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgagc attagcagct attatggcta taccagctat 180

gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agcgcggata ccagcaaaaa caccgcgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcgaagaa 300

tggatgagct attggtattg gccgcgctat tattattatg gcatggatta ttggggccag 360

ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 384

<210> 8

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgcc gcgcgagcca gagcgtgagc agcgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatagc gcgagcagcc tgtatagcgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagccgcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcag gcggcgctga tgagcccgat tacctttggc 300

cagggcacca aagtggaaat taaacgc 327

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60

ccc 63

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactggagcc acccccagtt cgagaag 27

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 12

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 13

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 14

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 15

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 16

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His Gly Ser Gly

180

<210> 17

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

20 25 30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

35 40 45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

50 55 60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ser

<210> 18

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60

tccaaccctg gacca 75

<210> 19

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca cggaagcgga 540

<210> 20

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60

agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120

tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180

gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240

cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294

Claims

1.一种嵌合型抗原受体，其特征在于，从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ、F2A、IL-7、F2A、CCL19；所述单链抗体ScFv由重链可变区V_H、连接多肽Linker、轻链可变区V_L组成；所述重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述CCL19的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示

2.一种嵌合型抗原受体，其特征在于，从N端到C端顺次拼接信号肽、识别并结合肿瘤细胞表面TCRγδ的单链抗体ScFv、Strep tagⅡ、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB、CD3ζ，所述单链抗体ScFv由重链可变区V_H、连接多肽Linker、轻链可变区V_L组成；所述重链可变区V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，其特征在于，包括以慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、转座子载体或非病毒瞬时表达载体为骨架，插入如权利要求1-2任一项所述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列。

4.一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于，由编码权利要求1-2任一项所述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列或权利要求3所述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，所述免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、CD4+T细胞，CD8+T细胞；所述嵌合型抗原受体的单链抗体ScFv结合肿瘤细胞表面的TCRγδ。

5.一种权利要求1-2任一项所述的嵌合型抗原受体或权利要求3所述的重组嵌合型抗原受体的基因载体或权利要求4所述的表达嵌合型抗原受体免疫细胞在制备治疗淋巴细胞白血病的药物中的用途。

6.编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列转染T细胞得到的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞和糖皮质激素组成的药物组合物在制备治疗淋巴细胞白血病的药物中的用途。