CN111676245B - 一种含有HSV-1型溶瘤病毒的NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用 - Google Patents

一种含有HSV-1型溶瘤病毒的NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有杀伤肿瘤细胞功能的系统，包括HSV‑1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和转录因子‑Cre元件；所述转录因子为NFAT、NF‑κB和/或AP‑1；本发明通过精确呈递并激活HSV‑1型溶瘤病毒的复制，联合嵌合型抗原受体和转录因子‑Cre元件协同作用于杀伤实体肿瘤细胞，其治疗肿瘤的效果显著卓越，且无任何毒副作用。

Description

一种含有HSV-1型溶瘤病毒的NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及一种CAR-T细胞及其应用，具体涉及一种精确呈递并激活HSV-1型溶瘤病毒复制的CAR-T细胞及其应用。
背景技术
CAR-T细胞免疫疗法疗法在血液病治疗中展示了出色的潜力，尤其时在B细胞急性白血病治疗方面以高达90％的完全缓解率获得大众的认可。但在实体肿瘤治疗中却有明显的短板，主要由于实体肿瘤有致密的肿瘤组织和更为复杂的肿瘤微环境，使CAR-T细胞难以从血液中浸润至肿瘤病灶，实体肿瘤细胞自身常表达PD-L1抗原以及微环境中常存在调节型T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)等使少量CAR-T浸润入后难以存活增殖和实行杀伤肿瘤细胞的能力。
溶瘤病毒疗法是针对实体肿瘤治疗而产生的免疫疗法，可以较完美地补足CAR-T细胞在实体肿瘤治疗中的缺陷。2015年10月美国FDA批准首个溶瘤病毒产品talimogenelaherparepvec(T-vec,Imlygic)用于复发或不可切除病灶的黑色素瘤治疗。溶瘤病毒是一种经过基因编辑后可特异性在增殖通路被过度活化的肿瘤细胞内部复制和裂解而在正常组织和细胞中复制受抑制的病毒，由于溶瘤病毒特异性裂解肿瘤细胞的能力和临近细胞传播的特性，使溶瘤病毒在实体肿瘤治疗中独具优势，可以有效地裂解肿瘤细胞，破坏肿瘤微环境并在裂解肿瘤细胞的同时释放肿瘤相关抗原激活体内免疫反应，与CAR-T疗法形成较完美的互补杀伤实体肿瘤的作用。
但溶瘤病毒大多采用瘤内给药的方式给药，当病灶比较隐匿如在颅骨内部或器官内部时瘤内给药较难实施，而且较难普及，而静脉给药易被机体的抗肿瘤免疫反应消灭和在肝脏部位积聚不能达到理想的抗肿瘤效果，因此开发溶瘤病毒给药方案以及和CAR-T联合应用方案仍然是急需解决的肿瘤治疗难题。
发明内容
本发明的目的在于，解决上述现有技术的不足，提供一种NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用，该CAR-T细胞能精确呈递并激活HSV-1型溶瘤病毒(Switch-oHSV-1-X)的复制，并与之联合用于杀伤实体肿瘤细胞，其治疗肿瘤的效果显著卓越，且无任何毒副作用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明提供了一种具有杀伤实体肿瘤细胞作用的系统，所述系统包括HSV-1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和转录因子-Cre元件。
进一步的，所述HSV-1型溶瘤病毒为具有复制开关的Switch-HSV-1-X；较佳的，所述HSV-1型溶瘤病毒可源于HSV-1多种毒株改造而成，包括：HSV-1JS1、HSV-1F、HSV-1 17、HSV-1E19、HSV-1KOS、HSV-1v23、HSV-1v29及其它临床野生毒株如HSV1-2006-50683、HSV1-2009-20371、HSV1-2011-3153中的一种或多种，优选为HSV-1 17；较佳的，通过同源重组的方式删除双拷贝的ICP34.5和单拷贝的ICP47，并在ICP34.5基因组位点插入CMV-EGFP-polyA标签基因表达框即得到可特异性在肿瘤细胞中复制的溶瘤病毒oHSV-1-X；在oHSV-1-X基础上利用同源重组的手段在ICP4翻译起始密码子ATG上游插入CMV-Loxp-mCherry-polyA-Loxp元件调控ICP4基因的转录即得到具有开关的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。较佳的，CMV-Loxp-mCherry-polyA-Loxp元件为从5’端至3’端依次拼接CMV启动子、正向Loxp、mCherry CDS、SV40 polyA、正向Loxp，优选地正向Loxp核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，mCherry CDS氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，SV40 polyA核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体(ScFv)、strep tag II、CD8 hinge、CD28TM+ICD、4-1BB、CD3ζ。优选地，所述信号肽为CD8α信号肽，更优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体可特异性识别实体肿瘤表面的特异性蛋白；优选地，所述CD8 hinge氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；优选地，所述CD28TM+ICD氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；优选地，所述4-1BB氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选地，所述CD3ζ氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。较佳的，所述单链抗体scFv可靶向实体肿瘤靶点，如EGFR vIII、HER2、MUC1、GD2、IL13aII、PSCA等，优选为，EGFR vIII。scFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选的，所述EGFR vIII-scFv重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述EGFR vIII-scFv轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQID NO.12所示；优选地，所述连接肽Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步的，所述转录因子-Cre元件中，所述转录因子与CAR共同构建入T细胞内；较佳的，所述转录因子为NFAT、NF-κB和/或AP-1。更佳的，所述转录因子为NFAT。较佳的，NFAT-Cre元件顺次拼接NFAT-Pro、Cre重组酶、转录终止信号；优选地，所述NFAT-Pro为依赖于NFAT激活的启动子，更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cre重组酶为可特异性识别Loxp位点并可以执行DNA重组功能的酶，更优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述转录终止信号优选为SV40 polyA信号，优选地，SV40 polyA信号核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了一种重组嵌合型抗原受体基因载体，分开表达CAR和NFAT-Cre于两个载体或者共同表达CAR和NFAT-Cre于一个载体。以慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、转座子载体或非病毒瞬时表达载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体核苷酸序列；优选地，以转座子载体pT2/HB为骨架，插入上述的CAR和NFAT-Cre核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达CAR和NFAT-Cre的免疫细胞，由上述的嵌合型抗原受体的核苷酸序列或上述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞，优选为外周血来源的T细胞。
本发明还提供了一种上述表达CAR和NFAT-Cre的T细胞与具有启动开关的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的联用方案。将上述得到溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X按照一定的MOI负载入含有CAR和NFAT-Cre的T细胞，便得到细胞内部负载有Switch-oHSV-1-X的NFAT-Cre-CAR-T细胞。当该细胞与识别并杀伤靶细胞时便可激活胞内溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的复制和释放，进而感染、裂解靶细胞，达到CAR-T呈递及激活溶瘤病毒联合治疗实体肿瘤的目的。如图1所示。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供带有NFAT-Cre系统的CAR-T细胞，此细胞除了行使CAR-T的正常杀伤功能以外携带有基于转录因子NFAT激活转录的NFAT-Cre系统，当CAR系统胞外的scFv与靶蛋白结合并激活T细胞从而激活转录因子NFAT入核促进Cre重组酶表达，产生后续的基于Loxp位点的重组作用；
2、本发明还提供具有Cre重组酶介导开启复制功能的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X，此溶瘤病毒在ICP4基因前加了表达调控开关，当开关未开启时ICP4不能表达使溶瘤病毒不能复制扩增，在Cre重组酶的缺失重组下才能开启ICP4的表达进而激活此溶瘤病毒的复制；
3、本发明最终提供通过CAR-T靶向呈递及精确调控激活溶瘤病毒的方案，该方案通过具有NFAT-Cre系统的CAR-T运送具有基有Cre启动开关的溶瘤病毒，在CAR-T呈递溶瘤病毒过程中可避免溶瘤病毒在CAR-T细胞运输过程中的少量复制影响CAR-T细胞的活性，当CAR-T携带溶瘤病毒至肿瘤细胞时，胞外scFv与靶蛋白结合并快速开启胞内溶瘤病毒的复制，进而感染临近靶细胞破坏肿瘤微环境、释放肿瘤相关抗原介导CAR-T细胞及自体免疫系统形成联合杀伤实体肿瘤的免疫反应。
附图说明
图1为NFAT-Cre系统激活溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X示意图；
图2为EGFR vIII-CAR的DNA片段的示意图；
图3为NFAT-Cre系统DNA片段示意图；
图4为EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR系统DNA片段示意图；
图5为pT2-EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR质粒图谱；
图6为Switch-oHSV-1-X基因改造示意图；
图7为EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T转染效率检测结果；
图8为溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X负载入EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T的检测结果；
图9为EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T负载Switch-oHSV-1-X后在靶细胞刺激下的病毒激活复制的基因组检测结果；
图10为Switch-oHSV-1-X经过EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T的负载激活后可特异性地呈递给对应靶点的靶细胞；
图11为Switch-oHSV-1-X负载入EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞后的联合杀瘤结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：PT2-EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR质粒的构建
1、人工合成单链抗体EGFR vIII的序列，即将CD8α信号肽核苷酸序列SEQ IDNO.14、重链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.15、连接多肽Linker核苷酸序列SEQ ID NO.16、轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.17所示的核苷酸片段顺次拼接合成，构成SP-EGFRvIII-scFv。
2、以人的cDNA文库为模板，设计引物PCR分别扩增片段CD8 hinge核苷酸序列SEQID NO.18、CD28TM+ICD核苷酸序列SEQ ID NO.19、4-1BB核苷酸序列SEQ ID NO.20、CD3ζ核苷酸序列SEQ ID NO.21，以引物互补方式得到Strep tagⅡ核苷酸片段SEQ ID NO.22，用Overlap PCR技术将SP-EGFR vIII-scFv与片段Strep tagⅡ、CD8 hinge、CD28TM+ICD、、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成完整的嵌合抗原受体CAR结构EGFR vIII-CAR，结构示意图如图2所示。
3、人工合成NFAT-Pro序列SEQ ID NO.1，以P1噬菌体基因组为模板设计引物扩增出Cre重组酶核苷酸序列SEQ ID NO.23，以商业化质粒pcDNA3.1为模板扩增出SV40 polyA核苷酸序列SEQ ID NO.4。同样地，用Overlap PCR技术分别将NFAT-Pro、Cre重组酶和SV40polyA顺次扩增连接成NFAT-Cre，结构示意图如图3所示。然后EF1aα启动子控制下的EGFRvIII-CAR表达框、NFAT-Cre表达框背向连接到一起，命名为EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR结构示意图如图4所示。
4、将质粒pT2/HB使用HandIII和EcoRI限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于1.5mL离心管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
5、将上述载体回收片段分别与EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR以1:2摩尔比加入1.5mL离心管加入ExnaseⅡ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5小时；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μLsoc培养基37℃、220rpm培养2小时；2小时后将1.5mL离心管4000g离心1min移除约400ng上清，然后将菌体沉淀轻轻吹打混匀，涂布在LB平板37℃培养12小时；在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。
5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒pT2-EGFR vIII-NFAT-
Cre-CAR，送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行菌株保种。pT2-EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR的质粒图谱示意图如图5所示。
实施例2、质粒的制备与测序
1、质粒的制备
将含质粒pT2-EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR的DH5α菌种分别接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。
取出EndoFree plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。
向离心瓶中加120mL Buffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。
向离心瓶中加120mL Buffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。
向QIAfilter Cartridge倒入50mL Buffer FW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。将混合液抽滤入已标记好对应的玻璃瓶中。
向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。
将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffer QBT平衡，重力作用使之流尽。
将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mL Buffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。
再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。
向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。
超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid mega kit中的Buffer TE放入烘箱内预热。
在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。
在烘箱内拿出Buffer TE，在超净工作台内向每管加入1mL Buffer TE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。
在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的1.5mL离心管中。吸出2μL，用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的1.5mL离心管上，获得大量质粒pT2-EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR。
2、目的基因测序
分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。
实施例3、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞的制备
1、T细胞转染：
采集健康供者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3 MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizerTMCTSTMT-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizerTMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每106个细胞加入25μL Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。
24小时后，取2×106个T细胞300g离心5分钟弃掉上清，加入3mL PBS重悬，300g离心5分钟弃掉上清，重复上述PBS清洗步骤，用吸头吸干净上清，加入500μL电转buffer重悬细胞，300g离心5分钟，用吸头吸干净上清，加入200μL电转buffer重悬细胞并分别加入3μg的pT2-EGFR vIII-CAR-NFAT-Cre质粒，2μg转座酶表达载体pCMV(CAT)-T7-SB100，充分混匀后加入至2mm规格电转杯放入电转仪，选择人类T淋巴细胞电转程序执行电转。电转后迅速加入温浴好得T细胞培养基转入培养盘中，调整浓度至2×106个cells/mL，放入细胞培养箱培养。
2、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞转导效率检测
培养48小时后，取1.0×106个转导后T细胞，与1μg/mL FITC-Protein-L室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-T细胞在总细胞中的比率。EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞转染效率检测结果分别如图7所示。图7表明成功制备了EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞。
实施例4、Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒的制备
1.穿梭载体的构建：
oHSV-1-X病毒为基于HSV-1 17毒株删除两个拷贝的ICP34.5和单拷贝的ICP47(ICP34.5和ICP47为病毒复制的非必需基因)，并在ICP34.5基因组位点插入CMV-EGFP-polyA标签基因表达框。溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的改造是基于溶瘤病毒oHSV-1-X进行的。为了达到替换ICP4基因启动子和加入Loxp-mCherry-polyA-Loxp(LSL)的目的，我们利用同源重组的方法进行基因的改造合成。首先用DNAzol试剂裂解oHSV-1-X病毒颗粒，乙醇沉淀的方法提取其基因组DNA。以oHSV01-X DNA为模版分段扩增出ICP4基因，并且同时扩增病毒基因组两处ICP4基因起始密码子上游1500bp和终止密码子TAA下游1500bp作为两对同源臂。将两对同源尾按照前后顺序分别以重叠PCR方式顺次连到一起，前后同源臂之间插入单一限制性内切酶ClaI和XhoI，前后两端分别插入单一限制性核酸内切酶XbaI和HandIII。然后经过XbaI和HandIII双酶切两对同源臂和pUC57载体，用T4连接酶将两对同源臂分别构入pUC57载体通过转化、测序获得载体pUC57-TYW-1和pUC57-TYW-2。
人工合成Loxp-mCherry-polyA-Loxp(LSL)基因片段，通过PCR手段从pcDNA3.1载体中获取CMV启动子。利用重叠PCR手段将CMV、Loxp-mCherry-polyA-Loxp和ICP4三个片段融合为一，并在两端分别加上ClaI和XhoI酶切位点，得到CMV-LSL-ICP4片段。用ClaI和XhoI酶切CMV-LSL-ICP4片段和pUC57-TYW-1、pUC57-TYW-2载体，通过T4连接酶将CMV-LSL-ICP4构入pUC57-T-YW-1和pUC57-TYW-2载体。通过测序得到同源重组载体pUC57-CMV-LSL-ICP4-1和pUC57-CMV-LSL-ICP4-2。通过摇菌和纯化得到大量质粒，经过XbaI和HandIII双酶切纯化回收后便得到用于病毒基因组重组的CMV-LSL-ICP4-1和CMV-LSL-ICP4-2片段。
2、同源重组、筛选获得目标病毒：
将Vero-ICP4细胞传代入100mm细胞培养皿中，当细胞汇合度达到约85％时将oHSV01-X病毒基因组DNA与线性化重组片段CMV-LSL-ICP4-1和CMV-LSL-ICP4-2利用脂质体转染试剂共同转染vero-ICP4细胞。同时将2％低熔点琼脂糖高温灭菌，灭菌后放入密封容器放入56℃烘箱备用防止冷却凝固；用DMEM粉末配置2×DMEM培养基过滤除菌备用。待脂质体转染Vero细胞6至8小时后弃掉培养基并用与2×DMEM培养基与2％低熔点琼脂糖1：1混匀，待到冷却至37℃左右时迅速覆盖共转染病毒基因组与重组片段的Vero细胞，随后放入4℃冰箱约20分钟凝固后再放回培养箱继续培养。待2至4天后经同源重组和病毒的包装会有溶细胞空斑出现，有个别病毒基因组上ICP4会被CMV-LSL-ICP4片段取代，这使得重组的病毒发出红色裂解细胞斑。此时用吸头挑取多个红色裂解斑的细胞放入200μL培养基种反复冻融3次释放病毒颗粒，再次感染细胞密度在90％左右的vero细胞，三个小时后用上述同样的方法覆盖琼脂糖培养基继续进行培养，待2-4天后出现细胞溶解空斑时挑取红色斑块。后续经过6-8轮重复的病毒挑选纯化，最终得到纯度非常高的病毒株，经过测序筛选后得到oHSV-1-X病毒基因组中ICP4基因均被CMV-LSL-ICP4取代，即为具有开关的可控性溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。Switch-oHSV-1-X构建流程如图6所示。
实施例5、负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞比例检测
1.EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞负载溶瘤病毒
Switch-oHSV-1-X：
分别计数1×107个EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞，300g离心5分钟弃掉培养基，加入1mL T细胞培养基调整细胞浓度至1×107个/mL。按照MOI＝1加入Switch-oHSV-1-X并加入终浓度5μg/mL的Polybrene，充分混匀置于37℃，5％CO2培养箱中转染3小时。3小时后300g离心5分钟弃去含病毒悬液的培养基，加入5mL T细胞培养基重悬细胞，随后300g离心5分钟弃去培养基，重复上述清洗步骤2至3次，调整细胞密度至2×106个/mL放入37℃，5％CO2培养箱培养备用。
2、负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞比例检测：
EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X放入培养箱培养48小时至72小时，负载病毒的细胞绿色荧光蛋白EGFP会表达，通过流式细胞数检测EGFP所占比例就可确定EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T负载溶瘤病毒的比例，流式检测结果如图8所示，结果表明EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞已成功负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。
实施例6、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T条件性启动Switch-oHSV-1-X的检测：
1、负载Switch-oHSV-1-X的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T接受靶细胞刺激：
构建不含NFAT-Cre元件的EGFR vIII-CAR-T细胞，按实施例5中负载溶瘤病毒的方式，在EGFR vIII-CAR-T细胞中加入溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。将EGFR vIII-CAR-T细胞、负载Switch-oHSV-1-X病毒的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞与其靶细胞U251-MG(EGFRvIII+)及阴性靶细胞K562(作为对照组)按效靶比2：1共同孵育3小时，随后用吸头轻轻吹悬EGFR vIII-CAR-T细胞、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞(靶细胞为贴壁状态)，将培养基吸入15mL离心管中300g离心5分钟弃去培养基，用T细胞培养基重悬调整密度至2×106/mL放入CO2培养箱继续培养。36小时后分别计数一定数目的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞以及EGFR vIII-CAR-T细胞，用DNAzol法提取基因组。
2、运用qPCR的方式检测EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞中溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X基因组拷贝数：
检测EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞中的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X基因组拷贝数，具体方法为：选择Switch-oHSV-1-X基因组的保守序列为扩增溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的靶序列，以人β-globin基因为内参基因，在同一反应体系中扩增目的基因和内参基因，目的基因和内参基因标记不同的荧光基团。在目的基因上设计特异性引物探针，使用带有目的基因的质粒做标准品，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，通过待测样本Switch-oHSV-1-X的Ct值，即可从标准曲线上计算出Switch-oHSV-1-X的拷贝数。同理，可得出待测样品的β-globin拷贝数，β-globin拷贝数的一半即为待测样品的细胞个数，即用β-globin拷贝数校准待测样本中的细胞个数。Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒相对EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞数的拷贝数则可以表示为：2×靶基因拷贝数/β-globin基因拷贝数。实验结果见图9，结果表明相对于不经过刺激(K562阴性靶细胞)的对照组，经过靶细胞刺激的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T中检测到约13000copies/106cells的Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒，表明EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞可以成功开启Switch-oHSV-1-X复制。
实施例7、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T特异性呈递Switch-oHSV-1-X至靶细胞：
1、负载Switch-oHSV-1-X病毒的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞与靶细胞共同孵育
构建不含NFAT-Cre元件的EGFR vIII-CAR-T细胞，按实施例5中负载溶瘤病毒的方式，在EGFR vIII-CAR-T细胞中加入溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。将EGFR vIII-CAR-T细胞、负载Switch-oHSV-1-X病毒的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞与其靶细胞U251-MG(EGFRvIII+)及阴性靶细胞K562(作为对照组)，按照效靶比2：1共同孵育12至24小时，随后用吸头轻轻吹悬EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞(靶细胞为贴壁状态)，吸弃悬浮培养基及其中的T细胞，用PBS将贴壁的靶细胞清洗三遍，尽量将T细胞清洗干净。随后用加入少量胰蛋白酶将靶细胞从皿底消化下来，用适量培养基终止消化后转入1.5mL离心管。取相同个数的靶细胞及阴性对照靶细胞用DNAzol法提取其基因组DNA。
2、运用qPCR的方法检测靶细胞中的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X基因组拷贝数按实施例6中的方法检测溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X基因组拷贝数与靶细胞U251-MG的β-globin拷贝数，Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒相对靶细胞数的拷贝数则可以表示为：2×靶基因拷贝数/β-globin拷贝数。结果如图10所示，结果显示负载Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒的EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞与靶细胞共同孵育后，靶细胞中检测到大量Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒，表明EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T可将溶瘤病Switch-oHSV-1-X呈递给靶细胞，并在靶细胞中迅速复制。
此外，EGFR vIII-CAR-T+Switch-oHSV-1-X组的数据表明，在没有NFAT-Cre元件的情况下不能将Switch-oHSV-1-X呈递给靶细，且不能开启溶瘤病毒的Switch-oHSV-1-X的复制。
实施例8、EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T与Switch-oHSV-1-X协同杀伤靶细胞：
1、Luciferase靶细胞稳转细胞系的构建
本方案采用慢病毒构建稳转细胞系的方式标记靶细胞，首先我们分别将2×105U251-MG细胞系转入T25培养瓶中放入CO2培养箱过夜培养，待细胞汇合度约75％时按MOI＝3转入PTK-Luci-Puro慢病毒(该慢病毒携带银火虫Luciferase基因及抗性基因Puromycin)。转染约4小时后用吸头吸去含病毒的培养基上清，缓慢加入新鲜的DMEM完全培养基放入细胞培养箱继续培养。待细胞长满皿底时按照1/3比例传代。待转入慢病毒72小时后按照工作浓度2μg/mL加入Puromycin进行筛选，在此期间细胞长满继续按照1/3传代并始终维持Puromycin的工作浓度2μg/mL。连续筛选约7至10天，便可得到纯度达98％以上的稳转Luciferase的U251-MG细胞，即U251-MG-Luci。
2、负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T靶细胞杀伤实验：
按实施例5的方法将溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X负载入EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T中。将负载溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T、单独的EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T、单独的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X和靶细胞U251-MG-Luci按效靶比2:1和4:1共同孵育，48小时后加入荧光素酶底物D(-)-Luciferin。利用在酶标仪检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms。检测完成后，统计各样品荧光强度K值。将单独的靶细胞培养对照组的荧光强度记为KC，组别中最大的荧光酶活力记作杀伤100％，即KM。按下列公式计算每组的杀伤效率：
杀伤效率％＝(KC-K)/(KC-KM)×100％靶细胞裂解百分数
结果显示(见图11)，在1：1的效靶比下，负载有溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X的EGFRvIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞对靶细胞U251-MG-Luci的杀伤效率约为63％，显著高于单独的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞组(约为8％)和单独的Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒组(约为9％)，同样在效靶比为4：1时，负载有Switch-oHSV-1-X的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞组杀伤效率约为96％，显著高于单独的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞组(约为14％)和单独的Switch-oHSV-1-X溶瘤病毒组(约为11％)，表明负载有Switch-oHSV-1-X的EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T细胞较于其它两组能明显促进HER+靶细胞U251-MG-Luci的裂解。
此外，Switch-oHSV-1-X组的数据表明，加装有NFAT-Cre启动开关的溶瘤病毒在未经Cre开启前具有安全性，几乎不具备杀伤细胞的能力；同时也证明NFAT-Cre元件在开启溶瘤病毒复制中扮演着必要的角色。
通过上述各实施例及实验数据表明EGFR vIII-NFAT-Cre-CAR-T可条件性激活细胞内部Switch-oHSV-1-X的复制，并呈递至临近的靶细胞，共同产生杀伤靶细胞的协同作用。解决了溶瘤病毒的给药问题和缓解CAR-T在实体肿瘤治疗中的明显弊端，并可与CAR-T免疫疗法产生协同抗肿瘤作用，为实体肿瘤提供新的治疗方案。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种含有HSV-1型溶瘤病毒的NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用
<130> 1
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NFAT-Pro核苷酸序列
<400> 1
tcggtacctc gcgaatgcat ctagaaagct ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 120
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt cgcgaattcg cggagactct agagggtata 180
taatggaagc tcgatttcca g 201
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α信号肽氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cre重组酶氨基酸序列
<400> 3
Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val
1 5 10 15
Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg
20 25 30
Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val
35 40 45
Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe
50 55 60
Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala
65 70 75 80
Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn
85 90 95
Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala
100 105 110
Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly
115 120 125
Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln
130 135 140
Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn
145 150 155 160
Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu
165 170 175
Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg
180 185 190
Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly
195 200 205
Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp
210 215 220
Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys
225 230 235 240
Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu
245 250 255
Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile
260 265 270
Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly
275 280 285
His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val
290 295 300
Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile
305 310 315 320
Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val
325 330 335
Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp
340
<210> 4
<211> 122
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyA核苷酸序列
<400> 4
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 Hinge氨基酸序列
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 68
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28TM+ICD氨基酸序列
<400> 6
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB氨基酸序列
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ氨基酸序列
<400> 8
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry氨基酸序列
<400> 9
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正向Loxp核苷酸序列
<400> 10
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR vIII-VH氨基酸序列
<400> 11
Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu
20 25 30
Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro
50 55 60
Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR vIII-VL氨基酸序列
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker氨基酸序列
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α信号肽核苷酸序列
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 15
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR vIII-VH核苷酸序列
<400> 15
cggcccgaga ttcagctcgt gcaatcggga gcggaagtca agaagccagg agagtccttg 60
cggatctcat gcaagggtag cggctttaac atcgaggatt actacatcca ctgggtgagg 120
cagatgccgg ggaagggact cgaatggatg ggacggatcg acccagaaaa cgacgaaact 180
aagtacggtc cgatcttcca aggccatgtg actattagcg ccgatacttc aatcaatacc 240
gtgtatctgc aatggtcctc attgaaagcc tcagataccg cgatgtacta ctgtgctttc 300
agaggagggg tctactgggg acagggaact accgtgactg tctcgtcc 348
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker核苷酸序列
<400> 16
ggcggaggcg ggtcaggagg tggcggcagc ggaggaggag ggtcc 45
<210> 17
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR vIII-VL核苷酸序列
<400> 17
gacgtcgtga tgacccagag ccctgacagc ctggcagtga gcctgggcga aagagctacc 60
attaactgca aatcgtcgca gagcctgctg gactcggacg gaaaaacgta cctcaattgg 120
ctgcagcaaa agcctggcca gccaccgaag cgccttatct cactggtgtc gaagctggat 180
tcgggagtgc ccgatcgctt ctccggctcg ggatcgggta ctgacttcac cctcactatc 240
tcctcgcttc aagcagagga cgtggccgtc tactactgct ggcagggaac ccactttccg 300
ggaaccttcg gcggagggac gaaagtggag atcaag 336
<210> 18
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 Hinge核苷酸序列
<400> 18
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 19
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28TM+ICD核苷酸序列
<400> 19
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 20
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB核苷酸序列
<400> 20
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ核苷酸序列
<400> 21
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Strep tag II核苷酸序列
<400> 22
aactggagcc acccccagtt cgagaag 27
<210> 23
<211> 1029
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cre重组酶核苷酸序列
<400> 23
atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60
gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120
acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180
cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240
cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300
cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360
cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480
ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540
agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600
aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 660
gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 780
ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 900
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 960
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 1020
gatggcgat 1029

Claims (3)

1.一种具有杀伤实体肿瘤细胞作用的产品，其特征在于，所述产品包括 HSV-1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和转录因子-Cre元件；
所述HSV-1型溶瘤病毒缺失双拷贝的ICP34.5和单拷贝的ICP47， 并在ICP34.5基因组位点插入CMV-EGFP-polyA标签基因表达框，以及在ICP4翻译起始密码子ATG上游插入 CMV-Loxp-mCherry-polyA-Loxp元件；所述CMV-Loxp-mCherry-polyA-Loxp 元件为从5’端至3’端依次拼接CMV启动子、正向Loxp、mCherry CDS、SV40 polyA和正向Loxp；所述正向Loxp核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示，mCherry CDS氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，SV40 polyA核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体、 strep tag II、CD8hinge、CD28TM+ICD、4-1BB、CD3ζ；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体由重链可变区VH、连接多肽、轻链可变区VL组成，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述CD8 hinge氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述CD28TM+ICD氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述4-1BB氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述CD3ζ氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述转录因子-Cre元件中，所述转录因子为NFAT；NFAT-Cre元件顺次拼接NFAT-Pro、Cre重组酶、转录终止信号；所述NFAT-Pro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cre的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种细胞，其特征在于包含权利要求1所述的产品。
3.权利要求1所述的产品在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
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