CN110747174A - 一种用于肿瘤治疗的重组病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于肿瘤治疗的重组病毒，属于肿瘤治疗技术领域，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。本发明提供的重组病毒具有更高的安全性和肿瘤选择特异性。

Description

一种用于肿瘤治疗的重组病毒
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤治疗的重组病毒。
背景技术
痘病毒(Poxvirus)是病毒粒最大的一类DNA病毒，包括多种类型：痘苗病毒(Vaccinia virus)、天花病毒(Variola virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)和猴痘病毒(Monkey poxvirus)等。其中痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain，VTT)在消灭天花的过程中发挥重大作用。痘苗病毒具有宿主范围广、非必需基因多、高度保守性、外源基因的容量大、胞质复制等特点。
目前，肿瘤的治疗还是一个世界性难题，主要的方法有放化疗、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)以及单克隆抗体疗法。而溶瘤病毒作为肿瘤治疗新的研究方向，目前已经取得了一些研究成果。以腺病毒(Adenovirus)为载体的溶瘤病毒在转移性非小细胞肺癌和三阴乳腺癌(Metastatic NSCLCTNBCJX-594)及脑癌(Brain cancer)中已经进入了临床II期阶段。同时以HSV为载体的Talimogene laherparepvec(T-VEC)治疗黑色素瘤的研究已进入III期阶段。而在痘病毒中，JX-594作为第一个进入临床阶段用于肿瘤治疗的重组病毒，是在痘苗病毒株WesternReserve的基础上将TK区进行敲除，然后插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF)，在肝癌(Hepatocellelar carcinoma)治疗中已经进入临床III期，可以和Sorafenib等多种化学治疗药物联合使用抵抗肝癌。另一株重组病毒GL-ONC1(GLV-1h68)是以痘苗病毒Lister株为载体，缺失TK、F4L14.5L、A56R，插入Renilla luciferase-GFP、LacZ、gusA基因，在腹膜癌(peritoneal carcinomatosis)治疗中进入临床II期。
相对于正常组织细胞，肿瘤细胞在多种信号途径表现异常，如何获得最佳的肿瘤细胞选择性病毒复制效果，以及最大限度的保证病毒的肿瘤细胞选择性复制、提高其安全性至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肿瘤治疗的重组病毒，本发明提供的重组病毒具有更高的安全性和肿瘤选择特异性。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于肿瘤治疗的重组病毒，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中缺失TK基因，得到缺失TK基因的重组病毒时，所述缺失TK基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
1)将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2)将所述步骤1)得到的Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
3)将所述步骤2)得到的感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
4)将所述步骤3)得到的病毒悬液感染Vero细胞，在绿色荧光下，挑取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中缺失F4L基因，得到缺失F4L基因的重组病毒时，所述缺失F4L基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
a、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
b、将所述步骤a得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c、将所述步骤b得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d、将所述步骤c得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中缺失B19R基因，得到缺失B19R基因的重组病毒时，所述缺失B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
A、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
B、将所述步骤A得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
C、将所述步骤B得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
D、将所述步骤C得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失C10L基因和VGF基因，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和F4L基因，得到缺失TK基因和F4L基因的重组病毒时，所述缺失TK基因和F4L基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
Ⅰ、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
Ⅱ、将所述步骤Ⅰ得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
Ⅲ、将所述步骤Ⅱ得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
Ⅳ、将所述步骤Ⅲ得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和F4L基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和B19R基因，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
⑴、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
⑵、将所述步骤⑴得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
⑶、将所述步骤⑵得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
⑷、将所述步骤⑶得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失F4L基因和B19R基因，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
㈠、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
㈡、将所述步骤㈠得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
㈢、将所述步骤㈡得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
㈣、将所述步骤㈢得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒。
优选的，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
a1、将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
b1将所述步骤a1得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c1将所述步骤b1得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d1将所述步骤c1得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
本发明提供了一种用于肿瘤治疗的重组病毒，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。痘苗病毒作为DNA病毒，多种与脱氧核糖核酸合成相关的酶在其复制过程中发挥重要作用。这些酶包括胸苷激酶(thymidylate kinase，TK)、核糖核酸还原酶(ribonucleotide reducyase)、脱氧尿苷三磷酸酶(deoxyuridine triphosphatase)等。痘苗病毒复制时，在这些酶的作用下可形成一个高浓度的核苷酸池，以确保子代DNA复制的顺利进行。正常细胞中，核苷酸的浓度较低,，因此TK是病毒在正常细胞增殖所必需的；肿瘤细胞中则具有较高浓度的核苷酸，因此TK对于病毒在肿瘤细胞增殖是非必需的。由上可知，删除TK基因的痘病毒能够优先在为其提供足够核苷酸的肿瘤细胞中复制，而不能在正常细胞中复制。核糖核酸还原酶F4L在病毒感染细胞后不久产生，在结构上与真核生物的核糖核酸还原酶能够达到70％～80％的相似，它包含一个催化小亚基和调节大亚基，能够催化核苷二磷酸形成脱氧核苷二磷酸。大亚基的突变将会抑制还原酶活性，小鼠中病毒突变体的毒力也将会降低。此外，B19R编码一种结合I型干扰素的受体蛋白；C10L抑制病毒DNA对天然免疫的激活；VGF是病毒感染早期产生的病毒生长因子，与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)同源，可与细胞表面的EGF受体相结合，结合后可介导细胞内Ras信号通路的激活，进一步启动细胞周期并促进细胞分化，而细胞分化又会促进细胞TK等的合成，最终提高病毒的感染效率。这对于病毒在正常细胞中的扩增十分重要,，而在本身可以大量增殖的肿瘤细胞中是非必需的。本发明提供的缺失了TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因等的重组病毒具有更高的安全性和肿瘤选择特异性。
附图说明
图1为gRNA设计靶向的位置及序列；
图2为靶向TK区gNRA质粒中Cas9蛋白的表达结果，其中Lenti-delNLS为gRNA载体质粒，Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3为靶向TK区的3个gRNA质粒，N为293T细胞；
图3为靶向TK区gNRA质粒中Cas9蛋白的定位结果，其中载体质粒Lenti-delNLS、靶向TK区的3个gRNA质粒Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3质粒的Cas9均定位在细胞质；
图4为重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP及同源重组示意图；
图5为在293T细胞中感染野生型痘苗病毒后，重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP的荧光表达情况；
图6用荧光显微镜观察重组病毒第一轮筛选纯化的结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图7为重组病毒第一轮筛选的重组效率；
图8为经过几轮纯化，获得的重组病毒中绿色荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图9为重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP鉴定所需PCR引物示意图；
图10为对重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP的PCR鉴定结果，其中WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒；
图11为在293T细胞中转染pQCXIP-Cre质粒，Cre蛋白表达结果，其中control为293T细胞，PQCXIP为载体质粒；
图12为转染质粒pQCXIP-Cre，获得的重组病毒VACV-ΔTK的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图13为统计无色噬斑与所有噬斑的比例，计算得到删除效率；
图14为对重组病毒VACV-ΔTK进行PCR鉴定结果，其中，WT为野生型病毒，VGFP为重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP，A、B、C、D为重组病毒VACV-ΔTK；
图15为在293T细胞中感染野生型痘苗病毒后，重组质粒pF4L-RFP-LoxP的荧光表达情况；
图16为经过几轮纯化，获得的重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图17为对重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP的PCR鉴定结果，其中WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒；
图18为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔF4L的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图19为对重组病毒VACV-ΔF4L进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP，A、B、C、D为重组病毒VACV-ΔF4L；
图20为在293T细胞中感染野生型痘苗病毒后，重组质粒pB19R-RFP-LoxP的荧光表达情况；
图21为经过几轮纯化，获得的重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图22为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔB19R的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图23为对重组病毒VACV-ΔB19R进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP，VdelB为重组病毒VACV-ΔB19R；
图24为在293T细胞中感染野生型痘苗病毒后，重组质粒pVC-RFP-LoxP的荧光表达情况；
图25为经过几轮纯化，获得的重组病毒VACV-ΔVC-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况；
图26为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔVC的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图27为对重组病毒VACV-ΔVC进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔVC-RFP-LoxP，VdelVC为重组病毒VACV-ΔVC。
图28为在VACV-ΔTK的基础上删掉F4L，获得的重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图29为对重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP进行PCR鉴定的结果；其中WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP；
图30为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔTK/F4L的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图31为对重组病毒VACV-ΔTK/F4L进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP，A、B为重组病毒VACV-ΔTK/F4L；
图32为在VACV-ΔTK的基础上删掉B19R，获得的重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图33为对重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP；
图34为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔTK/B19R的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图35为对重组病毒VACV-ΔTK/B19R进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP，VdelTB为重组病毒VACV-ΔTK/B19R；
图36为在VACV-ΔTK的基础上删掉VC，获得的重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图37为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔTK/VC的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图38为对重组病毒VACV-ΔTK/VC进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP，VdelTVC为重组病毒VACV-ΔTK/VC；
图39为在VACV-ΔF4L的基础上删掉B19R，获得的重组病毒VACV-ΔF4L/B19R-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图40为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔF4L/B19R的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图41为对重组病毒VACV-ΔF4L/B19R进行PCR鉴定的结果，其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔF4L/B19R-RFP-LoxP，VdelFB为重组病毒VACV-ΔF4L/B19R；
图42为在VACV-ΔF4L的基础上删掉VC，获得的重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP中荧光蛋白的表达情况，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图43为利用Cre-LoxP删除荧光标记，获得的重组病毒VACV-ΔF4L/VC的第一轮筛选结果，其中左图为明视场结果，右图为荧光结果；
图44为对重组病毒VACV-ΔF4L/VC进行PCR鉴定的结果。其中WT为野生型病毒，VRFP为重组病毒VACV-ΔF4L/VC-RFP-LoxP，VdelFVC为重组病毒VACV-ΔF4L/VC；
图45为稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞系中TK1及RRM2的表达结果，其中Vero-TR为稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞；
图46为在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，VACV野生型及缺失TK/F4L的重组病毒的复制情况及细胞活力检测结果，其中A为VACV野生型及缺失TK/F4L的重组病毒的复制情况，B为细胞活力检测结果；
图47为敲低TK1、RRM2的HeLa细胞系中TK1及RRM2的表达结果，其中HeLa-A7为敲低TK1的HeLa细胞，HeLa-D4为敲低RRM2的HeLa细胞；
图48为在敲低TK1、RRM2的HeLa细胞系中，VACV野生型及缺失TK、缺失F4L、同时缺失TK和F4L的重组病毒的复制情况及细胞活力检测结果，其中A为VACV野生型及缺失TK/F4L的重组病毒的复制情况，B为细胞活力检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于肿瘤治疗的重组病毒，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。
在本发明中，所述痘苗病毒天坛株的全基因组序列已存入国际基因库中，编号为Gene Bank，No.AF095689。本发明对所述痘苗病毒天坛株的来源没有特殊限定，采用常规即可。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中缺失TK基因，得到缺失TK基因的重组病毒时，所述缺失TK基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
1)将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2)将所述步骤1)得到的Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
3)将所述步骤2)得到的感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
4)将所述步骤3)得到的病毒悬液感染Vero细胞，在绿色荧光下，挑取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。
本发明将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3。
在本发明中，所述gRNA1、gRNA2和gRNA3的核苷酸序列针对痘苗病毒天坛株的TK基因，通过网站(http://crispr.mit.edu/，http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计得到，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下所示：
gaaaccgagatagaaataat；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：
gttatagtagccgcactcga；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体序列如下所示：
gtgagcgtatggcaaacga。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是利用引物lentidNLS-F(SEQ ID No.40)：aggacattctggaagatatcgtgctgaccc，lentidNLS-R(SEQ ID No.41)：agaagtttgttgcgccggatcccttatcgtcatcgtctttgtaatcgtcgcctcccagctgagaca扩增出缺失NLS的Cas9，同时将Lenti-V2用EcoRV酶切，然后利用无缝克隆将缺失NLS的Cas9替换lenti-V2中的Cas9，得到Lenti-delNLS，所述Lenti-delNLS的具体序列为lentiCRISPRv2(Addgene#52961)序列中1-8596和8645-14873
本发明对所述将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述痘苗病毒天坛株MOI：0.05。本发明优选使用DMEM稀释痘苗病毒天坛株，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pJ2R-EGFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码绿色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和TK区同源臂序列。其中关键序列依次为TK区同源臂左臂(GenBank:JX489139.1中79716-80438)，LoxP序列(SEQ ID No.42)ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat，EGFP基因(GeneID:20473140)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，p11和p7.5启动子(GenBank:JX489139.1中43077-43168,189237-189494)，TK区同源臂右臂(GenBank:JX489139.1中80701-81460)。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在绿色荧光下，挑取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在绿色荧光下，提取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。本发明对删除绿色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过转染pQCXIP-Cre质粒的方法删除绿色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中缺失F4L基因，得到缺失F4L基因的重组病毒时，所述缺失F4L基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
a、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
b、将所述步骤a得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c、将所述步骤b得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d、将所述步骤c得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。
本发明将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6。
在本发明中，所述gRNA4、gRNA5和gRNA6的核苷酸序列针对痘苗病毒天坛株的F4L基因，通过网站(http://crispr.mit.edu/，http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计得到，所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体序列如下所示：
gtgggtgaataccaaaaaat；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：
gtagaaggaatcttcttttc；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体序列如下所示：
gatagattgatttctgaatt。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述痘苗病毒天坛株MOI：0.05。本发明优选使用DMEM稀释痘苗病毒天坛株，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pF4L-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和F4L区同源臂序列。其中关键序列依次为F4L区同源臂左臂(GenBank:JX489139.1中31818-32450)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，RFP基因(GenBank:KT823412.1，3571-4284)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，p11和p7.5启动子(GenBank:JX489139.1中43077-43168,189237-189494)，F4L区同源臂右臂(GenBank:JX489139.1中33281-33900)。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中缺失B19R基因，得到缺失B19R基因的重组病毒时，所述缺失B19R基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
A、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
B、将所述步骤A得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
C、将所述步骤B得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
D、将所述步骤C得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。
本发明将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9。
在本发明中，所述gRNA7、gRNA8和gRNA9的核苷酸序列针对痘苗病毒天坛株的B19R基因，通过网站(http://crispr.mit.edu/，http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计得到，所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体序列如下所示：
cgatgtctatggcgtaactg；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下所示：
ggaggacactttgcgctgaa；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，具体序列如下所示：
gtgcctccgaacatacatgc。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述痘苗病毒天坛株MOI：0.05。本发明优选使用DMEM稀释痘苗病毒天坛株，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pB19R-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和B19R区同源臂序列。其中关键序列依次为B19R区同源臂左臂(GenBank:JX489139.1中178101-178725)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，RFP基因(GenBank:KT823412.1，3571-4284)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，p11和p7.5启动子(GenBank:JX489139.1中43077-43168,189237-189494)，B19R区同源臂右臂(GenBank:JX489139.1中179776-180360)。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失C10L基因和VGF基因，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒。
本发明将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15。
在本发明中，所述gRNA10、gRNA11和gRNA12的核苷酸序列针对痘苗病毒天坛株的C10L基因，所述gRNA13、gRNA14和gRNA15的核苷酸序列针对痘苗病毒天坛株的VGF基因，通过网站(http://crispr.mit.edu/，http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计得到，所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，具体序列如下所示：
gtgtataatatctagaggtag；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，具体如下所示：
gttcgactattatgttcttac；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，具体序列如下所示：
gttgtaatcatcttctgtgac；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，具体序列如下所示：
gatcagatcattcgccgatag；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，具体序列如下所示：
gtaccgtcaatatctctagcg；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，具体序列如下所示：
gttcgatagcgttaccactat。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述痘苗病毒天坛株MOI：0.05。本发明优选使用DMEM稀释痘苗病毒天坛株，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pVC-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和VGF-C10L区同源臂序列。其中关键序列依次为VGF-C10L区同源臂左臂(GenBank:JX489139.1中183792-184297)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，RFP基因(GenBank:KT823412.1，3571-4284)，LoxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，p11和p7.5启动子(GenBank:JX489139.1中43077-43168,189237-189494)，VGF-C10L区同源臂右臂(GenBank:JX489139.1中181798-182388)。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和F4L基因，得到缺失TK基因和F4L基因的重组病毒时，所述缺失TK基因和F4L基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
Ⅰ、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
Ⅱ、将所述步骤Ⅰ得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
Ⅲ、将所述步骤Ⅱ得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
Ⅳ、将所述步骤Ⅲ得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和F4L基因的重组病毒。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述的缺失TK基因的重组病毒MOI为0.05。本发明优选使用DMEM稀释所述的缺失TK基因的重组病毒，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pF4L-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和F4L区同源臂序列。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和F4L基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和F4L基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和B19R基因，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒的构建方法优选包括以下步骤：
⑴、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
⑵、将所述步骤⑴得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
⑶、将所述步骤⑵得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
⑷、将所述步骤⑶得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述的缺失TK基因的重组病毒MOI为0.05。本发明优选使用DMEM稀释所述的缺失TK基因的重组病毒，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pB19R-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和B19R区同源臂序列。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述所述的缺失TK基因的重组病毒MOI为0.05。本发明优选使用DMEM稀释所述的缺失TK基因的重组病毒，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pVC-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和VGF-C10L区同源臂序列。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失F4L基因和B19R基因，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
㈠、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
㈡、将所述步骤㈠得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
㈢、将所述步骤㈡得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
㈣、将所述步骤㈢得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选转染2h。在本发明中，所述的缺失F4L基因的重组病毒MOI为0.05。本发明优选使用DMEM稀释所述的缺失F4L基因的重组病毒，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pB19R-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和B19R区同源臂序列。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
在本发明中，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
a1、将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
b1将所述步骤a1得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求3所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c1将所述步骤b1得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d1将所述步骤c1得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
在本发明中，所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。
本发明对所述将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS中的方法没有特殊限定，采用常规将gRNA导入质粒中的方法即可。
本发明将得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将上述技术方案所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞。
本发明对所述293T细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选使用六孔板来接种293T细胞，接种量优选为每孔5×105个，所述293T细胞在孔中用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，本发明对所述无抗生素的DMEM完全培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，当所述293T细胞的融合度达到60～70％时进行转染。在本发明中，所述Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞的量优选为4μg。在本发明中，所述转染的时间优选为22～26h，更优选为24h。
本发明优选所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞，更优选感染2h。在本发明中，所述所述的缺失F4L基因的重组病毒MOI为0.05。本发明优选使用DMEM稀释所述的缺失F4L基因的重组病毒，将得到的稀释液感染293T细胞。
本发明将得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液。
在本发明中，所述pVC-RFP-LoxP质粒中优选含有p7.5启动子、p11启动子、编码红色荧光蛋白基因及两侧LoxP基因序列和VGF-C10L区同源臂序列。
在本发明中，所述感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h；所述继续培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
本发明将得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
本发明对所述Vero细胞的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述Vero细胞优选接种于六孔板中，使用无抗生素的DMEM完全培养基进行培养，所述Vero细胞每孔的接种量优选为1×106个.在本发明中，当所述Vero细胞的融合度达到80～90％时，将所述病毒悬液稀释10倍后进行感染，所述感染的时间优选为2h，感染结束后更换浓度为1.2％的甲基纤维素培养基培养3d，在红色荧光下，提取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。本发明对删除红色荧光基因的方法没有特殊限定，优选采用通过Cre-LoxP方法删除红色荧光基因。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
通过CRISPR-Cas9系统获得缺失TK区带有EGFP的重组病毒
1、方法
1.1、gRNA的设计
针对天坛株痘苗病毒TK区，通过网站(http://crispr.mit.edu/，http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)设计gRNA序列，包括gRNA1、gRNA2和gRNA3(如图1所示)。
gRNA1的序列为：GAAACCGAGATAGAAATAAT；
gRNA2的序列为：GTTATAGTAGCCGCACTCGA；
gRNA3的序列为：GTGAGCGTATGGCAAACGA。
利用引物lentidNLS-F：
AGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCC，lentidNLS-R：AGAAGTTTGTTGCGCCGGATCCCTTATCGTCATCGTCTTTGTAATCGTCGCCTCCCAGCTGAGACA扩增出缺失NLS的Cas9，同时将Lenti-V2用EcoRV酶切，然后利用无缝克隆将缺失NLS的Cas9替换lenti-V2中的Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS。然后将三条靶向TK区的gRNA序列导入Lenti-delNLS，获得带有胞质定位Cas9的gRNA质粒Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3。
1.2、gRNA-Cas9质粒中Cas9蛋白的表达及定位的检测
1.2.1、293T转染gRNA-Cas9质粒
转染前18-24h，在六孔板中接种293T细胞，每孔5×105，转染时细胞融合度为60％左右。转染前1h，将孔内的完全培养基更换为不含血清的DMEM，置37℃，5％CO2培养箱培养。取gRNA-Cas9质粒，加入400μl DMEM中，振荡混匀。另取400μl DMEM加入PEI(按照质粒质量：PEI体积＝1:1.2)振荡混匀，室温静置5min。将质粒混合液与PEI混合液混合，振荡混匀，室温放置20min。将六孔板中的DMEM吸出，加入转染混合液。并置于细胞培养箱内37℃，5％CO2培养4小时。然后将六孔板内的转染混合液吸出，加入含10％胎牛血清的完全培养基，37℃，5％CO2培养48h后收取细胞。
1.2.2、蛋白的提取
在293T(5×105)细胞中转染Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3，48h后收取细胞。3000rpm离心3min，PBS洗一次，加入100μL细胞裂解液RIPA(20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸钠，1mM EDTA，1％NP40)，离心后的上清加入上样缓冲液，进行Western Blot。
1.2.3、Western Blot检测Cas9的表达
(l)首先制备12％的分离胶(4mL 30％丙烯酰胺溶液，2.5mL Tris/HCI pH8.8，100μL 10％SDS，100μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合60min。
(2)倒干净上层水，再制备5％的积层胶(0.5mL 30％丙烯酰胺溶液，0.5mL TriS/HCI pH6.8，40μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸氨，5μL TEMED)，在积层胶上插入梳齿，室温下聚合50min。待胶完全凝聚后，小心拔下梳齿。
(3)收获的裂解液12000rpm，4℃离心10min。取60μL，加入4×上样缓冲液20μL，98℃煮10min。
(4)制备的电泳胶装进电泳槽，在内槽加满新鲜配制的电泳缓冲液(没过制胶板)，将上步处理好的样品取20μL缓缓加入积层胶梳齿孔中，再在电泳槽外槽内加入适量电泳缓冲液，进行电泳:首先是120V，电泳20分钟，观察样品被很好的压缩成一条线，蛋白预染Marker开始分离，说明样品进入分离胶，可调整电流为160V，继续电泳40分钟，观察蛋白预染Marker很好的分开，结束电泳。
(5)切掉多余胶块，按照从负极到正极分别为滤纸、胶、硝酸纤维素膜(NC膜)、滤纸的顺序叠放在转膜夹板中，放入转膜装置，加满新配的转膜液，冰上或4℃，插上电极进行转膜，80V 120min，将胶上的蛋白转移到NC膜上。
(6)转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，水平摇床上25rpm，室温孵育l h。
(7)将膜浸在含适当稀释抗体(Flag抗体1:1000稀释)的5％脱脂奶粉中，水平摇床上25rpm，4℃过夜。
(8)50rpm水平摇床上，用TBST洗膜4次，5min/次。
(9)弃掉洗液，加入1:10000稀释的Alexa
Figure BDA0002253804780000241
488goat anti-mouse二抗，水平摇床上25rpm，室温避光孵育lh。
(10)弃掉二抗，25rpm水平摇床上用TBST洗膜4次，5min/次。
(11)取出膜，利用LI-COR Odyssey仪器扫膜(结果见附图2，可见Flag-Cas9的表达)。
1.2.4、通过免疫荧光实验检测gRNA-Cas9质粒中Cas9蛋白的定位
在HeLa细胞中转染Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3，24h后PBS洗2遍，用4％的多聚甲醛固定15min，再用含0.1％Triton的多聚甲醛室温打孔10min。PBS洗4次，再用封闭液室温封闭2h。上一抗Flag，室温2h或者4℃过夜。0.1％Triton的PBS洗4次，上二抗Alexa
Figure BDA0002253804780000242
488 goat anti-mouse，避光室温1h。PBS洗1遍，DAPI染色5min，PBS洗2遍，通过激光共聚焦显微镜观察。
1.3、重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP的获得
1.3.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染上述3个gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP(主要包括p7.5启动子、p11启动子、编码绿色荧光蛋白基因及两侧LoxP序列，TK区同源臂)；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.3.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取绿色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.3.3、重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒和野生型病毒样品按DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR扩增。具体操作步骤如下：
引物设计：根据NCBI数据库中提供的Gene Bank，No.AF095689病毒株的核苷酸全序列，依据引物设计的基本原则，运用软件Primer Premier 5.0设计编码病毒蛋白基因序列的特异性引物。
表1 引物序列
Figure BDA0002253804780000251
PCR操作步骤：
(1)PCR扩增的操作步骤如下：
表2 PCR扩增的操作步骤
Figure BDA0002253804780000252
(2)按照上述表格剂量的添加到0.2mL无核酸的薄壁PCR管中(引物序列见上述引物表)。
(3)轻轻的混匀，通过短暂离心确保全部反应成分在扩增管的管底。
(4)将反应体系置入已经按照上述方法设置的PCR仪器中反应。收集PCR反应产物，-20℃保存。
PCR产物电泳：
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测病毒PCR产物：
(1)在已加有30mL 1×TAE电泳缓冲液的三角锥瓶中加入准确称量的琼脂糖粉0.3g。
(2)锥瓶放入微波炉中用中火加热至琼脂糖完全溶解后，室温下冷却至60～70℃左右，加入溴化乙锭(EB)2μL，轻轻摇晃使其充分混匀。
(3)将胶模放入胶槽中固定好，并在距底板0.5-1.0mm的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
(4)将温热的琼脂糖溶液倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。
(5)在凝胶完全凝固后(于室温放置10-25min或置于4℃冰箱5min)，小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中。
(6)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。
(7)取10μL DNA样品与2μL的6×Loading Buffer混合后，用微量移液器缓慢将混合物加入加样孔内。
(8)盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。几分钟后，溴酚蓝从加样孔中迁移到凝胶中。继续电泳直至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离。
(9)切断电流，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。取出凝胶。
(10)紫外灯下观察样品的移动情况并拍照。
2、结果
2.1gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定
将三条靶向TK区的gRNA序列(如图1所示)导入Lenti-delNLS，分别获得3个带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒。在293T(5×105)细胞中分别转染Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3各4μg，48h后裂解细胞。通过Western Blot检测，结果显示与对照N相比，在293T细胞中Flag标签的Cas9能够成功表达(如图2所示)。在HeLa(1×105)细胞中转染0.5μg Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3，通过激光共聚焦显微镜观察，显示在转染了Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2、Lenti-delNLS-gRNA3的细胞中，缺失NLS的Cas9在细胞质中表达(如图3所示)。
2.2重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP的构建及鉴定
构建的重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP主要包括P7.5、P11、H5启动子、绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein，EGFP)、LoxP位点、TK区同源臂(Left arm，Rightarm)。重组质粒及同源重组的示意图如图4所示。重组质粒经测序验证后，在293T细胞中感染VTT，然后转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒。48h后，免疫荧光观察EGFP的表达，证明pJ2R-EGFP-LoxP构建成功，且绿色荧光蛋白成功表达(如图5所示)。
2.3重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP的筛选
293T细胞中转染三个gRNA-Cas9质粒，24h后感染天坛株痘苗病毒VTT，2h后，转染重组质粒pJ2R-EGFP-LoxP，4h后，换成2％FBS的培养基。48h后，收获重组病毒悬液。在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验进行第一轮筛选。筛选结果如图6所示，能观察到有绿色荧光蛋白表达的重组病毒噬斑。计算得到的重组效率如图7所示，利用CRISPR-Cas9技术获得重组病毒的效率能达到10％以上，与传统的同源重组构建重组病毒的效率(Ball,L.A.High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.J.Virol.1987,61,1788–1795.)只有0.1％-1％相比，重组的效率大大提高。为得到重组病毒，用相同方法进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有绿色荧光蛋白表达(如图8所示)。
2.4重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP的鉴定
将重组病毒按
Figure BDA0002253804780000271
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后利用PCR扩增验证(PCR验证所用引物如图9和表1所示)，重组病毒中缺失了TK区，又插入了EGFP基因(如图10所示)，再将PCR产物测序，确证重组病毒在VTT的TK区准确插入EGFP基因。
实施例2
通过Cre-LoxP技术删除实施例1中缺失TK的重组病毒中的筛选标记EGFP
1.方法
1.1 pQCXIP-Cre质粒的构建与鉴定
用引物Cre-F(SEQ ID No.43)：
cgctgcaggaattgatccgcggccgccaccatggattacaaggatgacgacgataagagctccaatttactgac，
Cre-R(SEQ ID No.44)：gtcgtttgttcggggatccggaattccgcccctctcc扩增Cre基因，然后连入NotI、BamHI酶切的pQCXIP载体中，获得pQCXIP-Cre(SEQ ID No.49)，测序证明序列正确，所述pQCXIP-Cre的核苷酸序列包括Flag标签(SEQ ID No.45)gattacaaggatgacgacgataagagc及Cre编码序列(Gene ID:2777477)。
1.2、重组病毒VACV-ΔTK的获得
1.2.1、通过转染pQCXIP-Cre质粒删除VACV-ΔTK-EGFP-LoxP病毒中的EGFP
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染对照及pQCXIP-Cre质粒，4～6h后换成10％FBS的培养基(转染方法同实施例1)。24h后，用DMEM稀释重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP，感染细胞；2h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将1.2.1中收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒中EGFP的删除效率。挑取无色噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒VACV-ΔTK。
1.3、重组病毒VACV-ΔTK的鉴定
重组病毒基因组提取及鉴定同实验案实施例1。
2、结果
2.1、pQCXIP-Cre质粒的构建与鉴定
在293T(5×105)细胞中转染对照及pQCXIP-Cre，48h后收取细胞。3000rpm离心3min，PBS洗一次，加入100μL细胞裂解液RIPA，-20℃保存备用。然后通过Western blot检测蛋白表达，Flag-Cre蛋白成功表达(如图11所示)。
2.2、重组病毒VACV-ΔTK的纯化
在293T细胞中转染质粒pQCXIP-Cre，4～6h后换成10％FBS的培养基。24h后，用DMEM稀释重组病毒VACV-ΔTK-EGFP-LoxP，感染细胞；2h后，换成2％FBS的培养基；48h后，收获病毒悬液。在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验进行第一轮筛选，转染质粒pQCXIP-Cre获得的重组病毒出现没有绿色荧光的噬斑(结果如图12所示)。荧光显微镜下能观察到有无色噬斑与所有噬斑的比例，计算得到的删除效率约为50％，如图13所示。为得到重组病毒VACV-ΔTK，挑选没有绿色荧光的噬斑，用相同方法进行多轮筛选，最终获得没有绿色荧光的重组病毒(即痘苗病毒天坛株缺失TK基因)。
2.3重组病毒VACV-ΔTK的鉴定
利用实施例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图14所示)，重组病毒A、B、C、D中没有EGFP及TK区序列。并进行测序验证，证明获得删除TK且不含EGFP的重组病毒。
实施例3
通过CRISPR-Cas9及Cre-LoxP系统获得缺失F4L区并删除筛选标记的重组病毒
1、方法
1.1、F4L gRNA的设计
设计方法同实施例1，靶向F4L的gRNA的序列为：
gRNA4：GTGGGTGAATACCAAAAAAT
gRNA5：GTAGAAGGAATCTTCTTTTC
gRNA6：GATAGATTGATTTCTGAATT
将三条靶向F4L区的gRNA序列导入Lenti-delNLS，获得带有胞质定位Cas9的gRNA质粒Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5、Lenti-delNLS-gRNA6。
1.2、重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP的获得
重组、纯化及鉴定过程方法同实施例1，如下：
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pF4L-RFP-LoxP(包括p7.5、p11启动子、红色荧光蛋白基因及两侧LoxP序列，F4L区同源臂)；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000292
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR扩增。具体操作步骤如下：
引物设计根据NCBI数据库中提供的Gene Bank，No.AF095689病毒株的核苷酸全序列，依据引物设计的基本原则，运用软件Primer Premier 5.0设计编码病毒蛋白基因序列的特异性引物。
表3 引物序列
2、结果
2.1重组质粒pF4L-RFP-LoxP的构建及鉴定
构建的重组质粒pF4L-RFP-LoxP主要包括P7.5、P11、H5启动子、红色荧光蛋白、LoxP位点、F4L区同源臂(Left arm，Right arm)。重组质粒经测序验证后，在293T细胞中感染VTT，然后转染pF4L-RFP-LoxP质功，粒。且4红8h色后荧，光免蛋疫白荧成光功观表察达R(FP如图的表15达所，示证)明。pF4L-RFP-LoxP构建成
2.2重组病毒VACV-ΔF4L-RFP-LoxP的筛选
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图16所示)。通过PCR鉴定的方法同实例1，结果显示在缺失F4L的位置上准确插入RFP蛋白(如图17所示)。
2.3重组病毒VACV-ΔF4L的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图18所示)，进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得无荧光的重组病毒。
2.4重组病毒VACV-ΔF4L的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图19所示)，重组病毒A、B、C、D中没有RFP和F4L区。并进行测序验证，证明获得删除F4L且不含RFP的重组病毒。
实施例4
通过CRISPR-Cas9及Cre-LoxP系统获得缺失B19R区并删除筛选标记的重组病毒
1、方法
1.1、B19R gRNA的设计
设计方法同实施例1，B19R gRNA的序列为：
gRNA7：CGATGTCTATGGCGTAACTG
gRNA8：GGAGGACACTTTGCGCTGAA
gRNA9：GTGCCTCCGAACATACATGC
将三条靶向B19R的gRNA序列导入Lenti-delNLS，获得带有胞质定位Cas9的gRNA质粒Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8、Lenti-delNLS-gRNA9。
1.2、重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP的获得
重组、纯化及鉴定过程方法同实施例1，如下：
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pB19R-RFP-LoxP(包括p7.5、p11启动子、红色荧光蛋白基因及两侧LoxP序列，B19R同源臂)；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000302
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR扩增。具体操作步骤如下：
引物设计根据NCBI数据库中提供的Gene Bank，No.AF095689病毒株的核苷酸全序列，依据引物设计的基本原则，运用软件Primer Premier 5.0设计编码病毒蛋白基因序列的特异性引物。所用引物如下：
表4 引物序列
Figure BDA0002253804780000301
2、结果
2.1重组质粒pB19R-RFP-LoxP的构建及鉴定
构建的重组质粒pB19R-RFP-LoxP包括P7.5、P11、H5启动子、红色荧光蛋白、LoxP位点、B19R区同源臂(Left arm，Right arm)。重组质粒经测序验证后，在293T细胞中感染VTT，然后转染pB19R-RFP-LoxP质粒。48h后，免疫荧光观察RFP的表达，证明pB19R-RFP-LoxP构建成功，且红色荧光蛋白成功表达(如图20所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP的筛选
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图21所示)。
2.3重组病毒VACV-ΔB19R的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图22所示)，并进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.4重组病毒VACV-ΔB19R的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图23所示)，重组病毒中没有RFP及B19R序列。并进行测序验证，证明获得删除B19R且不含RFP的重组病毒。
实施例5
通过CRISPR-Cas9及Cre-LoxP系统获得缺失C10L及VGF区并删除筛选标记的重组病毒
1、方法
1.1、C10L、VGF gRNA的设计
由于C10L、VGF的编码区在基因组上的位置紧邻，设计同时缺失C10L及VGF区域，设计方法同实施例1，C10L gRNA的序列为：
gRNA10：GTGTATAATATCTAGAGGTAG
gRNA11：GTTCGACTATTATGTTCTTAC
gRNA12：GTTGTAATCATCTTCTGTGAC
VGF gRNA的序列为：
gRNA13：GATCAGATCATTCGCCGATAG
gRNA14：GTACCGTCAATATCTCTAGCG
gRNA15：GTTCGATAGCGTTACCACTAT
1.2、重组病毒VACV-ΔB19R-RFP-LoxP的获得
重组时同时转染VGF及C10L的gRNA质粒，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1，
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，同时转染VGF及C10L的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pVC-RFP-LoxP(包括p7.5、p11启动子、红色荧光蛋白基因及两侧LoxP序列，VGF-C10L同源臂)；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔVC-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000321
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR扩增。具体操作步骤如下：
引物设计：根据NCBI数据库中提供的Gene Bank，No.AF095689病毒株的核苷酸全序列，依据引物设计的基本原则，运用软件Primer Premier 5.0设计编码病毒蛋白基因序列的特异性引物。
表5 引物序列
Figure BDA0002253804780000322
2、结果
2.1重组质粒pVC-RFP-LoxP的构建及鉴定
构建的重组质粒pVC-RFP-LoxP包括P7.5、P11、H5启动子、红色荧光蛋白、LoxP位点、VGF及C10L区同源臂(Left arm，Right arm)。重组质粒经测序验证后，在293T细胞中感染VTT，然后转染pVC-RFP-LoxP质粒。48h后，免疫荧光观察RFP的表达，证明pVC-RFP-LoxP构建成功，且红色荧光蛋白成功表达(如图24所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔVC-RFP-LoxP的筛选
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图25所示)。
2.3重组病毒VACV-ΔVC的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图26所示)，并进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.4重组病毒VACV-ΔVC的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图27所示)，重组病毒中没有RFP、VGF及C10L的序列。并进行测序验证，证明获得删除VC且不含RFP的重组病毒。
实施例6
在病毒VACV-ΔTK的基础上缺失F4L区获得同时删除TK和F4L的重组病毒
1、方法
1.1、F4L gRNA的设计
设计方法及gRNA的序列同实施例3。
1.2、重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP的获得
重组时转染F4L的gRNA质粒，随后感染缺失TK的VACV-ΔTK病毒，重组质粒pF4L-RFP-LoxP同实施例3，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1。
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染F4L的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释缺失TK的VACV-ΔTK病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pF4L-RFP-LoxP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒、VACV-ΔTK和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000331
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的病毒基因组进行PCR扩增。所用引物同实施例3。
2、结果
2.1重组病毒VACV-ΔTK/F4L-RFP-LoxP的筛选纯化
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图28所示)。通过PCR鉴定的方法，结果显示在缺失F4L的位置上准确插入RFP蛋白(如图29所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔTK/F4L的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图30所示)，并进行纯化的方法同实施例2，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.3重组病毒VACV-ΔTK/F4L的鉴定
利用实施例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图31所示)，重组病毒A、B没有RFP和F4L序列。并进行测序验证，证明获得删除TK、F4L且不含RFP的重组病毒。
实施例7
在病毒VACV-ΔTK的基础上缺失B19R区获得同时删除TK和B19R的重组病毒
1、方法
1.1、B19R gRNA的设计
设计方法同实施例1，gRNA的序列同实施例4。
1.2、重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP的获得
重组时转染B19R的gRNA质粒，随后感染缺失TK的VACV-ΔTK病毒，重组质粒pB19R-RFP-LoxP同实施例3，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1。
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染B19R的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释缺失TK的VACV-ΔTK病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pB19R-RFP-LoxP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒、VACV-ΔTK和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000341
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的病毒基因组进行PCR扩增。所用引物同实施例4。
2、结果
2.1重组病毒VACV-ΔTK/B19R-RFP-LoxP的筛选纯化
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图32所示)。通过PCR鉴定的方法同实例1，结果显示在缺失B19R的位置上准确插入RFP蛋白(如图33所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔTK/B19R的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图34所示)，并进行纯化的方法同实施例2，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.3重组病毒VACV-ΔTK/B19R的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图35所示)，重组病毒中没有RFP、B19R序列。并进行测序验证，证明获得删除TK、B19R且不含RFP的重组病毒。
实施例8
在病毒VACV-ΔTK的基础上缺失C10L/VGF区获得同时删除TK和C10L及VGF的重组病毒
1、方法
1.1、C10L、VGF gRNA的设计
设计方法同实施例1，gRNA的序列同实施例5。
1.2、重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP的获得
重组时转染VGF及C10L的gRNA质粒，随后感染缺失TK的VACV-ΔTK病毒，重组质粒pVC-RFP-LoxP同实施例3，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1。
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染VGF及C10L的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释缺失TK的VACV-ΔTK病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pVC-RFP-LoxP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒、VACV-ΔTK和野生型病毒样品按DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的病毒基因组进行PCR扩增。所用引物同实施例5。
2、结果
2.1重组病毒VACV-ΔTK/VC-RFP-LoxP的筛选纯化
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图36所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔTK/VC的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图37所示)，并进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.3重组病毒VACV-ΔTK/VC的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图38所示)，重组病毒中没有RFP、VGF、C10L的序列。并进行测序验证，证明获得删除TK、VGF及C10L且不含RFP的重组病毒。
实施例9
在病毒VACV-ΔF4L的基础上缺失B19R区获得同时删除F4L和B19R的重组病毒
1、方法
1.1、B19R gRNA的设计
设计方法同实施例1，gRNA的序列同实施例4。
1.2、重组病毒VACV-ΔF4L/B19R-RFP-LoxP的获得
重组时转染B19R的gRNA质粒，随后感染缺失F4L的VACV-ΔF4L病毒，重组质粒pB19R-RFP-LoxP同实施例3，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1，所用引物同实施例4。
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染B19R的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释缺失F4L的VACV-ΔF4L病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pB19R-RFP-LoxP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔF4L/B19R-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒、VACV-ΔF4L和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000352
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的病毒基因组进行PCR扩增。所用引物同实施例4。
2、结果
2.1重组病毒VACV-ΔF4L/B19R-RFP-LoxP的筛选纯化
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图39所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔF4L/B19R的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图40所示)，并进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.3重组病毒VACV-ΔF4L/B19R的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图41所示)，重组病毒中没有RFP、B19R的序列。并进行测序验证，证明获得删除F4L、B19R且不含RFP的重组病毒。
实施例10
在病毒VACV-ΔF4L的基础上缺失C10L/VGF区获得同时删除F4L和C10L及VGF的重组病毒
1、方法
1.1、C10L、VGF gRNA的设计
设计方法同实施例1，gRNA的序列同实施例5。
1.2、重组病毒VACV-ΔF4L/VC-RFP-LoxP的获得
重组时转染VGF及C10L的gRNA质粒，随后感染缺失F4L的VACV-ΔF4L病毒，重组质粒pVC-RFP-LoxP同实施例3，其余纯化及鉴定过程方法同实施例1，所用引物同实施例5。
1.2.1、重组过程
293T细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，转染VGF及C10L的gRNA-Cas9质粒4μg。24h后，用DMEM稀释缺失F4L的VACV-ΔF4L病毒，感染细胞；2h后，转染重组质粒pVC-RFP-LoxP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，吸弃1.2mL上清，吹取细胞，冻融三次。
1.2.2、通过病毒噬斑形成实验进行纯化过程
Vero(1×106)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释重新感染Vero细胞。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1.2％的甲基纤维素培养基。三天后，免疫荧光显微镜下统计重组病毒的重组效率。挑取红色荧光噬斑重复上述方法进行多轮筛选，得到重组病毒。
1.2.3、重组病毒VACV-ΔF4L/VC-RFP-LoxP的鉴定
获得的重组病毒、VACV-ΔF4L和野生型病毒样品按
Figure BDA0002253804780000361
DNA Mini Kit说明书提取DNA，然后将DNA溶于无菌水，用Nanodrop测定DNA含量。将提取的病毒基因组进行PCR扩增。所用引物同实施例5。
2、结果
2.1重组病毒VACV-ΔF4L/VC-RFP-LoxP的筛选纯化
重组及筛选过程同实施例1，进行多轮筛选，最终获得重组病毒，荧光显微镜下观察到所有噬斑均有红色荧光蛋白表达(如图42所示)。
2.2重组病毒VACV-ΔF4L/VC的获得及纯化
通过Cre-LoxP方法删除RFP获得没有红色荧光的重组病毒(如图43所示)，并进行纯化的方法同实施例1，经多轮筛选，最终获得重组病毒。
2.3重组病毒VACV-ΔF4L/VC的鉴定
利用实验案例1方法将病毒扩大培养，提取病毒DNA，进行PCR验证(如图44所示)，重组病毒中没有RFP、VGF、C10L的序列。并进行测序验证，证明获得删除F4L、VGF及C10L且不含RFP的重组病毒。
实施例11
在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，VACV野生型及缺失TK、F4L的重组病毒的复制能力
1、方法
为了满足肿瘤细胞快速生长的需求，肿瘤细胞中常常高表达TK1和核苷酸还原酶2(RRM2)，用以维持胞内高水平的核苷酸，为细胞增殖提供原料。Vero细胞中TK1及RRM2的内源性表达极低，可以在Vero细胞中稳定表达TK1及RRM2，来模拟肿瘤细胞的代谢水平。
1.1、稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞系的建立
Vero细胞(6×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％-70％时，转染TK1及RRM2质粒。24h后加入1.0μg/ml嘌呤霉素(puromycin)进行筛选。两周后获得稳定表达TK1/RRM2的细胞系。
1.2、检测稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞系中TK1及RRM2的表达
利用Western Blot方法检测细胞系中TK1及RRM2的表达，方法同实施例1。
1.3在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，VACV野生型及同时缺失TK和F4L的重组病毒的复制能力的检测
在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，分别加入VACV野生型或同时缺失TK和F4L的重组病毒(MOI：0.1)进行感染，感染2h后换用0.1％血清的低血清培养基培养，24h、48h、72h后收集细胞，利用噬斑形成实验检测病毒的滴度，以指示病毒的复制情况。
1.4VACV野生型及同时缺失TK和F4L的重组病毒感染Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero后，细胞活力的检测
在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，分别加入VACV野生型或同时缺失TK和F4L的重组病毒进行感染，感染后72h利用MTT细胞增殖及细胞毒性检测实验检测细胞活力。具体方法如下：感染72h后，细胞每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，纪录结果。
2、结果
2.1稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞系中TK1及RRM2的表达
利用Western Blot方法检测细胞系中TK1及RRM2的表达，结果显示稳定表达TK1/RRM2的Vero细胞系中能够检测到TK1及RRM2的表达(如图45所示)。
2.2在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，VACV野生型及缺失TK/F4L的重组病毒的复制能力
在Vero细胞及过表达TK1/RRM2的Vero中，分别加入VACV野生型或缺失TK/F4L的重组病毒进行感染，检测病毒的滴度，显示在Vero细胞中缺失TK/F4L的重组病毒复制能力明显低于野生型病毒，而在模拟肿瘤细胞的过表达TK1/RRM2细胞中，缺失TK/F4L的重组病毒复制能力与野生型病毒区别不明显(如图46中的A所示)。MTT细胞增殖及细胞毒性检测实验表明，在Vero细胞中缺失TK/F4L的重组病毒感染后细胞活力与野生型病毒相比大大提高(如图46中的B所示)，表明缺失了TK/F4L的重组病毒具有更高的安全性和肿瘤选择特异性。
实施例12
在HeLa细胞及敲低TK1、RRM2的HeLa中，VACV野生型及缺失TK、F4L的重组病毒的复制能力
1、方法
HeLa细胞中TK1及RRM2的内源性表达较高，在HeLa细胞中敲低TK1、RRM2，可以来模拟正常细胞的核苷酸代谢水平。
1.1、敲低TK1/RRM2的HeLa细胞系的建立
HeLa细胞(5×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％-70％时，转染TK1或RRM2的shRNA质粒。24h后加入0.4ug/ml嘌呤霉素(puromycin)进行筛选。两周后获得敲低TK1、RRM2的细胞系。
1.2、检测敲低TK1/RRM2的HeLa细胞系中TK1及RRM2的表达
利用Western Blot方法检测细胞系中TK1及RRM2的表达，方法同实施例1。
1.3在HeLa细胞及敲低TK1、RRM2的HeLa中，VACV野生型及缺失TK、F4L的重组病毒的复制能力的检测
在HeLa细胞及敲低TK1、RRM2的HeLa中，分别加入VACV野生型或缺失TK、缺失F4L、同时缺失TK和F4L的重组病毒(MOI：0.5)进行感染，感染2h后换用0.1％血清的低血清培养基培养，48h后收集细胞，利用噬斑形成实验检测病毒的滴度，以指示病毒的复制情况。
1.4VACV野生型及缺失TK、F4L的重组病毒感染HeLa细胞及敲低TK1、RRM2的HeLa后，细胞活力的检测
在HeLa细胞及敲低TK1、RRM2的HeLa中，分别加入VACV野生型或缺失TK、缺失F4L、同时缺失TK和F4L的重组病毒进行感染，感染后48h利用MTT细胞增殖及细胞毒性检测实验检测细胞活力。具体方法如下：感染48h后，细胞每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，纪录结果。
2、结果
2.1敲低TK1/RRM2的HeLa细胞系中TK1及RRM2的表达
利用Western Blot方法检测细胞系中TK1及RRM2的表达，结果显示敲低TK1/RRM2的HeLa细胞系中能够检测到TK1及RRM2的表达明显降低(如图47所示)。
2.2在HeLa细胞及敲低TK1/RRM2的HeLa细胞系中，VACV野生型及缺失TK/F4L的重组病毒的复制能力
在HeLa细胞及敲低TK1/RRM2的HeLa中，分别加入VACV野生型或缺失TK、缺失F4L、同时缺失TK和F4L的重组病毒进行感染，检测病毒的滴度，显示在模拟正常细胞的敲低TK1/RRM2的HeLa中缺失TK/F4L的重组病毒复制能力明显低于野生型病毒，而在HeLa细胞中，缺失TK/F4L的重组病毒复制能力略有降低，但降低不显著(如图48中的A所示)。MTT细胞增殖及细胞毒性检测实验表明，在模拟正常细胞的敲低TK1/RRM2的HeLa中缺失TK/F4L的重组病毒感染后细胞活力与野生型病毒相比大大提高(如图48中的B所示)，进一步表明缺失了TK/F4L的重组病毒具有更高的安全性和肿瘤选择特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛宁逸生物科技有限公司
<120> 一种用于肿瘤治疗的重组病毒
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaaccgaga tagaaataat 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttatagtag ccgcactcga 20
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<212> DNA
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gatagattga tttctgaatt 20
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cgatgtctat ggcgtaactg 20
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gtgcctccga acatacatgc 20
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gtgtataata tctagaggta g 21
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gttcgactat tatgttctta c 21
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gttgtaatca tcttctgtga c 21
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gatcagatca ttcgccgata g 21
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gtaccgtcaa tatctctagc g 21
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ctccgtgata ggtatcgatg 20
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gtcctcctat tgaagacagt c 21
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ctcactctcg ctctcgctgt tca 23
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catcgtctag tttatcagtg tcc 23
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gtcgtttgtt cggggatccg gaattccgcc cctctcc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gattacaagg atgacgacga taagagc 27

Claims (10)

1.一种用于肿瘤治疗的重组病毒，其特征在于，痘苗病毒天坛株中缺失TK基因、F4L基因、B19R基因、C10L和VGF基因中的任一种或任意两种，得到重组病毒。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中缺失TK基因，得到缺失TK基因的重组病毒时，所述缺失TK基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
1)将gRNA1、gRNA2和gRNA3导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述gRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2)将所述步骤1)得到的Lenti-delNLS-gRNA1、Lenti-delNLS-gRNA2和Lenti-delNLS-gRNA3转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
3)将所述步骤2)得到的感染293T细胞转染pJ2R-EGFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
4)将所述步骤3)得到的病毒悬液感染Vero细胞，在绿色荧光下，挑取绿色荧光噬斑，得到带有绿色荧光基因的重组病毒，删除绿色荧光基因后，得到缺失TK基因的重组病毒。
3.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中缺失F4L基因，得到缺失F4L基因的重组病毒时，所述缺失F4L基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
a、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
b、将所述步骤a得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c、将所述步骤b得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d、将所述步骤c得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失F4L基因的重组病毒。
4.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中缺失B19R基因，得到缺失B19R基因的重组病毒时，所述缺失B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
A、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
B、将所述步骤A得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
C、将所述步骤B得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
D、将所述步骤C得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到缺失B19R基因的重组病毒。
5.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失C10L基因和VGF基因，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将痘苗病毒天坛株感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失C10L基因和VGF基因的重组病毒。
6.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和F4L基因，得到缺失TK基因和F4L基因的重组病毒时，所述缺失TK基因和F4L基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
Ⅰ、将gRNA4、gRNA5和gRNA6导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述gRNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述gRNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
Ⅱ、将所述步骤Ⅰ得到的Lenti-delNLS-gRNA4、Lenti-delNLS-gRNA5和Lenti-delNLS-gRNA6转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求2所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
Ⅲ、将所述步骤Ⅱ得到的感染293T细胞转染pF4L-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
Ⅳ、将所述步骤Ⅲ得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和F4L基因的重组病毒。
7.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因和B19R基因，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
⑴、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
⑵、将所述步骤⑴得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求2所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
⑶、将所述步骤⑵得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
⑷、将所述步骤⑶得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因和B19R基因的重组病毒。
8.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
①将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
②将所述步骤①得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求2所述的缺失TK基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
③将所述步骤②得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
④将所述步骤③得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失TK基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
9.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失F4L基因和B19R基因，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
㈠、将gRNA7、gRNA8和gRNA9导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述gRNA8的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述gRNA9的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
㈡、将所述步骤㈠得到的Lenti-delNLS-gRNA7、Lenti-delNLS-gRNA8和Lenti-delNLS-gRNA9转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求3所述的缺失F4L基因的重组病毒感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
㈢、将所述步骤㈡得到的感染293T细胞转染pB19R-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
㈣、将所述步骤㈢得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因和B19R基因的重组病毒。
10.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，当痘苗病毒天坛株中同时缺失缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒时，所述同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒的构建方法包括以下步骤：
a1、将gRNA10、gRNA11、gRNA12、gRNA13、gRNA14和gRNA15导入Lenti-delNLS，得到Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15；
所述Lenti-delNLS是将Lenti-V2中Cas9的NLS缺失，得到Lenti-delNLS；
所述gRNA10的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述gRNA11的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述gRNA12的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述gRNA13的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述gRNA14的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述gRNA15的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
b1将所述步骤a1得到的Lenti-delNLS-gRNA10、Lenti-delNLS-gRNA11、Lenti-delNLS-gRNA12、Lenti-delNLS-gRNA13、Lenti-delNLS-gRNA14和Lenti-delNLS-gRNA15转染293T细胞22～26h，得到转染293T细胞，将权利要求3感染转染293T细胞1.5～2.5h后，得到感染293T细胞；
c1将所述步骤b1得到的感染293T细胞转染pVC-RFP-LoxP质粒3.5～4.5h，继续培养45～50h，收取细胞，将所述细胞冻融，得到病毒悬液；
d1将所述步骤c1得到的病毒悬液感染Vero细胞，在红色荧光下，挑取红色荧光噬斑，得到带有红色荧光基因的重组病毒，删除红色荧光基因后，得到同时缺失F4L基因、C10L基因和VGF基因的重组病毒。
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