CN114874999A - 一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗。所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，蛋白E和M的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游；蛋白S和N的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游。将此重组病毒免疫小鼠，在小鼠血清中检测到较高的S、N特异性抗体滴度，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。本发明提供的新冠病毒疫苗对于新型冠状病毒的防控具有重要意义。

Description

一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗。
背景技术
痘苗病毒(Vaccinia virus)是一类较大的有包膜的DNA病毒，早期即被用作预防天花的疫苗。因痘苗病毒基因组较大，对外源基因的容量大，及长期的使用历史等特点，目前以载体的形式用于抵抗感染性疾病的疫苗的构建，以及治疗性肿瘤疫苗和溶瘤病毒的载体。痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)是中国自主研发的成功用于预防天花的疫苗毒株，在我国天花的消灭过程中发挥了重要的作用。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与早期流行威胁公共健康的SARS-CoV-1、MERS同属于冠状病毒科β属，SARS-CoV-2基因组为单正链RNA，基因组大小约29.7kb，与SARS-CoV-1的序列相似性达79.6％。与SARS-CoV-1相似，SARS-CoV-2与宿主细胞表面的受体血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme-2，ACE-2)结合，诱导病毒囊膜和靶细胞膜融合，并释放病毒基因组。SARS-CoV-2主要编码四个结构蛋白：刺突蛋白S，核衣壳蛋白N，膜蛋白M，包膜蛋白E。这四个结构蛋白对SARS-CoV-2病毒颗粒结构的完整性起着至关重要的作用。S蛋白介导病毒与受体的结合；N蛋白与病毒基因组RNA结合形成核衣壳，参与病毒RNA的复制和病毒颗粒的组装；M蛋白是病毒颗粒中丰度最高的结构蛋白，与其它结构蛋白结合，促进子代病毒颗粒在细胞质ERGIC区的装配和形成；E蛋白参与病毒颗粒的装配和出芽。研究发现，SARS-CoV-1的S、N、E、M四个结构蛋白在细胞中共同表达后，能够产生自装配的病毒样颗粒(VLP)，这种病毒样颗粒不含有病毒的基因组，不具备感染性，但形态学上与SARS-CoV-1真病毒十分相似。近期对SARS-CoV-2的研究发现，共同表达SARS-CoV-2的S、N、E、M四个结构蛋白，也能够产生与真病毒十分相似的病毒样颗粒。由于病毒样颗粒在形态上与真病毒的高度相似性，以病毒样颗粒为靶标设计的疫苗，其有效性可能超越针对病毒单一组分如S蛋白的疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗(新冠病毒疫苗)。
本发明在痘苗病毒天坛株的基础上建立了一种可形成新冠病毒样颗粒的新型冠状病毒疫苗，基于我国自主研发的天花疫苗株痘苗病毒天坛株，缺失TK区导入新冠的S、N蛋白编码基因序列，同时缺失F4L区导入新冠病毒E和M编码基因序列，构建能够同时表达新冠病毒S、N、E、M四种结构蛋白的重组病毒TK-SN/F4L-EM。将此重组病毒免疫小鼠，在小鼠血清中检测到较高的S、N特异性抗体滴度，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种重组痘苗病毒，所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和膜蛋白M的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游；所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游。
优选地，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述膜蛋白M的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游，所述刺突蛋白S的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述核衣壳蛋白N的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游。
进一步地，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和启动子P7.5以及膜蛋白M的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和启动子P7.5以及核衣壳蛋白N的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:2所示。
第二方面，本发明提供所述重组痘苗病毒的制备方法，所述方法包括：将新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列以同源重组的方式整合于痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上，并将新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列以同源重组的方式整合于TK基因位置上。
进一步地，以携带有痘苗病毒F4L基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列的DNA载体。
进一步地，以携带有痘苗病毒TK基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列的DNA载体。
优选地，F4L区穿梭质粒为pF4L(pF4L全序列如SEQ ID NO:3所示)，含有以下元件：①F4L基因区同源左臂和同源右臂，是痘苗病毒和穿梭质粒发生同源重组的同源序列；②痘苗病毒的启动子P7.5，用以启动其下游基因的转录；③痘苗病毒的启动子P11，用以启动其下游基因的转录。
TK区穿梭质粒为pTK(pTK全序列如SEQ ID NO:4所示)，含有以下元件：①TK基因区同源左臂和同源右臂，是痘苗病毒和穿梭质粒发生同源重组的同源序列；②痘苗病毒的启动子P7.5，用以启动其下游基因的转录；③痘苗病毒的启动子P11，用以启动其下游基因的转录。
第三方面，本发明提供一种新冠病毒疫苗，其有效成分为所述的重组痘苗病毒。
第四方面，本发明提供所述重组痘苗病毒在制备新冠病毒疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供所述重组痘苗病毒在制备用于诊断新冠病毒感染的检测试剂或试剂盒中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供一种基于痘苗病毒天坛株的新型冠状病毒疫苗，在痘苗病毒天坛株的基础上，敲除痘苗病毒天坛株TK区导入新冠的S、N蛋白编码基因序列，同时缺失F4L区导入新冠病毒E和M编码基因序列，构建能够同时表达新冠病毒S、N、E、M四种结构蛋白的重组病毒TK-SN/F4L-EM。将此重组病毒免疫小鼠，在小鼠血清中检测到较高的S、N特异性抗体滴度，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中提供的重组质粒pF4L-EM及同源重组示意图。
图2为本发明较佳实施例中提供的重组病毒鉴定所需PCR引物示意图。
图3为本发明较佳实施例中提供的对重组病毒F4L-EM的PCR鉴定图。WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒。
图4为本发明较佳实施例中提供的重组病毒F4L-EM感染细胞后E、M蛋白的表达。其中，MOCK为阴性对照。
图5为本发明较佳实施例中提供的重组质粒pTK-SN及同源重组示意图。
图6为本发明较佳实施例中提供的重组病毒鉴定所需PCR引物示意图。
图7为本发明较佳实施例中提供的对重组病毒TK-SN/F4L-EM的PCR鉴定图。WT为野生型病毒，A、B、C、D为重组病毒。
图8为本发明较佳实施例中提供的重组病毒TK-SN/F4L-EM感染细胞后S、N、E、M蛋白的表达。其中，MOCK为阴性对照。
图9为本发明较佳实施例中对缺失TK区的重组病毒的PCR鉴定图。其中，WT为野生型病毒，A、B、C为重组病毒。
图10为本发明较佳实施例中对缺失TK和F4L区的重组病毒dTF的PCR鉴定图。其中，WT为野生型病毒，A、B、C为重组病毒。
图11为本发明较佳实施例中提供的小鼠免疫后血清中S特异性抗体的检测结果。其中，dTF 1st为病毒载体dTF初次免疫组小鼠血清，dTF 2nd为病毒载体dTF二次免疫组小鼠血清，SNEM 1st为重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM初次免疫组小鼠血清，SNEM 2nd为重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM二次免疫组小鼠血清。
图12为本发明较佳实施例中提供的小鼠免疫后血清中N特异性抗体的检测结果。其中，dTF 1st为病毒载体dTF初次免疫组小鼠血清，dTF 2nd为病毒载体dTF二次免疫组小鼠血清，SNEM 1st为重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM初次免疫组小鼠血清，SNEM 2nd为重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM二次免疫组小鼠血清。
图13为本发明较佳实施例中提供的小鼠免疫后抗原特异性T细胞免疫的检测结果，其中，dTF为病毒载体dTF免疫组小鼠脾细胞，SNEM为重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM免疫组小鼠脾细胞，分别经S、N或EM的肽库刺激，检测S、N或EM特异的表达IFNγ的CD8+T细胞百分比。
图14为本发明较佳实施例中重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM小鼠免疫后血清中中和抗体的检测结果。其中，S、Alpha S、Beta S、Delta S、Omicron S分别为对新冠原始株、Alpha、Beta、Delta、Omicron假病毒的中和效果。
具体实施方式
本发明旨在提供一种基于痘苗病毒天坛株，可形成新冠病毒样颗粒的新型冠状病毒疫苗。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种新型冠状病毒疫苗，敲除痘苗病毒天坛株TK区导入新冠的S、N蛋白编码序列，同时缺失F4L区导入新冠病毒E和M编码序列，构建能够同时表达新冠病毒S、N、E、M四种结构蛋白的重组病毒TK-SN/F4L-EM。
具体地，通过转染带有新冠包膜蛋白E和膜蛋白M的编码序列及痘苗病毒F4L区同源臂的重组质粒并感染痘苗病毒天坛株，经重组及筛选过程，获得在痘苗病毒F4L区导入新冠病毒E和M的重组病毒F4L-EM。此重组病毒感染细胞后可表达新冠的E蛋白和M蛋白。在此重组病毒F4L-EM的基础上，将细胞转染带有新冠刺突蛋白S和核衣壳蛋白N及痘苗病毒TK区同源臂的重组质粒并感染此重组病毒，经重组及筛选过程，获得在TK区导入新冠病毒S和N，同时在F4L区导入新冠病毒E和M的重组病毒TK-SN/F4L-EM，重组病毒感染细胞后能同时检测到新冠病毒S、N、E、M的表达，可装配形成新冠病毒样颗粒。随后，将此重组病毒免疫小鼠，在小鼠血清中检测到较高的S、N特异性抗体滴度，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明使用的HEK293T、Vero细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱中培养，每2-3天传代一次。
实施例1表达新冠病毒E、M蛋白的重组痘苗病毒F4L-EM的构建
1、方法
1.1、重组病毒F4L-EM的获得
1.1.1、重组
六孔板中接种293T细胞(5×105)，过夜培养，细胞生长平铺60％～70％时，转染带有新冠病毒E、M编码基因序列的重组质粒pF4L-EM。4h后，感染野生型病毒；2h后，弃上清，换新鲜的完全培养基；48h后，收获细胞，并冻融三次，获得病毒悬液。
1.1.2、利用病毒噬斑形成实验进行纯化
六孔板中接种Vero(1×106)细胞并培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释加入六孔板中进行感染。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1％的低熔点琼脂培养基。三天后，挑取噬斑利用E或M特异引物进行PCR鉴定，获得阳性噬斑后重复上述方法进行多轮筛选，直至得到纯重组病毒。PCR所用引物见表1：
表1
Figure BDA0003610420920000051
1.2、重组病毒的鉴定
获得的纯的重组病毒和野生型病毒利用
Figure BDA0003610420920000052
DNA Mini Kit提取病毒DNA。将提取的病毒DNA进行PCR扩增和鉴定。PCR所用引物见表1。同时，将PCR产物进行测序，确证重组病毒在F4L区准确插入E、M的编码基因序列。然后，将获得的重组病毒感染Vero细胞，24h后裂解细胞，通过Western Blot检测新冠病毒E、M蛋白的表达。
2、结果
2.1重组质粒pF4L-EM的构建
将SARS-CoV-2的E、M编码序列进行密码子优化后，通过分子克隆方法连入带有痘苗病毒F4L区同源臂(F3L、F5L)的重组载体pF4L(SEQ ID NO:3)中，获得重组质粒pF4L-EM。构建的重组质粒pF4L-EM主要包括痘苗病毒P7.5、P11启动子、E、M、F4L区同源臂(F3L、F5L)。同源重组示意图如图1所示。
2.2重组病毒F4L-EM的筛选、纯化及鉴定
293T细胞中转染重组质粒pF4L-EM，4h后感染天坛株痘苗病毒，2h后，换成新鲜的完全培养基。48h后，收获细胞冻融三次，得到重组病毒悬液。在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验对阳性噬斑进行筛选及PCR鉴定。挑取单个噬斑利用针对E或M的特异引物进行PCR鉴定，重复几轮筛选以获得纯的重组病毒。获得的纯化后重组病毒利用
Figure BDA0003610420920000062
DNA MiniKit提取DNA，然后进行PCR验证(图2、图3)，显示重组病毒中在F4L区插入了E和M的编码基因，同时将PCR产物测序，确证重组病毒序列的正确。确证重组病毒序列正确后，将重组病毒感染Vero细胞24h，收集细胞通过Western Blot检测，新冠病毒E和M蛋白能够成功表达(图4)。
实施例2同时表达新冠病毒S、N、E、M蛋白的重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM的构建
1、方法
1.1、重组病毒TK-SN/F4L-EM的获得
1.1.1、重组
六孔板中接种293T细胞(5×105)，过夜培养，细胞生长平铺60％～70％时，转染带有新冠病毒S、N编码序列的重组质粒pTK-SN。4h后，感染上述表达E、M的重组病毒F4L-EM；2h后，弃上清，换新鲜的完全培养基；48h后，收获细胞，并冻融三次，获得病毒悬液。
1.1.2、利用病毒噬斑形成实验进行纯化
六孔板中接种Vero(1×106)细胞并培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释加入六孔板中进行感染。2h后，PBS洗一遍，换成终浓度为1％的低熔点琼脂培养基。三天后，挑取噬斑利用S或N特异引物进行PCR鉴定，获得阳性噬斑后重复上述方法进行多轮筛选，直至得到纯重组病毒。PCR所用引物见表2：
表2
Figure BDA0003610420920000061
Figure BDA0003610420920000071
1.2、重组病毒的鉴定
获得的纯的重组病毒利用
Figure BDA0003610420920000072
DNA Mini Kit提取病毒DNA。将提取的病毒DNA进行PCR扩增和鉴定。PCR所用引物见表2。同时，将PCR产物进行测序，确证重组病毒在TK区插入S、N，同时在F4L区准确插入E、M的编码序列。然后，将获得的重组病毒感染Vero细胞，24h后裂解细胞，通过Western Blot检测新冠病毒S、N、E、M蛋白的表达。
2、结果
2.1重组质粒pTK-SN的构建
将SARS-CoV-2的S、N编码基因序列进行密码子优化后，通过分子克隆方法连入带有痘苗病毒TK区同源臂(J1R、J3R)的重组载体pTK(SEQ ID NO:4)中，获得重组质粒pTK-SN(SEQ ID NO:5)。构建的重组质粒pTK-SN主要包括痘苗病毒P7.5、P11启动子、TK区同源臂(J1R、J3R)、SARS-CoV-2的S、N编码序列。同源重组示意图如图5所示。
2.2重组病毒TK-SN/F4L-EM的筛选、纯化及鉴定
293T细胞中转染重组质粒pTK-SN，4h后感染天坛株痘苗病毒，2h后，换成新鲜的完全培养基。48h后，收获细胞冻融三次，得到重组病毒悬液。在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验对阳性噬斑进行筛选及PCR鉴定。挑取单个噬斑利用针对S或N的特异引物进行PCR鉴定，重复几轮筛选以获得纯的重组病毒。获得的纯化后重组病毒利用
Figure BDA0003610420920000073
DNA MiniKit提取DNA，然后进行PCR验证(图6、图7)，显示重组病毒中在TK区插入S、N，同时在F4L区插入了E和M的编码基因，并且将PCR产物测序，确证重组病毒序列的正确。确证重组病毒序列正确后，将重组病毒感染Vero细胞24h，收集细胞通过Western Blot检测，新冠病毒S、N、E和M蛋白能够同时表达(图8)。
实施例3缺失TK和F4L的痘苗病毒的构建
1、方法
1.1、缺失TK的痘苗病毒的构建
293T细胞中转染带有痘苗病毒TK区同源臂(J1R、J3R)的重组载体pTK(SEQ ID NO:4)，4h后感染野生型病毒；2h后，更换新鲜的完全培养基；48h后，收获细胞，并冻融三次，获得病毒悬液。利用病毒噬斑形成实验进行多轮筛选纯化，获得的纯的重组病毒后进行PCR扩增和鉴定。具体方法同实施例1和2。
1.2、缺失TK和F4L的痘苗病毒的构建
293T细胞中转染带有痘苗病毒F4L区同源臂(F3L、F5L)的重组载体pF4L(SEQ IDNO:3)，4h后感染上述缺失TK的病毒；2h后，更换新鲜的完全培养基；48h后，收获细胞，并冻融三次，获得病毒悬液。利用病毒噬斑形成实验进行多轮筛选纯化，获得的纯的重组病毒后进行PCR扩增和鉴定。具体方法同实施例1和2。
2、结果
2.1缺失TK的痘苗病毒的构建
经重组、纯化和鉴定，构建的缺失TK的痘苗病毒，TK区序列缺失(图9)。
2.2缺失TK和F4L的痘苗病毒的构建
经重组、纯化和鉴定，在缺失TK的基础上构建缺失F4L的痘苗病毒，F4L区序列缺失(图10)。
实施例4表达新冠病毒S、N、E和M蛋白的重组痘苗病毒TK-S的小鼠免疫实验
1、方法
1.1小鼠免疫方案
6周的BalB/C小鼠分为2组，每组5只，第一组为病毒载体对照，缺失TK和F4L的痘苗病毒dTF免疫；第二组为重组疫苗组，缺失TK插入S、N，缺失F4L区插入了E和M的重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM免疫。在第0天时经皮下免疫，病毒载体对照组免疫100μl(5×106PFU/ml)dTF，重组疫苗组免疫100μl(5×106PFU/ml)TK-SN/F4L-EM。第3周采取相同剂量、相同途径加强一次，每次免疫后第12天取血进行抗体检测。收获的小鼠血清56℃灭活30min，并保存于-80℃冰箱。
1.2小鼠血清中S或N抗体的检测
小鼠血清中S特异性抗体的检测使用义翘神州SARS-CoV-2(2019-nCoV)SpikeS1抗体滴度检测试剂盒(小鼠)。检测所需酶标条(包被有新型冠状病毒S1蛋白)先用300μL 1×洗涤缓冲液洗板5次，然后加入待检测的梯度稀释的小鼠血清，室温孵育2小时后用1×洗涤缓冲液洗板5次。然后加入抗小鼠IgG的抗体-HRP(1:100)，室温孵育1小时。洗板5次后，将配制的底物(底物A和底物B按1:1等体积混合)加入酶标板中，避光孵育20分钟。最后加入50μL/孔终止液，在20分钟内读取OD450nm的光吸收值。小鼠血清中N特异性抗体的检测使用义翘神州SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid/N抗体滴度检测试剂盒(小鼠)检测，具体方法同上。
1.3小鼠细胞免疫反应的检测
免疫后小鼠取脾脏，研磨后利用红细胞裂解液分离制备脾单核细胞悬液，随后利用联科生物小鼠Th1/Th2染色试剂盒说明书略微修改进行检测。具体方法如下：将1×106细胞悬液加至96孔板中，加入S肽库、N肽库、E和M肽库(金斯瑞公司)分别刺激1h，然后加入阻断细胞因子分泌的BrefeldinA(BFA,布雷非德菌素A)和Monensin(莫能霉素)继续培养5h。将上述细胞悬液转移至流式管中，加入anti-MouseCD3ε-FITC和anti-mouse CD8a-PE/Cyanine7混匀，室温避光孵育15分钟。每管加入FIX&PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15分钟，用1X洗涤液洗涤后加入FIX&PERM Medium B和anti-Mouse IFN-γ-PE，室温避光孵育15分钟。用1X洗涤液洗涤后加入500μl 2％多聚甲醛重悬，利用流式细胞仪检测。
1.4小鼠血清中中和抗体的检测
将表达新冠病毒原始株Wuhan-Hu-1(毒株Wuhan-Hu-1在GenBank中的登录号为MN908947)、Alpha、Beta、Delta或Omicron的S蛋白的质粒与慢病毒包装质粒表达Gag-Pol的psPAX2、带有萤火虫荧光素酶(luciferase)的plenti-GFP共同转染293T细胞，48h后收取上清获得表达S蛋白的新冠病毒原始株、Alpha、Beta、Delta、Omicron假病毒。然后通过将新冠假病毒感染HeLa-ACE2细胞(转染了ACE2受体的HeLa细胞)，检测萤火虫荧光素酶的表达来指示病毒感染的情况。
2、结果
2.1小鼠血清中S特异性抗体的检测
小鼠血清进行4倍梯度稀释后，利用SARS-CoV-2(2019-nCoV)SpikeS1抗体滴度检测试剂盒检测血清中的S特异性抗体，结果显示病毒载体对照血清(dTF)中未检出S抗体，而重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM(SNEM)免疫的小鼠血清中能够检出S特异性抗体，而且加强免疫(SNEM 2nd)后S抗体的水平高于初次免疫(SNEM 1st)(图11)。利用SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid/N抗体滴度检测试剂盒检测血清中的N特异性抗体，结果显示病毒载体对照血清(dTF)中未检出，而重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM(SNEM)免疫的小鼠血清中能够检出N特异性抗体(图12)。
2.2小鼠细胞免疫反应的检测
流式细胞分析结果显示，与对照dTF相比，TK-SN/F4L-EM(SNEM)免疫后经S、N或EM的肽库刺激，能检出S、N或EM特异的CD8+T细胞表达IFNγ(图13)，表明TK-SN/F4L-EM免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
综上，本发明提供一种基于痘苗病毒天坛株的新型冠状病毒疫苗。将此疫苗株免疫小鼠后，在小鼠血清中能检测到高水平的S和N抗体，免疫后可诱导抗原特异的T细胞免疫反应。
2.3小鼠血清中中和抗体的检测
新冠病毒原始株、Alpha、Beta、Delta、Omicron假病毒的中和试验结果显示，重组痘苗病毒TK-SN/F4L-EM(SNEM)免疫的小鼠血清对新冠原始株、Alpha、Beta、Delta、Omicron假病毒均具有中和活性(图14)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院病原生物学研究所 中国医学科学院医学实验动物研究所
<120> 一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗
<130> KHP221112554.3
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1293
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttactggacc aagagcgcga tgttgtcgga ggagctgcta tggtcagtgt tcaatttgta 60
gtttccaatc ctgtatctgg agtaagcggc gaagccggag tctccggcta ctctttgtga 120
tgcacccagc ttgtaatatg agagagtcct agacgtagca acagttatct ctttgggaag 180
gtctttaatg tcgcagcggc ccaagtgatg gcccgcgatc ctgagatgtc ccctcagtat 240
caccgcaccg atcacgagct cgctctcgag cagtgggcgc gtcaagatgg taccgtgcaa 300
gggcacgttc agcaggatgt tggtttcagg gttgaaagac cacatgctcc ttgttctggc 360
aaaaagtctg aaagacgcga tgaagtagga cagccacatg agtcctacca gacaagccat 420
tgcgattgcg atacctccgg taatccaatt tattctgtat acggcggcca gcacgaagca 480
tgcgagcgta accggccaaa gcagccagag gaagatgagc ttgataatgt acaggaacct 540
gttcctgttg gcgtaagcga attgcaggag acaaatccaa gtcaggaaaa gaaaaccgat 600
aacgaggttc cactgttcga ggagcttctt cagttcctcc acagtaattg ttccatttga 660
atcagccatg gtggcgaatt catttatagc atagaaaaaa acaaaatgaa attctactat 720
atttttacat acatatattc taaatatgaa agtggtgatt gtgactagcg tagcatcgct 780
tctagacatc tatatactat atagtaatac caatactcaa gactacgaaa ctgatacaat 840
ctcttatcat gtgggtaatg ttctcgatgt cgatagccat atgcccggta gttgcgatat 900
acataaactg atcactaatt ccaaacccac ccgcttttta tagtaagttt ttcacccata 960
aataataaat acaataatta atttctcgta aaagtagaaa atatattcta atttattgca 1020
cggtaaggaa gtagaatcat aaagaacagt gacggatccg ccaccatgta ctcatttgtc 1080
agcgaggaaa caggcactct tatcgtgaac agtgtactgc tgtttctggc atttgttgtt 1140
ttcctgctcg tgacactggc tatcttgacc gcactcaggc tctgtgctta ctgctgcaat 1200
atcgtaaacg taagcctggt caaaccctcc ttctatgtct actccagagt caagaatttg 1260
aactcctcaa gagtacctga cttgcttgtt taa 1293
<210> 2
<211> 5484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaggcctgg gtgctatcag ctgatgacat agactgctgg agttgcttgc taaaatcgtc 60
gagatcagcg gcaggcagca atgtaaccgt ttgttgcttc ttctgcctct gaggcaaggc 120
ctgggtctca tcagccttct tcttcttgtc ctttttaggt tcagtgggtg ggaaagtctt 180
ataggcgtcg atgtgcttgt taagcaagat aacctggtcc ttgaagtttg ggtccttatc 240
atccagcttg atggcgccgg tgtatgtcaa ccaagtacca gaaggggtca cttccatacc 300
aatgcggctc atgccgaaaa atgcggacgc ggagggtgcg aactgtgcga tctggggcca 360
gtgtttgtaa tcagtaccct gcctaatgag ctcttggtca ccgaagttac cttgggtctg 420
ttcaggtccc ctgcggccga atgcctgtgt cacattgtat gccttagttg cggttctttt 480
ctggcgcggc ttcttactcg cctcagctgc actcttcttc gtcacagttt ggccctgttg 540
ttgctgaccc tttccggaca tctttgattc cagctgatta aggcggtcca gcagcagcag 600
ggcgagggca gcgtctccgc cgttaccggc cattctggca ggtgaagtac ctctactgga 660
acctggggtg ctgttcctac tggaattcct tgacctagag gaggatcttg aggaggcctg 720
gctgccgccc ctactaccct cagcgtagaa tcccttgggg agggttgttc cttgaggcaa 780
ctgcagtacg atggcagcat tgttagcggg gtttcttgtg ccaatatggt ccttgggggt 840
gttcagagct ccttccgtcg ccacccagat aataccatct ttgttggcac cgtatggcaa 900
gccagcctcg gggccagttc ccaggtagta gaagtaccac ctcggggaca gatccttcat 960
ttttccgtca ccgccgcgga tgcggcgcgt tgctctccta tagtagccga tctggtcatc 1020
gggggaggag tttgtattaa ttggcacgcc ctgacctctg gggaacttca agtcctcttt 1080
tccgtgctgg gtcagtgctg taaaccaaga ggctgtgtta ttaggcaagc cctggggtct 1140
tctctgcttg gacctagcac cggacctctc accgttttgg ttgctaccag tgctatcact 1200
agggccgcca aatgtaatcc tgggagcatt cctttggttt tgtggtccat tgtctgacat 1260
ggtggcctcg aggaattcat ttatagcata gaaaaaaaca aaatgaaatt ctactatatt 1320
tttacataca tatattctaa atatgaaagt ggtgattgtg actagcgtag catcgcttct 1380
agacatctat atactatata gtaataccaa tactcaagac tacgaaactg atacaatctc 1440
ttatcatgtg ggtaatgttc tcgatgtcga tagccatatg cccggtagtt gcgatataca 1500
taaactgatc actaattcca aacccacccg ctttttatag taagtttttc acccataaat 1560
aataaataca ataattaatt tctcgtaaaa gtagaaaata tattctaatt tattgcacgg 1620
taaggaagta gaatcataaa gaacagtgac ggatccgcca ccatgttcgt tttccttgtt 1680
ctgttgcctc tcgttagtag ccaatgcgtc aaccttacta ctagaaccca gctccctcca 1740
gcatatacca actctttcac caggggcgta tattacccgg acaaagtgtt ccgctcaagt 1800
gtgctgcatt ctacgcagga ccttttcttg ccctttttca gtaatgttac ttggtttcat 1860
gctatccatg tgtctggaac taacggaacc aagcgctttg acaaccccgt cctccctttc 1920
aacgatggcg tgtacttcgc ttccacggaa aagtcaaaca taattcgcgg ctggatcttt 1980
ggtacaacac tcgactcaaa gacgcagagc ctgctgatcg ttaataacgc tacaaatgtt 2040
gtgataaagg tgtgtgaatt tcagttctgc aatgatccct tcctgggtgt gtactaccat 2100
aagaataaca agagctggat ggaatccgaa tttagggttt acagttccgc taacaactgc 2160
acattcgaat acgtaagcca gccatttctt atggatcttg agggcaagca aggaaacttc 2220
aagaacttga gggagttcgt gttcaaaaat atcgacggct attttaagat atatagcaag 2280
cacactccaa taaacttggt gcgcgacctg ccccagggat tctctgctct ggagcccctg 2340
gtggatctgc ccattggaat aaacataact cgctttcaaa cactgctcgc cctgcatcgc 2400
agttacctca cccctggtga tagtagttca ggatggacag caggagccgc cgcatactac 2460
gtcggctacc tgcagcctag gaccttcttg ctgaagtaca acgagaacgg tacaataact 2520
gacgctgtgg actgcgctct ggaccctctg tccgagacga agtgcaccct gaagagcttt 2580
actgttgaaa aaggcattta ccaaaccagc aacttccgcg tccagccaac cgagagcatc 2640
gtcagatttc ccaacattac aaatctgtgt cccttcggcg aggtgttcaa cgccacacgc 2700
ttcgcttcag tgtacgcatg gaaccgcaag cgcatatcta actgcgtcgc ggattattct 2760
gtcctctaca actccgcctc tttctccacc ttcaagtgct acggagtgtc accgactaag 2820
ctgaacgatc tctgctttac caacgtctac gcggactcct tcgtgataag aggtgatgaa 2880
gtgagacaaa tagccccagg tcagactggt aagatcgcag attacaacta caaattgcct 2940
gatgatttca ctggttgcgt tatcgcgtgg aactctaata acctcgattc taaggtcggt 3000
ggtaactaca attacctgta ccgcttgttt aggaagtcaa acctgaagcc tttcgagagg 3060
gatatttcaa ccgaaatcta tcaagcgggt tcaacaccgt gtaacggtgt ggaaggattt 3120
aactgctact tccccctgca gtcttacgga ttccagccaa ccaatggcgt gggttaccaa 3180
ccttatcgcg tggtggttct gagtttcgaa ctgttgcacg ctcccgccac ggtatgcggt 3240
cccaagaaga gcactaactt ggtgaagaat aagtgcgtga atttcaattt caatggcctc 3300
actggaactg gagtgctgac cgaatccaat aagaagttct tgcccttcca gcagttcgga 3360
agagacattg ctgacacaac cgacgcggtg cgcgatcctc agactctgga gatattggac 3420
attacaccat gttctttcgg cggtgtgtct gtcattactc cgggcacgaa tactagcaac 3480
caggtagccg tgctgtacca agacgtgaat tgcacagagg ttcccgtcgc aattcacgct 3540
gaccagctga cccccacgtg gagggtttac agcactggta gtaacgtctt ccagacgaga 3600
gccggttgct tgatcggagc ggaacatgtg aataactcct acgagtgcga catccccatc 3660
ggagccggta tatgcgcctc ttatcagaca caaactaact cacccaggag agcccgcagt 3720
gtggcttctc aaagcattat agcatacact atgtctcttg gtgccgaaaa ttccgtggcc 3780
tattctaaca attcaatcgc catcccaacc aacttcacaa ttagcgtgac taccgaaata 3840
ctgcctgtga gcatgacgaa aaccagcgta gactgcacta tgtatatctg tggagactcc 3900
actgagtgct ccaaccttct cctgcagtac ggtagcttct gtacccaatt gaaccgcgcc 3960
cttacaggca tcgctgttga gcaagataag aatacccagg aagtttttgc ccaggttaag 4020
cagatataca aaacaccgcc cattaaggac ttcggaggct tcaacttctc tcagatactg 4080
cctgacccct ccaagccatc aaaacgcagc ttcattgagg acctcttgtt caacaaagtg 4140
actctggctg atgctggctt cattaagcag tacggagatt gcctgggaga tattgctgcc 4200
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gtgctgcatt ctacgcagga ccttttcttg ccctttttca gtaatgttac ttggtttcat 3240
gctatccatg tgtctggaac taacggaacc aagcgctttg acaaccccgt cctccctttc 3300
aacgatggcg tgtacttcgc ttccacggaa aagtcaaaca taattcgcgg ctggatcttt 3360
ggtacaacac tcgactcaaa gacgcagagc ctgctgatcg ttaataacgc tacaaatgtt 3420
gtgataaagg tgtgtgaatt tcagttctgc aatgatccct tcctgggtgt gtactaccat 3480
aagaataaca agagctggat ggaatccgaa tttagggttt acagttccgc taacaactgc 3540
acattcgaat acgtaagcca gccatttctt atggatcttg agggcaagca aggaaacttc 3600
aagaacttga gggagttcgt gttcaaaaat atcgacggct attttaagat atatagcaag 3660
cacactccaa taaacttggt gcgcgacctg ccccagggat tctctgctct ggagcccctg 3720
gtggatctgc ccattggaat aaacataact cgctttcaaa cactgctcgc cctgcatcgc 3780
agttacctca cccctggtga tagtagttca ggatggacag caggagccgc cgcatactac 3840
gtcggctacc tgcagcctag gaccttcttg ctgaagtaca acgagaacgg tacaataact 3900
gacgctgtgg actgcgctct ggaccctctg tccgagacga agtgcaccct gaagagcttt 3960
actgttgaaa aaggcattta ccaaaccagc aacttccgcg tccagccaac cgagagcatc 4020
gtcagatttc ccaacattac aaatctgtgt cccttcggcg aggtgttcaa cgccacacgc 4080
ttcgcttcag tgtacgcatg gaaccgcaag cgcatatcta actgcgtcgc ggattattct 4140
gtcctctaca actccgcctc tttctccacc ttcaagtgct acggagtgtc accgactaag 4200
ctgaacgatc tctgctttac caacgtctac gcggactcct tcgtgataag aggtgatgaa 4260
gtgagacaaa tagccccagg tcagactggt aagatcgcag attacaacta caaattgcct 4320
gatgatttca ctggttgcgt tatcgcgtgg aactctaata acctcgattc taaggtcggt 4380
ggtaactaca attacctgta ccgcttgttt aggaagtcaa acctgaagcc tttcgagagg 4440
gatatttcaa ccgaaatcta tcaagcgggt tcaacaccgt gtaacggtgt ggaaggattt 4500
aactgctact tccccctgca gtcttacgga ttccagccaa ccaatggcgt gggttaccaa 4560
ccttatcgcg tggtggttct gagtttcgaa ctgttgcacg ctcccgccac ggtatgcggt 4620
cccaagaaga gcactaactt ggtgaagaat aagtgcgtga atttcaattt caatggcctc 4680
actggaactg gagtgctgac cgaatccaat aagaagttct tgcccttcca gcagttcgga 4740
agagacattg ctgacacaac cgacgcggtg cgcgatcctc agactctgga gatattggac 4800
attacaccat gttctttcgg cggtgtgtct gtcattactc cgggcacgaa tactagcaac 4860
caggtagccg tgctgtacca agacgtgaat tgcacagagg ttcccgtcgc aattcacgct 4920
gaccagctga cccccacgtg gagggtttac agcactggta gtaacgtctt ccagacgaga 4980
gccggttgct tgatcggagc ggaacatgtg aataactcct acgagtgcga catccccatc 5040
ggagccggta tatgcgcctc ttatcagaca caaactaact cacccaggag agcccgcagt 5100
gtggcttctc aaagcattat agcatacact atgtctcttg gtgccgaaaa ttccgtggcc 5160
tattctaaca attcaatcgc catcccaacc aacttcacaa ttagcgtgac taccgaaata 5220
ctgcctgtga gcatgacgaa aaccagcgta gactgcacta tgtatatctg tggagactcc 5280
actgagtgct ccaaccttct cctgcagtac ggtagcttct gtacccaatt gaaccgcgcc 5340
cttacaggca tcgctgttga gcaagataag aatacccagg aagtttttgc ccaggttaag 5400
cagatataca aaacaccgcc cattaaggac ttcggaggct tcaacttctc tcagatactg 5460
cctgacccct ccaagccatc aaaacgcagc ttcattgagg acctcttgtt caacaaagtg 5520
actctggctg atgctggctt cattaagcag tacggagatt gcctgggaga tattgctgcc 5580
agggacctca tctgcgccca gaagtttaat ggcctgacag tcttgccccc acttctgaca 5640
gacgagatga ttgctcagta cacatctgcc ctcctcgctg gcaccataac atccggatgg 5700
acatttggtg ctggtgctgc cctccagatt cccttcgcaa tgcagatggc gtatcgcttt 5760
aacggcatcg gtgtcacaca aaacgtgttg tatgagaacc aaaagctcat cgctaaccag 5820
tttaattctg ctattggtaa gattcaggac agcctgtcat caaccgcgtc tgcccttggt 5880
aagttgcagg acgtggtgaa ccagaatgct caggctttga atactctggt gaagcaactc 5940
tcttcaaatt tcggcgctat ctcttctgtg ttgaacgaca tcctgagtcg ccttgataag 6000
gtggaagctg aagttcaaat tgatagattg attactggca ggctccagtc tttgcagacc 6060
tacgttacac agcagctgat tagggcggct gaaattagag cttccgccaa tctggctgca 6120
accaagatgt ccgaatgcgt cctgggtcag tcaaagcgcg ttgacttttg tggtaaaggc 6180
taccacctca tgtcatttcc ccagtcagca cctcacggag tagtgttcct ccacgtcacc 6240
tacgttccag cacaggaaaa gaattttacc actgcgccgg caatctgtca cgacggtaag 6300
gcacacttcc cccgcgaggg cgtattcgtg tctaacggaa ctcattggtt cgtcacacag 6360
agaaacttct atgagcctca gatcattacc accgacaata catttgtgtc cggtaactgc 6420
gacgttgtga ttggaatcgt caacaacact gtgtacgatc cacttcagcc agaactggat 6480
agcttcaagg aagaattgga caaatatttc aaaaatcaca cttcacccga tgtggacctg 6540
ggtgacatta gtggtatcaa tgcgtccgtg gtcaatattc aaaaagagat tgacaggctc 6600
aacgaagtgg ccaagaacct gaacgaaagt cttatcgatc tgcaagaatt gggaaagtat 6660
gagcagtaca tcaagtggcc gtggtacatt tggttgggtt ttatcgccgg tctgatcgcc 6720
atcgttatgg ttaccattat gctttgctgc atgacgagct gttgctcctg tctgaaggga 6780
tgctgctctt gcggatcatg ttgcaagttc gatgaagacg atagcgaacc agttctgaag 6840
ggcgtcaagc tgcattacac ataagcggcc gcgtcgacgt agaaagtgtt acatcgactc 6900
ataatattat attttttatc taaaaaacta aaaataaaca ttgattaaat tttaatataa 6960
tacttaaaaa tggatgttgt gtcgttagat aaaccgttta tgtattttga ggaaattgat 7020
aatgagttag attacgaacc agaaagtgca aatgaggtcg caaaaaaact gccgtatcaa 7080
ggacagttaa aactattact aggagaatta ttttttctta gtaagttaca gcgacacggt 7140
atattagatg gtgccaccgt agtgtatata ggatctgctc ctggtacaca tatacgttat 7200
ttgagagatc atttctataa tttaggagtg atcatcaaat ggatgctaat tgacggccgc 7260
catcatgatc ctattttaaa tggattgcgt gatgtgactc tagtgactcg gttcgttgat 7320
gaggaatatc tacgatccat caaaaaacaa ctgcatcctt ctaagattat tttaatttct 7380
gatgtgagat ccaaacgagg aggaaatgaa cctagtacgg cggatttact aagtaattac 7440
gctctacaaa atgtcatgat tagtatttta aaccccgtgg catctagtct taaatggaga 7500
tgcccgtttc cagatcaatg gatcaaggac ttttatatcc cacacggtaa taaaatgtta 7560
caaccttttg ctccttcata ttcagctgaa atgagattat taagtattta taccggtgag 7620
aacatgagac tgactcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg 7680
tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc 7740
gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc 7800
gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc 7860
ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg 7920
gcggccgacg cgctgggcta cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc 7980
cccattatga ttcttctcgc ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg 8040
tccaggcagg tagatgacga ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc 8100
agcctaactt cgatcattgg accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc 8160
acatggaacg ggttggcatg gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg 8220
ttgcgtcgcg gtgcatggag ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg 8280
ctaacggatt caccactcca agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg 8340
cgcaaaccaa cccttggcag aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc 8400
ggcgcatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt 8460
tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac 8520
gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa 8580
tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ctcttccgct 8640
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 8700
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 8760
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 8820
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 8880
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 8940
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 9000
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 9060
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 9120
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 9180
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 9240
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 9300
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccc gctggtagcg gtggtttttt 9360
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 9420
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 9480
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 9540
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 9600
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 9660
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 9720
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 9780
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 9840
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt 9900
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 9960
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 10020
tgtcagaa 10028

Claims (9)

1.重组痘苗病毒，其特征在于，所述重组痘苗病毒是在痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上整合新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列，并在TK基因位置上整合新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列构建得到的；其中，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和膜蛋白M的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游；所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列以5’端相对的方式连接，并分别连接在不同的启动子下游。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述膜蛋白M的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游，所述刺突蛋白S的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P7.5的下游，所述核衣壳蛋白N的编码基因序列位于痘苗病毒启动子P11的下游。
3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒包膜蛋白E的编码基因序列和启动子P7.5以及膜蛋白M的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其特征在于，所述新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和启动子P7.5以及核衣壳蛋白N的编码基因序列和启动子P11以串联方式连接，所述串联后的序列如SEQ ID NO:2所示。
5.权利要求1-4任一项所述重组痘苗病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列以同源重组的方式整合于痘苗病毒天坛株基因组中F4L基因位置上，并将新冠病毒刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的编码基因序列以同源重组的方式整合于TK基因位置上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以携带有痘苗病毒F4L基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒包膜蛋白E和膜蛋白M的编码基因序列的DNA载体；和/或
以携带有痘苗病毒TK基因同源左臂和同源右臂的穿梭质粒作为新冠病毒刺突蛋白S的编码基因序列和核衣壳蛋白N的编码基因序列的DNA载体。
7.一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗，其特征在于，有效成分为权利要求1-4任一项所述的重组痘苗病毒。
8.权利要求1-4任一项所述重组痘苗病毒在制备新冠病毒疫苗中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述重组痘苗病毒在制备用于诊断新冠病毒感染的检测试剂或试剂盒中的应用。
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