CN116710108A - 用于同时调节诸基因表达的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组多核酸构建体的组合物，所述构建体包含至少一个编码能够与靶mRNA结合的siRNA的核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列。本文还公开该组合物在治疗癌症和在同时调节两个或更多个基因表达方面的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月5日提交的美国临时申请号63/087,643和2021年6月23日提交的美国临时申请号63/213,841的权益，所述文献各自通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。2021年9月30日创建的所述ASCII副本命名为57623_707_601_SL.txt并且大小为295,347比特。
背景技术
人类许多异常状况由基因表达水平相对于没有人类这类异常状况的受试者中那些蛋白质表达水平的变动引起或与之相关。这在癌症的情况下尤其如此。例如，癌细胞已知得益于涉及细胞增殖或血管生成的蛋白质表达渐增及涉及肿瘤免疫应答的蛋白质表达减少。因此，需要减少一种或多种涉及细胞增殖或血管生成的靶基因产物产生并且同时增加其他靶基因产物(如涉及肿瘤免疫应答的蛋白质)产生的疗法，其中需要所述肿瘤免疫应答以防止或治疗受试者中癌症发生。
发明简述
本文提供用于使用一个重组多核酸构建体或RNA构建体同时调节两个或更多个蛋白质序列或核酸序列表达的组合物和方法。在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子并且其中第二RNA编码了调节与肿瘤增生相关的基因表达的遗传元件。在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码了调节与免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。在一些方面，本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的组合物中任一者和可药用辅料。
在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-2(IL-2)、IL-15、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节血管内皮生长因子A(VEGFA)、VEGFA同工型、胎盘生长因子(PIGF)、分化抗原簇155(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、myc原癌基因(c-Myc)、其片段或其功能性变体的表达。在一些方面，本文提供的一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-2(IL-2)、其片段或其功能性变体的第一RNA，所述第一RNA与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节MHC I类链相关序列A(MICA)、MHC I类链相关序列B(MICB)、内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体的表达。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-12(IL-12)、IL-7、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)，雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、其片段或其功能性变体的表达。在一些方面，本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的组合物中任一者和可药用辅料。
在一些方面，本文提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用本文所述的任一组合物或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，头颈癌是头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，头颈癌是喉癌、下咽癌、扁桃体癌症、鼻腔癌症、鼻旁窦癌、鼻咽癌、转移性鳞状颈部癌症伴隐性原发癌、唇癌、口腔癌、口腔癌、口咽癌、唾液腺癌、脑肿瘤、食管癌、眼癌、甲状旁腺癌、头颈肉瘤或甲状腺癌。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些方面，本文提供一种包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ ID NOs:1-17和125-141的核酸序列。
通过引用并入
本说明书提到的全部出版物、专利和专利申请均通过引用方式并入本文至如下程度，即如同专门且独立地指出通过引用方式并入每份单独出版物、专利和专利申请。
附图简述
本公开的特征尤其用所附权利要求阐述。将通过参考阐述其中利用本公开原理的说明性实施方案的以下发明详述，更好地理解本公开的特征和优点，并且本公开的附图是：
图1描述构建体设计示意图。一个多核酸构建体可以在目的基因序列(作为示例给出的IL-2)上游包含T7启动子序列，用于T7 RNA聚合酶结合和在单一转录物中成功体外转录目的基因和siRNA二者。信号肽IL-2以灰色框突出显示。将mRNA与siRNA连接或将siRNA与siRNA连接的接头分别以水平条纹框或方格条纹框指示。T7：T7启动子，siRNA：小干扰性RNA。
图2A是诱导IL-2从人胚肾细胞(HEK-293)分泌的图。X-轴指示用于转染到HEK-293细胞中的mRNA：化合物(Cpd.)1、化合物2、化合物3或化合物4。Y-轴是使用ELISA时与化合物1所致的IL-2蛋白相比的IL-2蛋白分泌倍数变化量值。数据代表每种化合物3份重复样本的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
图2B是诱导IL-2分泌从人成年角质形成细胞(HaCaT)的图。X-轴指示用于转染到HaCaT细胞中的mRNA：化合物(Cpd.)1、化合物2、化合物3或化合物4。Y-轴是使用ELISA时与化合物1所致的IL-2蛋白相比的IL-2蛋白分泌倍数变化量值。数据代表每种化合物3份重复样本的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
图2C是诱导IL-2分泌从人肺上皮细胞(A549)的图。X-轴指示用于转染到A549细胞中的mRNA：化合物(Cpd.)1、化合物2、化合物3或化合物4。Y-轴是使用ELISA时与化合物1所致的IL-2蛋白相比的IL-2蛋白分泌倍数变化量值。数据代表每种化合物3份重复样本的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
图3是在过量表达VEGFA(0.3μg VEGFA mRNA)的肺上皮细胞(A549细胞)中化合物5(Cpd.5)导致IL-2蛋白剂量依赖性分泌并且同时干扰VEGFA表达的图。X-轴指示用于转染到A549细胞中的化合物5浓度(分别对应于0、150、300、600、900或1200ng/孔的4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.02nM)。Y-轴是经化合物5转染后24小时，通过ELISA对相同细胞培养上清液中VEGFA蛋白水平(ng/ml)(左侧)和IL-2蛋白水平(右侧)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图4A是用VEGFA mRNA转染以过量表达VEGFA的人舌细胞癌细胞(SCC-4)中化合物5(Cpd.5)干扰VEGFA表达的图。X-轴指示仅用9.5nM(300ng)VEGFA mRNA(VEGFA mRNA)转染或经9.5nM(300ng)VEGFA mRNA和26.4nM(900ng)化合物5(Cpd.5)共转染的SCC-4细胞。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中VEGFA蛋白水平(ng/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图4B是通过ELISA测量，与图4A中相同的细胞培养上清液中IL-2蛋白水平(ng/ml)的图。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图5A是内源过量表达VEGFA的人舌细胞癌细胞(SCC-4)中化合物5(Cpd.5)干扰VEGFA表达的图。X-轴指示在26.4nM(900ng)化合物5转染之前(内源)和之后(Cpd.5)的SCC-4细胞。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中VEGFA蛋白水平(ng/ml)的测量。数据代表二次重复的均数±均数标准误。
图5B是通过ELISA测量，与图5A中相同的细胞培养上清液中IL-2蛋白水平(ng/ml)的图。数据代表二次重复的均数±均数标准误。
图6A是用VEGFA mRNA转染以过量表达VEGFA(9.5nM或0.3μgVEGFA mRNA)的人舌细胞癌细胞(SCC-4)中化合物5(Cpd.5)和商品siRNA干扰VEGFA表达的图。X-轴指示用递增浓度的化合物5(4.4nM至44.02nM)或商品siRNA(0.05mM至2.5mM)转染的SCC-4细胞。Y-轴指示转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中VEGFA蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图6B是用VEGFA mRNA转染以过量表达VEGFA(9.5nM或0.3μgVEGFA mRNA)的人肺上皮细胞(A549)中化合物5(Cpd.5)和商品siRNA干扰VEGFA表达的图。X-轴指示用递增浓度的化合物5(4.4nM至44.02nM)或商品siRNA(0.05mM至2.5mM)转染的A549细胞。Y-轴指示转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中VEGFA蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图6C是在SCC-4细胞和A549细胞中比较Cpd 5和商品siRNA的IC50值的表。
图7A是组成型表达可溶性和膜MICB的人舌细胞癌细胞(SCC-4)中化合物6(化合物6)干扰MICB表达的图。X-轴指示在35.11nM(900ng)化合物6转染之前(内源)和之后(Cpd.6)的SCC-4细胞。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中可溶性MICB蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图7B是组成型表达可溶性和膜MICB的人舌细胞癌细胞(SCC-4)中MICB表达受化合物6(Cpd.6)干扰的图。X-轴指示在35.11nM(900ng)化合物6转染之前(内源)和之后(Cpd.6)的SCC-4细胞。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中膜MICB蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图7C是通过ELISA测量，与图7A和图7B中相同的细胞培养上清液中IL-2蛋白水平(ng/ml)的图。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图8A是在组成型表达可溶性MICA的人舌细胞癌(SCC-4细胞)中化合物6(Cpd.6)导致IL-2蛋白剂量出现依赖性分泌并且同时干扰MICA表达的图。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物6浓度(1.58、2.93、5.85、11.7、23.41、35.11和46.81nM)。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中可溶性MICA蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图8B是图8A中描述的相同SCC-4细胞上清液中化合物6(Cpd.6)导致IL-2蛋白剂量出现依赖性分泌并且同时干扰MICB表达的图。SCC-4细胞组成型表达可溶性MICB。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物6浓度(1.58、2.93、5.85、11.7、23.41、35.11和46.81nM)。Y-轴是转染后24小时，通过ELISA对细胞培养上清液中可溶性MICB蛋白水平(pg/ml)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图9A是按5000个细胞/孔向超低贴壁(ULA)平板接种的SK-OV-3-NLR细胞的立体(3D)球状体培养物中化合物3(100ng)转染后12、24小时和48小时所测量的IL-2表达的图。用TR-FRET测定法进行IL-2定量。误差线代表三次重复的均数±SEM。
图9B-图9D显示在外周血单核细胞(PBMCs)存在下，经化合物3转染的SK-OV-3NLR球状体的总核定位RFP(NLR)积分强度的变化。SK-OV-3NLR按5000个细胞/孔铺种于ULA平板(一式四份)中并且使用脂质转染胺2000，以不同剂量的化合物3(3ng、10ng、30ng和100ng)转染。随后将细胞离心以形成球状体并且在添加PBMC之前培养48小时。分离自3位捐赠者的PBMC(图9B、图9C和图9D)按密度200,000个细胞/孔随抗CD3一起添加。每3小时对共培养物成像共168小时(7天)。将总NLR积分强度对24小时时间点归一化并且使用IncuCyte软件内部的球状体模块分析。rhIL2：人重组IL-2
图9E显示一组代表性IncuCyte图像，所述图像显示在第-5天在SK-OV-3NLR条件下，在单独PBMC对照处理、人重组IL-2处理(rhIL2)和化合物3处理(100ng)后化合物3介导的NLR积分降低。
图10A是一张图，其显示HEK-BlueTMIL-2报道细胞中从已用化合物5(0.3μg/孔)转染的人胚肾(HEK293)细胞的上清液衍生并且通过ELISA定量的rh-IL-2(0.001ng至300ng)或IL-2(0.001ng–45ng)诱导JAK3/STAT5途径出现剂量依赖性激活。X-轴指示化合物5衍生的IL-2或rh-IL-2的不同浓度。Y-轴指示对rh-IL-2(rh-IL-2的最低SEAP值设置为0和rh-IL-2的最高SEAP值设置为100％)归一化的IL-2信号传导激活。数据代表每剂量4次重复的均数±均数标准误。
图10B是一张图，其显示HEK-BlueTMIL-2报道细胞中从已用化合物6(0.3μg/孔)转染的人胚肾(HEK293)细胞的上清液衍生并且通过ELISA定量的rh-IL-2(0.001ng至300ng)或IL-2(0.001ng–45ng)诱导JAK3/STAT5途径出现剂量依赖性激活。X-轴指示化合物6衍生的IL-2或rh-IL-2的不同浓度。Y-轴指示对rh-IL-2归一化的IL-2信号传导激活。数据代表每剂量4次重复的均数±均数标准误。
图10C是显示通过发光细胞活力法(CellTiter-Glo)测量的NK细胞介导杀伤测定法的图。将SCC-4细胞用不同剂量的化合物5、化合物6和两个模拟对照RNAs(0.1nM至2.5nM)转染。转染后30分钟，将NK-92细胞与SCC-4细胞按10:1效应细胞对靶细胞(E:T)比率共培养并且随后在37℃温育24小时。随后将细胞彻底洗涤以移除NK-92细胞，并且使用CellTiter-Glo通过细胞活力测定法分析存活的SCC-4细胞。将未处理的SCC-4细胞作为对照使用并且设定成0％。数据代表来自每剂量4次重复的均数±SEM。
图11A是显示SCC-4细胞中化合物7(Cpd.7)和化合物8(Cpd.8)诱导内源表达的VEGFA出现剂量依赖性下调的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的VEGFA水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物7浓度(1.1、2.2、4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.04nM/孔)和化合物8浓度(0.47、0.94、1.89、3.79、7.58、15.15、22.73、30.31和37.88nM/孔)。来自未转染细胞的VEGFA水平设定成100％。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的VEGFA水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图11B是显示SCC-4细胞中化合物7(3x siRNA)和化合物8(5x siRNA)诱导IL-2水平剂量依赖性分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-2水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物7浓度(1.1、2.2、4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.04nM/孔)和化合物8浓度(0.47、0.94、1.89、3.79、7.58、15.15、22.73、30.31和37.88nM/孔)。Y-轴是对细胞培养上清液中IL-2蛋白水平(nM)的测量，1nM对应于IL-2对其受体的解离常数(Kd)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图11C是显示SCC-4细胞中化合物9(Cpd.9)和化合物(Cpd.10)诱导IL-2分泌长达72小时的时程的图。从转染(30nM)后6至72小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-2水平。X-轴指示转染后小时数并且Y-轴是对细胞培养上清液中IL-2蛋白水平(nM)的测量。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图11D是显示SCC-4细胞中乱序siRNA(scr.siRNA)、商品VEGFA siRNA、化合物9和化合物10以时间依赖方式下调组成型表达的VEGFA水平长达72小时的图。从转染(30nM)后6小时至72小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的VEGFA水平。来自未转染细胞的VEGFA水平设定成100％并且下调过程对这个值归一化。X-轴指示转染后小时数并且Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的VEGFA水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图12A和图12C是分别显示SCC-4细胞和A549细胞中化合物11(Cpd.11)诱导的IL-12水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-12水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物11浓度(7(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-12蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图12B和图12D是分别显示SCC-4细胞和A549细胞中因化合物11处理引起IDH1水平、CDK4水平和CDK6水平下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量IDH1、CDK4和CDK6的RNA水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞和A549细胞中的化合物11浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的IDH1、CDK4和CDK6水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图12E和图12G是分别显示SCC-4细胞和A549细胞中化合物12(Cpd.12)诱导的IL-12水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-12水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞和A549细胞中的化合物12浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-12蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图12F和图12H是分别显示SCC-4细胞和A549细胞中因化合物12处理引起EGFR水平、KRAS水平和mTOR水平下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量EGFR、KRAS和mTOR的RNA水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞和A549细胞中的化合物12浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的EGFR、KRAS和mTOR水平下调。BQL＝低于测定法定量限值。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图13A和图13B是分别显示A549细胞和SCC-4细胞中化合物13(Cpd.13)诱导的IL-12水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-12水平。X-轴指示用于转染到A549细胞和SCC-4细胞中的化合物13浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-12蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图13C是显示A549细胞中化合物14(Cpd.14)诱导的IL-12水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-12水平。X-轴指示用于转染到A549细胞中的化合物14浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-12蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图13D和图13E是分别显示A549细胞和SCC-4细胞中因化合物13处理引起EGFR表达下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量EGFR的RNA水平。X-轴指示用于转染到A549细胞和SCC-4细胞中的化合物13浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的EGFR水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图13F是显示A549细胞中因化合物14处理引起mTOR表达下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量mTOR的RNA水平。X-轴指示用于转染到A549细胞中的化合物14浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的mTOR水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14A和图14C是分别显示A549细胞和SCC-4细胞中化合物15(Cpd.15)诱导的IL-15水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-15水平。X-轴指示用于转染到A549细胞和SCC-4细胞中的化合物15浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-15蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14B和图14D是分别显示A549细胞和SCC-4细胞中因化合物15处理引起VEGFA和CD155表达下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量VEGFA和CD155的RNA水平。X-轴指示用于转染到A549细胞和SCC-4细胞中的化合物15浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的VEGFA和CD155水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14E是显示人胶质母细胞瘤细胞系(U251 MG)细胞中化合物16(Cpd.16)诱导的IL-15水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-15水平。X-轴指示用于转染到U251 MG细胞中的化合物16浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-15蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14F是显示U251 MG细胞中因化合物16处理引起VEGFA、PD-L1和c-Myc表达下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量VEGFA、PD-L1和c-Myc的RNA水平。X-轴指示用于转染到U251 MG细胞中的化合物16浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的VEGFA，PD-L1和c-Myc水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14G是显示U251 MG细胞中化合物17(Cpd.17)诱导的IL-7水平分泌的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-7水平。X-轴指示用于转染到U251 MG细胞中的化合物17浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴是细胞培养上清液中的IL-7蛋白水平(pg/ml)。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图14H是显示U251 MG细胞中因化合物17处理引起PD-L1表达下调的图。转染后24小时，在技术性重复中通过qPCR从细胞裂解物测量PD-L1的RNA水平。X-轴指示用于转染到U251 MG细胞中的化合物17浓度(10nM和30nM/孔)。Y-轴指示对未转染样品(基础水平)归一化的PD-L1水平下调。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
图15A是显示SCC-4细胞中化合物5(Cpd.5)和化合物10(Cpd.10)诱导内源表达的VEGFA下调的图。转染后24小时，通过ELISA测量细胞培养上清液中的VEGFA水平。X-轴指示用于转染到SCC-4细胞中的化合物5浓度和化合物10浓度(20和30nM)。来自未转染细胞的VEGFA水平代表SCC-4细胞的内源性VEGFA分泌水平并且标记为‘0’。Y-轴指示通过ELISA测量的VEGFA水平。数据代表2次独立测量的均数±均数标准误。
图15B是一个图，其显示在体外血管生成模型的HUVEC中来自图15A中不同培养基上清液的VEGFA诱导的分支点数目。使用人重组VEGFA(VEGF)作为对照并且从6小时时间点处的显微图片计数分支点数目。数据代表6次独立测量的均数±均数标准误。
发明详述
本文提供用于同时调节两个或更多个基因表达的组合物和方法，包括至少一个编码目的基因的核酸序列和至少一个编码或包含能够与靶信使RNA(mRNA)结合的小干扰性RNA(siRNA)的核酸序列。本文中还提供用于治疗癌症的组合物和方法，包括从单一RNA同时表达细胞因子和遗传元件的重组RNA构建体，该遗传元件减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的表达。本文还提供同时调节两个或更多个基因表达的组合物和方法。本文提供组合物，所述组合物包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子并且其中第二RNA编码了减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。在一个示例中，第一RNA可以是编码细胞因子的信使RNA(mRNA)并且可以增加细胞因子的蛋白质水平。在另一个示例中，减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达的第二RNA或遗传元件可以包括能够与靶mRNA结合的并且可以下调靶mRNA编码的蛋白质水平的小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，靶mRNA可以包括与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的mRNA。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管，类似于或等同于下述方法和材料也可用于实施和测试本发明，但在此描述了适合的方法与材料。
定义
阐述本发明书的某些具体细节，旨在透彻理解多种实施方案。但是，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实施本公开。在其他情况下，未详细显示或描述熟知结构，以避免不必要地模糊实施方案描述。除非上下文另有要求，否则本说明书和后附权利要求通篇范围内，词“包含”及其变体，如，“包含了”和“包含着”应按照开放性、包含性意义解释，即，解释为“包括但不限于”。另外，本文中提供的标题仅为方便为宜，并且不解释要求保护的本公开的范围或意思。
除非内容另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。还应当指出除非上下文另外明确说明，否则术语“或”通常按其包括“和/或”的含义使用。如本文所用的术语“和/或”及其任意组合”及其语法等同物可以互换使用。这些术语可能表示具体构思任何组合。仅出于说明目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任意组合”可以单独意指A；单独意指B；单独意指C；意指A和B；B和C；A和C；及A、B和C”。除非上下文具体地指独立使用，否则术语“或”可以联合或独立地使用。
术语“约”或“大约”可以意指处于如本领域技术人员所测定的特定值的可接受误差范围内部，所述可接受误差范围将部分地取决于怎样度量或测定该值，即，测量系统的限值。例如，根据本领域的惯例，“约”可以意指处于1个或多于1个标准差范围内。备选地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。备选地，尤其相对于生物系统或过程，本术语可以意指某个值的某个数量级范围内、5倍范围内和2倍范围内。在本申请和权利要求中描述具体值的情况下，除非另外声明，否则应当假定“约”意指处于该具体值的可接受误差范围内。
如本说明书和权利要求书中所用，词“包含”(以及包含的任何形式，如“包含了”及“包含着”)、“具有”(以及具有的任何形式，如“具有了”及“具备”)、“包括”(以及包括的任何形式，如“包括了”及“包括”)或“含有”(以及含有的任何形式，如“含有”及“含有”)是包含性的或开放式的并且不排除额外的、未提到的元素或方法步骤。构思了本说明书中讨论的任何实施方案可以相对于本公开的任何方法或组合物而实施，并且反之亦然。另外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。
本说明书中谈及“诸实施方案”、“某些实施方案”、“优选实施方案”、“具体实施方案”、“一些实施方案”、“某个实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”，意指联系这些实施方案所描述的具体特点、结构或特征包含于本公开的至少一些实施方案中，但不必然地包含于其全部实施方案中。为促进理解本公开，下文定义众多术语和短语。
如本文所用的术语“RNA”包括编码氨基酸序列的RNA(例如，mRNA等)以及不编码氨基酸序列的RNA(例如，siRNA、shRNA、miRNA等)。如本文所用的RNA可以是编码性RNA，即，编码氨基酸序列的RNA。这类RNA分子也称作mRNA(信使RNA)且为单链RNA分子。如本文所用的RNA可以是非编码性RNA，即，不编码氨基酸序列的RNA。The RNA如本文所用可以是非编码性RNA，即，不编码氨基酸序列或不翻译成蛋白质的RNA。非编码性RNA可以包括，但不限于小干扰性RNA(siRNA)、短或小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)和非编码性长RNA(IncRNA)。如本文所用的siRNA可以包括双链RNA(dsRNA)区、发夹结构、环结构或其任意组合。在一些实施方案中，siRNA可以包含至少一个shRNA、至少一个dsRNA区或至少一个环结构。在一些实施方案中，siRNA可以从dsRNA或shRNA加工而来。在一些实施方案中，siRNA可以由内源蛋白如DICER从shRNA加工或切割而来。在一些实施方案中，可以从siRNA切去或移除发夹结构或环结构。例如，可以是切去或移除shRNA的发夹结构或环结构。在一些实施方案中，本文所述的RNA可以通过本领域普通技术人员已知的合成、化学或酶促方法体系产生，通过本领域普通技术人员已知的重组技术产生，或从天然来源分离，或通过其任意组合产生。该RNA可以包含修饰的或未修饰的核苷酸或其混合物，例如，RNA可以任选地包含本领域已知的化学性和天然存在性核苷修饰(例如，N1-甲基假尿苷，本文中还称作甲基假尿苷)。
术语“核酸序列”、“多核酸序列”、“核苷酸序列”在本文中可互换使用并且在此具有相同含义且指DNA或RNA。在一些实施方案中，核酸序列是包含彼此通过糖/磷酸酯-主链的磷酸二酯键共价连接的核苷酸单体或由其组成的聚合物。术语“核酸序列”、“多核酸序列”和“核苷酸序列”可以涵盖未修饰的核酸序列，即，包含未修饰的核苷酸或天然核苷酸。术语“核酸序列”、“多核酸序列”和“核苷酸序列”还可以涵盖修饰的核酸序列，如碱基修饰、糖修饰或主链修饰等的DNA或RNA。
术语“天然核苷酸”和“规范核苷酸”在本文中可互换使用并且在此具有相同含义且指天然存在性核苷酸碱基——腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)。
术语“未修饰的核苷酸”在本文中用来指未经历天然修饰(例如在体内未表观遗传或未转录后修饰)的天然核苷酸。术语“未修饰的核苷酸”在本文中优选地用来指未经历天然修饰(例如在体内未表观遗传或转录后修饰)及未经历化学修饰(例如在体外未经化学修饰)的天然核苷酸。
术语“修饰的核苷酸”在本文中用来指天然修饰的核苷酸(如表观遗传或转录后修饰的核苷酸)和化学修饰的核苷酸，例如，体外经化学修饰的核苷酸。
重组RNA构建体
本文提供用于治疗癌症的组合物和方法，包括重组多核酸构建体或RNA构建体，所述构建体包含目的基因和通过与靶RNA结合来减少另一个基因表达的遗传元件。另外，本文还提供使用单一RNA转录物，同时调节两个或更多个基因表达的组合物和方法。减少另一个基因表达的遗传元件示例可以包括能够与靶mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)。
本文还提供重组多核酸构建体或RNA构建体，所述构建体包含目的基因和减少另一个基因(如siRNA)表达的遗传元件，其中目的基因和减少另一个基因(如siRNA)表达的遗传元件可以按顺序方式从5’至3’方向(如图1中所说明)或从3’至5’方向存在。在一个示例中，目的基因可以存在于减少另一个基因(如siRNA)表达的遗传元件的5’或其上游，并且目的基因可以通过接头(mRNA至siRNA/shRNA接头，也可以指“间隔区”)连接至siRNA，如图1中所说明。在另一个示例中，目的基因可以存在于减少另一个基因(如siRNA)表达的遗传元件的3’或其下游，并且siRNA可以通过接头(siRNA/shRNA至mRNA接头，也可以指“间隔区”)连接至目的基因。本文提供的重组多核酸构建体或RNA构建体可以包含多于一个种类的siRNA并且多于一个种类的siRNA每者可以由接头(siRNA至siRNA或shRNA至shRNA接头)连接。在一些实施方案中，mRNA至siRNA(或siRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以不同。在一些实施方案中，mRNA至siRNA/shRNA(或siRNA/shRNA至mRNA)接头的序列和siRNA至siRNA(或shRNA至shRNA)接头的序列可以相同。本文提供的重组多核酸构建体或RNA构建体可以包含多于一个目的基因并且多于一个目的基因每者可以由接头(mRNA至mRNA接头)连接。作为目的基因示例，图1中显示白介素2(IL-2)。IL-2包含N末端处的信号肽序列。IL-2可以包含未修饰(WT)的信号肽序列或修饰的信号肽序列。本文提供的重组多核酸构建体还可以包含结合RNA聚合酶的启动子序列。作为一个示例，图1中显示结合T7 RNA聚合酶的T7启动子。
本文提供的重组RNA构建体可以包含多个拷贝数的目的基因，其中多个拷贝数的目的基因每者编码相同的蛋白质。本文中还提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包括多个目的基因，其中多个目的基因每者编码不同的蛋白质。本文提供的重组RNA构建体可以包含多个种类的siRNA(例如，至少两个种类的siRNA)，其中多个种类的siRNA每者能够与相同的靶RNA结合。在一些实施方案中，多个种类的siRNA每者可以与相同靶RNA的相同区域结合。在一些实施方案中，多个种类的siRNA每者可以与相同靶RNA的不同区域结合。在一些实施方案中，多个种类的siRNA中一些者可以与相同靶RNA结合并且多个种类的siRNA中一些者可以与相同靶RNA的不同区域结合。本文中还提供重组RNA构建体，所述构建体包含多个种类的siRNA，其中多个种类的siRNA每者能够与不同靶RNA结合。在一些实施方案中，靶RNA是信使(mRNA)。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子并且其中第二RNA编码了减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。在一个示例中，第一RNA可以是编码细胞因子的mRNA并且可以增加细胞因子蛋白质水平。在另一个示例中，本文所述的组合物中减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达的第二RNA或遗传元件可以包括能够与靶mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，靶mRNA可以是与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的mRNA，并且可以下调靶mRNA的蛋白质表达。
重组多核酸或重组RNA可以指非天然存在并且在体外被合成或操作的多核酸或RNA。重组多核酸或RNA可以在实验室合成并且可以通过使用重组DNA或RNA技术，通过使用DNA或RNA酶促修饰(如酶促限制酶切消化、连接、克隆和/或体外转录)来制备。重组多核酸可以在体外转录以产生信使RNA(mRNA)并且可以将重组mRNA分离、纯化并用于转染到细胞中。本文所用的重组多核酸或RNA可以编码蛋白质、多肽、靶基序、信号肽和/或非编码性RNA如小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，在合适条件下，重组多核酸或RNA可以并入细胞并且在细胞内部表达。
本文提供的重组RNA构建体可以包含多于一个编码目的基因的核酸序列。例如，重组RNA构建体可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个编码目的基因的核酸序列。在一些情况下，两个或更多个核酸序列每者可以编码相同的目的基因，其中由相同目的基因编码的mRNA与siRNA靶mRNA不同。在一些情况下，两个或更多个核酸序列每者可以编码不同的目的基因，其中由不同目的基因编码的mRNA不是同一RNA构建体中编码的siRNA的靶。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含三个或更多个编码目的基因的核酸序列，其中三个或更多个核酸序列每者可以编码相同的目的基因或不同的目的基因，并且其中由相同或不同目的基因编码的mRNA不是同一RNA构建体中编码的siRNA的靶。例如，重组RNA构建体可以包含四个编码目的基因的核酸序列，其中四个核酸序列中三者编码相同的目的基因并且四个核酸序列中一者编码不同的目的基因，并且其中由相同或不同目的基因编码的mRNA不是同一RNA构建体中编码的siRNA的靶。
本文提供的重组RNA构建体可以包含多于一个种类的siRNA，所述siRNA靶向与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的mRNA。例如，本文提供的重组RNA构建体可以包含1-10个种类靶向相同mRNA或不同mRNA的siRNA。在一些情况下，1-10个种类靶向相同mRNA的siRNA每者可以包含相同序列，即1-10个种类的siRNA每者与靶mRNA的相同区域结合。在一些情况下，1-10个种类靶向相同mRNA的siRNA每者可以包含不同序列，即1-10个种类的siRNA每者与靶mRNA的不同区域结合。本文提供的重组RNA构建体可以包含至少两个种类的siRNA，所述siRNA靶向与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的mRNA。例如，本文提供的重组RNA构建体，可以包含3个种类靶向一个mRNA的siRNA并且3个种类的siRNA每者包含靶向mRNA相同区域的相同核酸序列。在这个示例中，3个种类的siRNA每者可以包含靶向外显子1的相同核酸序列。在另一个示例中，3种类的siRNA每者可以包含靶向mRNA不同区域的不同核酸序列。在这个示例中，3种类的siRNA之一可以包含靶向外显子1的核酸序列并且3种类的siRNA的另一者可以包含靶向外显子2的核酸序列等。在又一个示例中，3种类的siRNA每者可以包含靶向不同mRNA的不同核酸序列。在全部方面，本文提供的重组RNA构建体中的siRNA可以不影响由同一RNA构建体组合物中mRNA表达的目的基因(如细胞因子)表达。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述重组RNA构建体包含第一RNA和第二RNA，所述第一RNA编码细胞因子，所述第二RNA编码减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。本文所述组合物中的第一RNA和第二RNA可以由接头连接。在一些情况下，包含第一RNA和第二RNA的组合物还包含编码接头的核酸序列。接头可以为约6个约50个核苷酸长度。例如，接头可以为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39个或至少约40个核苷酸长度。例如，接头可以为最多约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个或最多约50个核苷酸长度。在一些情况下，可以使用tRNA接头。tRNA系统进化上跨活生物保守并且利用内源RNA酶P和Z加工多顺反子构建体(Dong等人,2016)。在一些情况下，本文所述的tRNA接头可以包含核酸序列，所述核酸序列包含AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAG ACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:20)。在一些情况下，包含了含有ATAGTGAGTCGTATTAACGTACCAACAA(SEQ ID NO:21)的核酸序列的接头可以用来连接第一RNA和第二RNA。
本文提供的重组RNA构建体可以进一步包含5’帽、Kozak序列和/或内部核糖体进入位点(IRES)，和/或尤其3'端处的聚腺苷酸尾，旨在改善翻译。在一些情况下，重组RNA构建体可以进一步包含任何技术人员已知促进翻译的区域。5’帽的非限制性示例可以包括抗逆向CAP类似物、Clean帽、帽0、帽1、帽2或锁核酸帽(LNA-帽)。在一些情况下，5’帽可以包含m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G、m7G、m7G(5’)G、m7GpppG或m7GpppGm。
本文提供的重组RNA构建体可以进一步包含聚腺苷酸尾。在一些情况下，聚腺苷酸尾包含1至220个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:150)。例如，聚腺苷酸尾包含1、3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215或220个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:150)。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至120、1至140、1至160、1至180、1至200、1至220、20至40、20至60、20至80、20至100、20至120、20至140、20至160、20至180、20至200、20至220、40至60、40至80、40至100、40至120、40至140、40至160、40至180、40至200、40至220、60至80、60至100、60至120、60至140、60至160、60至180、60至200、60至220、80至100、80至120、80至140、80至160、80至180、80至200、80至220、100至120、100至140、100至160、100至180、100至200、100至220、120至140、120至160、120至180、120至200、120至220、140至160、140至180、140至200、140至220、160至180、160至200、160至220、180至200、180至220、或200至220个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:150)。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含1、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或220个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:150)。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含至少1、20、40、60、80、100、120、140、160、180或至少200个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:151)。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含最多20、40、60、80、100、120、140、160、180、200或最多220个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:152)。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾包含120个碱基对的聚腺苷酸(SEQ ID NO:153)。
本文提供的重组RNA构建体可以进一步包含Kozak序列。Kozak序列可以指作为蛋白质翻译位点发挥作用的核酸序列基序。文献中详述了Kozak序列，例如，Kozak,M.,Gene299(1-2):1-34，所述通过引用方式完整并入本文。在一些实施方案中，本文所述的Kozak序列可以包含了含有GCCACC(SEQ ID NO:19)的序列。在一些实施方案中，本文提供的重组RNA构建体可以进一步包含核定位信号(NLS)。
本文所述的重组RNA构建体可以包含一个或多个核苷酸变体，包含非规范核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的示例包括二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤、N1-甲基假尿苷等。在一些情况下，核苷酸可以在其磷酸酯部分包含修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。这类修饰的非限制性示例包括长度更大的磷酸酯链和用巯基部分修饰。在一些实施方案中，磷酸酯链可以包含4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸酯部分。在一些实施方案中，巯基部分可以包括但不限于α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯。在一些实施方案中，本文所述的重组RNA构建体不包含5-甲基胞嘧啶和/或N6-甲基腺苷。
可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链处修饰本文所述的重组RNA构建体。例如，修饰可以在一个或多个一般可用于与互补性核苷酸形成氢键的原子处和/或在一个或多个一般不能够与互补性核苷酸形成氢键的原子处。在一些实施方案中，主链修饰包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、磷酰胺酯和磷酰二胺键。硫代磷酸酯键用硫原子取代磷酸酯主链中的非桥接氧并且延迟核酸酶降解寡核苷酸。磷酰二胺键(N3’→P5’)导致阻止核酸酶识别与降解。在一些实施方案中，主链修饰包含让肽键替代主链结构中的磷，或连接基团，这包括氨基甲酸酯、酰胺和链状与环状烃基。例如，N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位可以由肽核酸中的肽键连接。带修饰主链的寡核苷酸综述于以下文献中：Micklefield,Backbonemodification of nucleic acids:synthesis,structure and therapeuticapplications(主链修饰核酸：合成、结构和治疗性应用),Curr.Med.Chem.,8(10):1157-79,2001和Lyer等人,Modified oligonucleotides-synthesis,properties andapplications(修饰的寡核苷酸-合成、属性和应用),Curr.Opin.Mol.Ther.,1(3):344-358,1999。
本文提供的重组RNA构建体可以包含修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸组合。在一些情况下，含腺苷、含鸟苷和含胞苷的核苷酸未经修饰或部分地经修饰。在一些情况下，对于修饰的RNA构建体，1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的尿苷核苷酸可以经修饰。在一些实施方案中，5％至25％的尿苷核苷酸在重组RNA构建体中经修饰。修饰的尿苷核苷酸的非限制性示例可以包括假尿苷、N1-甲基假尿苷或N1-甲基假-UTP并且可以利用本领域已知的任何修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以含有修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸组合，其中1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的尿苷核苷酸可以包含假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-甲基假-UTP或本领域已知的任何其他修饰的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以含有修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸组合，其中1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的尿苷核苷酸可以包含N1-甲基假尿苷。
本文提供的重组RNA构建体可以经密码子优化。从总体上看，密码子优化指通过以下方式修饰核酸序列以便在目的宿主细胞中表达的过程：将天然序列的至少一个密码子(例如，多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)替换成在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子，同时维持天然氨基酸序列。可轻易获得密码子选择表，例如，在“密码子选择数据库”，并且这些表可以按许多方式改编。还可获得对特定序列作密码子优化以便在特定宿主细胞中表达的计算机算法，如作为优选的Gene(Aptagen,PA)和/>(ThermoFischer,MA)。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以不作密码子优化。
在一些情况下，重组RNA构建体可以包含核酸序列，所述核酸序列包括选自SEQ IDNOs:1-17和125-141的序列。
RNA干扰和小干扰性RNA(siRNA)
RNA干扰(RNAi)或RNA沉默是其中RNA分子通过使靶mRNA分子无效来抑制基因表达或翻译的过程。RNAi过程描述于以下文献中：Mello和Conte(2004)Nature 431,338-342；Meister和Tuschl(2004)Nature 431,343-349；Hannon和Rossi(2004)Nature 431,371-378；和Fire(2007)Angew.Chem.Int.Ed.46,6966-6984。简而言之，在天然过程中，该反应始于通过dsRNA特异性核酸内切酶Dicer，将长双链RNA(dsRNA)切割成小dsRNA片段或带发夹结构的siRNA(即，shRNA)。这些小dsRNA片段或siRNA随后整合入RNA诱导的沉默复合体(RISC)并且导引RISC至靶mRNA序列。在干扰期间，siRNA双链体解开，并且反义链保持与RISC复合，以引导RISC至靶mRNA序列，以诱导降解和后续抑制蛋白质翻译。不同于市售的合成性siRNA，本发明中的siRNA可以在细胞摄取后，利用细胞胞质中的内源性Dicer和RISC途径从重组RNA构建体(例如，包含mRNA和一个或多个siRNA的重组RNA构建体)被切下，并且遵循以上详述的天然过程，因为本发明重组RNA构建体中的siRNA可以包含发夹环结构。另外，由于重组RNA构建体的剩余部分(即，mRNA)在Dicer切割siRNA后保持完好，故实现想要的蛋白质从本发明重组RNA构建体中的目的基因表达。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含至少一个包含能够与靶RNA结合的siRNA的核酸序列。在一些情况下，靶RNA是mRNA。在一些实施方案中，siRNA能够与靶mRNA在5’非翻译区结合。在一些实施方案中，siRNA能够与靶mRNA在3’非翻译区结合。在一些实施方案中，siRNA能够与靶mRNA在外显子结合。在一些情况下，靶RNA是非编码性RNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含一个包含有义siRNA链的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含一个包含反义siRNA链的核酸序列。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含一个包含反义siRNA链的核酸序列和一个包含反义siRNA链的核酸序列。本发明所包含siRNA的详情在Cheng等人(2018)J.Mater.Chem.B.,6,4638-4644中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。
例如，在一些情况下，重组RNA构建体可以包含至少1个种类的siRNA，即，包含siRNA有义链的核酸序列和包含siRNA反义链的核酸序列。如本文所述，1种类的siRNA可以指1个种类的有义链siRNA和1个种类的反义链siRNA。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含多于1种类的siRNA，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个种类的包含siRNA有义链和siRNA反义链的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含1至20个种类的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或至少10个种类的siRNA。在一些实施方案中，重组RNA构建体可以包含最多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或最多20个种类的siRNA。在一个优选的实施方案中，本文所述的重组RNA构建体包含至少2个种类的siRNA。在另一个的优选实施方案中，本文所述的重组RNA构建体包含至少3个种类的siRNA。
本文提供包含1-20个或更多个siRNA种类的重组RNA构建体组合物，其中1-20或更多个siRNA种类每者能够与靶RNA结合。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA或非编码性RNA。在一些情况下，siRNA种类每者与相同的靶RNA结合。在一种情况下，siRNA种类每者可以包含相同序列并且与相同靶RNA的相同区域或序列结合。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类并且1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类每者包含靶向靶RNA相同区域的相同序列，即重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5个或更丰富的siRNA种类。在另一种情况下，siRNA种类每者可以包含不同序列并且与相同靶RNA的不同区域或序列结合。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类并且1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类每者可以包含靶向相同靶RNA中不同区域的不同序列。在这个示例中，1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类的一种siRNA可以靶向外显子1并且1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类的另一种siRNA可以靶向相同mRNA的外显子2等。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类并且1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类的2者可以包含相同序列并且与靶RNA相同区域结合以及1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类的3者或更多者可以包含不同序列并且与相同靶RNA的不同区域结合。在一些情况下，siRNA种类每者与不同的靶RNA结合。在一些实施方案中，靶RNA可以是mRNA或非编码性RNA等。
本文提供包含1-20个或更多个siRNA种类的重组RNA构建体组合物，其中1-20或更多个siRNA种类每者由接头连接。在一些情况下，接头可以是不可切割接头。在一些情况下，接头可以是可切割接头如可自切割接头。在一些情况下，接头可以是tRNA接头。tRNA系统进化上跨活生物保守并且利用内源RNA酶P和Z加工多顺反子构建体(Dong等人，2016)。在一些实施方案中，tRNA接头可以包含核酸序列，所述核酸序列包含AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAG ACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:20)。在一些实施方案中，包含了含有TTTATCTTAGAGGCATATCCCTACGTACCAACAA(SEQ ID NO:22)的核酸序列的接头可以用来连接连接不同的siRNA种类。
在一些情况下，siRNA与其mRNA靶特异性结合导致干扰靶mRNA的正常功能，以引起调节(例如下调)功能和/或活性，并且其中存在足够程度互补性，以避免siRNA在其中想要特异性结合的条件下(即在体内测定法或治疗性处理情况时生理条件下以及在体外测定法情况时其中进行测定法的条件下)，与非目标核酸序列非特异性结合。
如本文所用的蛋白质可以指一般包含一种或多种肽或多肽的分子。肽或多肽一般是由肽键连接的氨基酸残基链。肽通常包含2个与50个之间的氨基酸残基。多肽通常包含多于50个氨基酸残基。蛋白质一般折叠成三维形式，后者可能为蛋白质发挥其生物学功能所必备。如本文所用的蛋白质可以包括蛋白质片段、蛋白质变体和融合蛋白。片段可以是全长序列的核酸分子如DNA、RNA或蛋白质的较短部分。因此，片段一般包含与全长序列内部相应节段相同的序列。在一些实施方案中，具有某序列的片段可以包含至少5％到至少80％衍生该片段的全长核苷酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白质可以是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是人类蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是从细胞分泌的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质可以是细胞膜上的蛋白质。在一些实施方案中，如本文提到的蛋白质可以是这样的蛋白质，其经分泌并且借助细胞表面上经常涉及免疫反应的受体或其他涉及病毒性感染的宿主蛋白，局部或系统充当靶细胞信号传导的调节物。本领域已知且在文献可获得在本发明上下文中有用的蛋白质(包括由目的基因编码的蛋白质)的核苷酸序列和氨基酸序列。例如，在UniProt数据库可获得在本发明上下文中有用的蛋白质(包括由目的基因编码的蛋白质)的核苷酸序列和氨基酸序列。
本文提供重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含能够与靶mRNA结合以调节靶mRNA表达的siRNA。在一些情况下，通过能够与靶mRNA结合的siRNA下调靶mRNA的表达(例如，靶mRNA编码的蛋白质的水平)。在一些实施方案中，靶mRNA的表达受能够与靶mRNA结合的siRNA抑制。如本文所述，抑制或下调靶mRNA表达可以指但不限于干扰靶mRNA以干扰从靶mRNA翻译蛋白质；因此，抑制或下调靶mRNA表达可以指但不限于，相比包含能够与靶mRNA结合的siRNA的重组RNA构建体不存情况下从靶mRNA表达的蛋白质的水平，从靶mRNA表达的蛋白质的水平降低。可以通过使用任何本领域熟知的方法测量蛋白质表达水平并且这些方法包括但不限于蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。一个测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定法，如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特异性抗原的抗体和能够检测所捕获抗原的第二抗体。检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press中。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含了含有能够与靶mRNA结合的siRNA的至少一个核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中靶mRNA与目的基因编码的mRNA不同。本本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含了含有能够与靶mRNA结合的siRNA的至少一个核酸序列和至少一个编码目的基因的核酸序列，其中siRNA不影响目的基因表达。在一些情况下，siRNA不能够与目的基因编码的mRNA结合。在一些情况下，siRNA不抑制目的基因表达。在一些情况下，siRNA不下调目的基因表达。如本文所述，抑制或下调目的基因表达可以指但不限于干扰蛋白质从重组RNA构建体翻译；因此，抑制或下调目的基因表达可以指但不限于，相比在能够与靶mRNA结合的siRNA的重组RNA构建体不存在下表达的蛋白质的水平，蛋白质的水平降低。可以通过使用任何本领域熟知的方法测量蛋白质表达水平并且这些方法包括但不限于蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。一个测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定法，如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特异性抗原的抗体和能够检测所捕获抗原的第二抗体。检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratory Manual(抗体：实验室手册),(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press中。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含至少一个包含能够与靶mRNA结合的siRNA的核酸序列。siRNA能够与之结合的靶mRNA的非限制性示列表包括与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因的mRNA。例如，靶mRNA可以是编码血管内皮生长因子(VEGF)、VEGFA、VEGFA同工型、胎盘生长因子(PIGF)、其片段或其功能性变体的mRNA。如本文所用的功能性变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可以包含通过插入、缺失和/或置换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列情况下)所修饰的序列。例如，变体分子可以包含或编码突变体蛋白，包括但不限于功能增加型或功能丧失型突变体。表A中显示VEGFA同工型的非限制性示例列表。
表A.VEGFA同工型列表
/>
在一些实施方案中，VEGFA包含SEQ ID NO:34中所列的序列。下文显示一个示例性PIGF序列：
PIGF NCBI参考序列：NM_001207012.1(SEQ ID NO:123)
/>
例如，靶mRNA可以是编码MHC I类链相关序列A(MICA)、MHC I类链相关序列B(MICB)、内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体的mRNA。如本文所用的功能性变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可以包含通过插入、缺失和/或置换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列情况下)所修饰的序列。例如，变体分子可以包含或编码突变体蛋白，包括但不限于功能增加型或功能丧失型突变体。在一些实施方案中，ADAM是ADAM 17。在一些实施方案中，靶mRNA可以编码诱饵蛋白。在一些实施方案中，诱饵蛋白是可溶性形式的细胞受体。在一些实施方案中，诱饵蛋白是可溶性MICA、MICB、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，靶mRNA可以编码涉及从细胞膜脱落的MICA和/或MICB的蛋白质。在一些实施方案中，涉及从细胞膜脱落的MICA和/或MICB的蛋白质包括ERp5、ADAM、MMP、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，涉及从细胞膜脱落的MICA和/或MICB的蛋白质包括ADAM17、其片段或其功能性变体。下文显示一个示例性ADAM17序列：
ADAM17 NCBI参考序列：NM_003183.6(SEQ ID NO:124)
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例如，靶mRNA可以是编码异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)、雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、分化抗原簇(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)或myc原癌基因(c-Myc)、其片段、或其功能性变体的mRNA。如本文所用的功能性变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可以包含通过插入、缺失和/或置换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列情况下)所修饰的序列。例如，变体分子可以包含或编码突变体蛋白，包括但不限于功能增加型或功能丧失型突变体。
在一些实施方案中，靶mRNA可以编码选自VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、MICA、MICB、ERp5、ADAM17、MMP、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1、c-Myc、其片段、其功能性变体及其组合的蛋白质。在一些实施方案中，VEGFA mRNA包含了含有SEQ ID NO:36的序列。在一些实施方案中，MICA mRNA包含了含有SEQ ID NO:39的序列。在一些实施方案中，MICB mRNA包含了含有SEQ ID NO:42的序列。在一些实施方案中，IDH1 mRNA包含了含有SEQID NO:51的序列。在一些实施方案中，CDK4 mRNA包含了含有SEQ ID NO:54的序列。在一些实施方案中，CDK6mRNA包含了含有SEQ ID NO:57的序列。在一些实施方案中，EGFR mRNA包含了含有SEQ ID NO:60的序列。在一些实施方案中，mTOR mRNA包含了含有SEQ ID NO:63的序列。在一些实施方案中，KRAS mRNA包含了含有SEQ ID NO:66的序列。在一些实施方案中，CD155 mRNA包含了含有SEQ ID NO:72的序列。在一些实施方案中，PD-L1 mRNA包含了含有SEQ ID NO:75的序列。在一些实施方案中，c-Myc mRNA包含了含有SEQ ID NO:78的序列。
目的基因
本文提供重组RNA构建体，所述构建体包含一种或多种拷贝的编码目的基因的核酸序列。例如，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝的编码目的基因的核酸序列。在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝的编码目的基因的核酸序列中每者编码相同的目的基因。在一些情况下，重组RNA构建体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝的编码细胞因子的核酸序列。
本文中还提供重组RNA构建体，所述构建体包含两个或更多个拷贝的编码目的基因的核酸序列，其中两个或更多个核酸序列中每者可以编码不同的目的基因。在一些情况下，两个或更多个编码不同目的基因的核酸序列中每者可以包含编码分泌性蛋白的核酸序列。在一些情况下，两个或更多个编码不同目的基因的核酸序列中每者可以包含编码细胞因子的核酸序列。在一些实施方案中，两个或更多个编码不同目的基因的核酸序列中每者可以编码不同的细胞因子。本文还提供包含接头的重组RNA构建体。在一些实施方案中，接头可以连接两个或更多个编码目的基因的核酸序列的每者。在一些情况下，接头可以是不可切割接头。在一些情况下，接头可以是可切割接头。在一些情况下，接头可以是可自切割接头。接头的非限制性示例包括柔性接头、2A肽接头(或2A自剪切性肽)如T2A、P2A、E2A或F2A和tRNA接头等。tRNA系统进化上跨活生物保守并且利用内源RNA酶P和Z加工多顺反子构建体(Dong等人，2016)。在一些实施方案中，tRNA接头可以包含核酸序列，所述核酸序列包含AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA(SEQ ID NO:20)。
本文提供重组RNA构建体，所述构建体包含编码目的基因以调节目的基因表达的RNA。例如，可以调节由目的基因的mRNA编码的蛋白质表达。例如，通过表达重组RNA构建体中由目的基因的mRNA编码的蛋白质，上调目的基因表达。例如，通过升高重组RNA构建体中由目的基因的mRNA编码的蛋白质的水平，上调目的基因表达。可以通过使用任何本领域熟知的方法测量蛋白质表达水平并且这些方法包括但不限于蛋白质印迹法、流式细胞术、ELISA、RIA和各种蛋白质组学技术。一个测量或检测多肽的示例性方法是免疫测定法，如ELISA。这种类型的蛋白质定量可以基于能够捕获特异性抗原的抗体和能够检测所捕获抗原的第二抗体。检测和/或测量多肽的示例性测定法描述于Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),(1988),Cold Spring HarborLaboratory Press中。
本文提供重组RNA构建体，所述构建体包含编码目的基因的RNA，其中目的基因编码目的蛋白。在一些情况下，目的蛋白是治疗性蛋白。在一些情况下，目的蛋白为人源，即，是人蛋白质。在一些情况下，目的基因编码细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子包括白介素。在一些实施方案中，目的蛋白是白介素2(IL-2)、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。如本文所用的功能性变体可以指全长分子、其片段或其变体。例如，变体分子可以包含通过插入、缺失和/或置换一个或多个氨基酸(在蛋白质序列情况下)或一个或多个核苷酸(在核酸序列情况下)所修饰的序列。
在一些情况下，如本文所用的白介素2(IL-2)或IL-2可以指天然序列的人IL-2(Uniprot数据库：P60568或Q0GK43和在Genbank数据库中：NM_000586.3)、其片段或其功能性变体。编码人IL-2的天然DNA序列可以经密码子优化。人IL-2的天然序列可以由具有20个氨基酸的信号肽(核苷酸1-60)和具有如SEQ ID NO:23中所示的133个氨基酸的人成熟IL-2(核苷酸61-459)组成。在一些实施方案中，该信号肽是未修饰的IL-2信号肽。在一些实施方案中，该信号肽是通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽。在一些实施方案中，如本文所用的白介素2(IL-2)或IL-2可以指人成熟IL-2。在一些实施方案中，成熟蛋白可以指在表达并分泌某蛋白质的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的该蛋白质。在一些实施方案中，成熟IL-2可以指在表达并分泌IL-2的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-2蛋白。在一些实施方案中，人成熟IL-2可以指在表达并分泌人IL-2的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-2蛋白并且正常情况下含有由如SEQ ID NO:24中所示的核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-2可以包含IL-2片段、IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-2片段可以至少部分地有功能，即与野生型或全长IL-2相比，可以按相似或较低水平展现IL-2活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-2片段可以有完整功能，即与野生型或全长IL-2相比，可以按相同水平展现IL-2活性。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可以包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可以至少部分地有功能，即与野生型IL-2相比，可以按相似或较低水平展现IL-2活性。在一些实施方案中，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体可以有完整功能，即与野生型IL-2相比，可以按相同水平展现IL-2活性。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，IL-2变体、IL-2突变蛋白或IL-2突变体按较高水平展现IL-2活性。
编码IL-2的mRNA可以指一种mRNA，所述mRNA包含了编码具有153个氨基酸的人IL-2前肽的核苷酸序列或编码具有133个氨基酸的人成熟IL-2的核苷酸序列。编码人IL-2前肽的核苷酸序列和编码人成熟IL-2的核苷酸序列可以经密码子优化。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含1个IL-2mRNA副本。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含2个或更多个IL-2mRNA副本。
在一些情况下，如本文所用的白介素12(IL-12)或IL-12可以指天然序列的人IL-12α(Genbank数据库：NM_000882.4)、天然序列的人IL-12β(Genbank数据库：NM_002187.2)、其片段或其功能性变体。编码人IL-12的天然DNA序列可以经密码子优化。人IL-12α的天然序列可以由具有22个氨基酸的信号肽和具有如SEQ ID NO:43中所示197个氨基酸的人成熟IL-12组成。在一些实施方案中，该信号肽是未修饰的IL-12α信号肽。在一些实施方案中，该信号肽是通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-12α信号肽。人IL-12β的天然序列可以由具有22个氨基酸的信号肽和具有如SEQ ID NO:46中所示的306个氨基酸的人成熟IL-12组成。在一些实施方案中，该信号肽是未修饰的IL-12β信号肽。在一些实施方案中，该信号肽是通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-12β信号肽。
在一些实施方案中，如本文所用的白介素12(IL-12)或IL-12可以指人成熟IL-12α。在一些实施方案中，如本文所用的白介素12(IL-12)或IL-12可以指人成熟IL-12β。在一些实施方案中，成熟蛋白可以指在表达并分泌某蛋白质的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的该蛋白质。在一些实施方案中，成熟IL-12可以指在表达并分泌IL-12的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-12α蛋白。在一些实施方案中，成熟IL-12可以指在表达并分泌IL-12的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-12β蛋白。在一些实施方案中，人成熟IL-12可以指在表达并分泌人IL-12的人细胞的内质网中合成并借助高尔基体分泌的IL-12α蛋白并且正常情况下含有由如SEQ ID NO:44中所示的核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，人成熟IL-12可以指在表达并分泌人IL-12的人细胞的内质网中合成并借助高尔基体分泌的IL-12β蛋白并且正常情况下含有由如SEQ ID NO:47中所示的核苷酸编码的氨基酸。
在一些实施方案中，IL-12α可以包括IL-12α片段、IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-12α片段至少部分地有功能，即与野生型或全长IL-12α相比，可以按相似或较低水平展现IL-12α活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-12α片段可以有完整功能，即与野生型或全长IL-12α相比，可以按相同水平展现IL-12α活性。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体可以包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-12α氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体至少部分地有功能，即与野生型IL-12α相比，可以按相似或较低水平展现IL-12α活性。在一些实施方案中，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体可以有完整功能，即与野生型IL-12α相比，可以按相同水平展现IL-12α活性。在一些实施方案中，与野生型IL-12α相比，IL-12α变体、IL-12α突变蛋白或IL-12α突变体可以按较高水平展现IL-12α活性。
在一些实施方案中，IL-12β可以包括IL-12β片段、IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-12β片段至少部分地有功能，即与野生型或全长IL-12β相比，可以按相似或较低水平展现IL-12β活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-12β片段可以有完整功能，即与野生型或全长IL-12β相比，可以按相同水平展现IL-12β活性。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可以包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-12β氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体至少部分地有功能，即与野生型IL-12β相比，可以按相似或较低水平展现IL-12β活性。在一些实施方案中，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可以有完整功能，即与野生型IL-12β相比，可以按相同水平展现IL-12β活性。在一些实施方案中，与野生型IL-12β相比，IL-12β变体、IL-12β突变蛋白或IL-12β突变体可以按较高水平展现IL-12β活性。
编码IL-12的mRNA可以指一种mRNA，所述mRNA包含了编码具有219个氨基酸的人IL-12α前肽的核苷酸序列或编码具有197个氨基酸的人成熟IL-12α的核苷酸序列。编码人IL-12α前肽的核苷酸序列和编码人成熟IL-12的核苷酸序列可以经密码子优化。编码IL-12的mRNA可以指一种mRNA，所述mRNA包含了编码具有328个氨基酸的人IL-12β前肽的核苷酸序列或编码具有306个氨基酸的人成熟IL-12β的核苷酸序列。编码人IL-12β前肽的核苷酸序列和编码人成熟IL-12的核苷酸序列可以经密码子优化。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含1个IL-12mRNA副本。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含2个或更多个IL-12mRNA副本。
在一些情况下，如本文所用的白介素15(IL-15)或IL-15可以指天然序列的人IL-15(Genbank数据库：NM_000585.4)、其片段或其功能性变体。编码人IL-15的天然DNA序列可以经密码子优化。人IL-15的天然序列可以由具有29个氨基酸的信号肽和具有如SEQ IDNO:67中所示133个氨基酸的人成熟IL-15组成。在一些实施方案中，该信号肽是未修饰的IL-15信号肽。在一些实施方案中，该信号肽是通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-15信号肽。在一些实施方案中，如本文所用的白介素15(IL-15)或IL-15可以指人成熟IL-15。在一些实施方案中，成熟蛋白可以指在表达并分泌某蛋白质的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的该蛋白质。在一些实施方案中，成熟IL-15可以指在表达并分泌IL-15的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-15蛋白。在一些实施方案中，人成熟IL-15可以指在表达并分泌人IL-15的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-15蛋白并且正常情况下含有由如SEQ ID NO:68中所示的核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-15可以包含IL-15片段、IL-15变体、IL-15突变蛋白或IL-15突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-15片段至少部分地有功能，即与野生型或全长IL-15相比，可以按相似或较低水平展现IL-15活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-15片段可以有完整功能，即与野生型或全长IL-15相比，可以按相同水平展现IL-15活性。在一些实施方案中，IL-15变体、IL-15突变蛋白或IL-15突变体可以包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-15氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15变体、IL-15突变蛋白或IL-15突变体至少部分地有功能，即与野生型IL-15相比，可以按相似或较低水平展现IL-15活性。在一些实施方案中，IL-15变体、IL-15突变蛋白或IL-15突变体可以有完整功能，即与野生型IL-15相比，可以按相同水平展现IL-15活性。在一些实施方案中，与野生型IL-15相比，IL-15变体、IL-15突变蛋白或IL-15突变体可以按较高水平展现IL-15活性。
编码IL-15的mRNA可以指一种mRNA，所述mRNA包含了编码具有162个氨基酸的人IL-15前肽的核苷酸序列或编码具有133个氨基酸的人成熟IL-15的核苷酸序列。编码人IL-15前肽的核苷酸序列和编码人成熟IL-15的核苷酸序列可以经密码子优化。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含1个IL-15mRNA副本。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含2个或更多个IL-15mRNA副本。
在一些情况下，如本文所用的白介素7(IL-7)或IL-7可以指天然序列的人IL-7(Genbank数据库：NM_000880.3)、其片段或其功能性变体。编码人IL-7的天然DNA序列可以经密码子优化。人IL-7的天然序列可以由具有25个氨基酸的信号肽和具有如SEQ ID NO:79中所示152个氨基酸的人成熟IL-7组成。在一些实施方案中，该信号肽是未修饰的IL-7信号肽。在一些实施方案中，该信号肽是通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-7信号肽。在一些实施方案中，如本文所用的白介素7(IL-7)或IL-7可以指人成熟IL-7。在一些实施方案中，成熟蛋白可以指在表达并分泌某蛋白质的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的该蛋白质。在一些实施方案中，成熟IL-7可以指在表达并分泌IL-7的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-7蛋白。在一些实施方案中，人成熟IL-7可以指在表达并分泌人IL-7的人细胞中内质网里合成并借助高尔基体分泌的IL-7蛋白并且正常情况下含有由如SEQ ID NO:80中所示的核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，IL-7可以包含IL-7片段、IL-7变体、IL-7突变蛋白或IL-7突变体。在一些实施方案中，本文所述的IL-7片段至少部分地有功能，即与野生型或全长IL-7相比，可以按相似或较低水平展现IL-7活性。在一些实施方案中，本文所述的IL-7片段可以有完整功能，即与野生型或全长IL-7相比，可以按相同水平展现IL-7活性。在一些实施方案中，IL-7变体、IL-7突变蛋白或IL-7突变体可以包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-7氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7变体、IL-7突变蛋白或IL-7突变体至少部分地有功能，即与野生型IL-7相比，可以按相似或较低水平展现IL-7活性。在一些实施方案中，IL-7变体、IL-7突变蛋白或IL-7突变体可以有完整功能，即与野生型IL-7相比，可以按相同水平展现IL-7活性。在一些实施方案中，与野生型IL-7相比，IL-7变体、IL-7突变蛋白或IL-7突变体可以按较高水平展现IL-7活性。
编码IL-7的mRNA可以指一种mRNA，所述mRNA包含了编码具有177个氨基酸的人IL-7前肽的核苷酸序列或编码具有152个氨基酸的人成熟IL-7的核苷酸序列。编码人IL-7前肽的核苷酸序列和编码人成熟IL-7的核苷酸序列可以经密码子优化。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含1个IL-7mRNA副本。在一些情况下，本文提供的重组RNA构建体可以包含2个或更多个IL-7mRNA副本。
靶基因
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含靶基序。如本文所用的靶基序或靶向基序可以指存在于新合成的多肽或蛋白质中的任何短肽，其中所述新合成的多肽或蛋白质被运往除细胞质或细胞溶胶之外的细胞膜、胞外区室或胞内区室的任何部分。在一些实施方案中，肽可以指一系列彼此连接的氨基酸残基，一般通过在毗邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间肽键连接。胞内区室包括但不限于胞内细胞器如胞核、核仁、内体、蛋白酶体、核糖体、染色质、核被膜、核孔，外泌体、黑素体、高尔基体、过氧化物酶体、内质网(ER)、溶酶体、中心体、微管、线粒体、叶绿体、微丝、中间丝或胞质膜。在一些实施方案中，信号肽可以称作信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。在一些实施方案中，靶基序与编码目的基因的核酸序列有效连接。在一些实施方案中，术语“有效连接”可以指两个或更多个核酸序列之间的功能性关系，例如，转录调节物或信号序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果某编码性序列表达为一种前蛋白，所述前蛋白参与导引编码性序列编码的多肽至细胞膜、胞内或胞外区室，则该靶基序或编码靶基序的核酸与该编码性序列有效连接。例如，如果某编码性序列表达为一种前蛋白，所述前蛋白参与导引编码性序列编码的多肽分泌，则该信号肽或编码信号肽的核酸与该编码性序列有效连接。例如，如果启动子刺激或调节编码性序列转录，则该启动子为有效连接。靶基序的非限制性示例包括信号肽、核定位信号(NLS)、核仁定位信号(NoLS)、溶酶体靶向信号、线粒体靶向信号、过氧化物酶体靶向信号、微管末端定位信号(MtLS)、内体靶向信号、叶绿体靶向信号、高尔基体靶向信号、内质网(ER)靶向信号、蛋白酶体靶向信号、膜靶向信号、跨膜靶向信号、中心体定位信号(CLS)或任何向细胞膜、胞外区室或胞内区室的某个部分导引蛋白质的其他信号。
信号肽是存在于运往分泌途径的新合成蛋白质的N末端处的短肽。本发明的信号肽可以长10-40个氨基酸。信号肽可以位于目的蛋白的N末端或原蛋白形式的目的蛋白的N末端处。信号肽可以为真核源。在一些实施方案中，信号肽可以是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，信号肽可以是人蛋白质。在一些情况下，信号肽可以是同源信号肽(即来自相同蛋白质)或异源信号肽(即来自不同的蛋白质或合成性信号肽)。在一些情况下，信号肽可以是蛋白质的天然存在信号肽或已修饰信号肽。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含靶基序，其中靶基序可以选自(a)对目的基因编码的蛋白质呈异源的靶基序；(b)对目的基因编码的蛋白质呈异源的靶基序，其中对目的基因编码的蛋白质呈异源的靶基序通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序；(d)与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序，其中与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过；和(e)没有自然界中靶基序的功能的天然存在性氨基酸序列，其中天然存在性氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过。
本文提供包含重组RNA构建体的组合物，所述构建体包含靶基序，其中靶基序是信号肽。在一些实施方案中，信号肽选自：(a)对目的基因编码的蛋白质呈异源的信号肽；(b)对目的基因编码的蛋白质呈异源的信号肽，其中对目的基因编码的蛋白质呈异源的信号肽通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过，前提是该蛋白质不是氧化还原酶；(c)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽；(d)与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽，其中与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过；和(e)在自然界中没有信号肽功能的天然存在性氨基酸序列，其中天然存在性氨基酸序列任选地通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰过。在一些情况下，信号肽N末端的氨基酸1-9具有高于2的平均疏水性评分。
在一些情况下，如本文所用的对目的基因编码的蛋白质呈异源的靶基序或对目的基因编码的蛋白质呈异源的信号肽可以指与蛋白质的天然存在性靶基序或信号肽不同的天然存在性靶基序或信号肽。例如，靶基序或信号肽未衍生自目的基因。通常，对给定蛋白质呈异源的靶基序或信号肽是来自另一种与给定蛋白质无关的蛋白质的靶基序或信号肽。例如，对给定蛋白质呈异源的靶基序或信号肽具有这样的氨基酸序列，其异于给定蛋白质的靶基序或信号肽的氨基酸序列超过50％、60％、70％、80％、90％或超过95％。尽管异源序列可以衍生自相同生物，但它们天然地(在自然界中)不出现于相同核酸分子中，如不出现于相同mRNA中。对蛋白质呈异源的靶基序或信号肽和该靶基序或信号肽对其呈异源的蛋白质可以具有相同或不同起源。在一些实施方案中，它们为真核源。在一些实施方案中，它们为相同真核生物的。在一些实施方案中，它们为哺乳动物源。在一些实施方案中，它们为相同哺乳动物生物的。在一些实施方案中，它们为人源。例如，RNA构建体可以包含编码人IL-2基因的核酸序列和另一种人细胞因子的信号肽。在一些实施方案中，RNA构建体可以包含对蛋白质呈异源的信号肽，其中信号肽和蛋白质为相同起源，即人源。
在一些情况下，如本文所用的与目的基因编码的蛋白质同源的靶基序或与目的基因编码的蛋白质同源的信号肽可以指蛋白质的天然存在性靶基序或信号肽。与某蛋白质同源的靶基序或信号肽是由该蛋白质的基因如其在自然界中出现那样编码的靶基序或信号肽。与蛋白质同源的靶基序或信号肽通常为真核源。在一些实施方案中，与蛋白质同源的靶基序或信号肽为哺乳动物源。在一些实施方案中，与蛋白质同源的靶基序或信号肽为人源。
在一些实施方案中，没有自然界中靶基序的功能的天然存在性氨基酸序列或者没有如本文所用的自然界中信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列可以指在自然界中出现并且与自然界中出现的任何靶基序或信号肽的氨基酸序列不相同的氨基酸序列。没有自然界中靶基序或信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列可以长10-50个氨基酸之间。在一些实施方案中，没有自然界中靶基序或信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列为真核源并且与任何真核源靶基序或信号肽不相同。在一些实施方案中，没有自然界中靶基序或信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列为哺乳动物源并且与任何哺乳动物源靶基序或信号肽不相同。在一些实施方案中，没有自然界中靶基序或信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列为哺乳动物源并且与自然界中出现的任何人源靶基序或信号肽不相同。没有自然界中靶基序或信号肽的功能的天然存在性氨基酸序列通常是蛋白质的编码性序列的氨基酸序列。如本文所用的术语“天然存在性”、“天然”和“在自然界中”具有等同含义。
在一些情况下，如本文所用的信号肽的N末端氨基酸1-9可以指信号肽的氨基酸序列N末端的前九个氨基酸。类似地，如本文所用的信号肽的N末端氨基酸1-7可以指信号肽的氨基酸序列N末端的前七个氨基酸并且信号肽的N末端氨基酸1-5可以指信号肽的氨基酸序列N末端的前五个氨基酸。
在一些情况下，通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的氨基酸序列可以指在氨基酸序列内部包含至少一个氨基酸的氨基酸置换、插入和/或缺失的氨基酸序列。例如，如本文所用，与通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰的目的基因编码的蛋白质呈异源的靶基序或与通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰的目的基因编码的蛋白质呈异源的信号肽可以指与蛋白质是异源的靶基序或信号肽，该蛋白质中对其天然存在性氨基酸序列内部包含至少一个氨基酸的氨基酸置换、插入、和/或缺失的蛋白质呈异源的氨基酸序列。例如，如本文所用，与通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰的目的基因编码的蛋白质同源的靶基序或与通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰的目的基因编码的蛋白质同源的信号肽可以指与蛋白质同源的，该蛋白质在其天然存在性氨基酸序列内部包含至少一个氨基酸的氨基酸置换、插入、和/或缺失的靶基序或信号肽。在一些实施方案中，可以通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸修饰天然存在性氨基酸序列并且天然存在性氨基酸序列可以在其天然存在性氨基酸序列内部包含置换、插入、和/或缺失至少一个氨基酸的氨基酸。氨基酸置换或置换可以指将氨基酸序列或多肽序列中特定位置处的某氨基酸替换为另一种氨基酸。例如，置换R34K指一种多肽，其中位置34处的精氨酸(Arg或R)为赖氨酸(Lys或K)替换。对于前述示例，34K提示将位置34处的氨基酸置换成赖氨酸(Lys或K)。在一些实施方案中，多个置换一般由斜线分隔。例如，R34K/L38V指包含置换R34K和L38V的变体。氨基酸插入或插入可以指在氨基酸序列或多肽序列中特定位置处加入氨基酸。例如，插入物-34指在位置34处插入。氨基酸缺失或缺失可以指在氨基酸序列或多肽序列中特定位置处移除氨基酸。例如，R34-指缺失位置34处的精氨酸(Arg或R)。
在一些情况下，缺失的氨基酸是疏水性评分低于-0.8、-0.7、-0.6、-0.5、-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或低于1.9的氨基酸。在一些情况下，置换用氨基酸是疏水性评分高于被置换氨基酸的疏水性评分的氨基酸。例如，置换用氨基酸是疏水性评分2.8和更高，或3.8和更高氨基酸。在一些情况下，插入的氨基酸是疏水性评分2.8和更高或3.8和更高氨基酸。
在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可以包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可以包含1至7个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可以不包含氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N末端的氨基酸1-30内部包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N末端的氨基酸1-30内部包含1至9个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些情况下，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N末端的氨基酸1-20内部包含1至15个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸序列可以在靶基序或信号肽的氨基酸序列的N末端的氨基酸1-20内部包含1至9个氨基酸插入、缺失和/或置换。在一些情况下，可以任选通过缺失和/或置换来修饰本文所述的氨基酸序列的至少一个氨基酸。
在一些情况下，与无修饰的信号肽相比，修饰的信号肽的氨基酸序列的N末端前九个氨基酸的平均疏水性评分升高1.0个单位或以上。在一些情况下，疏水性评分或疏水度评分可以在本文中与亲水性评分同义使用并且可以指如根据Kyte-Doolittle尺度(Kyte J.,Doolittle R.F.；J.Mol.Biol.157:105-132(1982))计算的氨基酸疏水性程度。根据Kyte-Doolittle尺度的氨基酸疏水性评分如下：
表B.氨基酸疏水性评分
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在一些情况下，可以通过加合氨基酸序列中每个氨基酸根据Kyte-Doolittle尺度的疏水性评分除以氨基酸数目，计算氨基酸序列的平均疏水性评分。例如，信号肽的氨基酸序列N末端的氨基酸1-9的平均疏水性评分可以通过加合九个氨基酸各自的疏水性评分除以九来计算。
根据Zimmerman极性指数(Zimmerman J.M.,Eliezer N.,Simha R.；J.Theor.Biol.21:170-201(1968))计算极性。在一些实施方案下，可以通过加合氨基酸序列中每个氨基酸根据Zimmerman极性指数计算的极性值除以氨基酸数目，计算氨基酸序列的平均极性。例如，信号肽的氨基酸序列N末端的氨基酸1-9的平均极性可以通过加合N末端氨基酸1-9的九个氨基酸各自的平均极性除以九来计算。根据Zimmerman极性指数的极性氨基酸如下：
表C.氨基酸极性
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在一些情况下，白介素2(IL-2)的天然存在性信号肽可以用一个或多个置换、缺失和/或插入修饰，其中IL-2的天然存在性信号肽指Uniprot数据库中作为P60568或Q0GK43和Genbank数据库中作为NM_000586.3的IL-2氨基酸序列的氨基酸1-20。在一些情况下，IL-2信号肽的氨基酸序列可以用选自Y2L、R3K、R3-、M4L、Q5L、S8L、S8A、-13A、L14T、L16A、V17-和V17A的一个或多个置换、缺失和/或插入修饰。在一些情况下，野生型(WT)IL-2信号肽氨基酸序列包含了含有SEQ ID NO:26的序列。在一些情况下，修饰的IL-2信号肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。在一些情况下，修饰的IL-2信号肽由选自SEQ ID NOs:31-33的DNA序列编码。
表达载体和产生RNA构建体
本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体编码重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)编码目的基因的mRNA；和(ii)至少一个能够与靶mRNA结合的siRNA。例如，编码目的基因的mRNA可以是IL-2、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。例如，靶mRNA可以是VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、MICA、MICB、ERp5、ADAM、MMP、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。本文还提供包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体编码本文所述的RNA构建体，例如包含编码细胞因子的第一RNA的重组RNA构建体，所述第一RNA与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件可以减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达。例如，细胞因子可以是IL-2、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。例如，与肿瘤增生或血管生成相关的基因可以是VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1、c-Myc、其片段或其功能性变体。VEGFA同工型的非限制性示例包括VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF165B、VEGF183、VEGF189、VEGF206、L-VEGF121、L-VEGF165、L-VEGF189、L-VEGF206、同工型15、同工型16、同工型17和同工型18。例如，与免疫系统识别相关的基因可以是MICA、MICB、ERp5、ADAM、MMP、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码1、2、3、4、5个或更多个siRNA种类。在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码针对靶mRNA的1个siRNA种类。在相关方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3种siRNA，后者各自针对靶mRNA。在相关方面，siRNA种类每者可以包含相同序列、不同序列或其组合。例如，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3种siRNA，各自针对靶mRNA的相同区域或序列。例如，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3种siRNA，各自针对靶mRNA的不同区域或序列。在一些方面，编码重组RNA构建体的重组多核酸构建体可以编码3个siRNA种类，其中3个siRNA种类各自针对不同的靶mRNA。在一些实施方案中，靶mRNA可以是VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、MICA、MICB、ERp5、ADAM17、MMP、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc的mRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含选自SEQ ID NOs:82-98的序列。
本文所述的多核酸构建体可以通过本领域已知的任何方法获得，如通过化学合成的DNA链、通过PCR或通过Gibson组装法。通过化学合成或PCR方法或Gibson组装法组合构建多核酸构建体的优点是，可以优化密码子以确保融合蛋白按高水平在宿主细胞中表达。密码子优化可以指通过以下方式修饰核酸序列以便在目的宿主细胞中表达的过程：将天然序列的至少一个密码子(例如，多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)替换成在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子，同时维持天然氨基酸序列。可轻易获得密码子选择表，例如，在“密码子选择数据库”，并且这些表可以按许多方式改编。还可获得对特定序列作密码子优化以便在特定宿主细胞中表达的计算机算法，如Gene(Aptagen,PA)和/>(ThermoFischer,MA)。一旦获得，多核苷酸即可以并入合适的载体中。如本文所用的载体可以指用于体内或体外摄取、增殖、表达或传递核酸的天然存在或合成生成的构建体，例如，质粒、微环、噬菌粒、粘粒、人工染色体/微型染色体、细菌噬菌体、病毒如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、细菌噬菌体。用来构建载体的方法为所属技术领域的技术人员熟知并且描述于各种出版物中。具体而言，本领域技术人员已知构建合适载体的技术，包括对功能性和调节性组件如启动子、增强子、终止和多聚腺苷化信号、选择标记、复制起点和剪接信号的说明。多种载体为本领域熟知并且一些可商业地获自企业，如Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.；Invitrogen,Carlsbad,Calif.；Promega,Madison,Wis.；Thermo Fisher Scientific；或Invivogen,San Diego,Calif。体外转录用载体的非限制性示例包括pT7CFE1-CHis、pMX(如pMA-T、pMA-RQ、pMC、pMK、pMS、pMZ)、pEVL、pSP73、pSP72、pSP64和pGEM(如/>-4Z、/>-5Zf(+)、/>-11Zf(+)、/>-9Zf(-)、/>-3Zf(+/-)、/>-7Zf(+/-))。在一些情况下，重组多核酸构建体可以是DNA。
如本文所述的多核酸构建体可以为环形或线形。例如，环形多核酸构建体可以包括载体系统如pMX、pMA-T、pMA-RQ或pT7CFE1-CHis。例如，线形多核酸构建体可以包括线形载体如pEVL或线性化载体。在一些情况下，重组多核酸构建体还可以包含启动子。在一些情况下，启动子可以存在于编码第一RNA的序列或编码第二RNA的序列上游。启动子的非限制性示例可以包括T3、T7、SP6、P60、Syn5和KP34。在一些情况下，本文提供的重组多核酸构建体可以包含T7启动子，所述启动子包含了含有TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:18)的序列。在一些情况下，重组多核酸构建体还包含编码Kozak序列的序列。Kozak序列可以指作为蛋白质翻译位点发挥作用的核酸序列基序。文献中详述了Kozak序列，例如，Kozak,M.,Gene299(1-2):1-34，所述通过引用方式完整并入本文。在一些实施方案中，重组多核酸构建体包含了编码Kozak序列的序列，所述Kozak序列包含了含有GCCACC(SEQ ID NO:19)的序列。在一些情况下，本文所述的重组多核酸构建体可以经密码子优化。
本本文提供包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体编码本文所述的重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含一个或多个编码能够与靶RNA结合的siRNA的核酸序列和一个或多个编码目的基因的核酸序列，其中能够与靶RNA结合的siRNA不是目的基因编码的内含子序列的一部分。在一些情况下，目的基因在无RNA剪接下表达。在一些情况下，能够与靶RNA结合的siRNA结合于靶mRNA的外显子。在一些情况下，能够与靶RNA结合的siRNA特异性结合于一种靶RNA。在一些情况下，重组多核酸构建体可以包含核酸序列，所述核酸序列包括选自SEQ ID NOs:82-98的序列。
本文提供产生本文所述的RNA构建体组合物的方法。例如，重组RNA构建体可以通过体外转录从多核酸构建体产生，所述多核酸构建体包含RNA聚合酶的启动子、至少一个编码目的基因的核酸序列、至少一个编码能够与靶mRNA结合的siRNA的核酸序列，和编码聚腺苷酸尾的核酸序列。体外转录反应可以进一步包含RNA聚合酶、核苷酸三磷酸(NTPs)混合物和/或加帽酶。使用体外转录产生RNA以及分离和纯化已转录RNA的详情为本领域熟知并且可以例如在以下中找到：Beckert和Masquida((2011)Synthesis of RNA by In vitroTranscription(《体外转录法合成RNA》).RNA.Methods in Molecular Biology(Methodsand Protocols),第703卷.Humana Press)。体外转录物试剂盒的非限制性清单包括MEGAscriptTMT3转录试剂盒、MEGAscript T7 kit、MEGAscriptTMSP6转录试剂盒、MAXIscriptTMT3转录试剂盒、MAXIscriptTMT7转录试剂盒、MAXIscriptTMSP6转录试剂盒、MAXIscriptTMT7/T3转录试剂盒、MAXIscriptTMSP6/T7转录试剂盒、mMESSAGE mMACHINETMT3转录试剂盒、mMESSAGE mMACHINETMT7转录试剂盒、mMESSAGE mMACHINETMSP6转录试剂盒、MEGAshortscriptTMT7转录试剂盒、HiScribeTMT7高产率RNA合成试剂盒、HiScribeTMT7体外转录试剂盒、AmpliScribeTMT7-FlashTM转录试剂盒、AmpliScribeTMT7高产率转录试剂盒、AmpliScribeTMT7-FlashTMBiotin-RNA转录试剂盒、T7转录试剂盒、HighYield T7 RNA合成试剂盒、T7转录试剂盒等。
体外转录反应还可以包含转录缓冲系统、核苷酸三磷酸(NTPs)和RNA酶抑制物。在一些实施方案中，转录缓冲系统可以包含二硫苏糖醇(DTT)和镁离子。NTP可以是天然存在的或非自然存在(修饰)的NTP。非自然存在(修饰)的NTP的非限制性示例包括N1-甲基假尿苷、假尿苷、N1-乙基假尿苷、N1-甲氧甲基假尿苷、N1-丙基假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲氧尿苷、5-甲基尿苷、5-羧甲酯尿苷、5-甲酰基尿苷、5-羧尿苷、5-羟尿苷、5-溴代尿苷、5-碘代尿苷、5,6-二氢尿苷、6-氮尿苷、噻吩并尿苷、3-甲基尿苷、1-羧甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧胞苷、5-羟胞苷、5-碘代胞苷、5-溴代胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、4-甲氧基-假异胞苷与4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、N1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-甲基-2-氨基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。DNA依赖性RNA聚合酶的非限制性示例包括T3、T7、SP6、P60、Syn5和KP34 RNA聚合酶。在一些实施方案中、RNA聚合酶选自T3 RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、P60 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶和KP34 RNA聚合酶。
如本文所述，可以从体外转录反应混合物分离和纯化转录的RNA。例如，可以使用柱纯化法分离并且纯化转录的RNA。从体外转录反应混合物分离和纯化已转录RNA的详情为本领域熟知并且可以使用任何市售试剂盒。RNA纯化试剂盒的非限制性清单包括MEGAclear试剂盒、RNA Cleanup试剂盒、/>RNA纯化试剂盒、/>RNAClean-up等。
治疗性应用
本文提供可用于治疗癌症的组合物。在一些方面，该组合物按足够治疗或预防疾病或病状的量存在或施用。本文提供组合物，所述组合物包含编码细胞因子的第一RNA，所述第一RNA与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件可以减少与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的基因表达。在一些实施方案中，细胞因子可以包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，可以减少与肿瘤增生相关或血管生成的基因表达的遗传元件可以包括靶向VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1、c-Myc、其片段或其功能性变体的siRNA。在一些实施方案中，可以减少与免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件可以包括靶向MICA、MICB、ERp5、ADAM、MMP、其片段或其功能性变体的siRNA。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。
本文中还提供药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任何RNA组合物和可药用辅料。药物组合物可以指包含向有需求的受试者待施用的治疗有效量活性药用成分连同一种或多种可药用辅料的混合物或溶液。术语“可药用”指可用于制备药物组合物的物质的属性，所述物质通常安全、无毒且既非生物学不利，也非其他不利的，并且为兽医以及人制药用途可接受。术语“可药用”可以指不废除化合物的生物学活性或性能且相对无毒的物质，如载体或稀释剂，即该物质可以施用至个体，不造成不利生物学效应或不以有害方式与其中包含该物质的组合物的任一组分相互作用。可药用辅料可以指药物组合物中没有治疗活性且对所施用的受试者无毒的任何可药用成分，如在配制药物产品中所用的崩解剂、粘结剂、填料、溶剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、运载体、稀释剂、辅料、防腐剂或润滑剂。药物组合物可以促进向生物施用化合物并且可以按常规方式使用一种或多种可药用非活性成分配制，所述可药用非活性成分促进将活性化合物加工成可按药学方式使用的制剂。恰当的制剂依赖于选择的施用途径并且药物组合物概要可以例如存在于通过引用方式并入本文的以下文献中：Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《药学科学与实践》),第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical Dosage Forms(《药物剂型》),Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；及Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems(《药物剂型与药物递送系统》),第7版(LippincottWilliams&Wilkins 1999)。在一些实施方案中，可以通过在水溶液中溶解活性物质(例如，本文所述的重组多核酸构建体或RNA构建体)配制药物组合物，用于注射至患病组织或患病细胞。在一些实施方案中，可以通过在水溶液中溶解活性物质(例如，本文所述的重组多核酸构建体或RNA构建体)配制药物组合物，用于直接注射至患病组织或患病细胞。在一些实施方案中，患病组织或患病细胞包括肿瘤或肿瘤细胞。
本文中还提供在有需求的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向患癌症的受试者施用治疗有效量的本文所述的组合物或药物组合物。如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指正在施用的药剂或化合物的足够量，所述足够量将缓解正在接受治疗的疾病或病状的一个或多个症状到某个程度；例如减少和/或减轻一个或多个体征、症状或疾病原因或生物系统的任何其他预期改变。例如，治疗性用途的“有效量”可以是药剂的引起一个或多个疾病症状有临床意义减少的量。可以使用技术如剂量递增研究在个例中确定适宜的“有效”量。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗着”或“治疗”包含缓解、削弱或减轻疾病或病状的至少一个症状、预防额外症状、抑制疾病或病状，例如，制止疾病或病状形成、减轻疾病或病状、造成疾病或病状消退、减轻疾病或病状所致状况、或预防性和/或治疗性阻止疾病或病状的症状。在一些实施方案中，治疗疾病或病状包括缩减患病组织或患病细胞的尺寸。在一些实施方案中，治疗受试者中的疾病或病状包括提高受试者存活。在一些实施方案中，治疗疾病或病状包括减少或缓解疾病严重程度、延迟疾病发作、抑制疾病进展、减少受试者住院或住院时长、改善受试者生活质量、减少与疾病相关的症状的数目、减轻或缓解与疾病相关的症状的严重程度、减少与疾病相关的症状的持续时间、防止与疾病相关的症状复发、抑制疾病症状的形成或发作、或抑制与疾病相关的症状进展。在一些实施方案中，治疗癌症包括减少肿瘤尺寸或增加癌症患者的存活。
在一些情况下，受试者可以涵盖哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于哺乳纲的任何成员：人、非人灵长类如黑猩猩和其他猿物种与猴物种；家畜如牛、马、羊、山羊、猪；家养动物如兔、犬和猫；实验室动物，包括啮齿类，如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一些情况下，哺乳动物是人。在一些情况下，受试者可以是动物。在一些情况下，动物可以包括人类和非人类动物。在一个实施方案中，非人类动物可以是哺乳动物，例如啮齿类如大鼠或小鼠。在另一个实施方案中，非人类动物可以是小鼠。在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，受试者是人。在一些情况下，受试者是成人、幼儿或婴儿。在一些情况下，受试者是伴侣动物。在一些情况下，受试者是猫、犬或啮齿类。在一些情况下，受试者是犬或猫。
本文还提供治疗癌症的方法，所述方法包括施用本文所述的组合物或药物组合物至癌症受试者。在一些情况下，癌症是实体瘤。在一些情况下，实体瘤可以包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、Wilm肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、Ew肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌症、间皮瘤、非小细胞肺癌、非黑素瘤性皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、和甲状腺癌。在一些实施方案中，实体瘤可以包括肉瘤、癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，实体瘤可以为良性或恶性。
在一些情况下，癌症是头颈癌。不希望受任何理论约束，头颈癌是全球第六大最常见癌症并且占实体瘤的6％。每年大约650,000新患者经诊断患有头颈癌，并且尽管可提供晚期治疗选项，全球每年死亡350,000例，美国境内死亡12,000例。升高形成头颈癌概率的危险因素包括吸烟和/或饮酒、延长的阳光暴晒(例如，在唇区或头颈部皮肤)、人乳头瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、性别(例如，男性对比性)、年龄(例如，年龄超过40岁者面临更高风险)、口腔和牙齿卫生状况不良和环境性或职业性吸入物(例如，石棉、木粉、涂料烟尘和其他某些化学品)、使用大麻、营养差、胃食管反流病(GERD)和喉咽返流病(LPRD)、免疫系统削弱、辐射暴露或既往头颈癌史。吸烟是单个最大的头颈癌危险因素，并且包括吸香烟、雪茄或烟斗；咀嚼烟草；使用鼻烟；和二手吸烟。约85％头颈癌与使用烟草有关，并且烟草使用量可能影响预后。另外，几乎25％的头颈癌为HPV阳性。
头颈癌可以包括上呼吸消化道的上皮恶性肿瘤，所述上呼吸消化道包括鼻旁窦、鼻腔、口腔、咽和喉。头颈癌的非限制性示例包括喉癌、下咽癌、扁桃体癌症、鼻腔癌症、鼻旁窦癌、鼻咽癌、转移性鳞状颈部癌症伴隐性原发癌、唇癌、口腔癌、口咽癌、唾液腺癌、脑肿瘤、食管癌、眼癌、甲状旁腺癌、头颈肉瘤和甲状腺癌。本文所述的头颈癌可以位于上呼吸消化道处。上呼吸消化道的非限制性示例包括鼻旁窦、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽、口咽、下咽和喉。
在一些实施方案中，癌症选自头颈癌、黑素瘤和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，头颈癌是头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，头颈癌是喉癌、下咽癌、扁桃体癌症、鼻腔癌症、鼻旁窦癌、鼻咽癌、转移性鳞状颈部癌症伴隐性原发癌、唇癌、口腔癌、口咽癌、唾液腺癌、脑肿瘤、食管癌、眼癌、甲状旁腺癌、头颈肉瘤或甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌。
本文所述的早期治疗癌症可以包括手术摘除肿瘤、放射疗法、使用药物治疗的疗法如化疗、靶向疗法、免疫疗法或其组合。靶向疗法是靶向可能有助于癌生长和存活的特定基因、蛋白质或组织环境的治疗法，并且该治疗法旨在阻断癌细胞生长和传播，同时限制对健康细胞的损伤。对于头颈癌，使用抗体的靶向疗法可以用来抑制细胞增殖、肿瘤增生或生长或抑制肿瘤血管生成。免疫疗法是可以改进、靶向或恢复免疫系统功能以抗击癌症的治疗法。抗体的非限制性示例包括抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体和抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体。癌症免疫疗法的非限制性示例包括免疫系统调节物、T细胞转移疗法、免疫检查点抑制剂和单克隆抗体。免疫系统调节物可以提高针对癌症的免疫应答并且包括诸如白介素和干扰素α(IFNα)等细胞因子。T细胞转移疗法可以指一种治疗，其中免疫细胞从癌症患者取得供离体操纵并且复注射至相同患者。例如，免疫细胞从癌症患者取得供特异性扩充肿瘤识别性淋巴细胞(例如，肿瘤浸润型淋巴细胞疗法)或供修饰细胞以表达特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(例如，CAR T细胞疗法)。免疫检查点抑制剂可以阻断免疫检查点、恢复或允许针对癌细胞的免疫应答。免疫检查点抑制剂的非限制性示例包括程序性死亡-配体1(PD-L1)抑制剂、程序性死亡蛋白1(PD1)抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)抑制剂。单克隆抗体可以旨在结合于特定靶蛋白以阻断癌细胞中靶蛋白的活性(例如，抗EGFR、抗VEGF等)。
在癌症中，减少涉及肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别的基因(例如，VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、MICA、MICB、ERp5、ADAM、MMP、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc、等)表达，与此同时增加细胞因子(例如，IL-2、IL-12、IL-15或IL-7等)表达以增强免疫应答可能具有治疗效果。在一个示例中，可以增加可降低(癌细胞如头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞)增殖速率的IL-2表达。IL-2是调节淋巴细胞活性的细胞因子并且是强力T细胞生长因子。IL-2由抗原刺激的CD4+T细胞、天然杀伤细胞或活化的树状细胞产生并且对CD4+调节性T细胞的维持和分化重要。不希望受约束任何理论，局部IL-2疗法可能造成肿瘤内部或附近血液流动停滞和淋巴液引流停滞，导致肿瘤坏死和血栓形成。在另一个示例中，可以减少可促进肿瘤周围血管生成的VEGF表达以阻断肿瘤生长所需的血液供应。本文所述的VEGF可以是任何VEGF家族成员，包括VEGFA、VEGFA同工型或PIGF。VEGFA同工型的非限制性示例包括VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF165B、VEGF183、VEGF189、VEGF206、L-VEGF121、L-VEGF165、L-VEGF189、L-VEGF206、同工型15、同工型16、同工型17和同工型18。在又一个示例中，可以减少由肿瘤细胞表达的细胞表面糖蛋白MICA和/或MICB(MICA/B)表达以恢复天然杀伤(NK细胞和T细胞)的免疫应答来增强肿瘤消退。MICA/B为NK细胞和淋巴细胞上表达以促进识别和消除肿瘤细胞的天然杀伤第2组成员D(NKG2D)受体所识别。癌细胞可以通过从细胞表面脱落MICA/B以破坏NKG2D识别，逃避免疫监视。癌细胞还可以释放可在肿瘤生长和缺氧期间与NKGD2受体结合的可溶形式的MICA/B，这可能诱导NKG2D内化，以规避免疫应答并破坏NK细胞免疫监视。可以通过抑制或减少涉及膜蛋白脱落的蛋白质表达阻断MICA/B从细胞表面脱落或释放。涉及脱落的蛋白质的示例包括但不限于基质金属蛋白酶(MMP)和解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAMs)。MMP的非限制性示例包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17和MMP19。还可以通过抑制或减少因子表达，阻断MICA/B从细胞表面脱落或释放，其中所述因子涉及调节脱落过程的蛋白质如二硫化物异构酶ERp5。
在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含编码目的基因的mRNA和能够与靶mRNA结合的siRNA。在一些方面，本文提供本文所述的任何RNA组合物或药物组合物用于治疗癌症的方法中，所述组合物包含编码目的基因的mRNA和能够与靶mRNA结合的siRNA。在一些方面，本文提供本文所述的任何RNA组合物或药物组合物以制造用于治疗癌症的药物的用途，所述组合物包含编码目的基因的mRNA和能够与靶mRNA结合的siRNA。在一些方面，本文提供本文所述的任何RNA组合物或药物组合物用于治疗受试者中的癌症，所述组合物包含编码目的基因的mRNA和能够与靶mRNA结合的siRNA。在一些实施方案中，该siRNA能够与VEGF、VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1、c-Myc、其片段或其功能性变体结合。在一些实施方案中，该siRNA能够与MICA、MICB、MICA和MICB二者(MICA/B)、ERp5、ADAM、MMP、其片段或其功能性变体结合。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些实施方案中，编码目的基因的mRNA编码细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。
在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与VEGFA、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc结合的siRNA和编码IL-2、IL-12、IL-15或IL-7的mRNA。在一些方面，本文提供一种本文所述的重组RNA组合物或药物组合物用于癌症治疗方法中，所述组合物包含能够与VEGFA、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc结合的siRNA和编码IL-2、IL-12、IL-15或IL-7的mRNA。在一些方面，本文提供一种本文所述的重组RNA组合物或药物组合物以制造用于治疗癌症的药物的用途，所述组合物包含能够与VEGFA、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc结合的siRNA和编码IL-2、IL-12、IL-15或IL-7的mRNA。在一些方面，本文提供一种本文所述的重组RNA组合物或药物组合物用于治疗受试者中癌症的用途，所述组合物包含能够与VEGFA、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc结合的siRNA和编码IL-2、IL-12、IL-15或IL-7的mRNA。在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与VEGFA同工型的mRNA结合的siRNA和编码IL-2的mRNA。在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与PIGF mRNA结合的siRNA和编码IL-2的mRNA。在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与MICA或MICB的mRNA结合的siRNA和编码IL-2的mRNA。在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与ERp5、ADAM17或MMP的mRNA结合的siRNA和编码IL-2的mRNA。在一些方面，本文提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的重组RNA组合物或药物组合物，所述组合物包含能够与VEGFA、MICA、MICB、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1、或c-Myc的mRNA结合的siRNA和编码IL-2、IL-12、IL-15或IL-7的mRNA。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够与VEGFA mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2、3、4或5种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种或至少5种各自针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种或至少5种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:1-4或125-128(化合物1-化合物4)中所述的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:5(化合物5)、SEQ ID NO:7(化合物7)、SEQ ID NO:8(化合物8)、SEQ ID NO:9(化合物9)、SEQ IDNO:10(化合物10)、SEQ ID NO:129(化合物5)、SEQ ID NO:131(化合物7)、SEQ ID NO:132(化合物8)、SEQ ID NO:133(化合物9)或SEQ ID NO:134(化合物10)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够与PIGF mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对PIGF mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对PIGF mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够与VEGFA同工型的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA同工型的mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含各自针对VEGFA同工型的mRNA的至少3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够与MICA或MICB mRNA结合的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面重组RNA构建体可以包含1种针对MICA或MICB mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对MICA或MICB mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:1-4或125-128(化合物1-化合物4)中所述的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:130(化合物6)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-2mRNA；和(ii)至少一种能够与ERp5、ADAM17或MMP的mRNA结合的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含针对ERp5、ADAM17或MMP的mRNA的1种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含各自针对ERp5、ADAM17、或MMP的mRNA的至少3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-12mRNA；和(ii)至少一种能够与IDH1、CDK4和/或CDK6的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对IDH1 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对CDK4 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对CDK6 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对IDH1 mRNA的siRNA、1种针对CDK4mRNA的siRNA和1种针对CDK6mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对IDH1 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对CDK4mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对CDK6 mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:135(化合物11)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-12mRNA；和(ii)至少一种能够与EGFR、mTOR、和/或KRAS的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对EGFR mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对mTOR mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对KRAS mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对EGFR mRNA的siRNA、1种针对mTORmRNA的siRNA和1种针对KRAS mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对EGFR mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对mTORmRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对KRAS mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:12(化合物12)、SEQ ID NO:13(化合物13)、SEQ ID NO:14(化合物14)、SEQ ID NO:136(化合物12)、SEQ ID NO:137(化合物13)或SEQ ID NO:138(化合物14)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-15mRNA；和(ii)至少一种能够与VEGFA和/或CD155的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对CD155 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA和2种针对CD155 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对CD155 mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:15或139(化合物15)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-15mRNA；和(ii)至少一种能够与VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对PD-L1 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对c-MycmRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA、1种针对PD-L1 mRNA的siRNA和1种针对c-Myc mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对VEGFA mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对PD-L1 mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对c-MycmRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:16或140(化合物16)中所述的序列。
在一些方面，向有需求的受试者施用的组合物或药物组合物包含重组RNA构建体，所述重组RNA构建体包含：(i)IL-7mRNA；和(ii)至少一种能够与PD-L1的mRNA结合的siRNA。在相关方面，多核酸构建体编码或包含至少1、2或3种siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含1种针对PD-L1mRNA的siRNA。在相关方面，重组RNA构建体可以包含至少3种各自针对PD-L1 mRNA的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自是相同的、不同的或其组合。在相关方面，重组RNA构建体可以包含如SEQ ID NO:17或141(化合物17)中所述的序列。
本文所述的重组RNA构建体组合物可以作为联合疗法施用。采用两种或更多种治疗活性剂或治疗药的联合疗法可以使用通过不同作用机制起效的药剂和治疗药。使用作用机制不同的药剂和治疗药的联合疗法可以导致加合效应或协同效应。联合疗法可以允许比单药疗法中所用更低的每种药剂的剂量，因而减少药剂的毒性副作用和/或升高其治疗指数。联合疗法可以降低耐药性癌细胞将形成的可能性。在一些情况下，联合疗法包含影响免疫应答(例如，提高或激活应答)的治疗剂或疗法和影响(例如，抑制或杀伤)肿瘤/癌细胞的治疗剂。在一些情况下，联合疗法可以包含(i)本文所述的重组RNA组合物或药物组合物；和(ii)一种或多种选自手术摘除肿瘤、放射疗法、化疗、靶向疗法和免疫疗法的额外疗法。在一些实施方案中，本文所述的重组RNA组合物或药物组合物可以在一种或多种额外疗法之前、与之同时和/或跟随其后施用至患癌症的受试者用于联合疗法。在一些实施方案中，一种或多种额外疗法包含1、2、3种或更多种额外治疗剂或疗法。
本文所述的组合物和药物组合物可以使用本领域已知的任何合适方法施用至受试者。用于本发明的合适制剂和递送方法通常为本领域熟知。例如，本文所述的组合物可以按多种方式施用至受试者，所述多种方式包括肠胃外、静脉内、真皮内、肌内、结肠、直肠或腹腔内。在一些实施方案中，本文所述的组合物通过注射至受试者来施用。例如，本文所述的组合物可以通过腹膜内注射、肌内注射、皮下注射、肿瘤内注射或静脉内注射至受试者来施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以通过注射至受试者的患病器官或患病组织来施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以通过注射至受试者中肿瘤或癌细胞来施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以肠胃外、静脉内、肌内或经口施用。
本文所述的任一组合物和药物组合物可以连同使用手册一起提供。使用手册可以包含对本领域普通技术人员或主治医生如何根据本发明治疗或预防如本文所述疾病或疾病(例如，癌症如头颈癌)的指导。在一些实施方案中，使用手册可以包含分别关于本文中所述递送/施用模式和递送/施用方案的指导(例如，递送/施用途径、给药方案、递送/施用时间、递送/施用频率等)。在一些实施方案中，使用手册可以包含应如何施用或注射本发明组合物和/或配制供施用或注射的说明。原则上，可以包含已在本文他处相对于递送/施用模式和递送/施用方案所述者作为使用手册中的相应说明。
本文所述的组合物和药物组合物可以用于基因疗法中。在某些实施方案中，本文所述的包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物可以在基因治疗载体中递送至细胞。基因治疗载体和基因递送方法为本领域熟知。这些方法的非限制性示例包括在递送至细胞后具有附加体型或整合型基因组的病毒载体递送系统，包括DNA病毒和RNA病毒；非病毒载体递送系统，包括DNA质粒、裸核酸和与递送载体复合的核酸、转座子系统(递送并整合至宿主基因组中；Moriarity等人(2013)Nucleic Acids Res 41(8),e92；Aronovich等人(2011)Hum.Mol.Genet.20(R1),R14-R20)、逆转录病毒的介导DNA转移(例如，Moloney小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒、和乳腺瘤病毒；参见，例如Kay等人(1993)Science 262,117-119,Anderson(1992)Science 256,808-813)和DNA病毒介导的DNA转移，包括腺病毒、疱疹病毒、细小病毒和腺相关病毒(例如，Ali等人(1994)GeneTherapy 1,367-384)。病毒载体还包括但不限于腺相关病毒载体、腺病毒病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和单纯疱疹病毒载体。能够在宿主基因组中整合的载体包括但不限于逆转录病毒或慢病毒。
在一些实施方案中，本文所述的包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物可以借助直接DNA转移法递送至细胞(Wolff等人(1990)Science 247,1465-1468)。重组多核酸构建体或RNA构建体可以在轻度机械破碎细胞膜、暂时透化细胞后递送至细胞。可以通过温和迫使细胞通过小孔实现对膜的这种轻度机械破坏(Sharei等人PLOS ONE(2015)10(4),e0118803)。在另一个实施方案中，本文所述的包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物可以借助脂质体介导的DNA转移法递送至细胞(例如，Gao和Huang(1991)Biochem.Ciophys.Res.Comm.179,280-285；Crystal(1995)Nature Med.1,15-17；Caplenet al.(1995)Nature Med.3,39-46)。脂质体可以涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集物所形成的多种单层和多层脂质载体。重组多核酸或RNA构建体可以包封于脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内部、借助与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分与脂质体连接、包埋于脂质体中或者与脂质体复合。
调节基因表达
本文提供在细胞中单一RNA转录物同时表达siRNA和mRNA的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含本文所述的任何重组多核酸或RNA构建体的组合物。本文还提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码目的基因，并且其中第二RNA编码能够与靶信使RNA(mRNA)结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中靶mRNA与目的基因编码的mRNA不同，并且其中靶mRNA和目的基因的表达同时受调节。在一些情况下，如本文所用的表达多核酸、基因、DNA或RNA可以指转录和/或翻译该多核酸、基因、DNA或RNA。在一些情况下，如本文所用，调节、增加、上调减少或下调多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)的表达可以指通过影响多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)的转录和/或翻译，调节、增加、上调、减少、下调由该多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)编码的蛋白质的水平。在一些情况下，抑制多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)表达可以指如此影响该多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)的转录和/或翻译，从而减少或消除由该多核酸、基因(如目的基因)、DNA或RNA(如靶mRNA)编码的蛋白质的水平。
例如，本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码能够与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中其蛋白质产物与肿瘤增生、血管生成或免疫系统识别相关的mRNA和细胞因子的表达同时受调节。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够与VEGFA mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-2和VEGFA的表达同时受调节，即IL-2的表达上调并且VEGFA的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFAmRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含如SEQ ID NO:86(化合物5)、SEQID NO:88(化合物7)、SEQ ID NO:89(化合物8)、SEQ ID NO:90(化合物7)或SEQ ID NO:91(化合物10)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:5(化合物5)、SEQ ID NO:7(化合物7)、SEQ ID NO:8(化合物8)、SEQ ID NO:9(化合物9)、SEQ ID NO:10(化合物10)、SEQ ID NO:129(化合物5)、SEQ ID NO:131(化合物7)、SEQ ID NO:132(化合物8)、SEQ ID NO:133(化合物9)或SEQ ID NO:134(化合物10)中包含的序列。
本文还提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够与VEGFA同工型的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-2和VEGFA同工型的表达同时受调节，即IL-2的表达上调并且VEGFA同工型的mRNA表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA同工型的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA同工型的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。
本文还提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够与PIGF mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-2和PIGF的表达同时受调节，即IL-2的表达上调并且PIGF的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对PIGF mRNA的相同区域的siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对PIGF mRNA的不同区域的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对其相同区域、不同区域或其组合。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够与MICA和/或MICB(MICA/B)mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-2和MICA/B的表达同时受调节，即IL-2的表达上调并且MICA/B的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对MICA/B mRNA的相同区域的siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对MICA/B mRNA的不同区域的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对其相同区域、不同区域或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:87(化合物6)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ IDNO:6或130(化合物6)中包含的序列。
本文还提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-2，并且其中第二RNA编码能够与ERp5、ADAM或MMP的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-2和ERp5、ADAM或MMP的表达同时受调节，即IL-2的表达上调并且ERp5、ADAM或MMP的mRNA表达同时下调。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对ERp5、ADAM17或MMP的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对ERp5、ADAM17或MMP的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-12，并且其中第二RNA编码能够与IDH1、CDK4和/或CDK6的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-12、IDH1、CDK4和/或CDK6的表达同时受调节，即IL-12的表达上调并且IDH1、CDK4和/或CDK6的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对IDH1、CDK4和/或CDK6的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对IDH1、CDK4和/或CDK6的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含1种针对IDH1mRNA的siRNA、1种针对CDK4 mRNA的siRNA和1种针对CDK6 mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:92(化合物11)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:11或135(化合物11)中包含的序列。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-12，并且其中第二RNA编码能够与EGFR、mTOR和/或KRAS的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-12、EGFR、mTOR和/或KRAS的表达同时受调节，即IL-12的表达上调并且EGFR、mTOR和/或KRAS的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对EGFR、mTOR和/或KRAS的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对EGFR、mTOR和/或KRAS的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含1种针对EGFRmRNA的siRNA、1种针对mTOR mRNA的siRNA和1种针对KRAS mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:93(化合物12)、SEQ ID NO:94(化合物13)或SEQ IDNO:95(化合物14)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:12(化合物12)、SEQ ID NO:13(化合物13)、SEQ ID NO:14(化合物14)、SEQ ID NO:136(化合物12)、SEQ ID NO:137(化合物13)或SEQ ID NO:138(化合物14)中包含的序列。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-15，并且其中第二RNA编码能够与VEGFA和/或CD155的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-15、VEGFA和/或CD155的表达同时受调节，即IL-15的表达上调并且VEGFA和/或CD155的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA和/或CD155的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA和/或CD155的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA和2种针对CD155 mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:96(化合物15)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:15或139(化合物15)中包含的序列。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-15，并且其中第二RNA编码能够与VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-15、VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的表达同时受调节，即IL-15的表达上调并且VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的mRNA的相同区域的3种siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含各自针对VEGFA、PD-L1和/或c-Myc的mRNA的不同区域的3种siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对相同者、不同者或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含1种针对VEGFA mRNA的siRNA、1种针对PD-L1 mRNA的siRNA和1种针对c-Myc mRNA的siRNA。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:97(化合物16)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:16或140(化合物16)中包含的序列。
本文提供在细胞中同时调节两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码IL-7，并且其中第二RNA编码能够与PD-L1 mRNA结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中IL-7和PD-L1的表达同时受调节，即IL-7的表达上调并且PD-L1的表达同时下调。在相关方面，重组多核酸构建体或RNA构建体可以编码或包含至少1、2、3、4、5种或更多种siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对PD-L1mRNA的相同区域的siRNA。在相关方面，重组多核酸或RNA构建体可以编码或包含3种各自针对PD-L1 mRNA的不同区域的siRNA。在相关方面，至少3种siRNA各自针对其相同区域、不同区域或其组合。在相关方面，重组多核酸构建体可以包含在SEQ ID NO:98(化合物17)中包含的序列。在相关方面，重组RNA构建体可以包含在SEQ ID NO:17或141(化合物17)中包含的序列。
本文提供在细胞中同时上调和下调两个或更多个基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞引入包含重组多核酸构建体或RNA构建体的组合物，所述构建体编码或包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码目的基因(例如，IL-2、IL-12、IL-15或IL-7)，并且其中第二RNA编码能够与靶mRNA(例如，VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、MICA、MICB、ERp5、ADAM、MMP、IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS、CD155、PD-L1或c-Myc)结合的小干扰性RNA(siRNA)；其中靶mRNA与目的基因编码的mRNA不同，并且其中靶mRNA的表达下调并且目的基因表达同时上调。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些实施方案中，通过能够与靶mRNA结合的siRNA下调靶mRNA的表达。在一些实施方案中，通过表达由目的基因编码的mRNA或蛋白质上调目的基因的表达。
说明性实施方案
在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码了调节与肿瘤增生相关的基因表达的遗传元件。在一些实施方案中，细胞因子是白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，细胞因子包含选自SEQ ID NOs:24、44、47、68和80的序列。在一些实施方案中，细胞因子包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的信号肽序列或修饰的信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:26和125-128的序列。在一些实施方案中，IL-2包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的IL-2信号肽序列包含SEQ IDNO:26中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
在一些实施方案中，第一RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，siRNA能够结合与肿瘤增生相关的基因的mRNA。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5或更多种冗余种类的siRNA。在一些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
在一些实施方案中，与肿瘤增生相关的基因包含与血管生成相关的基因。在一些实施方案中，与血管生成相关的基因编码血管内皮生长因子(VEGF)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，VEGF是VEGFA、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，VEGFA包含SEQ ID NO:35中所列的序列。在一些实施方案中，VEGF是VEGFA同工型、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，VEGF是胎盘生长因子(PIGF)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，与肿瘤增生相关的基因包括异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)、雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、分化抗原簇(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)或myc原癌基因(c-Myc)。在一些实施方案中，与肿瘤增生相关的基因包含选自SEQ ID NOs:50、53、56、59、62、65、71、74和77的序列。
在一些实施方案中，第一RNA通过接头与第二RNA连接。在一些实施方案中，接头包含tRNA接头或包含了SEQ ID NO:21中所列序列的接头。在一些实施方案中，本文所述的组合物还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA和第二RNA均为重组的。
在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码了调节与免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。在一些实施方案中，细胞因子是白介素-2(IL-2)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，IL-2包含SEQ ID NO:24中所列的序列。在一些实施方案中，IL-2包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的IL-2信号肽序列包含SEQ ID NO:26中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
在一些实施方案中，第一RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，siRNA能够与编码细胞表面定位蛋白质的与免疫系统识别相关的基因的mRNA结合。在一些实施方案中，与免疫系统识别相关的基因编码MHC I类链相关序列A(MICA)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，MICA包含SEQ ID NO:38中所列的序列。在一些实施方案中，与免疫系统监视相关的基因编码MHC I类链相关序列B(MICB)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，MICB包含SEQ ID NO:41中所列的序列。在一些实施方案中，与免疫系统识别相关的基因编码内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5或更多种冗余种类的siRNA。在一些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
在一些实施方案中，第一RNA通过接头与第二RNA连接。在一些实施方案中，接头包含tRNA接头或包含了SEQ ID NO:21中所列序列的接头。在一些实施方案中，本文所述的组合物还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA和第二RNA均为重组的。
在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-2(IL-2)、IL-15、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节血管内皮生长因子A(VEGFA)、VEGFA同工型、胎盘生长因子(PIGF)、分化抗原簇155(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、myc原癌基因(c-Myc)、其片段或其功能性变体的表达。在一些实施方案中，第一RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，IL-2包含SEQ IDNO:24中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的IL-2信号肽序列包含SEQ ID NO:26中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQID NOs:27-29的序列。在一些实施方案中，IL-15包含了含有SEQ ID NO:68的序列。在一些实施方案中，IL-15包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰IL-15信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的IL-15信号肽序列包含SEQ ID NO:144中所列的序列。
在一些实施方案中，第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，siRNA能够与VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、CD155、PD-L1或c-Myc的mRNA结合。在一些实施方案中，VEGFA包含SEQ ID NO:35中所列的序列。在一些实施方案中，CD155包含了含有SEQ ID NO:71的序列。在一些实施方案中，PD-L1包含了含有SEQ ID NO:74的序列。在一些实施方案中，c-Myc包含包括SEQ ID NO:77的序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5或更多种冗余种类的siRNA。在一些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
在一些实施方案中，第一RNA通过接头与第二RNA连接。在一些实施方案中，接头包含tRNA接头或包含了SEQ ID NO:21中所列序列的接头。在一些实施方案中，本文所述的组合物还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA和第二RNA均为重组的。
在一些方面，本文提供的一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-2(IL-2)、其片段或其功能性变体的第一RNA，所述第一RNA与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节MHC I类链相关序列A(MICA)、MHC I类链相关序列B(MICB)、内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体的表达。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些实施方案中，第一RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，IL-2包含SEQ ID NO:24中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，未修饰的IL-2信号肽序列包含SEQ ID NO:26中所列的序列。在一些实施方案中，该信号肽包含通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸修饰的IL-2信号肽序列。在一些实施方案中，通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。在一些实施方案中，第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，siRNA能够与MICA、MICB、ERp5、ADAM或MMP的mRNA结合。在一些实施方案中，MICA包含SEQ ID NO:38中所列的序列。在一些实施方案中，MICB包含SEQID NO:41中所列的序列。在一些实施方案中，ADAM是ADAM17。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5或更多种冗余种类的siRNA。在一些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。在一些实施方案中，第一RNA通过接头与第二RNA连接。在一些实施方案中，接头包含tRNA接头或包含了SEQ ID NO:21中所列序列的接头。在一些实施方案中，本文所述的组合物还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA和第二RNA均为重组的。
在一些方面，本文提供一种组合物，所述组合物包含了编码白介素-12(IL-12)、IL-7、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)，雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、其片段或其功能性变体的表达。
在一些实施方案中，第一RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，IL-12包含了含有SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:47的序列。在一些实施方案中，IL-12包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰的IL-12信号肽。在一些实施方案中，未修饰的IL-12信号肽包含在SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:143中所列的序列。在一些实施方案中，IL-7包含了含有SEQ ID NO:80的序列。在一些实施方案中，IL-7包含信号肽。在一些实施方案中，该信号肽包含未修饰IL-7信号肽。在一些实施方案中，未修饰的IL-7信号肽包含在SEQ ID NO:128中所列的序列。
在一些实施方案中，第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。在一些实施方案中，siRNA能够与IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS或PD-L1的mRNA结合。在一些实施方案中，IDH1包含了含有SEQ ID NO:50的序列。在一些实施方案中，CDK4包含了含有SEQ ID NO:53的序列。在一些实施方案中，CDK6包含了含有SEQ ID NO:56的序列。在一些实施方案中，mTOR包含了含有SEQ ID NO:62的序列。在一些实施方案中，EGFR包含了含有SEQ ID NO:59的序列。在一些实施方案中，KRAS包含了含有SEQ ID NO:65的序列。在一些实施方案中，PD-L1包含了含有SEQ ID NO:74的序列。
在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。在一些实施方案中，第二RNA包含1、2、3、4、5或更多种冗余种类的siRNA。根据权利要求119或120所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
在一些实施方案中，第一RNA通过接头与第二RNA连接。在一些实施方案中，接头包含tRNA接头或包含了含有SEQ ID NO:21序列的接头。在一些实施方案中，组合物还包含包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。在一些实施方案中，第一RNA和第二RNA均为重组的。
在一些方面，本文提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的组合物中任一者和可药用辅料。在一些方面，本文提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用本文所述的任一组合物或药物组合物。在一些方面，本文提供一种本文所述的任一组合物或药物组合物用于治疗癌症的方法中。在一些方面，本文提供本文所述的任一组合物或药物组合物制造用于治疗癌症的药物的用途。在一些方面，本文提供本文所述的任一组合物或药物组合物用于治疗受试者中癌症的用途。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是头颈癌。在一些实施方案中，头颈癌是头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，头颈癌是喉癌、下咽癌、扁桃体癌症、鼻腔癌症、鼻旁窦癌、鼻咽癌、转移性鳞状颈部癌症伴隐性原发癌、唇癌、口腔癌、口腔癌、口咽癌、唾液腺癌、脑肿瘤、食管癌、眼癌、甲状旁腺癌、头颈肉瘤或甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症位于上呼吸消化道处。在一些实施方案中，上呼吸消化道包括鼻旁窦、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽、口咽、下咽或喉。在一些实施方案中，受试者患有头颈癌。在一些实施方案中，患有头颈癌的受试者具备烟草使用史。在一些实施方案中，患有头颈癌的受试者具有人乳头瘤病毒(HPV)DNA。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些方面，本文提供一种包含重组多核酸构建体的组合物，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ ID NOs:1-17和125-141的核酸序列。
在一些方面，本文提供一种用于调节细胞中两个或更多个基因表达的组合物。在一些方面，本文提供一种细胞，其包含本文所述的任一组合物。在一些方面，本文提供一种包含重组多核酸构建体的载体，所述重组多核酸构建体编码本文所述的任一组合物。
在一些方面，本文提供一种在细胞中从单一RNA转录物产生siRNA和mRNA的方法，所述方法包括向细胞引入任一的本文所述组合物或本文所述载体。在一些方面，本文提供一种调节蛋白质表达的方法，所述方法包括向细胞中引入任一的本文所述组合物或本文所述载体，其中与没有该组合物或载体的细胞相比，第二RNA编码的蛋白质的表达减少。在一些方面，本文提供一种调节蛋白质表达的方法，所述方法包括向细胞中引入任一的本文所述组合物或本文所述载体，其中与没有该组合物或载体的细胞相比，第一RNA编码的蛋白质的表达增加。在一些方面，本文提供一种调节蛋白质表达的方法，所述方法包括向细胞中引入任一的本文所述组合物或本文所述载体，其中与没有该组合物或载体的细胞相比，第二RNA编码的蛋白质的表达减少，并且与没有该组合物或载体的细胞相比，第一RNA编码的蛋白质的表达增加。
实施例
这些实施例仅出于说明目的而提供并且不应限制本文所提供权利要求的范围。
实施例1：构建体设计、序列和合成
构建体设计
siRNA和目的基因均同时从体外转录产生的单一转录物(SEQ ID NOs:1-17和125-141)表达。多核苷酸或RNA构建体经工程化以包含在Cheng等人(2018)J.Mater.Chem.B.,6,4638-4644中描述的siRNA，以及在siRNA序列下游或上游进一步包含一个或多个目的基因(图1中显示的一个取向示例)。重组构建体可以编码或包含多于一个靶向相同或不同靶mRNA的siRNA序列。同样地，构建体可以包含两个或更多个目的基因的核酸序列。接头序列可以存在于构建体的任何二个元件之间(例如，Cheng等人2018描述的tRNA接头或经改造的序列)。
多核酸构建体可以在目的基因序列上游包含T7启动子序列(5’TAATACGACTCACTATA 3’；SEQ ID NO:18)，用于RNA聚合酶结合和在单一转录物中成功体外转录目的基因和siRNA二者。可以使用备选启动子例如，SP6、T3、P60、Syn5和KP34。使用旨在分布于T7启动子、目的基因、和siRNA序列两侧的引物，通过PCR产生转录模板以产生mRNA。反向引物包括一段胸苷(T)碱基(120)(SEQ ID NO:154)，以添加120bp长度的聚腺苷酸尾(SEQ ID NO:153)至mRNA。
构建体合成
如表1中所示的构建体(化合物识别号：化合物1-化合物17)由德国GeneArt(Thermo Fisher Scientific)作为含有T7 RNA聚合酶启动子(pMX，例如，pMA-T、pMK-RQ或pMA-RQ)的载体合成，密码子经优化(GeneOptimizer算法)。表1对每种化合物(Cpd.)显示编码的蛋白质、信号肽性质、siRNA构建体数目(number)和待通过siRNA与相应mRNA结合下调的蛋白质。每个构建体的序列在表2中显示并且如下表所示注释(SEQ ID 1-17)。
表1.化合物1-17的总结
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IL-2：白介素-2，VEGFA：血管内皮生长因子，MICA：MHC I类链相关序列A，MICB：MHCI类链相关序列B，IL-12：白介素-12，IDH1：异柠檬酸脱氢酶；CDK4：细胞周期蛋白依赖性激酶4，CDK6：细胞周期蛋白依赖性激酶6，EGFR：表皮生长因子受体，mTOR：雷帕霉素的机理性靶，KRAS：Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因，IL-15：白介素-15，CD155：分化抗原簇155(脊髓灰质炎病毒受体)，PD-L1：程序性细胞死亡-配体1，c-Myc：Myc原癌基因。
表2.化合物1-17的序列
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粗体＝有义siRNA链
粗体和斜体＝反义siRNA链
下划线＝信号肽
斜体＝Kozak序列
*加下划线序列内部的粗体标示经修饰的信号肽。
表3.所列序列目录
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表4.化合物1-17的质粒载体序列
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粗体＝化合物序列
粗体和下划线＝化合物序列
粗斜体＝Kozak序列
*粗体标示具有已修饰信号肽的构建体。
实施例2：体外转录RNA构建体和数据分析
使用编码化合物1-化合物17的pMA-T(化合物1-化合物4)、pMK-RQ(化合物5)或pMA-RQ(化合物6-化合物17)载体实施基于PCR的体外转录以产生mRNA。使用表5中的正向引物和反向引物，通过PCR产生转录模板。聚腺苷酸尾在模板中编码，产生一个120bp聚腺苷酸尾(SEQ ID NO:153)。鉴于siRNA侧翼区的重复序列，根据需要进行优化以实现特异性扩增。优化包括：1)减少质粒DNA载体的量，2)更改DNA聚合酶(Q5热启动聚合酶，New EnglandBiolabs)，3)减少每个PCR循环的变性时间(30秒至10秒)和延伸时间(45秒/kb至10秒/kb)，4)增加每个PCR循环的复性(10秒至30秒)，和5)增加每个PCR循环的终末延伸时间(至多15分钟)。除避免非特异性引物结合之外，还在冰上配制PCR反应混合物，包括试剂解冻，并且PCR循环次数减至25次。
对于体外转录，在37℃使用T7 RNA聚合酶(MEGAscript试剂盒，Thermo FisherScientific)2小时。合成的RNA用100％ N1-甲基假-UTP做化学修饰并且用抗逆转CAP类似物(ARCA；[m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G])在5'端共转录加帽(Jena Bioscience)。体外转录后，将mRNA使用MEGAclear试剂盒(Thermo Fisher Scientific)做柱纯化并使用Nanophotometer-N60(Implen)定量。
表5.模板生成用引物
使用体外转录，将化合物1-化合物17作为mRNA生成并且在多种体外模型中受测，所述多种体外模型在下文对IL-2、IL-7、IL-12和IL-15表达和与靶基因下调并行的相应蛋白质过量表达的组合效应具体说明。
如下确定构建体的分子量。通过确定每个序列中存在的每种碱基(A、C、G、T或N1-UTP)的总数并且这个数字乘以相应分子量(例如，A：347.2g/mol；C：323.2g/mol；G：363.2g/mol；N1-UTP：338.2g/mol)从每个序列确定每种构建体的分子量。通过加总对每种碱基获得的全部分子量和ARCA分子量817.4g/mol，确定分子量。每种构建体的分子量用来计算每孔中用于转染的mRNA的量至纳摩尔(nM)浓度。
使用GraphPad Prism 8(San Diego,USA)分析数据。为了使用ELISA估计标准品或样品中的蛋白质水平，从标准品或样品的平均吸光度扣除空白的平均吸光度值。根据生产商的方案，生成标准曲线并且使用四参数非线性回归作图。为确定每份样品中的蛋白质浓度，从标准曲线内推不同蛋白质的浓度。通过乘以稀释倍数，计算样品的最终蛋白质浓度。使用Student t检验或单因素方差分析，继而Dunnett多重比较检验，实施统计分析。
实施例3：体外转染HEK-293细胞
将人胚肾细胞293(HEK-293；ATCC CRL-1573，罗克韦尔，MD，USA)维持于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，瑞士巴塞尔Thermofischer，目录号10500-064)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中。为评估IL-2表达，将HEK-293细胞按20,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后转染。随后将细胞在含有10％ FBS的DMEM生长培养基中培育以达到转染前汇合度<80％。此后，遵循生产商的说明，使用脂质转染胺2000(Thermo Fisher Scientific)，用300ng特异性mRNA构建体按mRNA:脂质转染胺(lipofectamine)比率1:1w/v转染HEK-293细胞。移除100μl DMEM并且向每个孔添加50μl Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)，继而是Opti-MEM中的50μl mRNA和脂质转染胺2000复合物。在5小时孵育后，将培养基替换为新鲜的生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时。收集细胞培养上清液以使用ELISA(ThermoFisher目录号887025)测量分泌的IL-2。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
HEK-293细胞中的IL-2分泌
对包含IL-2蛋白编码序列的化合物1-化合物4测试IL-2表达和从HEK-293细胞分泌。使用IL-2ELISA，测量细胞培养上清液中的分泌性IL-2的蛋白质水平并且将其在图2A中参照于化合物1(含有WT IL-2信号肽)表述为变化的倍数。经化合物2-化合物4(含有修饰的IL-2信号肽)转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平约2倍高于经化合物1转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平。总之，数据表明与具有内源性信号肽的化合物1相比，具有同源性已修饰信号肽的化合物2-化合物4可以促进HEK-293细胞中产生的IL-2强化离开细胞。数据代表每种化合物3次重复的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
实施例4：体外转染HaCaT细胞
将人角质形成细胞(HaCaT；AddexBio目录号T0020001)维持于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，瑞士巴塞尔Thermofischer，目录号10500-064)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中。为评估IL-2表达，将HaCaT细胞按15,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后转染。随后将细胞在含有10％ FBS的DMEM生长培养基中培育以达到转染前汇合度<70％。此后，遵循生产商的说明，使用脂质转染胺2000(Invitrogen)，用300ng特异性mRNA构建体按mRNA:脂质转染胺(lipofectamine)比率1:1w/v转染HaCaT细胞。移除100μl DMEM并且向每个孔添加50μlOpti-MEM(Thermo Fisher Scientific)，继而是Opti-MEM中的50μlmRNA和脂质转染胺2000复合物。在5小时孵育后，将培养基替换为新鲜的生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时。收集细胞培养上清液以使用ELISA(ThermoFisher目录号887025)测量分泌的IL-2。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(p<0.01)。
HaCaT细胞中的IL-2分泌
对包含IL-2蛋白编码序列的化合物1-化合物4测试IL-2表达和从HaCaT细胞分泌。使用IL-2ELISA，测量细胞培养上清液中的分泌性IL-2的蛋白质水平并且将其在图2B中参照于化合物1(含有WT IL-2信号肽)表述为变化的倍数。经化合物2-化合物4(含有修饰的IL-2信号肽)转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平约2.7倍高于经化合物1转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平。总之，数据表明与具有内源性信号肽的化合物1相比，具有同源性已修饰信号肽的化合物2-化合物4可以促进HaCaT细胞分泌IL-2。数据代表每种化合物3次重复的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
实施例5：体外转染A549细胞
将人肺上皮癌细胞(A549；Sigma-Aldrich目录号6012804)维持于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，瑞士巴塞尔Thermofischer，目录号10500-064)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中。为评估IL-2表达，将A549细胞按10,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后转染。随后将细胞在含有10％ FBS的DMEM生长培养基中培育以达到转染前汇合度<70％。此后，遵循生产商的说明，使用脂质转染胺2000(Invitrogen)，用变动浓度4.4nM–35.2nM(0.15-1.2μg)的特异性mRNA构建体按mRNA:脂质转染胺(lipofectamine)比率1:1w/v转染A549细胞。移除100μl DMEM并且向每个孔添加50μl Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)，继而是Opti-MEM中的50μl mRNA和脂质转染胺2000复合物。在5小时孵育后，将培养基替换为新鲜的生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时。收集细胞培养上清液以使用ELISA(ThermoFisher目录号887025)测量分泌的IL-2。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
A549细胞中的IL-2分泌
对包含IL-2蛋白编码序列的化合物1-化合物4测试IL-2表达和从A549细胞分泌。使用IL-2ELISA，测量细胞培养上清液中的分泌性IL-2的蛋白质水平并且将其在图2C中参照于化合物1(含有WT IL-2信号肽)表述为变化的倍数。经化合物2-化合物4(含有修饰的IL-2信号肽)转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平约1.6倍高于经化合物1转染的细胞分泌的IL-2的蛋白质水平。总之，数据表明与具有内源性信号肽的化合物1相比，具有同源性已修饰信号肽的化合物2-化合物4可以促进A549细胞中分泌IL-2。数据代表每种化合物3次重复的均数±均数标准误。使用化合物1作为对照，通过单因素方差分析，随后Dunnett多重比较检验评估显著性(**，p<0.01)。
实施例6：A549细胞中IL-2分泌和VEGFA下调的组合效应：VEGFA过量表达模型
体外转染A549细胞
一个VEGFA过量表达模型用来评价A549细胞中化合物5所致的同时性VEGFA RNA干扰(RNAi)和IL-2表达。通过用0.3μg VEGFA mRNA转染A549细胞建立该VEGFA过量表达模型。将A549细胞用递增浓度4.4nM至35.2nM(0.15至1.2μg)的化合物5共转染，以评估化合物5对VEGFA干扰和IL-2过量表达的剂量依赖反应。转染后，将无FBS的生长培养基中的细胞在37℃孵育于含有5％ CO2的增湿气氛中24小时，随后通过ELISA对相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(待下调的靶mRNA；ThermoFisher目录号KHG0112)和IL-2(待过量表达的目的基因；ThermoFisher目录号887025)定量。为评估化合物5相对于市售siRNA(ThermoFisher目录号284703)的效力，使用商品VEGFA siRNA和化合物5进行剂量依赖反应研究。A549细胞经VEGFA mRNA(0.3μg/孔；9.5nM)和商品VEGFA siRNA(0.05、0.125、0.25、1.25和2.5mM)或化合物5(4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.02nM分别对应于0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5μg)共转染。转染后，将无FBS的生长培养基中的细胞在37℃孵育于含有5％CO2的增湿气氛中24小时，随后通过ELISA对相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(待下调的靶mRNA；ThermoFisher目录号KHG0112)和IL-2(待过量表达的目的基因；ThermoFisher目录号887025)定量。
结果
通过用递增剂量的化合物5(4.4nM至35.2nM)和恒定剂量的VEGFA mRNA(9.5nM或300ng/孔)共转染A549细胞并通过ELISA测量细胞培养上清液中的蛋白质水平，对包含3个种类靶向VEGFA的siRNA和IL-2蛋白编码序列的化合物5测试A549细胞中剂量依赖性VEGFA下调和IL-2同时表达。化合物5以剂量依赖性方式(至多超过100ng/ml)降低VEGFA蛋白质水平(高达70％)，同时升高IL-2蛋白水平，如图3中展示。总之，数据表明化合物5可以在不影响IL-2表达时下调VEGFA。数据代表4次重复的均数±均数标准误。
实施例7：SCC-4细胞中IL-2分泌和VEGFA下调的组合效应：VEGFA过量表达模型
体外转染SCC-4细胞
一个VEGFA过量表达模型用来评价SCC-4细胞中化合物5所致的同时性VEGFA RNA干扰(RNAi)和IL-2表达。通过用9.5nM(0.3μg)VEGFA mRNA转染SCC-4细胞建立该VEGFA过量表达模型。将SCC-4细胞用递增浓度4.4nM至35.2nM(0.15至1.2μg)的化合物5共转染，以评估化合物5对VEGFA干扰和IL-2过量表达的剂量依赖反应。转染后，将无FBS的生长培养基中的细胞在37℃孵育于含有5％ CO2的增湿气氛中24小时，随后通过ELISA对相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(待下调的靶mRNA；ThermoFisher目录号KHG0112)和IL-2(待过量表达的目的基因；ThermoFisher目录号887025)定量。为评估化合物5对抗VEGFA表达的效力，SCC-4细胞经9.5nM(0.3μg)VEGFA mRNA和化合物5(4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.02nM对应于0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5μg/孔)共转染。转染后，将无FBS的生长培养基中的细胞在37℃孵育于含有5％ CO2的增湿气氛中24小时，随后通过ELISA对相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(待下调的靶mRNA；ThermoFisher目录号KHG0112)和IL-2(待过量表达的目的基因；ThermoFisher目录号887025)定量。
结果
在其中用VEGFA mRNA转染SCC-4细胞的VEGFA过量表达模型中，测试设计成具有IL-2编码性序列和3个种类靶向VEGFA的siRNA的化合物5以评估同时表达IL-2和干扰VEGFA表达。化合物5降低外源过量表达的VEGFA的水平高达95％并且同时诱导IL-2表达(高于65ng/ml)，如图4A和图4B中展示。总之，化合物5可以减少外源VEGFA的过量表达，而同时诱导IL-2表达和分泌。
实施例8：SCC-4细胞中IL-2分泌和VEGFA下调的组合效应：内源VEGFA表达模型
体外转染SCC-4细胞
因为SCC-4细胞在体外内源过量表达VEGFA高达600pg/mL，故使用SCC-4细胞作为内源VEGFA过量表达模型(图5A)，以评价化合物5所致的同时性VEGFA RNA干扰(RNAi)和IL-2表达。SCC-4细胞经26.4nM(0.9μg)化合物5转染。将细胞在37℃孵育于含有5％ CO2的增湿气氛中24小时，随后通过使用特异性ELISA对相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(ThermoFisher目录号KHG0112)和IL-2(ThermoFisher目录号887025)定量。
结果
测试设计成具有IL-2编码性序列和3个种类靶向VEGFA的siRNA的化合物5以在体外组成型表达VEGFA至多600pg/mL的SCC-4细胞中评估同时表达IL-2和干扰VEGFA表达。化合物5降低内源VEGFA表达水平高达90％并且同时诱导IL-2表达(高达12ng/ml)，如图5A和图5B中展示。总之，化合物5可以降低内源表达的VEGFA的水平，而同时诱导IL-2表达和分泌。
实施例9：化合物5和商品siRNA在VEGFA下调方面的对比分析
体外转染SCC-4细胞
将人舌鳞状癌细胞系(SCC-4；Sigma-Aldrich，Buch瑞士，目录号89062002CRL-1573)在补充有HAM F12(1:1)+2mM谷氨酰胺+10％胎牛血清(FBS)+0.4μg/ml氢化可的松的Dulbecco改良Eagle's高葡萄糖培养基(DMEM，Sigma Aldrich)中维持。将细胞按15,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后转染。随后将细胞在DMEM/HAM F-12生长培养基中培育以达到转染前汇合度<70％。为评估化合物5相对于市售siRNA(ThermoFisher目录号284703)的效力，使用商品VEGFA siRNA和化合物5进行剂量反应研究。SCC-4细胞经9.5nM(0.3μg)VEGFA mRNA和商品VEGFA siRNA(0.05、0.125、0.25、1.25和2.5mM)或化合物5(4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.02nM对应于0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5μg/孔)共转染。遵循生产商的说明，使用脂质转染胺2000(Invitrogen)，用化合物5c mRNA或siRNA构建体按指定浓度，按mRNA:脂质转染胺比率1:1w/v转染SCC-4细胞。移除100μl DMEM并且以50μl Opti-MEM和在50μl Opti-MEM中的mRNA和脂质转染胺2000复合物(Thermo Fisher Scientific)替换。在5小时后，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时。
结果
为计算化合物5对比市售siRNA在下调VEGFA表达方面的抑制性浓度，在SCC-4细胞和A549细胞二者内建立的VEGFA过量表达模型中进行剂量反应研究。两种细胞均经9.5nM(0.3μg)VEGFA mRNA连同递增浓度的化合物5(4.4nM至44.02nM)或商品siRNA(0.05mM至2.5mM)共转染。在减少VEGFA表达方面，与商品siRNA相比，化合物5在SCC-4细胞中显示出19倍更高的效力并在A549细胞中显示超过52倍更高的效力(图6A和图6B)。图6C中显示化合物5在SCC-4细胞中(8nM)及A549细胞中(11nM)的IC50值
实施例10：SCC-4细胞中IL-2分泌和MICB下调的组合效应–内源MICB表达模型
体外转染SCC-4细胞
因为SCC-4细胞在体外组成型表达可溶性MICB(高达40pg/mL)和膜结合型MICB(高达80pg/mL)，故使用SCC-4细胞作为内源MICB表达模型，以评价化合物6所致的同时性的MICB RNA干扰(RNAi)和IL-2表达。SCC-4细胞经35.11nM(0.9μg)化合物6转染并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时。使用ELISA(ThermoFisher目录号BMS2303)定量细胞培养上清液和细胞裂解物中存在的MICB水平。使用ELISA(ThermoFisher目录号887025)测量相同细胞培养上清液存在的IL-2水平。
结果
测试设计成具有IL-2编码性序列和3个种类靶向MICB的siRNA的化合物6，以在体外组成型表达可溶性MICB(高达40pg/mL)和膜结合型MICB(高达80pg/mL)的SCC-4细胞中评估同时表达IL-2和干扰MICB表达。化合物6降低可溶性和膜结合型MICB二者的内源性表达水平分别高达70％和90％并且同时诱导IL-2表达(高达65ng/ml)，如图7A-图7C中展示。简言之，化合物6可以下调内源表达的MICB(可溶性和膜结合型二者)，而同时诱导IL-2表达和分泌。数据代表四次重复的均数±均数标准误。
实施例11：SCC-4细胞中IL-2分泌连同MICA和MICB一并下调的组合效应–内源MICA与MICB表达模型
体外转染SCC-4细胞
除MICB之外，SCC-4细胞在体外组成型表达可溶性MICA(高达200pg/mL)(有功能的MICB类似物)。归因于MICA和MICB之间基因组同源性高(>90％)，化合物6中的siRNA旨在同时干扰MICA和MICB蛋白二者的表达质。为评价化合物6的同步化MICA和MICB RNA干扰(RNAi)连同IL-2表达和分泌，将SCC-4细胞用递增剂量的化合物6mRNA(1.58、2.93、5.85、11.7、23.41、35.11和46.81nM)转染并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时。使用ELISA(RayBioech目录号ELH-MICA-1)定量细胞培养上清液中存在的MICA水平。使用ELISA(ThermoFisher目录号BMS2303)定量相同细胞培养上清液中存在的MICB水平。使用ELISA(ThermoFisher目录号887025)测量相同细胞培养上清液存在的IL-2水平。
结果
测试设计成具有IL-2编码性序列和3个种类靶向MICA和MICB二者的siRNA的化合物6，以在体外组成型表达可溶性MICA和MICB的SCC-4细胞中评估同时表达IL-2和干扰MICA/MICB表达。化合物6以剂量依赖性方式降低可溶性MICA和可溶性MICB的内源性表达水平高达80％并且同时诱导IL-2表达(>150ng/ml)，如图8A和图8B中展示。简言之，化合物6可以下调MICA和MICB内源表达，而同时诱导IL-2分泌。数据代表IL-2水平四次重复和MICA和MICB各自二次重复的均数±均数标准误
实施例12：SK-OV-3球状体模型下对外周血单核细胞肿瘤杀伤测定法中化合物3的生物活性评价
通过使用核-RFP转导的SK-OV-3肿瘤细胞系，在免疫细胞介导肿瘤细胞杀伤中评估化合物3的抗肿瘤活性。对于球状体中化合物3诱导的IL-2表达和分泌，来自二维(2D)培养物的SK-OV-3-NLR细胞按单一密度(5000个细胞/孔)接种入超低贴壁(ULA)平板并且使用脂质转染胺2000，以100ng化合物3构建体转染，随后离心(200x g持续10分钟)以产生球状体。一式四份设立条件。上清液在转染后12、24小时和48小时收获，以通过TR-FRET(PerkinElmer，目录号TRF1221C)测试IL-2表达。对于采用外周血单核细胞(PBMC)的实验，如上文所述生成球状体并且用化合物3(3ng、10ng、30ng和100ng)转染并且培养48小时，以允许球状体在添加PBMC之前达到200-500μm之间的直径。在48小时培养时间后，把来自3位健康捐献者的PBMC在抗CD3抗体存在下添加至各孔(200,000个细胞/孔)。添加人重组IL-2(2000IU/ml)和PBMC至适当的孔作为阳性对照。SK-OV-3-NLR单用条件不接受PBMC。使用IncuCyte(S3)每3小时对孔成像持续7天，测量总核定位RFP(NLR)积分强度变化作为PBMC介导的SK-OV-3球状体肿瘤杀伤作用的读出。将总NLR积分强度对24小时时间点归一化并且使用IncuCyte软件内部的球状体模块分析。这些图表显示使用GraphPad Prism(在每一侧平均化4个值并且使用二阶平滑多项式)从第5天起以附加平滑函数分析的数据。
结果
TR-FRET分析采自球状体的上清液表明IL-2表达和分泌呈时间依赖性增长(图9A)，其中球状体从3D悬浮培养物中用化合物3(100ng)转染的细胞形成。没有发现由于脂质转染胺(lipofectamine)转染而导致的球状体形成和生长。分析添加来自3位健康捐献者的PBMC后经化合物3转染的球状体，显示清晰的剂量依赖性免疫介导杀伤作用。跨全部捐献者，化合物3在30ng和100ng促进测定期间依据NLR总积分强度下降测定的PBMC驱动的肿瘤杀伤作用(第6天数据展现于图9B、图9C和图9D中)。在受测的全部三位捐献者中，化合物3诱导的杀伤效应大幅度优于按6nM浓度添加的人重组IL-2(rhIL-2)。图9E显示一组代表性IncuCyte图像，所述图像显示在第5天与对照相比，在SK-OV-3NLR条件下化合物3处理(100ng)后NLR积分降低。总之，化合物3mRNA构建体转染SK-OV-3NLR球状体以剂量依赖性方式增强PBMC介导的肿瘤杀伤作用。
实施例13：用于JAK3-STAT5激活的HEK-BlueTMhIL-2报道分子测定法
化合物5和化合物6的功能活性在HEK-BlueTMIL-2报道细胞(Invivogen，目录号代码：hkb-il2)中受测，设计该报道细胞旨在通过监测JAK/STAT途径的活化研究人IL-2受体激活。这些细胞衍生自人胚肾HEK293细胞系并且经工程化以表达人IL-2Rα基因、IL-2Rβ基因和IL-2Rγ基因，连同人JAK3基因和STAT5基因，以实现有完全功能的IL-2信号传导级联。另外，引入STAT5诱导型SEAP报道基因。一旦IL-2激活，继而STAT5激活，则可以在细胞培养上清液中用HEK-BlueTM检测细胞培养基实时测定产生的SEAP。通过人重组IL-2(rhIL-2，0.001ng至300ng)或衍生自已经用化合物5或化合物6(0.3μg/孔)转染的HEK293细胞的细胞培养上清液的IL-2(0.001ng–45ng)实现刺激HEK-BlueTMIL-2细胞，细节如下。
将HEK-BlueTMhIL-2细胞维持于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma Aldrich)中。将抗生素杀稻瘟素(10μg/mL)和博莱霉素(100μg/mL)添加至培养基，以选择含有转基因质粒IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ、JAK3、STAT5和SEAP的细胞。将细胞按40,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后刺激。将细胞在含有10％ FBS的DMEM生长培养基中培育以达到刺激前汇合度<80％。收集限定浓度衍生自HEK293细胞培养上清液的IL-2，稀释于20μl培养基中并添加至HEK-BlueTMIL-2细胞的培养基，以测量IL-2受体召集，继而测量JAK3-STAT5途径激活。平行测试从化合物5和化合物6(0.001–45ng)衍生的rhIL-2(0.001-300ng)或IL-2。在2小时孵育后，使用QUANTI-BlueTM(20μl细胞培养上清液+180μl QUANTI-BlueTM溶液)评估SEAP活性并且在SpectraMax i3多模式平板读数仪(Molecular Device)中620nm处读取光密度(O.D.)。使用未转染的样品作为背景对照并且从受测样品内的所获得O.D.值中扣除。
结果
用衍生自HEK293细胞(经化合物5或化合物6转染)的细胞培养上清液中的rhIL-2或IL-2对HEK-BlueTMIL-2细胞刺激是有功能的，因为全部三种受测化合物均以剂量依赖性方式诱导SEAP产生(图10A和图10B)。在直接比较时，相比rhIL-2(EC50：11ng/ml)，化合物5衍生的IL-2约5倍更有效(EC50：0.02ng/ml)，以及相比rhIL-2(EC50：0.15ng/ml)，化合物6衍生的IL-2约2倍更有效(EC50：0.08ng/ml)。总之，衍生自化合物5和化合物6的IL-2有功能且诱导IL-2信号传导级联至少如rhIL-2同样有效。
实施例14：化合物5和化合物6的NK细胞介导的杀伤测定
天然杀伤细胞(NK细胞)具有靶向和消除肿瘤细胞的潜力并且主要由IL-2细胞因子引发。为了测量化合物5和化合物6借助IL-2机制活化NK细胞的能力，使用SCC4细胞(Sigma-Aldrich，Buchs瑞士，目录号89062002CRL-1573)和天然杀伤92细胞(NK-92，DSMZ，ACC488，德国)。使用Opti-MEM中的脂质转染胺MessangerMax(ThermoFisher，目录号LMRNA015)，通过用化合物5(IL-2mRNA+3x VEGFA siRNA)、化合物6(IL-2mRNA+3x MICA/BsiRNA)、模拟RNA-1(IL-4mRNA+3x TNF-αsiRNA)或模拟RNA-2(MetLuc mRNA，无siRNA)转染SCC-4细胞，在SCC4细胞(10,000/孔)中进行剂量响应研究(0.1nM至2.5nM)。随后将SCC-4细胞在黑色96孔培养板中于37℃含有5％CO2的增湿气氛下孵育30分钟。将NK-92效应细胞以Opti-MEM中100,000细胞/孔，按效应子:靶比率10:1(E:T＝10:1)添加至转染的SCC-4靶细胞。在24小时后，将黑色96孔平板用黑色箔在底部密封并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS++，BioConcept，目录号3-05F001)洗涤3次，以移除悬浮的NK-92细胞。由于SCC-4细胞在自然界中有贴壁性，故24小时孵育导致细胞强力贴合至平板底部并且仅洗去NK-92细胞。依据是如果NK细胞导致杀伤SCC-4细胞，则洗涤后存在更少存活并贴附于平板底部的SCC-4细胞，这可以通过细胞活力测定法定量测量。在3次洗涤后，将50μl PBS++和50μl CellTiter-Glo2.0(CTG 2.0、Promega，目录号G924B)试剂添加至每个孔并将96孔平板在室温黑暗下孵育于10分钟。用SpectraMax i3x(Molecular Devices)测量发光，以使用标准设置计算细胞活力。
结果
NK细胞介导的杀伤测定法揭示用化合物5或化合物6转染且与NK-92细胞共孵育的SCC-4细胞发生剂量依赖性细胞溶解。从SCC-4细胞的分泌IL-2在E:T比率10:1促进定向杀伤SCC-4肿瘤细胞(对于化合物5，>50％并且对于化合物6，>40％，图10C)。对化合物5和化合物6二者转染的SCC-4细胞观察到NK细胞介导的杀伤作用。简言之，化合物5和化合物6通过剂量依赖方式活化NK细胞，展示出预计的抗肿瘤活性。
实施例15：化合物7和化合物8在SCC-4细胞中IL-2表达和VEGFA下调方面的对比分析
如上文所述培养和转染SCC-4细胞。为评估化合物7(IL-2mRNA+3xVEGFA siRNA)对比化合物8(IL-2mRNA+5x VEGFA siRNA)的效力，使用两种化合物进行剂量反应研究。将SCC-4细胞用化合物7(1.1、2.2、4.4、8.8、17.6、26.4、35.2和44.04nM/孔)或化合物8(0.47、0.94、1.89、3.79、7.58、15.15、22.73、30.31和37.88nM/孔)转染。在5小时后，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛孵育24小时，并且收集上清液。进行ELISA以定量相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(ThermoFisher目录号KHG0112)水平和IL-2(ThermoFisher目录号887025)水平。使用非线性Hill结合曲线以GraphPad Prism计算VEGFA的80％下调。
结果
为计算化合物7对比化合物8在下调VEGFA表达方面的抑制性浓度，在化合物7或化合物8转染的SCC-4细胞中进行剂量反应研究。将细胞用渐增浓度的化合物7或化合物8如上文所述转染。与化合物7相比，化合物8在SCC-4细胞中减少VEGFA表达方面显示出2.5倍更高的效力(图11A)。在SCC-4细胞中，化合物8在8nM实现VEGF下调80％，而化合物7在18nM实现VEGF下调80％，这显示增加siRNA拷贝数导致更高水平的VEGFA下调。但是，来自化合物8的IL-2表达约2倍低于来自化合物7的IL-2表达(图11B)。总之，增加化合物中siRNA拷贝数提高RNA干扰但是有损mRNA靶的表达。
实施例16：化合物9和化合物10在IL-2表达和VEGFA下调方面的时程研究
如上文所述培养和转染SCC-4细胞。为评估化合物9(IL-2mRNA+3xVEGFA siRNA，相同siRNA重复3次)对比化合物10(IL-2mRNA+3x VEGFA siRNA，30bp长度的3种不同siRNA)的时间效力，使用经化合物9或化合物10转染的SCC-4细胞进行时间过程研究。将SCC-4细胞用化合物9或化合物10按30nM/孔浓度转染。将市售VEGFA siRNA(ThermoFisher目录号284703)添加至实验用于比较并且使用乱序siRNA(Sigma，目录号SIC002)作为对照。随后将细胞在37℃含有5％ CO2的增湿气氛下孵育。在转染后6小时和72小时之间从不同孔收集样品。进行ELISA以定量相同细胞培养上清液中存在的VEGFA(ThermoFisher目录号KHG0112)水平和IL-2(ThermoFisher目录号887025)水平。来自每个时间点处未转染细胞的VEGFA水平设定成100％并且VEGFA下调水平对相应时间点处的水平归一化。
结果
时间过程研究显示对于化合物9和化合物10二者而言，IL-2按相似方式历经72小时积累(图11C)。但是，化合物10导致更强的VEGFA下调直至72小时，因为实现高于95％ RNA干扰水平，而化合物9在48小时后产生85％ RNA干扰水平(图11D)。这种影响甚至在6小时时间点可见，所述时间点显示化合物10所致的VEGFA下调(>30％)高于化合物9所致的VEGFA下调(20％)，如图11D中展示。如先前观察到，商品VEGFA siRNA导致VEGFA下调至多45％。整个实验期间阶段，通用性乱序siRNA未改变VEGFA表达。总之，相比化合物9，化合物10显示长久VEGFA下调，同时效力略微改进。
实施例17：靶向癌症中的多个信号传导途径：体外肿瘤模型中多个siRNA靶和免疫刺激细胞因子的组合
癌症是一种具有促进细胞失控性增殖伴凋亡减少的多个失调信号传导途径的复杂疾病。在肿瘤细胞中观察到包括哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、血管内皮生长因子(VEGFA)、表皮生长因子受体(EGFR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、c-Myc原癌基因(c-Myc)的肿瘤生长信号上调连同诸如MHC I类链相关序列A/B(MICA/B)和程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)等免疫逃逸蛋白高表达。另外，肿瘤微环境显示诸如白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)和白介素-7(IL-7)等免疫刺激细胞因子的水平降低。因此，下调涉及肿瘤生长的关键蛋白质连同上调免疫刺激细胞因子可能是癌症疗法的有吸引力途径。为了测量通过RNA干扰下调多个促肿瘤靶和免疫刺激细胞因子上调，化合物11、化合物12、化合物15和化合物16设计成包含多于一种siRNA靶连同抗肿瘤白介素mRNA。在SCC-4细胞，A549细胞和人胶质母细胞瘤细胞系(U251 MG)细胞中评估这些化合物靶向多个信号传导途径的效果。
SCC-4细胞中的头颈癌体外模型
人舌鳞状癌细胞系(SCC-4)衍生自一位55岁男性的舌并且在这个实施例中用来模拟头颈癌体外模型。如上文所述培养和转染SCC-4细胞。使用化合物11(IL-12mRNA+1x IDH1siRNA+1x CDK4 siRNA+1x CDK6 siRNA)、化合物12(IL-12mRNA+1x EGFR siRNA+1x mTORsiRNA+1x KRAS siRNA)和化合物15(IL-15mRNA+1x VEGFA siRNA+2x CD155 siRNA)平行评估对多个癌症相关靶的调节，将SCC-4细胞用这些化合物按10和30nM/孔浓度转染。转染后5小时，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时，并且收集上清液。进行ELISA以定量细胞培养上清液中存在的人IL-12p70(ThermoFisher目录号88-7126)水平和人IL-15(ThermoFisher目录号88-7620)水平。还处理相应的细胞裂解物，以使用Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green试剂盒(ThermoFisher目录号A25599)和引物(引物序列详情列于表6中)借助RT-qPCR，通过比照未转染样品进行相对定量，测量siRNA靶基因的RNA丰度。使用人18s rRNA作为参考对照。
结果
在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物11或化合物12转染的SCC-4细胞中，就IL-12表达和同时下调靶基因评价包含IDH1、CDK4和CDK6的1xsiRNA与IL-12mRNA的化合物11和包含EGFR、mTOR和KRAS的1x siRNA与IL-12mRNA的化合物12的作用。数据显示化合物11和化合物12均导致IL-12蛋白显著表达和分泌(>7000pg/ml)，如图12A和图12E中所示。在相同的细胞裂解物中，评估化合物11对IDH1，CDK4和CDK6 RNA转录物的RNA干扰。如图12B中展示，化合物11以剂量依赖性方式下调内源IDH1(10nM为75％，30nM为90％)、CDK4(10nM为93％，30nM为98％)和CDK6(10nM为85％，30nM为96％)水平。在图12E的相同细胞裂解物中评估化合物12对EGFR、mTOR和KRAS RNA转录物的RNA干扰。如图12F中所示，化合物12以针对KRAS的剂量依赖性方式下调内源EGFR(10nM为80％，30nM为92％)、KRAS(10nM为92％，30nM为83％)和mTOR(10nM为92％，30nM为98％)水平。
另外，在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物15转染的SCC-4细胞中，就IL-15表达和同时下调靶基因评价包含1x VEGFA siRNA、2x CD155 siRNA和IL-15mRNA的化合物15的作用。结果显示化合物15表达IL-15蛋白(>790pg/ml)，如图14C中所示。在相同的细胞裂解物中，使用qPCR评估化合物15对VEGFA和CD155 RNA转录物的RNA干扰。如图14D中展示，化合物15下调内源VEGFA(10nM为95％，30nM为98％)和CD155(10nM为73％，30nM为71％)水平。简而言之，使用化合物11、化合物12和化合物15，可以靶向多个信号传导途径以借助siRNA下调多个肿瘤学靶并且在相同时间上调IL-12细胞因子或IL-15细胞因子，以通过促进免疫细胞浸润或增殖提供抗肿瘤活性。
A549细胞中的肺癌体外模型
A549细胞是衍生自一位58岁男性的腺癌性人肺泡基底上皮细胞并且在这个实施例中用来模拟肺癌体外模型。如上文所述培养和转染A549细胞。使用化合物11(IL-12mRNA+1x IDH1 siRNA+1x CDK4 siRNA+1x CDK6 siRNA)、化合物12(IL-12mRNA+1x EGFR siRNA+1x mTOR siRNA+1x KRAS siRNA)和化合物15(IL-15mRNA+1x VEGFA siRNA+2x CD155siRNA)平行评估对多个癌症相关靶的调节，将A549细胞用这些化合物按10和30nM/孔浓度转染。转染后五小时，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛孵育24小时，并且收集上清液。进行ELISA以定量细胞培养上清液中存在的人IL-12p70(ThermoFisher目录号88-7126)水平和人IL-15(ThermoFisher目录号88-7620)水平。还处理相应的细胞裂解物，以使用Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green试剂盒(ThermoFisher目录号A25599)和引物(引物序列详情列于表6中)借助RT-qPCR，通过比照未转染样品进行相对定量，测量siRNA靶基因的RNA丰度。使用人18s rRNA作为参考对照。
结果
在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物11或化合物12转染的A549细胞中，就IL-12表达和同时下调靶基因评价包含IDH1、CDK4和CDK6的1xsiRNA与IL-12mRNA的化合物11和包含EGFR、mTOR、KRAS的1x siRNA与IL-12mRNA的化合物12的作用。数据显示化合物11和化合物12均导致IL-12蛋白显著表达和分泌(>1925pg/ml)，如图12C和图12G中所示。在相同的细胞裂解物中，评估化合物11对IDH1，CDK4和CDK6 RNA转录物的RNA干扰。如图12D中展示，化合物11下调内源IDH1(10nM为88％，30nM为92％)、CDK4(10nM为74％，30nM为80％)和CDK6(10nM为58％，30nM为60％)水平。在图12G的相同细胞裂解物中评估化合物12对EGFR、mTOR和KRAS RNA转录物的RNA干扰。如图12H中所示，化合物12在30nM化合物12转染的SCC-4细胞中下调内源EGFR水平(高达58％)。在这个细胞系中，内源KRAS mRNA表达太低，以致于无法借助KRAS qPCR测定法检出，水平甚至对照条件下低于定量限制(BQL)。如图12H中所示，化合物12以剂量依赖性方式下调内源mTOR水平(10nM为67％和30nM为79％)。
另外，在不同剂量(10nM和30nM)的化合物15转染的A549细胞中，就IL-15表达和同时下调靶基因评价包含1x VEGFA siRNA、2x CD155 siRNA和IL-15mRNA的化合物15的作用。如图14A中所示，化合物15导致IL-15蛋白显著表达和分泌(>715pg/ml)。在相同的细胞裂解物中，使用qPCR评估化合物15对VEGFA和CD155 RNA转录物的RNA干扰。如图14B中展示，化合物15下调内源性VEGFA(10nM为58％，30nM为51％)和CD155(10nM为43％，30nM为42％)水平。简而言之，使用化合物11、化合物12和化合物15，可以靶向多个信号传导途径以借助siRNA下调多个肿瘤学靶并且在相同时间上调IL-12细胞因子或IL-15细胞因子，以通过促进免疫细胞浸润或增殖提供抗肿瘤活性。
U251 MG细胞中的胶质母细胞瘤癌症体外模型
人胶质母细胞瘤细胞系(U251 MG；DSMZ，德国，目录号09063001)衍生自人恶性胶质母细胞瘤。将U251 MG细胞维持于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma Aldrich，目录号D0822)中。将细胞按20,000个细胞/孔接种于96孔培养板中并且在37℃于含有5％CO2的增湿气氛下孵育24小时，之后转染。随后将细胞在DMEM生长培养基中培育以达到转染前汇合度<70％。因此，遵循生产商的说明，使用脂质转染胺MessengerMax(Invitrogen)，用化合物16(IL-15mRNA+1x VEGFA siRNA+1x PD-L1siRNA+1x c-Myc siRNA)在10nM或30nM浓度，按化合物对脂质转染胺比率1:1w/v转染U251MG细胞。移除100μl DMEM并且替换以90μlOpti-MEM(Thermo Fisher Scientific，瑞士，目录号31985-070)和在Opti-MEM中的10μl化合物和脂质转染胺MessangerMax复合物。在5小时后，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％ CO2的增湿气氛孵育24小时。进行ELISA以定量存在于细胞培养上清液中的人IL-15(ThermoFisher目录号88-7620)水平。还处理相应的细胞裂解物，以使用Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBRGreen试剂盒(ThermoFisher目录号A25599)和引物(引物序列详情列于表6中)借助RT-qPCR，通过比照未转染样品进行相对定量，测量siRNA靶基因的RNA丰度。使用人18s rRNA作为参考对照。
结果
另外，在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物16转染的U251 MG细胞中，就IL-15表达和同时下调靶基因评价包含VEGFA、PD-L1和c-Myc的1x siRNA和IL-15mRNA的化合物16的作用。数据显示化合物16表达IL-15蛋白(>300pg/ml)，如图14E中所示。在相同的细胞裂解物中，评估化合物16对VEGFA、PD-L1和c-Myc RNA转录物的RNA干扰。如图14F中所展示，10和30nM水平的化合物16下调内源VEGFA达99％，10和30nM水平的化合物16下调PD-L1达>97％，并且10和30nM水平的化合物16下调c-Myc达>99％。总之，使用化合物16，可以靶向多个信号传导途径以借助siRNA下调多个肿瘤学靶并且在相同时间上调IL-15细胞因子，以通过促进抗肿瘤性免疫细胞如NK细胞和T细胞增殖提供抗肿瘤活性。
实施例18：体外肿瘤模型中单一siRNA靶和免疫刺激细胞因子的组合
在这个实施例中，评估了靶向单一促肿瘤基因下调连同过量表达免疫刺激性细胞因子的影响。评估了化合物13(IL-12mRNA+3x EGFR siRNA)、化合物14(IL-12mRNA+3x mTORsiRNA)和化合物17(IL-7mRNA+3x PD-L1 siRNA)在SCC-4细胞、A549细胞和U251MG细胞中的癌相关靶和细胞因子分泌的平行调节作用。全部三种细胞均如上文所述培养并用两个不同剂量(10nM和30nM)的以上化合物转染。转染后24小时，收集上清液。进行ELISA以定量细胞培养上清液中存在的人IL-12p70(ThermoFisher目录号88-7126)水平和人IL-7(ThermoFisher目录号EHIL7)水平。还处理相应的细胞裂解物，以使用Cells-to-CTTM 1-Step Power SYBR Green试剂盒(ThermoFisher目录号A25599)和引物(引物序列详情列于表6中)借助RT-qPCR，通过比照未转染样品进行相对定量，测量siRNA靶基因的RNA丰度。使用人18s rRNA作为参考对照。
结果
在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物13转染的A549细胞和SCC-4细胞二者中，就IL-12表达和同时下调EGFR基因评价包含3x EGFR siRNA和IL-12mRNA的化合物13的作用。如图13A和13B中所示，化合物13在A549细胞(至多2030pg/ml)和SCC-4细胞(至多7420pg/ml)二者中均表达IL-12蛋白。在相同的细胞裂解物中，评估化合物13对EGFR RNA转录物的RNA干扰。如图13D和图13E中展示，化合物13下调内源EGFR水平(A549细胞中30-40％和SCC-4细胞中85-92％)。
同样地，在两个不同剂量(10nM和30nM)的化合物14转染的A549细胞中，就IL-12表达和同时下调mTOR基因评价包含3x mTOR siRNA和IL-12mRNA的化合物14的作用。如13C图中所示，化合物14表达IL-12蛋白(在10nM化合物14转染的细胞中至多2800pg/ml和在30nM化合物14转染的细胞中至多365pg/ml(相比10nM化合物14，低>7倍))。在30nM化合物14转染的细胞中，观察到更高水平的细胞死亡，因为mTOR是细胞存活标志物。在相同的细胞裂解物中，评价化合物14对mTOR RNA转录物的RNA干扰。如图13F中展示，化合物14下调内源mTOR水平(A549细胞中50-73％)。
在U251 MG细胞中，就IL-7表达和同时下调PD-L1基因评价包含3x PD-L1 siRNA和IL-7mRNA的化合物17(10nM和30nM浓度)的作用。如图14G中所示，化合物17表达IL-7蛋白(至多1300pg/ml)。在相同的细胞裂解物中，评价化合物14对PD-L1 RNA转录物的RNA干扰。如图14H中展示，化合物14以剂量相关方式下调内源PD-L1水平(U251 MG细胞中60-87％)。
表6.qPCR测定法中所用的引物
实施例19：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管形成测定法：体外血管生成模型
为评估化合物5和化合物10的VEGFA下调效力的功能相关性，将SCC-4细胞如上文所述培养并用化合物5和化合物10(20和30nM/孔)转染。在5小时后，将培养基替换为无FBS的新鲜生长培养基并且将平板在37℃于含有5％CO2的增湿气氛孵育24小时以产生并分泌VEGFA至培养基中，并且收集上清液以及通过ELISA(ThermoFisher目录号KHG0112)定量VEGFA水平。相同的细胞培养上清液用来评估在化合物5和化合物10不处理情况下或处理后24小时，分泌的VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生血管生成的功能能力。HUVEC具有按欠汇合密度随适当的细胞外基质支持物铺种时形成三维毛细血管样管状结构(也称作伪小管形成)的能力。建立血管生成模型以测量化合物5和化合物10在这个体外模型中的抗血管生成活性。将HUVEC细胞(ATCC，目录号CRL-1730)在补充有10％ FBS(ATCC，#30-2020)、0.1mg/mL肝素(Sigma，#H3393)和30μg/mL ECGS(Corning，#354006)的F-12K培养基(ATCC目录号30-2004)于37℃含有5％ CO2的增湿气氛下维持24小时，之后分配入基质胶涂布的Ibidi平板。实验之前24小时，移液管吸头和μ-slide血管生成Ibidi平板(Ibidi，目录号81506)置于-20℃。生长因子降低的BD基质胶(BD Biosciences，目录号354230)在冰箱中冰上过夜解冻。在实验当天，在施加基质胶期间，将基质胶、移液管吸头和平板保持在层流中冰上。10μl基质胶施加至Ibidi平板的每个内孔中，防止它流入上孔中。将基质胶包被的平板置于加湿室中37℃持续1小时。HUVEC经胰蛋白酶消化并且使用标准程序计数，并且将细胞以5000个细胞/50μL的浓度悬浮于细胞培养基，所述细胞培养基衍生自SCC-4细胞上清液(未处理)或经化合物5或化合物10(20nM或30nM)处理的SCC-4细胞上清液或含重组VEGFA(0.5或5ng/mL)的培养基。使用新鲜的HUVEC培养基作为基线对照。在基质胶聚合后，将上文描述的50μL细胞悬液装入每个孔中。将Ibidi平板在37℃，5％ CO2孵育6小时。细胞用显微镜可视化并且拍摄图像(0小时和6小时)及分析管形成和分支点数目。
结果
测试设计成具有IL-2编码性序列和3个种类靶向VEGFA的siRNA的化合物5和化合物10以评估SCC-4细胞中对VEGFA表达的干扰。在对照条件下，SCC-4细胞产生并且向介质分泌大约0.8ng/ml VEGFA(图15A)。转染20和30nM的化合物5分别降低VEGFA水平至76％和60％，而化合物10在20和30nM均更强力地降低VEGFA至30％(图15A)。对50μl的这些细胞培养上清液分析其诱导作为HUVEC细胞中体外血管生成标志物的分支点形成的功能能力，并且与未处理的对照或具有限定rh-VEGFA浓度(0.5和5ng/mL)的培养基比较。图15B显示增加分支点(作为针对采用介质VEGFA的良好相关的小管形成的指标)的效力。SCC-4细胞在对照条件下产生的VEGFA诱导与两种rh-VEGFA对照相似的明显分支点形成。因VEGFA水平降低，来自化合物5和化合物10二者的上清液强烈减少分支点，而化合物10上清液比化合物5略微更有效地减少分支点形成，原因在于VEGFA水平更低。
本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且启发本领域技术人员的多种修改或改变应纳入本申请的精神与权限范围内和所附权利要求的范围内。
序列表
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<120>用于同时调节诸基因表达的组合物和方法
<130> 57623-707.601
<140>
<141>
<150> 63/213,841
<151> 2021-06-23
<150> 63/087,643
<151> 2020-10-05
<160> 154
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 1
gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcaca 60
aatagcgccc ctaccagcag cagcaccaag aaaacacagc tgcaactgga acacctcctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctga 468
<210> 2
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 2
gccaccatgc tgaaactgct gctgctcctg tgtatcgccc tgtctctggc cgccacaaat 60
agcgccccta ccagcagctc caccaagaaa acacagctgc aactggaaca tctgctgctg 120
gacctgcaga tgatcctgaa cggcatcaac aactacaaga accccaagct gacccggatg 180
ctgaccttca agttctacat gcccaagaag gccaccgagc tgaagcacct ccagtgcctg 240
gaagaggaac tgaagcccct ggaagaagtg ctgaatctgg cccagagcaa gaacttccac 300
ctgaggccta gggacctgat cagcaacatc aacgtgatcg tgctggaact gaaaggcagc 360
gagacaacct tcatgtgcga gtacgccgac gagacagcta ccatcgtgga atttctgaac 420
cggtggatca ccttctgcca gagcatcatc agcaccctga cctga 465
<210> 3
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 3
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cgccgctaca 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctga 468
<210> 4
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 4
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cctggtcacc 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctga 468
<210> 5
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 5
gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcaca 60
aatagcgccc ctaccagcag cagcaccaag aaaacacagc tgcaactgga acacctcctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaagcag aatcatcacg aagtggtact tgaccacttc gtgatgattc 540
tgctttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagag cttcctacag cacaacaaac 600
ttgttgttgt gctgtaggaa gctctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaaga 660
tccgcagacg tgtaaatgta cttgacattt acacgtctgc ggatctttat cttagaggca 720
tatccctttt atcttagagg catatccct 749
<210> 6
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 6
gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcaca 60
aatagcgccc ctaccagcag cagcaccaag aaaacacagc tgcaactgga acacctcctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaaggag attagggtct gtgagatact tgatctcaca gaccctaatc 540
tcctttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagat gccatgaaga ccaagacaac 600
ttgtgtcttg gtcttcatgg catctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagc 660
ctgatgggaa tggaacctaa cttgtaggtt ccattcccat caggctttat cttagaggca 720
tatccctttt atcttagagg catatccct 749
<210> 7
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 7
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cgccgctaca 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaagcag aatcatcacg aagtggtact tgaccacttc gtgatgattc 540
tgctttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagag cttcctacag cacaacaaac 600
ttgttgttgt gctgtaggaa gctctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaaga 660
tccgcagacg tgtaaatgta cttgacattt acacgtctgc ggatctttat cttagaggca 720
tatccctttt atcttagagg catatccct 749
<210> 8
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 8
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cgccgctaca 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaagcag aatcatcacg aagtggtact tgaccacttc gtgatgattc 540
tgctttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagag cttcctacag cacaacaaac 600
ttgttgttgt gctgtaggaa gctctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaaga 660
tccgcagacg tgtaaatgta cttgacattt acacgtctgc ggatctttat cttagaggca 720
tatccctacg taccaacaag cgcaagaaat cccggtataa acttgttata ccgggatttc 780
ttgcgcttta tcttagaggc atatccctac gtaccaacaa ggcgaggcag cttgagttaa 840
aacttgttta actcaagctg cctcgccttt atcttagagg catatccctt ttatcttaga 900
ggcatatccc t 911
<210> 9
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 9
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cgccgctaca 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaaggag taccctgatg agatcacttg gatctcatca gggtactcct 540
ttatcttaga ggcatatccc tacgtaccaa caaggagtac cctgatgaga tcacttggat 600
ctcatcaggg tactccttta tcttagaggc atatccctac gtaccaacaa ggagtaccct 660
gatgagatca cttggatctc atcagggtac tcctttatct tagaggcata tcccttttat 720
cttagaggca tatccct 737
<210> 10
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 10
gccaccatgt tgttgctgct gctcgcctgt attgccctgg cctctacagc cgccgctaca 60
aattctgccc ctaccagcag ctccaccaag aaaacccagc tgcaactgga acatctgctg 120
ctggacctgc agatgatcct gaacggcatc aacaactaca agaaccccaa gctgacccgg 180
atgctgacct tcaagttcta catgcccaag aaggccaccg agctgaagca cctccagtgc 240
ctggaagagg aactgaagcc cctggaagaa gtgctgaatc tggcccagag caagaacttc 300
cacctgaggc ctagggacct gatcagcaac atcaacgtga tcgtgctgga actgaaaggc 360
agcgagacaa ccttcatgtg cgagtacgcc gacgagacag ctaccatcgt ggaatttctg 420
aaccggtgga tcaccttctg ccagagcatc atcagcaccc tgacctgaat agtgagtcgt 480
attaacgtac caacaaggag ggcagaatca tcacgaagtg gtgaagtact tgacttcacc 540
acttcgtgat gattctgccc tcctttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagag 600
atgagcttcc tacagcacaa caaatgtgac ttgcacattt gttgtgctgt aggaagctca 660
tctctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagt acaagatccg cagacgtgta 720
aatgttccac ttgggaacat ttacacgtct gcggatcttg tactttatct tagaggcata 780
tcccttttat cttagaggca tatccct 807
<210> 11
<211> 1910
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 11
gccaccatgt gtcaccagca gctggtcatc agctggttca gcctggtgtt cctggcctct 60
cctctggtgg ccatctggga gctgaagaaa gacgtgtacg tggtggaact ggactggtat 120
cccgatgctc ctggcgagat ggtggtgctg acctgcgata cccctgaaga ggacggcatc 180
acctggacac tggatcagtc tagcgaggtg ctcggcagcg gcaagaccct gaccatccaa 240
gtgaaagagt ttggcgacgc cggccagtac acctgtcaca aaggcggaga agtgctgagc 300
cacagcctgc tgctgctcca caagaaagag gatggcattt ggagcaccga catcctgaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccttc ctgagatgcg aggccaagaa ctacagcggc 420
cggttcacat gttggtggct gaccaccatc agcaccgacc tgaccttcag cgtgaagtcc 480
agcagaggca gcagtgatcc tcagggcgtt acatgtggcg ccgctacact gtctgccgaa 540
agagtgcggg gcgacaacaa agaatacgag tacagcgtgg aatgccaaga ggacagcgcc 600
tgtccagccg ccgaagagtc tctgcctatc gaagtgatgg tggacgccgt gcacaagctg 660
aagtacgaga actacacctc cagctttttc atccgggaca tcatcaagcc cgatcctcca 720
aagaacctgc agctgaagcc tctgaagaac agcagacagg tggaagtgtc ctgggagtac 780
cccgacacct ggtctacacc ccacagctac ttcagcctga ccttttgcgt gcaagtgcag 840
ggcaagtcca agcgcgagaa aaaggaccgg gtgttcaccg acaagaccag cgccaccgtg 900
atctgcagaa agaacgccag catcagcgtc agagcccagg accggtacta cagcagctct 960
tggagcgaat gggccagcgt gccatgttct ggtggcggag gatctggcgg aggtggaagc 1020
ggcggaggcg gatctagaaa tctgcctgtg gccactcctg atcctggcat gttcccttgt 1080
ctgcaccaca gccagaacct gctgagagcc gtgtccaaca tgctgcagaa ggccagacag 1140
accctggaat tctacccctg caccagcgag gaaatcgacc acgaggacat caccaaggat 1200
aagaccagca ccgtggaagc ctgcctgcct ctggaactga ccaagaacga gagctgcctg 1260
aacagccggg aaaccagctt catcaccaac ggctcttgcc tggccagcag aaagacctcc 1320
ttcatgatgg ccctgtgcct gagcagcatc tacgaggacc tgaagatgta ccaggtggaa 1380
ttcaagacca tgaacgccaa gctgctgatg gaccccaagc ggcagatctt cctggaccag 1440
aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg caggccctga acttcaacag cgagacagtg 1500
ccccagaagt ctagcctgga agaacccgac ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc 1560
ctgctgcacg ccttccggat cagagccgtg accatcgaca gagtgatgag ctacctgaac 1620
gcctcctgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaagtt ccttccaaat ggctctgtac 1680
ttgacagagc catttggaag gaactttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagc 1740
atcgttcacc gagatctgaa cttgtcagat ctcggtgaac gatgctttat cttagaggca 1800
tatccctacg taccaacaag accagcagcg gacaaataaa acttgtttat ttgtccgctg 1860
ctggtcttta tcttagaggc atatcccttt tatcttagag gcatatccct 1910
<210> 12
<211> 1938
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 12
gccaccatgt gtcaccagca gctggtcatc agctggttca gcctggtgtt cctggcctct 60
cctctggtgg ccatctggga gctgaagaaa gacgtgtacg tggtggaact ggactggtat 120
cccgatgctc ctggcgagat ggtggtgctg acctgcgata cccctgaaga ggacggcatc 180
acctggacac tggatcagtc tagcgaggtg ctcggcagcg gcaagaccct gaccatccaa 240
gtgaaagagt ttggcgacgc cggccagtac acctgtcaca aaggcggaga agtgctgagc 300
cacagcctgc tgctgctcca caagaaagag gatggcattt ggagcaccga catcctgaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccttc ctgagatgcg aggccaagaa ctacagcggc 420
cggttcacat gttggtggct gaccaccatc agcaccgacc tgaccttcag cgtgaagtcc 480
agcagaggca gcagtgatcc tcagggcgtt acatgtggcg ccgctacact gtctgccgaa 540
agagtgcggg gcgacaacaa agaatacgag tacagcgtgg aatgccaaga ggacagcgcc 600
tgtccagccg ccgaagagtc tctgcctatc gaagtgatgg tggacgccgt gcacaagctg 660
aagtacgaga actacacctc cagctttttc atccgggaca tcatcaagcc cgatcctcca 720
aagaacctgc agctgaagcc tctgaagaac agcagacagg tggaagtgtc ctgggagtac 780
cccgacacct ggtctacacc ccacagctac ttcagcctga ccttttgcgt gcaagtgcag 840
ggcaagtcca agcgcgagaa aaaggaccgg gtgttcaccg acaagaccag cgccaccgtg 900
atctgcagaa agaacgccag catcagcgtc agagcccagg accggtacta cagcagctct 960
tggagcgaat gggccagcgt gccatgttct ggtggcggag gatctggcgg aggtggaagc 1020
ggcggaggcg gatctagaaa tctgcctgtg gccactcctg atcctggcat gttcccttgt 1080
ctgcaccaca gccagaacct gctgagagcc gtgtccaaca tgctgcagaa ggccagacag 1140
accctggaat tctacccctg caccagcgag gaaatcgacc acgaggacat caccaaggat 1200
aagaccagca ccgtggaagc ctgcctgcct ctggaactga ccaagaacga gagctgcctg 1260
aacagccggg aaaccagctt catcaccaac ggctcttgcc tggccagcag aaagacctcc 1320
ttcatgatgg ccctgtgcct gagcagcatc tacgaggacc tgaagatgta ccaggtggaa 1380
ttcaagacca tgaacgccaa gctgctgatg gaccccaagc ggcagatctt cctggaccag 1440
aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg caggccctga acttcaacag cgagacagtg 1500
ccccagaagt ctagcctgga agaacccgac ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc 1560
ctgctgcacg ccttccggat cagagccgtg accatcgaca gagtgatgag ctacctgaac 1620
gcctcctgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaaata gtgagtcgta ttaacgtacc 1680
aacaagaagg agctgcccat gagaaaactt gtttctcatg ggcagctcct tctttatctt 1740
agaggcatat ccctacgtac caacaagtgc aatgagggac cagtacaact tgtgtactgg 1800
tccctcattg cactttatct tagaggcata tccctacgta ccaacaagag ctgctgaagg 1860
actcatcaac ttgtgatgag tccttcagca gctctttatc ttagaggcat atccctttta 1920
tcttagaggc atatccct 1938
<210> 13
<211> 1910
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 13
gccaccatgt gtcaccagca gctggtcatc agctggttca gcctggtgtt cctggcctct 60
cctctggtgg ccatctggga gctgaagaaa gacgtgtacg tggtggaact ggactggtat 120
cccgatgctc ctggcgagat ggtggtgctg acctgcgata cccctgaaga ggacggcatc 180
acctggacac tggatcagtc tagcgaggtg ctcggcagcg gcaagaccct gaccatccaa 240
gtgaaagagt ttggcgacgc cggccagtac acctgtcaca aaggcggaga agtgctgagc 300
cacagcctgc tgctgctcca caagaaagag gatggcattt ggagcaccga catcctgaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccttc ctgagatgcg aggccaagaa ctacagcggc 420
cggttcacat gttggtggct gaccaccatc agcaccgacc tgaccttcag cgtgaagtcc 480
agcagaggca gcagtgatcc tcagggcgtt acatgtggcg ccgctacact gtctgccgaa 540
agagtgcggg gcgacaacaa agaatacgag tacagcgtgg aatgccaaga ggacagcgcc 600
tgtccagccg ccgaagagtc tctgcctatc gaagtgatgg tggacgccgt gcacaagctg 660
aagtacgaga actacacctc cagctttttc atccgggaca tcatcaagcc cgatcctcca 720
aagaacctgc agctgaagcc tctgaagaac agcagacagg tggaagtgtc ctgggagtac 780
cccgacacct ggtctacacc ccacagctac ttcagcctga ccttttgcgt gcaagtgcag 840
ggcaagtcca agcgcgagaa aaaggaccgg gtgttcaccg acaagaccag cgccaccgtg 900
atctgcagaa agaacgccag catcagcgtc agagcccagg accggtacta cagcagctct 960
tggagcgaat gggccagcgt gccatgttct ggtggcggag gatctggcgg aggtggaagc 1020
ggcggaggcg gatctagaaa tctgcctgtg gccactcctg atcctggcat gttcccttgt 1080
ctgcaccaca gccagaacct gctgagagcc gtgtccaaca tgctgcagaa ggccagacag 1140
accctggaat tctacccctg caccagcgag gaaatcgacc acgaggacat caccaaggat 1200
aagaccagca ccgtggaagc ctgcctgcct ctggaactga ccaagaacga gagctgcctg 1260
aacagccggg aaaccagctt catcaccaac ggctcttgcc tggccagcag aaagacctcc 1320
ttcatgatgg ccctgtgcct gagcagcatc tacgaggacc tgaagatgta ccaggtggaa 1380
ttcaagacca tgaacgccaa gctgctgatg gaccccaagc ggcagatctt cctggaccag 1440
aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg caggccctga acttcaacag cgagacagtg 1500
ccccagaagt ctagcctgga agaacccgac ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc 1560
ctgctgcacg ccttccggat cagagccgtg accatcgaca gagtgatgag ctacctgaac 1620
gcctcctgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaagaa ggagctgccc atgagaaaac 1680
ttgtttctca tgggcagctc cttctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagt 1740
ccaacgaatg ggcctaagaa cttgtcttag gcccattcgt tggactttat cttagaggca 1800
tatccctacg taccaacaag gacagcatag acgacacctt acttgaaggt gtcgtctatg 1860
ctgtccttta tcttagaggc atatcccttt tatcttagag gcatatccct 1910
<210> 14
<211> 1910
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 14
gccaccatgt gtcaccagca gctggtcatc agctggttca gcctggtgtt cctggcctct 60
cctctggtgg ccatctggga gctgaagaaa gacgtgtacg tggtggaact ggactggtat 120
cccgatgctc ctggcgagat ggtggtgctg acctgcgata cccctgaaga ggacggcatc 180
acctggacac tggatcagtc tagcgaggtg ctcggcagcg gcaagaccct gaccatccaa 240
gtgaaagagt ttggcgacgc cggccagtac acctgtcaca aaggcggaga agtgctgagc 300
cacagcctgc tgctgctcca caagaaagag gatggcattt ggagcaccga catcctgaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccttc ctgagatgcg aggccaagaa ctacagcggc 420
cggttcacat gttggtggct gaccaccatc agcaccgacc tgaccttcag cgtgaagtcc 480
agcagaggca gcagtgatcc tcagggcgtt acatgtggcg ccgctacact gtctgccgaa 540
agagtgcggg gcgacaacaa agaatacgag tacagcgtgg aatgccaaga ggacagcgcc 600
tgtccagccg ccgaagagtc tctgcctatc gaagtgatgg tggacgccgt gcacaagctg 660
aagtacgaga actacacctc cagctttttc atccgggaca tcatcaagcc cgatcctcca 720
aagaacctgc agctgaagcc tctgaagaac agcagacagg tggaagtgtc ctgggagtac 780
cccgacacct ggtctacacc ccacagctac ttcagcctga ccttttgcgt gcaagtgcag 840
ggcaagtcca agcgcgagaa aaaggaccgg gtgttcaccg acaagaccag cgccaccgtg 900
atctgcagaa agaacgccag catcagcgtc agagcccagg accggtacta cagcagctct 960
tggagcgaat gggccagcgt gccatgttct ggtggcggag gatctggcgg aggtggaagc 1020
ggcggaggcg gatctagaaa tctgcctgtg gccactcctg atcctggcat gttcccttgt 1080
ctgcaccaca gccagaacct gctgagagcc gtgtccaaca tgctgcagaa ggccagacag 1140
accctggaat tctacccctg caccagcgag gaaatcgacc acgaggacat caccaaggat 1200
aagaccagca ccgtggaagc ctgcctgcct ctggaactga ccaagaacga gagctgcctg 1260
aacagccggg aaaccagctt catcaccaac ggctcttgcc tggccagcag aaagacctcc 1320
ttcatgatgg ccctgtgcct gagcagcatc tacgaggacc tgaagatgta ccaggtggaa 1380
ttcaagacca tgaacgccaa gctgctgatg gaccccaagc ggcagatctt cctggaccag 1440
aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg caggccctga acttcaacag cgagacagtg 1500
ccccagaagt ctagcctgga agaacccgac ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc 1560
ctgctgcacg ccttccggat cagagccgtg accatcgaca gagtgatgag ctacctgaac 1620
gcctcctgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaagac cctgacattc gctactgtac 1680
ttgacagtag cgaatgtcag ggtctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaaga 1740
gctgctgaag gactcatcaa cttgtgatga gtccttcagc agctctttat cttagaggca 1800
tatccctacg taccaacaag gccaatgacc caacatctct acttgagaga tgttgggtca 1860
ttggccttta tcttagaggc atatcccttt tatcttagag gcatatccct 1910
<210> 15
<211> 772
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 15
gccaccatga gaatcagcaa gccccacctg agatccatca gcatccagtg ctacctgtgc 60
ctgctgctga acagccactt tctgacagag gccggcatcc acgtgttcat cctgggctgt 120
ttttctgccg gcctgcctaa gaccgaggcc aactgggtta acgtgatcag cgacctgaag 180
aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac atcgacgcca cactgtacac cgagagcgac 240
gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg aagtgctttc tgctggaact gcaagtgatc 300
agcctggaaa gcggcgacgc cagcatccac gacaccgtgg aaaacctgat catcctggcc 360
aacaacagcc tgagcagcaa cggcaatgtg accgagtccg gctgcaaaga gtgcgaggaa 420
ctggaagaga agaatatcaa agagttcctg cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc 480
atcaacacca gctgaatagt gagtcgtatt aacgtaccaa caaggagtac cctgatgaga 540
tcacttggat ctcatcaggg tactccttta tcttagaggc atatccctac gtaccaacaa 600
ggtatccatc tctggctatg aacttgtcat agccagagat ggataccttt atcttagagg 660
catatcccta cgtaccaaca agtcccgtaa cgccatcatc ttacttgaag atgatggcgt 720
tacgggactt tatcttagag gcatatccct tttatcttag aggcatatcc ct 772
<210> 16
<211> 772
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 16
gccaccatga gaatcagcaa gccccacctg agatccatca gcatccagtg ctacctgtgc 60
ctgctgctga acagccactt tctgacagag gccggcatcc acgtgttcat cctgggctgt 120
ttttctgccg gcctgcctaa gaccgaggcc aactgggtta acgtgatcag cgacctgaag 180
aagatcgagg acctgatcca gagcatgcac atcgacgcca cactgtacac cgagagcgac 240
gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg aagtgctttc tgctggaact gcaagtgatc 300
agcctggaaa gcggcgacgc cagcatccac gacaccgtgg aaaacctgat catcctggcc 360
aacaacagcc tgagcagcaa cggcaatgtg accgagtccg gctgcaaaga gtgcgaggaa 420
ctggaagaga agaatatcaa agagttcctg cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc 480
atcaacacca gctgaatagt gagtcgtatt aacgtaccaa caaggagtac cctgatgaga 540
tcacttggat ctcatcaggg tactccttta tcttagaggc atatccctac gtaccaacaa 600
gaaggttcag catagtagct aacttgtagc tactatgctg aaccttcttt atcttagagg 660
catatcccta cgtaccaaca aggacgacga gaccttcatc aaacttgttg atgaaggtct 720
cgtcgtcctt tatcttagag gcatatccct tttatcttag aggcatatcc ct 772
<210> 17
<211> 821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 17
gccaccatgt tccacgtgtc cttccggtac atcttcggcc tgcctccact gatcctggtg 60
ctgctgcctg tggccagcag cgactgtgat atcgagggca aagacggcaa gcagtacgag 120
agcgtgctga tggtgtccat cgaccagctg ctggacagca tgaaggaaat cggcagcaac 180
tgcctgaaca acgagttcaa cttcttcaag cggcacatct gcgacgccaa caaagaaggc 240
atgttcctgt tcagagccgc cagaaagctg cggcagttcc tgaagatgaa cagcaccggc 300
gacttcgacc tgcatctgct gaaagtgtct gagggcacca ccatcctgct gaattgcacc 360
ggccaagtga agggcagaaa gcctgctgct ctgggagaag cccagcctac caagagcctg 420
gaagagaaca agtccctgaa agagcagaag aagctgaacg acctctgctt cctgaagcgg 480
ctgctgcaag agatcaagac ctgctggaac aagatcctga tgggcaccaa agaacactga 540
atagtgagtc gtattaacgt accaacaaga aggttcagca tagtagctaa cttgtagcta 600
ctatgctgaa ccttctttat cttagaggca tatccctacg taccaacaag cgaattactg 660
tgaaagtcaa acttgttgac tttcacagta attcgcttta tcttagaggc atatccctac 720
gtaccaacaa gaccagcaca ctgagaatca aacttgttga ttctcagtgt gctggtcttt 780
atcttagagg catatccctt ttatcttaga ggcatatccc t 821
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 18
taatacgact cactata 17
<210> 19
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 19
gccacc 6
<210> 20
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 20
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgca 77
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 21
atagtgagtc gtattaacgt accaacaa 28
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 22
tttatcttag aggcatatcc ctacgtacca acaa 34
<210> 23
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 822
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60
caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120
tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180
gatgattttg aatggaatta ataattacaa gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt 240
taagttttac atgcccaaga aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga 300
actcaaacct ctggaggaag tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc 360
cagggactta atcagcaata tcaacgtaat agttctggaa ctaaagggat ctgaaacaac 420
attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta gaatttctga acagatggat 480
taccttttgt caaagcatca tctcaacact gacttgataa ttaagtgctt cccacttaaa 540
acatatcagg ccttctattt atttaaatat ttaaatttta tatttattgt tgaatgtatg 600
gtttgctacc tattgtaact attattctta atcttaaaac tataaatatg gatcttttat 660
gattcttttt gtaagcccta ggggctctaa aatggtttca cttatttatc ccaaaatatt 720
tattattatg ttgaatgtta aatatagtat ctatgtagat tggttagtaa aactatttaa 780
taaatttgat aaatataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 822
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的肽
<400> 27
Met Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Asn Ser
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的肽
<400> 28
Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Leu Ala Ser Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Asn Ser
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的肽
<400> 29
Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ala Leu Ala Ser Thr Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
atgtacagaa tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctggt cacaaatagc 60
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 31
atgctgaaac tgctgctgct cctgtgtatc gccctgtctc tggccgccac aaatagc 57
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 32
atgttgttgc tgctgctcgc ctgtattgcc ctggcctcta cagccgccgc tacaaattct 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400> 33
atgttgttgc tgctgctcgc ctgtattgcc ctggcctcta cagccctggt caccaattct 60
<210> 34
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225 230
<210> 35
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 480
aagtcctgga gcgtgtacgt tggtgcccgc tgctgtctaa tgccctggag cctccctggc 540
ccccatccct gtgggccttg ctcagagcgg agaaagcatt tgtttgtaca agatccgcag 600
acgtgtaaat gttcctgcaa aaacacagac tcgcgttgca aggcgaggca gcttgagtta 660
aacgaacgta cttgcagatg tgacaagccg aggcggtga 699
<210> 36
<211> 699
<212> RNA
<213> 智人
<400> 36
augaacuuuc ugcugucuug ggugcauugg agccuugccu ugcugcucua ccuccaccau 60
gccaaguggu cccaggcugc acccauggca gaaggaggag ggcagaauca ucacgaagug 120
gugaaguuca uggaugucua ucagcgcagc uacugccauc caaucgagac ccugguggac 180
aucuuccagg aguacccuga ugagaucgag uacaucuuca agccauccug ugugccccug 240
augcgaugcg ggggcugcug caaugacgag ggccuggagu gugugcccac ugaggagucc 300
aacaucacca ugcagauuau gcggaucaaa ccucaccaag gccagcacau aggagagaug 360
agcuuccuac agcacaacaa augugaaugc agaccaaaga aagauagagc aagacaagaa 420
aaaaaaucag uucgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa aucccgguau 480
aaguccugga gcguguacgu uggugcccgc ugcugucuaa ugcccuggag ccucccuggc 540
ccccaucccu gugggccuug cucagagcgg agaaagcauu uguuuguaca agauccgcag 600
acguguaaau guuccugcaa aaacacagac ucgcguugca aggcgaggca gcuugaguua 660
aacgaacgua cuugcagaug ugacaagccg aggcgguga 699
<210> 37
<211> 383
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Lys Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ile
305 310 315 320
Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
325 330 335
Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His
340 345 350
Pro Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp Ala Thr Gln Leu Gly Phe Gln
355 360 365
Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
370 375 380
<210> 38
<211> 1152
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac taaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tgctgctatt 960
tttgttatta ttattttcta tgtccgttgt tgtaagaaga aaacatcagc tgcagagggt 1020
ccagagctcg tgagcctgca ggtcctggat caacacccag ttgggacgag tgaccacagg 1080
gatgccacac agctcggatt tcagcctctg atgtcagatc ttgggtccac tggctccact 1140
gagggcgcct ag 1152
<210> 39
<211> 1152
<212> RNA
<213> 智人
<400> 39
auggggcugg gcccggucuu ccugcuucug gcuggcaucu ucccuuuugc accuccggga 60
gcugcugcug agccccacag ucuucguuau aaccucacgg ugcuguccug ggauggaucu 120
gugcagucag gguuucucac ugagguacau cuggaugguc agcccuuccu gcgcugugac 180
aggcagaaau gcagggcaaa gccccaggga cagugggcag aagauguccu gggaaauaag 240
acaugggaca gagagaccag agacuugaca gggaacggaa aggaccucag gaugacccug 300
gcucauauca aggaccagaa agaaggcuug cauucccucc aggagauuag ggucugugag 360
auccaugaag acaacagcac caggagcucc cagcauuucu acuacgaugg ggagcucuuc 420
cucucccaaa accuggagac uaaggaaugg acaaugcccc aguccuccag agcucagacc 480
uuggccauga acgucaggaa uuucuugaag gaagaugcca ugaagaccaa gacacacuau 540
cacgcuaugc augcagacug ccugcaggaa cuacggcgau aucuaaaauc cggcguaguc 600
cugaggagaa cagugccccc cauggugaau gucacccgca gcgaggccuc agagggcaac 660
auuaccguga caugcagggc uucuggcuuc uaucccugga auaucacacu gagcuggcgu 720
caggaugggg uaucuuugag ccacgacacc cagcaguggg gggauguccu gccugauggg 780
aauggaaccu accagaccug gguggccacc aggauuugcc aaggagagga gcagagguuc 840
accugcuaca uggaacacag cgggaaucac agcacucacc cugugcccuc ugggaaagug 900
cuggugcuuc agagucauug gcagacauuc cauguuucug cuguugcugc ugcugcuauu 960
uuuguuauua uuauuuucua uguccguugu uguaagaaga aaacaucagc ugcagagggu 1020
ccagagcucg ugagccugca gguccuggau caacacccag uugggacgag ugaccacagg 1080
gaugccacac agcucggauu ucagccucug augucagauc uuggguccac uggcuccacu 1140
gagggcgccu ag 1152
<210> 40
<211> 383
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gly Leu Gly Arg Val Leu Leu Phe Leu Ala Val Ala Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Met Val Leu Ser Gln Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu
35 40 45
Gly His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asn Val Leu Gly Ala Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Thr Glu Thr Glu Asp Leu Thr Glu Asn Gly Gln Asp Leu
85 90 95
Arg Arg Thr Leu Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Ser Ser Thr Arg
115 120 125
Gly Ser Arg His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Gln Glu Ser Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Thr Asn Phe Trp Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr Arg Ala Met Gln Ala Asp Cys Leu Gln Lys Leu Gln
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Ala Ile Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Cys Ser Glu Val Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Thr Leu Thr Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Arg Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Gly Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Ala Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser Gln Arg Thr Asp Phe Pro Tyr Val Ser Ala Ala Met Pro Cys Phe
305 310 315 320
Val Ile Ile Ile Ile Leu Cys Val Pro Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
325 330 335
Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His
340 345 350
Pro Val Gly Thr Gly Asp His Arg Asp Ala Ala Gln Leu Gly Phe Gln
355 360 365
Pro Leu Met Ser Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Thr
370 375 380
<210> 41
<211> 1152
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
atggggctgg gccgggtcct gctgtttctg gccgtcgcct tcccttttgc acccccggca 60
gccgccgctg agccccacag tcttcgttac aacctcatgg tgctgtccca ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttctcgc tgagggacat ctggatggtc agcccttcct gcgctatgac 180
aggcagaaac gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aaaatgtcct gggagctaag 240
acctgggaca cagagaccga ggacttgaca gagaatgggc aagacctcag gaggaccctg 300
actcatatca aggaccagaa aggaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acagcagcac caggggctcc cggcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac tcaagaatcg acagtgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggctatga acgtcacaaa tttctggaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cgcgctatgc aggcagactg cctgcagaaa ctacagcgat atctgaaatc cggggtggcc 600
atcaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacctgca gcgaggtctc agagggcaac 660
atcaccgtga catgcagggc ttccagcttc tatccccgga atatcacact gacctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacaacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggattcgcc aaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac ggcactcacc ctgtgccctc tgggaaggcg 900
ctggtgcttc agagtcaacg gacagacttt ccatatgttt ctgctgctat gccatgtttt 960
gttattatta ttattctctg tgtcccttgt tgcaagaaga aaacatcagc ggcagagggt 1020
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gatgcagcac agctgggatt tcagcctctg atgtcagcta ctgggtccac tggttccact 1140
gagggcacct ag 1152
<210> 42
<211> 1152
<212> RNA
<213> 智人
<400> 42
auggggcugg gccggguccu gcuguuucug gccgucgccu ucccuuuugc acccccggca 60
gccgccgcug agccccacag ucuucguuac aaccucaugg ugcuguccca ggauggaucu 120
gugcagucag gguuucucgc ugagggacau cuggaugguc agcccuuccu gcgcuaugac 180
aggcagaaac gcagggcaaa gccccaggga cagugggcag aaaauguccu gggagcuaag 240
accugggaca cagagaccga ggacuugaca gagaaugggc aagaccucag gaggacccug 300
acucauauca aggaccagaa aggaggcuug cauucccucc aggagauuag ggucugugag 360
auccaugaag acagcagcac caggggcucc cggcauuucu acuacgaugg ggagcucuuc 420
cucucccaaa accuggagac ucaagaaucg acagugcccc aguccuccag agcucagacc 480
uuggcuauga acgucacaaa uuucuggaag gaagaugcca ugaagaccaa gacacacuau 540
cgcgcuaugc aggcagacug ccugcagaaa cuacagcgau aucugaaauc cgggguggcc 600
aucaggagaa cagugccccc cauggugaau gucaccugca gcgaggucuc agagggcaac 660
aucaccguga caugcagggc uuccagcuuc uauccccgga auaucacacu gaccuggcgu 720
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cuggugcuuc agagucaacg gacagacuuu ccauauguuu cugcugcuau gccauguuuu 960
guuauuauua uuauucucug ugucccuugu ugcaagaaga aaacaucagc ggcagagggu 1020
ccagagcuug ugagccugca gguccuggau caacacccag uugggacagg agaccacagg 1080
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gagggcaccu ag 1152
<210> 43
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
210 215
<210> 44
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 45
<211> 1230
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
atttcgcttt cattttgggc cgagctggag gcggcggggc cgtcccggaa cggctgcggc 60
cgggcacccc gggagttaat ccgaaagcgc cgcaagcccc gcgggccggc cgcaccgcac 120
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agtcccggga aagtcctgcc gcgcctcggg acaattataa aaatgtggcc ccctgggtca 240
gcctcccagc caccgccctc acctgccgcg gccacaggtc tgcatccagc ggctcgccct 300
gtgtccctgc agtgccggct cagcatgtgt ccagcgcgca gcctcctcct tgtggctacc 360
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atcaagctct gcatacttct tcatgctttc agaattcggg cagtgactat tgatagagtg 960
atgagctatc tgaatgcttc ctaaaaagcg aggtccctcc aaaccgttgt catttttata 1020
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aggatgggac tattacatcc acatgatacc tctgatcaag tatttttgac atttactgtg 1140
gataaattgt ttttaagttt tcatgaatga attgctaaga agggaaaata tccatcctga 1200
aggtgttttt cattcacttt aatagaaggg 1230
<210> 46
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 47
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 48
<211> 1410
<212> DNA
<213> 智人
<400> 48
ctgtttcagg gccattggac tctccgtcct gcccagagca agatgtgtca ccagcagttg 60
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ttcttcatca gggacatcat caaacctgac ccacccaaga acttgcagct gaagccatta 780
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tcctacttct ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa 900
gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct gccgcaaaaa tgccagcatt 960
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ttcatgctat ttaaatattt aagtaattta tgtatttatt agtatattac tgttatttaa 1320
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agtccctatt atgcaaaatg tgaatttaat 1410
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<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Met Ser Lys Lys Ile Ser Gly Gly Ser Val Val Glu Met Gln Gly Asp
1 5 10 15
Glu Met Thr Arg Ile Ile Trp Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Ile Phe
20 25 30
Pro Tyr Val Glu Leu Asp Leu His Ser Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Asn
35 40 45
Arg Asp Ala Thr Asn Asp Gln Val Thr Lys Asp Ala Ala Glu Ala Ile
50 55 60
Lys Lys His Asn Val Gly Val Lys Cys Ala Thr Ile Thr Pro Asp Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Glu Glu Phe Lys Leu Lys Gln Met Trp Lys Ser Pro Asn
85 90 95
Gly Thr Ile Arg Asn Ile Leu Gly Gly Thr Val Phe Arg Glu Ala Ile
100 105 110
Ile Cys Lys Asn Ile Pro Arg Leu Val Ser Gly Trp Val Lys Pro Ile
115 120 125
Ile Ile Gly Arg His Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ala Thr Asp Phe
130 135 140
Val Val Pro Gly Pro Gly Lys Val Glu Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Gly Thr Gln Lys Val Thr Tyr Leu Val His Asn Phe Glu Glu Gly Gly
165 170 175
Gly Val Ala Met Gly Met Tyr Asn Gln Asp Lys Ser Ile Glu Asp Phe
180 185 190
Ala His Ser Ser Phe Gln Met Ala Leu Ser Lys Gly Trp Pro Leu Tyr
195 200 205
Leu Ser Thr Lys Asn Thr Ile Leu Lys Lys Tyr Asp Gly Arg Phe Lys
210 215 220
Asp Ile Phe Gln Glu Ile Tyr Asp Lys Gln Tyr Lys Ser Gln Phe Glu
225 230 235 240
Ala Gln Lys Ile Trp Tyr Glu His Arg Leu Ile Asp Asp Met Val Ala
245 250 255
Gln Ala Met Lys Ser Glu Gly Gly Phe Ile Trp Ala Cys Lys Asn Tyr
260 265 270
Asp Gly Asp Val Gln Ser Asp Ser Val Ala Gln Gly Tyr Gly Ser Leu
275 280 285
Gly Met Met Thr Ser Val Leu Val Cys Pro Asp Gly Lys Thr Val Glu
290 295 300
Ala Glu Ala Ala His Gly Thr Val Thr Arg His Tyr Arg Met Tyr Gln
305 310 315 320
Lys Gly Gln Glu Thr Ser Thr Asn Pro Ile Ala Ser Ile Phe Ala Trp
325 330 335
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340 345 350
Ala Phe Phe Ala Asn Ala Leu Glu Glu Val Ser Ile Glu Thr Ile Glu
355 360 365
Ala Gly Phe Met Thr Lys Asp Leu Ala Ala Cys Ile Lys Gly Leu Pro
370 375 380
Asn Val Gln Arg Ser Asp Tyr Leu Asn Thr Phe Glu Phe Met Asp Lys
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Leu Gly Glu Asn Leu Lys Ile Lys Leu Ala Gln Ala Lys Leu
405 410
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
atgtccaaaa aaatcagtgg cggttctgtg gtagagatgc aaggagatga aatgacacga 60
atcatttggg aattgattaa agagaaactc atttttccct acgtggaatt ggatctacat 120
agctatgatt taggcataga gaatcgtgat gccaccaacg accaagtcac caaggatgct 180
gcagaagcta taaagaagca taatgttggc gtcaaatgtg ccactatcac tcctgatgag 240
aagagggttg aggagttcaa gttgaaacaa atgtggaaat caccaaatgg caccatacga 300
aatattctgg gtggcacggt cttcagagaa gccattatct gcaaaaatat cccccggctt 360
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gggcgtttta aagacatctt tcaggagata tatgacaagc agtacaagtc ccagtttgaa 720
gctcaaaaga tctggtatga gcataggctc atcgacgaca tggtggccca agctatgaaa 780
tcagagggag gcttcatctg ggcctgtaaa aactatgatg gtgacgtgca gtcggactct 840
gtggcccaag ggtatggctc tctcggcatg atgaccagcg tgctggtttg tccagatggc 900
aagacagtag aagcagaggc tgcccacggg actgtaaccc gtcactaccg catgtaccag 960
aaaggacagg agacgtccac caatcccatt gcttccattt ttgcctggac cagagggtta 1020
gcccacagag caaagcttga taacaataaa gagcttgcct tctttgcaaa tgctttggaa 1080
gaagtctcta ttgagacaat tgaggctggc ttcatgacca aggacttggc tgcttgcatt 1140
aaaggtttac ccaatgtgca acgttctgac tacttgaata catttgagtt catggataaa 1200
cttggagaaa acttgaagat caaactagct caggccaaac tttaa 1245
<210> 51
<211> 1245
<212> RNA
<213> 智人
<400> 51
auguccaaaa aaaucagugg cgguucugug guagagaugc aaggagauga aaugacacga 60
aucauuuggg aauugauuaa agagaaacuc auuuuucccu acguggaauu ggaucuacau 120
agcuaugauu uaggcauaga gaaucgugau gccaccaacg accaagucac caaggaugcu 180
gcagaagcua uaaagaagca uaauguuggc gucaaaugug ccacuaucac uccugaugag 240
aagaggguug aggaguucaa guugaaacaa auguggaaau caccaaaugg caccauacga 300
aauauucugg guggcacggu cuucagagaa gccauuaucu gcaaaaauau cccccggcuu 360
gugaguggau ggguaaaacc uaucaucaua ggucgucaug cuuaugggga ucaauacaga 420
gcaacugauu uuguuguucc ugggccugga aaaguagaga uaaccuacac accaagugac 480
ggaacccaaa aggugacaua ccugguacau aacuuugaag aagguggugg uguugccaug 540
gggauguaua aucaagauaa gucaauugaa gauuuugcac acaguuccuu ccaaauggcu 600
cugucuaagg guuggccuuu guaucugagc accaaaaaca cuauucugaa gaaauaugau 660
gggcguuuua aagacaucuu ucaggagaua uaugacaagc aguacaaguc ccaguuugaa 720
gcucaaaaga ucugguauga gcauaggcuc aucgacgaca ugguggccca agcuaugaaa 780
ucagagggag gcuucaucug ggccuguaaa aacuaugaug gugacgugca gucggacucu 840
guggcccaag gguauggcuc ucucggcaug augaccagcg ugcugguuug uccagauggc 900
aagacaguag aagcagaggc ugcccacggg acuguaaccc gucacuaccg cauguaccag 960
aaaggacagg agacguccac caaucccauu gcuuccauuu uugccuggac cagaggguua 1020
gcccacagag caaagcuuga uaacaauaaa gagcuugccu ucuuugcaaa ugcuuuggaa 1080
gaagucucua uugagacaau ugaggcuggc uucaugacca aggacuuggc ugcuugcauu 1140
aaagguuuac ccaaugugca acguucugac uacuugaaua cauuugaguu cauggauaaa 1200
cuuggagaaa acuugaagau caaacuagcu caggccaaac uuuaa 1245
<210> 52
<211> 303
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Met Ala Thr Ser Arg Tyr Glu Pro Val Ala Glu Ile Gly Val Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Thr Val Tyr Lys Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val
20 25 30
Ala Leu Lys Ser Val Arg Val Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Leu Pro Ile Ser Thr Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Arg Arg Leu Glu
50 55 60
Ala Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Met Asp Val Cys Ala Thr
65 70 75 80
Ser Arg Thr Asp Arg Glu Ile Lys Val Thr Leu Val Phe Glu His Val
85 90 95
Asp Gln Asp Leu Arg Thr Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu
100 105 110
Pro Ala Glu Thr Ile Lys Asp Leu Met Arg Gln Phe Leu Arg Gly Leu
115 120 125
Asp Phe Leu His Ala Asn Cys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu
130 135 140
Asn Ile Leu Val Thr Ser Gly Gly Thr Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Tyr Gln Met Ala Leu Thr Pro Val Val Val
165 170 175
Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gln Ser Thr Tyr Ala
180 185 190
Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Met Phe
195 200 205
Arg Arg Lys Pro Leu Phe Cys Gly Asn Ser Glu Ala Asp Gln Leu Gly
210 215 220
Lys Ile Phe Asp Leu Ile Gly Leu Pro Pro Glu Asp Asp Trp Pro Arg
225 230 235 240
Asp Val Ser Leu Pro Arg Gly Ala Phe Pro Pro Arg Gly Pro Arg Pro
245 250 255
Val Gln Ser Val Val Pro Glu Met Glu Glu Ser Gly Ala Gln Leu Leu
260 265 270
Leu Glu Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Ser Ala Phe Arg
275 280 285
Ala Leu Gln His Ser Tyr Leu His Lys Asp Glu Gly Asn Pro Glu
290 295 300
<210> 53
<211> 912
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
atggctacct ctcgatatga gccagtggct gaaattggtg tcggtgccta tgggacagtg 60
tacaaggccc gtgatcccca cagtggccac tttgtggccc tcaagagtgt gagagtcccc 120
aatggaggag gaggtggagg aggccttccc atcagcacag ttcgtgaggt ggctttactg 180
aggcgactgg aggcttttga gcatcccaat gttgtccggc tgatggacgt ctgtgccaca 240
tcccgaactg accgggagat caaggtaacc ctggtgtttg agcatgtaga ccaggaccta 300
aggacatatc tggacaaggc acccccacca ggcttgccag ccgaaacgat caaggatctg 360
atgcgccagt ttctaagagg cctagatttc cttcatgcca attgcatcgt tcaccgagat 420
ctgaagccag agaacattct ggtgacaagt ggtggaacag tcaagctggc tgactttggc 480
ctggccagaa tctacagcta ccagatggca cttacacccg tggttgttac actctggtac 540
cgagctcccg aagttcttct gcagtccaca tatgcaacac ctgtggacat gtggagtgtt 600
ggctgtatct ttgcagagat gtttcgtcga aagcctctct tctgtggaaa ctctgaagcc 660
gaccagttgg gcaaaatctt tgacctgatt gggctgcctc cagaggatga ctggcctcga 720
gatgtatccc tgccccgtgg agcctttccc cccagagggc cccgcccagt gcagtcggtg 780
gtacctgaga tggaggagtc gggagcacag ctgctgctgg aaatgctgac ttttaaccca 840
cacaagcgaa tctctgcctt tcgagctctg cagcactctt atctacataa ggatgaaggt 900
aatccggagt ga 912
<210> 54
<211> 912
<212> RNA
<213> 智人
<400> 54
auggcuaccu cucgauauga gccaguggcu gaaauuggug ucggugccua ugggacagug 60
uacaaggccc gugaucccca caguggccac uuuguggccc ucaagagugu gagagucccc 120
aauggaggag gagguggagg aggccuuccc aucagcacag uucgugaggu ggcuuuacug 180
aggcgacugg aggcuuuuga gcaucccaau guuguccggc ugauggacgu cugugccaca 240
ucccgaacug accgggagau caagguaacc cugguguuug agcauguaga ccaggaccua 300
aggacauauc uggacaaggc acccccacca ggcuugccag ccgaaacgau caaggaucug 360
augcgccagu uucuaagagg ccuagauuuc cuucaugcca auugcaucgu ucaccgagau 420
cugaagccag agaacauucu ggugacaagu gguggaacag ucaagcuggc ugacuuuggc 480
cuggccagaa ucuacagcua ccagauggca cuuacacccg ugguuguuac acucugguac 540
cgagcucccg aaguucuucu gcaguccaca uaugcaacac cuguggacau guggaguguu 600
ggcuguaucu uugcagagau guuucgucga aagccucucu ucuguggaaa cucugaagcc 660
gaccaguugg gcaaaaucuu ugaccugauu gggcugccuc cagaggauga cuggccucga 720
gauguauccc ugccccgugg agccuuuccc cccagagggc cccgcccagu gcagucggug 780
guaccugaga uggaggaguc gggagcacag cugcugcugg aaaugcugac uuuuaaccca 840
cacaagcgaa ucucugccuu ucgagcucug cagcacucuu aucuacauaa ggaugaaggu 900
aauccggagu ga 912
<210> 55
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Met Glu Lys Asp Gly Leu Cys Arg Ala Asp Gln Gln Tyr Glu Cys Val
1 5 10 15
Ala Glu Ile Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Lys Val Phe Lys Ala Arg Asp
20 25 30
Leu Lys Asn Gly Gly Arg Phe Val Ala Leu Lys Arg Val Arg Val Gln
35 40 45
Thr Gly Glu Glu Gly Met Pro Leu Ser Thr Ile Arg Glu Val Ala Val
50 55 60
Leu Arg His Leu Glu Thr Phe Glu His Pro Asn Val Val Arg Leu Phe
65 70 75 80
Asp Val Cys Thr Val Ser Arg Thr Asp Arg Glu Thr Lys Leu Thr Leu
85 90 95
Val Phe Glu His Val Asp Gln Asp Leu Thr Thr Tyr Leu Asp Lys Val
100 105 110
Pro Glu Pro Gly Val Pro Thr Glu Thr Ile Lys Asp Met Met Phe Gln
115 120 125
Leu Leu Arg Gly Leu Asp Phe Leu His Ser His Arg Val Val His Arg
130 135 140
Asp Leu Lys Pro Gln Asn Ile Leu Val Thr Ser Ser Gly Gln Ile Lys
145 150 155 160
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Tyr Ser Phe Gln Met Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Val Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Tyr Ala Thr Pro Val Asp Leu Trp Ser Val Gly Cys Ile
195 200 205
Phe Ala Glu Met Phe Arg Arg Lys Pro Leu Phe Arg Gly Ser Ser Asp
210 215 220
Val Asp Gln Leu Gly Lys Ile Leu Asp Val Ile Gly Leu Pro Gly Glu
225 230 235 240
Glu Asp Trp Pro Arg Asp Val Ala Leu Pro Arg Gln Ala Phe His Ser
245 250 255
Lys Ser Ala Gln Pro Ile Glu Lys Phe Val Thr Asp Ile Asp Glu Leu
260 265 270
Gly Lys Asp Leu Leu Leu Lys Cys Leu Thr Phe Asn Pro Ala Lys Arg
275 280 285
Ile Ser Ala Tyr Ser Ala Leu Ser His Pro Tyr Phe Gln Asp Leu Glu
290 295 300
Arg Cys Lys Glu Asn Leu Asp Ser His Leu Pro Pro Ser Gln Asn Thr
305 310 315 320
Ser Glu Leu Asn Thr Ala
325
<210> 56
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
atggagaagg acggcctgtg ccgcgctgac cagcagtacg aatgcgtggc ggagatcggg 60
gagggcgcct atgggaaggt gttcaaggcc cgcgacttga agaacggagg ccgtttcgtg 120
gcgttgaagc gcgtgcgggt gcagaccggc gaggagggca tgccgctctc caccatccgc 180
gaggtggcgg tgctgaggca cctggagacc ttcgagcacc ccaacgtggt caggttgttt 240
gatgtgtgca cagtgtcacg aacagacaga gaaaccaaac taactttagt gtttgaacat 300
gtcgatcaag acttgaccac ttacttggat aaagttccag agcctggagt gcccactgaa 360
accataaagg atatgatgtt tcagcttctc cgaggtctgg actttcttca ttcacaccga 420
gtagtgcatc gcgatctaaa accacagaac attctggtga ccagcagcgg acaaataaaa 480
ctcgctgact tcggccttgc ccgcatctat agtttccaga tggctctaac ctcagtggtc 540
gtcacgctgt ggtacagagc acccgaagtc ttgctccagt ccagctacgc cacccccgtg 600
gatctctgga gtgttggctg catatttgca gaaatgtttc gtagaaagcc tctttttcgt 660
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gaagactggc ctagagatgt tgcccttccc aggcaggctt ttcattcaaa atctgcccaa 780
ccaattgaga agtttgtaac agatatcgat gaactaggca aagacctact tctgaagtgt 840
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caggacctgg aaaggtgcaa agaaaacctg gattcccacc tgccgcccag ccagaacacc 960
tcggagctga atacagcctg a 981
<210> 57
<211> 981
<212> RNA
<213> 智人
<400> 57
auggagaagg acggccugug ccgcgcugac cagcaguacg aaugcguggc ggagaucggg 60
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gucgaucaag acuugaccac uuacuuggau aaaguuccag agccuggagu gcccacugaa 360
accauaaagg auaugauguu ucagcuucuc cgaggucugg acuuucuuca uucacaccga 420
guagugcauc gcgaucuaaa accacagaac auucugguga ccagcagcgg acaaauaaaa 480
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ucggagcuga auacagccug a 981
<210> 58
<211> 1210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025 1030 1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040 1045 1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055 1060 1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
1070 1075 1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085 1090 1095
Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln
1100 1105 1110
Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro
1115 1120 1125
His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
1130 1135 1140
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala
1145 1150 1155
Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln
1160 1165 1170
Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
1175 1180 1185
Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
1190 1195 1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 59
<211> 3633
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120
ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180
gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240
accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300
ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360
gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420
caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480
agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540
cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600
ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660
gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720
acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780
aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840
cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900
gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960
gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020
ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080
aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140
ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200
atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560
agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620
cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680
gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800
ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860
catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920
cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980
gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040
aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100
caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160
ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220
cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280
gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340
tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400
tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460
atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520
aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580
ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640
atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700
ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760
agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820
atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag 2880
ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc 2940
attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000
ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060
cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca 3120
accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180
aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240
agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300
cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360
agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420
actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480
ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540
gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600
gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga 3633
<210> 60
<211> 3633
<212> RNA
<213> 智人
<400> 60
augcgacccu ccgggacggc cggggcagcg cuccuggcgc ugcuggcugc gcucugcccg 60
gcgagucggg cucuggagga aaagaaaguu ugccaaggca cgaguaacaa gcucacgcag 120
uugggcacuu uugaagauca uuuucucagc cuccagagga uguucaauaa cugugaggug 180
guccuuggga auuuggaaau uaccuaugug cagaggaauu augaucuuuc cuucuuaaag 240
accauccagg agguggcugg uuauguccuc auugcccuca acacagugga gcgaauuccu 300
uuggaaaacc ugcagaucau cagaggaaau auguacuacg aaaauuccua ugccuuagca 360
gucuuaucua acuaugaugc aaauaaaacc ggacugaagg agcugcccau gagaaauuua 420
caggaaaucc ugcauggcgc cgugcgguuc agcaacaacc cugcccugug caacguggag 480
agcauccagu ggcgggacau agucagcagu gacuuucuca gcaacauguc gauggacuuc 540
cagaaccacc ugggcagcug ccaaaagugu gauccaagcu gucccaaugg gagcugcugg 600
ggugcaggag aggagaacug ccagaaacug accaaaauca ucugugccca gcagugcucc 660
gggcgcugcc guggcaaguc ccccagugac ugcugccaca accagugugc ugcaggcugc 720
acaggccccc gggagagcga cugccugguc ugccgcaaau uccgagacga agccacgugc 780
aaggacaccu gccccccacu caugcucuac aaccccacca cguaccagau ggaugugaac 840
cccgagggca aauacagcuu uggugccacc ugcgugaaga aguguccccg uaauuaugug 900
gugacagauc acggcucgug cguccgagcc uguggggccg acagcuauga gauggaggaa 960
gacggcgucc gcaaguguaa gaagugcgaa gggccuugcc gcaaagugug uaacggaaua 1020
gguauuggug aauuuaaaga cucacucucc auaaaugcua cgaauauuaa acacuucaaa 1080
aacugcaccu ccaucagugg cgaucuccac auccugccgg uggcauuuag gggugacucc 1140
uucacacaua cuccuccucu ggauccacag gaacuggaua uucugaaaac cguaaaggaa 1200
aucacagggu uuuugcugau ucaggcuugg ccugaaaaca ggacggaccu ccaugccuuu 1260
gagaaccuag aaaucauacg cggcaggacc aagcaacaug gucaguuuuc ucuugcaguc 1320
gucagccuga acauaacauc cuugggauua cgcucccuca aggagauaag ugauggagau 1380
gugauaauuu caggaaacaa aaauuugugc uaugcaaaua caauaaacug gaaaaaacug 1440
uuugggaccu ccggucagaa aaccaaaauu auaagcaaca gaggugaaaa cagcugcaag 1500
gccacaggcc aggucugcca ugccuugugc ucccccgagg gcugcugggg cccggagccc 1560
agggacugcg ucucuugccg gaaugucagc cgaggcaggg aaugcgugga caagugcaac 1620
cuucuggagg gugagccaag ggaguuugug gagaacucug agugcauaca gugccaccca 1680
gagugccugc cucaggccau gaacaucacc ugcacaggac ggggaccaga caacuguauc 1740
cagugugccc acuacauuga cggcccccac ugcgucaaga ccugcccggc aggagucaug 1800
ggagaaaaca acacccuggu cuggaaguac gcagacgccg gccaugugug ccaccugugc 1860
cauccaaacu gcaccuacgg augcacuggg ccaggucuug aaggcugucc aacgaauggg 1920
ccuaagaucc cguccaucgc cacugggaug gugggggccc uccucuugcu gcugguggug 1980
gcccugggga ucggccucuu caugcgaagg cgccacaucg uucggaagcg cacgcugcgg 2040
aggcugcugc aggagaggga gcuuguggag ccucuuacac ccaguggaga agcucccaac 2100
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<210> 61
<211> 2549
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg
20 25 30
Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val
35 40 45
Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr
50 55 60
Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala
65 70 75 80
Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val
85 90 95
Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg
100 105 110
Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys
115 120 125
Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr
130 135 140
Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg
145 150 155 160
Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp
180 185 190
Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly
195 200 205
Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu
210 215 220
Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu
225 230 235 240
Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn
245 250 255
Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val
260 265 270
Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu
275 280 285
Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met
290 295 300
Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln
305 310 315 320
Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr
325 330 335
Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala
340 345 350
Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala
385 390 395 400
Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr
405 410 415
Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala
420 425 430
Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe
435 440 445
Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala
465 470 475 480
Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly
485 490 495
Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly
500 505 510
Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile
515 520 525
Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser
530 535 540
Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly
545 550 555 560
Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala
565 570 575
Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe
580 585 590
Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp
595 600 605
His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg
610 615 620
Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His
625 630 635 640
Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu
645 650 655
Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg
660 665 670
Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala
675 680 685
Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val
690 695 700
Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser
705 710 715 720
Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln
725 730 735
Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln
740 745 750
Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile
755 760 765
Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys
770 775 780
Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala
785 790 795 800
Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp
805 810 815
Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser
820 825 830
Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val
835 840 845
Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu
850 855 860
Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr
865 870 875 880
Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro
885 890 895
Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala
900 905 910
Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp
915 920 925
Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp
930 935 940
Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg
945 950 955 960
Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr
965 970 975
Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln
980 985 990
Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile
995 1000 1005
Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val
1010 1015 1020
Lys Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met
1025 1030 1035
Arg Glu Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile
1040 1045 1050
Leu Leu Ile Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys
1055 1060 1065
Leu Tyr Leu Pro Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met
1070 1075 1080
His Asp Asn Ser Pro Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala
1085 1090 1095
Ala Ile Gln Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu
1100 1105 1110
Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro
1115 1120 1125
Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr
1130 1135 1140
Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Arg Ile Ile His Pro
1145 1150 1155
Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu Leu Arg Ser Thr Ala
1160 1165 1170
Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu Gly Lys Lys Tyr
1175 1180 1185
Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val Arg His Arg
1190 1195 1200
Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile Val Lys
1205 1210 1215
Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr Gln
1220 1225 1230
His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly
1235 1240 1245
Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile
1250 1255 1260
Asn Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp
1265 1270 1275
Asp Trp Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys
1280 1285 1290
Asp Ser Ser Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln
1295 1300 1305
Ala Tyr Asn Pro Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val
1310 1315 1320
Ser Cys Trp Ser Glu Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile
1325 1330 1335
Arg Ser Ile Glu Leu Ala Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val
1340 1345 1350
Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Glu Phe Met Glu His Ser Asp
1355 1360 1365
Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg Asp Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu
1370 1375 1380
Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg Ala Tyr Ala Lys Ala Leu His
1385 1390 1395
Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly Pro Thr Pro Ala Ile Leu
1400 1405 1410
Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu Gln Gln Pro Glu Ala
1415 1420 1425
Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala Met Lys His Phe Gly Glu Leu
1430 1435 1440
Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu Trp Glu Asp
1445 1450 1455
Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp Asp
1460 1465 1470
Pro Glu Leu Met Leu Gly Arg Met Arg Cys Leu Glu Ala Leu Gly
1475 1480 1485
Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu
1490 1495 1500
Val Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg Met Ala Ala Ala
1505 1510 1515
Ala Ala Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr
1520 1525 1530
Cys Met Ile Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala
1535 1540 1545
Val Leu Ala Leu His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys
1550 1555 1560
Ile Asp Lys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met
1565 1570 1575
Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys
1580 1585 1590
His Met Leu Ser Glu Leu Glu Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val
1595 1600 1605
Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile Arg Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu
1610 1615 1620
Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu Asp Trp Gln Lys Ile Leu Met
1625 1630 1635
Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His Glu Asp Met Arg Thr Trp
1640 1645 1650
Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly Arg Leu Ala Leu
1655 1660 1665
Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp Pro Ser Arg
1670 1675 1680
Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val Thr Tyr
1685 1690 1695
Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp Ala
1700 1705 1710
Phe Gln His Met Gln His Phe Val Gln Thr Met Gln Gln Gln Ala
1715 1720 1725
Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu
1730 1735 1740
His Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln
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Leu Asn Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu
1760 1765 1770
Gln Tyr Tyr Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys
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Ala Trp His Ala Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His
1790 1795 1800
Tyr Lys His Gln Asn Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg
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His Ala Ser Gly Ala Asn Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr
1820 1825 1830
Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn
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Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser
1850 1855 1860
Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp Leu Ser Lys Thr Leu Leu
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Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe Phe Arg Ser Ile Ser
1880 1885 1890
Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu Arg Val Leu Thr
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Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn Glu Ala Leu
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Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu Gln Val
1925 1930 1935
Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu Val
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Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His
1955 1960 1965
Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr
1970 1975 1980
Thr Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met
1985 1990 1995
Cys Glu His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser
2000 2005 2010
Glu Glu Leu Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His
2015 2020 2025
Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn
2030 2035 2040
Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met
2045 2050 2055
Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala
2060 2065 2070
Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr
2075 2080 2085
Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu
2090 2095 2100
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu Pro Gln Leu
2105 2110 2115
Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro Lys Leu Leu Met Cys
2120 2125 2130
Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr Asp Pro Asn Gln
2135 2140 2145
Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu Gln Val Ile
2150 2155 2160
Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly Ser Asn
2165 2170 2175
Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu Arg
2180 2185 2190
Gln Asp Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu
2195 2200 2205
Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln
2210 2215 2220
Arg Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly
2225 2230 2235
Trp Val Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr
2240 2245 2250
Arg Glu Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met
2255 2260 2265
Leu Arg Met Ala Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys
2270 2275 2280
Val Glu Val Phe Glu His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp
2285 2290 2295
Leu Ala Lys Leu Leu Trp Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp
2300 2305 2310
Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Arg Ser Leu Ala Val Met Ser
2315 2320 2325
Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Pro Ser Asn
2330 2335 2340
Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys Ile Leu His Ile Asp Phe
2345 2350 2355
Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg Glu Lys Phe Pro Glu
2360 2365 2370
Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr Asn Ala Met Glu
2375 2380 2385
Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys His Thr Val
2390 2395 2400
Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala Val Leu
2405 2410 2415
Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met Asp
2420 2425 2430
Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser
2435 2440 2445
Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu
2450 2455 2460
Gly Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser
2465 2470 2475
Ile His Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu
2480 2485 2490
Asn Lys Lys Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu
2495 2500 2505
Thr Gly Arg Asp Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr
2510 2515 2520
Gln Val Glu Leu Leu Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu
2525 2530 2535
Cys Gln Cys Tyr Ile Gly Trp Cys Pro Phe Trp
2540 2545
<210> 62
<211> 7650
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
atgcttggaa ccggacctgc cgccgccacc accgctgcca ccacatctag caatgtgagc 60
gtcctgcagc agtttgccag tggcctaaag agccggaatg aggaaaccag ggccaaagcc 120
gccaaggagc tccagcacta tgtcaccatg gaactccgag agatgagtca agaggagtct 180
actcgcttct atgaccaact gaaccatcac atttttgaat tggtttccag ctcagatgcc 240
aatgagagga aaggtggcat cttggccata gctagcctca taggagtgga aggtgggaat 300
gccacccgaa ttggcagatt tgccaactat cttcggaacc tcctcccctc caatgaccca 360
gttgtcatgg aaatggcatc caaggccatt ggccgtcttg ccatggcagg ggacactttt 420
accgctgagt acgtggaatt tgaggtgaag cgagccctgg aatggctggg tgctgaccgc 480
aatgagggcc ggagacatgc agctgtcctg gttctccgtg agctggccat cagcgtccct 540
accttcttct tccagcaagt gcaacccttc tttgacaaca tttttgtggc cgtgtgggac 600
cccaaacagg ccatccgtga gggagctgta gccgcccttc gtgcctgtct gattctcaca 660
acccagcgtg agccgaagga gatgcagaag cctcagtggt acaggcacac atttgaagaa 720
gcagagaagg gatttgatga gaccttggcc aaagagaagg gcatgaatcg ggatgatcgg 780
atccatggag ccttgttgat ccttaacgag ctggtccgaa tcagcagcat ggagggagag 840
cgtctgagag aagaaatgga agaaatcaca cagcagcagc tggtacacga caagtactgc 900
aaagatctca tgggcttcgg aacaaaacct cgtcacatta cccccttcac cagtttccag 960
gctgtacagc cccagcagtc aaatgccttg gtggggctgc tggggtacag ctctcaccaa 1020
ggcctcatgg gatttgggac ctcccccagt ccagctaagt ccaccctggt ggagagccgg 1080
tgttgcagag acttgatgga ggagaaattt gatcaggtgt gccagtgggt gctgaaatgc 1140
aggaatagca agaactcgct gatccaaatg acaatcctta atttgttgcc ccgcttggct 1200
gcattccgac cttctgcctt cacagatacc cagtatctcc aagataccat gaaccatgtc 1260
ctaagctgtg tcaagaagga gaaggaacgt acagcggcct tccaagccct ggggctactt 1320
tctgtggctg tgaggtctga gtttaaggtc tatttgcctc gcgtgctgga catcatccga 1380
gcggccctgc ccccaaagga cttcgcccat aagaggcaga aggcaatgca ggtggatgcc 1440
acagtcttca cttgcatcag catgctggct cgagcaatgg ggccaggcat ccagcaggat 1500
atcaaggagc tgctggagcc catgctggca gtgggactaa gccctgccct cactgcagtg 1560
ctctacgacc tgagccgtca gattccacag ctaaagaagg acattcaaga tgggctactg 1620
aaaatgctgt ccctggtcct tatgcacaaa ccccttcgcc acccaggcat gcccaagggc 1680
ctggcccatc agctggcctc tcctggcctc acgaccctcc ctgaggccag cgatgtgggc 1740
agcatcactc ttgccctccg aacgcttggc agctttgaat ttgaaggcca ctctctgacc 1800
caatttgttc gccactgtgc ggatcatttc ctgaacagtg agcacaagga gatccgcatg 1860
gaggctgccc gcacctgctc ccgcctgctc acaccctcca tccacctcat cagtggccat 1920
gctcatgtgg ttagccagac cgcagtgcaa gtggtggcag atgtgcttag caaactgctc 1980
gtagttggga taacagatcc tgaccctgac attcgctact gtgtcttggc gtccctggac 2040
gagcgctttg atgcacacct ggcccaggcg gagaacttgc aggccttgtt tgtggctctg 2100
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atgaaccctg cctttgtcat gcctttcctg cgcaagatgc tcatccagat tttgacagag 2220
ttggagcaca gtgggattgg aagaatcaaa gagcagagtg cccgcatgct ggggcacctg 2280
gtctccaatg ccccccgact catccgcccc tacatggagc ctattctgaa ggcattaatt 2340
ttgaaactga aagatccaga ccctgatcca aacccaggtg tgatcaataa tgtcctggca 2400
acaataggag aattggcaca ggttagtggc ctggaaatga ggaaatgggt tgatgaactt 2460
tttattatca tcatggacat gctccaggat tcctctttgt tggccaaaag gcaggtggct 2520
ctgtggaccc tgggacagtt ggtggccagc actggctatg tagtagagcc ctacaggaag 2580
taccctactt tgcttgaggt gctactgaat tttctgaaga ctgagcagaa ccagggtaca 2640
cgcagagagg ccatccgtgt gttagggctt ttaggggctt tggatcctta caagcacaaa 2700
gtgaacattg gcatgataga ccagtcccgg gatgcctctg ctgtcagcct gtcagaatcc 2760
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ttgcctctgg atgagttcta cccagctgtg tccatggtgg ccctgatgcg gatcttccga 2880
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tccctgggac tcaaatgtgt gcagttcctg ccccaggtca tgcccacgtt ccttaacgtc 3000
attcgagtct gtgatggggc catccgggaa tttttgttcc agcagctggg aatgttggtg 3060
tcctttgtga agagccacat cagaccttat atggatgaaa tagtcaccct catgagagaa 3120
ttctgggtca tgaacacctc aattcagagc acgatcattc ttctcattga gcaaattgtg 3180
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cagctgtttg gcgccaacct ggatgactac ctgcatttac tgctgcctcc tattgttaag 3360
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acacttgctg atgaagagga ggatcctttg atttaccagc atcggatgct taggagtggc 3720
caaggggatg cattggctag tggaccagtg gaaacaggac ccatgaagaa actgcacgtc 3780
agcaccatca acctccaaaa ggcctggggc gctgccagga gggtctccaa agatgactgg 3840
ctggaatggc tgagacggct gagcctggag ctgctgaagg actcatcatc gccctccctg 3900
cgctcctgct gggccctggc acaggcctac aacccgatgg ccagggatct cttcaatgct 3960
gcatttgtgt cctgctggtc tgaactgaat gaagatcaac aggatgagct catcagaagc 4020
atcgagttgg ccctcacctc acaagacatc gctgaagtca cacagaccct cttaaacttg 4080
gctgaattca tggaacacag tgacaagggc cccctgccac tgagagatga caatggcatt 4140
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gaactggagt tccagaaagg ccccacccct gccattctag aatctctcat cagcattaat 4260
aataagctac agcagccgga ggcagcggcc ggagtgttag aatatgccat gaaacacttt 4320
ggagagctgg agatccaggc tacctggtat gagaaactgc acgagtggga ggatgccctt 4380
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tggaccctgg ttaatgatga gacccaagcc aagatggccc ggatggctgc tgcagctgca 4560
tggggtttag gtcagtggga cagcatggaa gaatacacct gtatgatccc tcgggacacc 4620
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ctcacagaca ttggtcggta ccacccccag gccctcatct acccactgac agtggcttct 5940
aagtctacca cgacagcccg gcacaatgca gccaacaaga ttctgaagaa catgtgtgag 6000
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ggcccccaga ctctgaagga aacatccttt aatcaggcct atggtcgaga tttaatggag 6240
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tgggacctct attatcatgt gttccgacga atctcaaagc agctgcctca gctcacatcc 6360
ttagagctgc aatatgtttc cccaaaactt ctgatgtgcc gggaccttga attggctgtg 6420
ccaggaacat atgaccccaa ccagccaatc attcgcattc agtccatagc accgtctttg 6480
caagtcatca catccaagca gaggccccgg aaattgacac ttatgggcag caacggacat 6540
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ctcaacatcg agcatcgcat catgttgcgg atggctccgg actatgacca cttgactctg 6840
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aagctgctgt ggctgaaaag ccccagctcc gaggtgtggt ttgaccgaag aaccaattat 6960
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ccatccaacc tgatgctgga ccgtctgagt gggaagatcc tgcacattga ctttggggac 7080
tgctttgagg ttgctatgac ccgagagaag tttccagaga agattccatt tagactaaca 7140
agaatgttga ccaatgctat ggaggttaca ggcctggatg gcaactacag aatcacatgc 7200
cacacagtga tggaggtgct gcgagagcac aaggacagtg tcatggccgt gctggaagcc 7260
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cgatcccgaa cgaggacgga ttcctactct gctggccagt cagtcgaaat tttggacggt 7380
gtggaacttg gagagccagc ccataagaaa acggggacca cagtgccaga atctattcat 7440
tctttcattg gagacggttt ggtgaaacca gaggccctaa ataagaaagc tatccagatt 7500
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gttccaacgc aagttgagct gctcatcaaa caagcgacat cccatgaaaa cctctgccag 7620
tgctatattg gctggtgccc tttctggtaa 7650
<210> 63
<211> 7650
<212> RNA
<213> 智人
<400> 63
augcuuggaa ccggaccugc cgccgccacc accgcugcca ccacaucuag caaugugagc 60
guccugcagc aguuugccag uggccuaaag agccggaaug aggaaaccag ggccaaagcc 120
gccaaggagc uccagcacua ugucaccaug gaacuccgag agaugaguca agaggagucu 180
acucgcuucu augaccaacu gaaccaucac auuuuugaau ugguuuccag cucagaugcc 240
aaugagagga aagguggcau cuuggccaua gcuagccuca uaggagugga aggugggaau 300
gccacccgaa uuggcagauu ugccaacuau cuucggaacc uccuccccuc caaugaccca 360
guugucaugg aaauggcauc caaggccauu ggccgucuug ccauggcagg ggacacuuuu 420
accgcugagu acguggaauu ugaggugaag cgagcccugg aauggcuggg ugcugaccgc 480
aaugagggcc ggagacaugc agcuguccug guucuccgug agcuggccau cagcgucccu 540
accuucuucu uccagcaagu gcaacccuuc uuugacaaca uuuuuguggc cgugugggac 600
cccaaacagg ccauccguga gggagcugua gccgcccuuc gugccugucu gauucucaca 660
acccagcgug agccgaagga gaugcagaag ccucaguggu acaggcacac auuugaagaa 720
gcagagaagg gauuugauga gaccuuggcc aaagagaagg gcaugaaucg ggaugaucgg 780
auccauggag ccuuguugau ccuuaacgag cugguccgaa ucagcagcau ggagggagag 840
cgucugagag aagaaaugga agaaaucaca cagcagcagc ugguacacga caaguacugc 900
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ggccucaugg gauuugggac cucccccagu ccagcuaagu ccacccuggu ggagagccgg 1080
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agcaucacuc uugcccuccg aacgcuuggc agcuuugaau uugaaggcca cucucugacc 1800
caauuuguuc gccacugugc ggaucauuuc cugaacagug agcacaagga gauccgcaug 1860
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uuuauuauca ucauggacau gcuccaggau uccucuuugu uggccaaaag gcagguggcu 2520
cuguggaccc ugggacaguu gguggccagc acuggcuaug uaguagagcc cuacaggaag 2580
uacccuacuu ugcuugaggu gcuacugaau uuucugaaga cugagcagaa ccaggguaca 2640
cgcagagagg ccauccgugu guuagggcuu uuaggggcuu uggauccuua caagcacaaa 2700
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gucuucaugc augacaacag cccaggccgc auugucucua ucaaguuacu ggcugcaauc 3300
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agcaccauca accuccaaaa ggccuggggc gcugccagga gggucuccaa agaugacugg 3840
cuggaauggc ugagacggcu gagccuggag cugcugaagg acucaucauc gcccucccug 3900
cgcuccugcu gggcccuggc acaggccuac aacccgaugg ccagggaucu cuucaaugcu 3960
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gcugaauuca uggaacacag ugacaagggc ccccugccac ugagagauga caauggcauu 4140
guucugcugg gugagagagc ugccaagugc cgagcauaug ccaaagcacu acacuacaaa 4200
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aauaagcuac agcagccgga ggcagcggcc ggaguguuag aauaugccau gaaacacuuu 4320
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guggccuaug acaagaaaau ggacaccaac aaggacgacc cagagcugau gcugggccgc 4440
augcgcugcc ucgaggccuu gggggaaugg ggucaacucc accagcagug cugugaaaag 4500
uggacccugg uuaaugauga gacccaagcc aagauggccc ggauggcugc ugcagcugca 4560
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caacagugca uugacaaggc cagggaccug cuggaugcug aauuaacugc gauggcagga 4740
gagaguuaca gucgggcaua uggggccaug guuucuugcc acaugcuguc cgagcuggag 4800
gagguuaucc aguacaaacu uguccccgag cgacgagaga ucauccgcca gaucuggugg 4860
gagagacugc agggcugcca gcguaucgua gaggacuggc agaaaauccu uauggugcgg 4920
ucccuugugg ucagcccuca ugaagacaug agaaccuggc ucaaguaugc aagccugugc 4980
ggcaagagug gcaggcuggc ucuugcucau aaaacuuuag uguugcuccu gggaguugau 5040
ccgucucggc aacuugacca uccucugcca acaguucacc cucaggugac cuaugccuac 5100
augaaaaaca uguggaagag ugcccgcaag aucgaugccu uccagcacau gcagcauuuu 5160
guccagacca ugcagcaaca ggcccagcau gccaucgcua cugaggacca gcagcauaag 5220
caggaacugc acaagcucau ggcccgaugc uuccugaaac uuggagagug gcagcugaau 5280
cuacagggca ucaaugagag cacaaucccc aaagugcugc aguacuacag cgccgccaca 5340
gagcacgacc gcagcuggua caaggccugg caugcguggg cagugaugaa cuucgaagcu 5400
gugcuacacu acaaacauca gaaccaagcc cgcgaugaga agaagaaacu gcgucaugcc 5460
agcggggcca acaucaccaa cgccaccacu gccgccacca cggccgccac ugccaccacc 5520
acugccagca ccgagggcag caacagugag agcgaggccg agagcaccga gaacagcccc 5580
accccaucgc cgcugcagaa gaaggucacu gaggaucugu ccaaaacccu ccugauguac 5640
acggugccug ccguccaggg cuucuuccgu uccaucuccu ugucacgagg caacaaccuc 5700
caggauacac ucagaguucu caccuuaugg uuugauuaug gucacuggcc agaugucaau 5760
gaggccuuag uggagggggu gaaagccauc cagauugaua ccuggcuaca gguuauaccu 5820
cagcucauug caagaauuga uacgcccaga cccuuggugg gacgucucau ucaccagcuu 5880
cucacagaca uuggucggua ccacccccag gcccucaucu acccacugac aguggcuucu 5940
aagucuacca cgacagcccg gcacaaugca gccaacaaga uucugaagaa caugugugag 6000
cacagcaaca cccuggucca gcaggccaug auggugagcg aggagcugau ccgaguggcc 6060
auccucuggc augagaugug gcaugaaggc cuggaagagg caucucguuu guacuuuggg 6120
gaaaggaacg ugaaaggcau guuugaggug cuggagcccu ugcaugcuau gauggaacgg 6180
ggcccccaga cucugaagga aacauccuuu aaucaggccu auggucgaga uuuaauggag 6240
gcccaagagu ggugcaggaa guacaugaaa ucagggaaug ucaaggaccu cacccaagcc 6300
ugggaccucu auuaucaugu guuccgacga aucucaaagc agcugccuca gcucacaucc 6360
uuagagcugc aauauguuuc cccaaaacuu cugaugugcc gggaccuuga auuggcugug 6420
ccaggaacau augaccccaa ccagccaauc auucgcauuc aguccauagc accgucuuug 6480
caagucauca cauccaagca gaggccccgg aaauugacac uuaugggcag caacggacau 6540
gaguuuguuu uccuucuaaa aggccaugaa gaucugcgcc aggaugagcg ugugaugcag 6600
cucuucggcc ugguuaacac ccuucuggcc aaugacccaa caucucuucg gaaaaaccuc 6660
agcauccaga gauacgcugu caucccuuua ucgaccaacu cgggccucau uggcuggguu 6720
ccccacugug acacacugca cgcccucauc cgggacuaca gggagaagaa gaagauccuu 6780
cucaacaucg agcaucgcau cauguugcgg auggcuccgg acuaugacca cuugacucug 6840
augcagaagg uggagguguu ugagcaugcc gucaauaaua cagcugggga cgaccuggcc 6900
aagcugcugu ggcugaaaag ccccagcucc gagguguggu uugaccgaag aaccaauuau 6960
acccguucuu uagcggucau gucaaugguu ggguauauuu uaggccuggg agauagacac 7020
ccauccaacc ugaugcugga ccgucugagu gggaagaucc ugcacauuga cuuuggggac 7080
ugcuuugagg uugcuaugac ccgagagaag uuuccagaga agauuccauu uagacuaaca 7140
agaauguuga ccaaugcuau ggagguuaca ggccuggaug gcaacuacag aaucacaugc 7200
cacacaguga uggaggugcu gcgagagcac aaggacagug ucauggccgu gcuggaagcc 7260
uuugucuaug accccuugcu gaacuggagg cugauggaca caaauaccaa aggcaacaag 7320
cgaucccgaa cgaggacgga uuccuacucu gcuggccagu cagucgaaau uuuggacggu 7380
guggaacuug gagagccagc ccauaagaaa acggggacca cagugccaga aucuauucau 7440
ucuuucauug gagacgguuu ggugaaacca gaggcccuaa auaagaaagc uauccagauu 7500
auuaacaggg uucgagauaa gcucacuggu cgggacuucu cucaugauga cacuuuggau 7560
guuccaacgc aaguugagcu gcucaucaaa caagcgacau cccaugaaaa ccucugccag 7620
ugcuauauug gcuggugccc uuucugguaa 7650
<210> 64
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys
165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met
180 185
<210> 65
<211> 567
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480
cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540
tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567
<210> 66
<211> 567
<212> RNA
<213> 智人
<400> 66
augacugaau auaaacuugu gguaguugga gcugguggcg uaggcaagag ugccuugacg 60
auacagcuaa uucagaauca uuuuguggac gaauaugauc caacaauaga ggauuccuac 120
aggaagcaag uaguaauuga uggagaaacc ugucucuugg auauucucga cacagcaggu 180
caagaggagu acagugcaau gagggaccag uacaugagga cuggggaggg cuuucuuugu 240
guauuugcca uaaauaauac uaaaucauuu gaagauauuc accauuauag agaacaaauu 300
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ccuucuagaa caguagacac aaaacaggcu caggacuuag caagaaguua uggaauuccu 420
uuuauugaaa caucagcaaa gacaagacag gguguugaug augccuucua uacauuaguu 480
cgagaaauuc gaaaacauaa agaaaagaug agcaaagaug guaaaaagaa gaaaaagaag 540
ucaaagacaa aguguguaau uauguaa 567
<210> 67
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 68
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys
1 5 10 15
Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
35 40 45
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
50 55 60
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
100 105 110
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
115 120 125
Phe Ile Asn Thr Ser
130
<210> 69
<211> 858
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
atgttccatc atgttccatg ctgctgacgt cacatggagc acagaaatca atgttagcag 60
atagccagcc catacaagat cgtattgtat tgtaggaggc attgtggatg gatggctgct 120
ggaaacccct tgccatagcc agctcttctt caatacttaa ggatttaccg tggctttgag 180
taatgagaat ttcgaaacca catttgagaa gtatttccat ccagtgctac ttgtgtttac 240
ttctaaacag tcattttcta actgaagctg gcattcatgt cttcattttg ggctgtttca 300
gtgcagggct tcctaaaaca gaagccaact gggtgaatgt aataagtgat ttgaaaaaaa 360
ttgaagatct tattcaatct atgcatattg atgctacttt atatacggaa agtgatgttc 420
accccagttg caaagtaaca gcaatgaagt gctttctctt ggagttacaa gttatttcac 480
ttgagtccgg agatgcaagt attcatgata cagtagaaaa tctgatcatc ctagcaaaca 540
acagtttgtc ttctaatggg aatgtaacag aatctggatg caaagaatgt gaggaactgg 600
aggaaaaaaa tattaaagaa tttttgcaga gttttgtaca tattgtccaa atgttcatca 660
acacttcttg attgcaattg attcttttta aagtgtttct gttattaaca aacatcactc 720
tgctgcttag acataacaaa acactcggca tttcaaatgt gctgtcaaaa caagtttttc 780
tgtcaagaag atgatcagac cttggatcag atgaactctt agaaatgaag gcagaaaaat 840
gtcattgagt aatatagt 858
<210> 70
<211> 417
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
195 200 205
Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala
385 390 395 400
Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr
405 410 415
Arg
<210> 71
<211> 1254
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60
tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc 120
ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat 180
gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa 240
acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc 300
gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac 360
tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga 420
gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca 480
gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac 540
tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc 600
actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc 660
tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg 720
tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat 780
gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc 840
acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt 900
cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct 960
cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020
tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080
atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140
tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200
gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag gtga 1254
<210> 72
<211> 1254
<212> RNA
<213> 智人
<400> 72
auggcccgag ccauggccgc cgcguggccg cugcugcugg uggcgcuacu ggugcugucc 60
uggccacccc caggaaccgg ggacgucguc gugcaggcgc ccacccaggu gcccggcuuc 120
uugggcgacu ccgugacgcu gcccugcuac cuacaggugc ccaacaugga ggugacgcau 180
gugucacagc ugacuugggc gcggcauggu gaaucuggca gcauggccgu cuuccaccaa 240
acgcagggcc ccagcuauuc ggaguccaaa cggcuggaau ucguggcagc cagacugggc 300
gcggagcugc ggaaugccuc gcugaggaug uucggguugc gcguagagga ugaaggcaac 360
uacaccugcc uguucgucac guucccgcag ggcagcagga gcguggauau cuggcuccga 420
gugcuugcca agccccagaa cacagcugag guucagaagg uccagcucac uggagagcca 480
gugcccaugg cccgcugcgu cuccacaggg ggucgcccgc cagcccaaau caccuggcac 540
ucagaccugg gcgggaugcc caauacgagc caggugccag gguuccuguc uggcacaguc 600
acugucacca gccucuggau auuggugccc ucaagccagg uggacggcaa gaaugugacc 660
ugcaaggugg agcacgagag cuuugagaag ccucagcugc ugacugugaa ccucaccgug 720
uacuaccccc cagagguauc caucucuggc uaugauaaca acugguaccu uggccagaau 780
gaggccaccc ugaccugcga ugcucgcagc aacccagagc ccacaggcua uaauuggagc 840
acgaccaugg guccccugcc acccuuugcu guggcccagg gcgcccagcu ccugauccgu 900
ccuguggaca aaccaaucaa cacaacuuua aucugcaacg ucaccaaugc ccuaggagcu 960
cgccaggcag aacugaccgu ccaggucaaa gagggaccuc ccagugagca cucaggcaug 1020
ucccguaacg ccaucaucuu ccugguucug ggaauccugg uuuuucugau ccugcugggg 1080
aucgggauuu auuucuauug guccaaaugu ucccgugagg uccuuuggca cugucaucug 1140
ugucccucga guacagagca ugccagcgcc ucagcuaaug ggcaugucuc cuauucagcu 1200
gugagcagag agaacagcuc uucccaggau ccacagacag agggcacaag guga 1254
<210> 73
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 74
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60
gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120
aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180
gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240
tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300
atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360
gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420
attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480
cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540
accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600
acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660
acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720
ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780
ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840
aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873
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<211> 873
<212> RNA
<213> 智人
<400> 75
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gauaagaaca uuauucaauu ugugcaugga gaggaagacc ugaagguuca gcauaguagc 240
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aucacagaug ugaaauugca ggaugcaggg guguaccgcu gcaugaucag cuaugguggu 360
gccgacuaca agcgaauuac ugugaaaguc aaugccccau acaacaaaau caaccaaaga 420
auuuugguug uggauccagu caccucugaa caugaacuga caugucaggc ugagggcuac 480
cccaaggccg aagucaucug gacaagcagu gaccaucaag uccugagugg uaagaccacc 540
accaccaauu ccaagagaga ggagaagcuu uucaauguga ccagcacacu gagaaucaac 600
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acagcugaau uggucauccc agaacuaccu cuggcacauc cuccaaauga aaggacucac 720
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uuaagaaaag ggagaaugau ggaugugaaa aaauguggca uccaagauac aaacucaaag 840
aagcaaagug auacacauuu ggaggagacg uaa 873
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<211> 454
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met
1 5 10 15
Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile
50 55 60
Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg
65 70 75 80
Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp
100 105 110
Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln
115 120 125
Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile
130 135 140
Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val
145 150 155 160
Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser
165 170 175
Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr
180 185 190
Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val
195 200 205
Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala
210 215 220
Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His
245 250 255
Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu
260 265 270
Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys
290 295 300
Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His
305 310 315 320
Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala
325 330 335
Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser
340 345 350
Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn
355 360 365
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
370 375 380
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
385 390 395 400
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
405 410 415
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
420 425 430
Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
435 440 445
Leu Arg Asn Ser Cys Ala
450
<210> 77
<211> 1365
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
atggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60
agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120
gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180
agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240
cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300
aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360
ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420
aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480
tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540
cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc 600
tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc 660
aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc 720
tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg 780
cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt 840
tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga 900
ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat 960
cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc 1020
aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc 1080
aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag 1140
aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa 1200
aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc 1260
gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa 1320
cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cgtaa 1365
<210> 78
<211> 1365
<212> RNA
<213> 智人
<400> 78
auggauuuuu uucggguagu ggaaaaccag cagccucccg cgacgaugcc ccucaacguu 60
agcuucacca acaggaacua ugaccucgac uacgacucgg ugcagccgua uuucuacugc 120
gacgaggagg agaacuucua ccagcagcag cagcagagcg agcugcagcc cccggcgccc 180
agcgaggaua ucuggaagaa auucgagcug cugcccaccc cgccccuguc cccuagccgc 240
cgcuccgggc ucugcucgcc cuccuacguu gcggucacac ccuucucccu ucggggagac 300
aacgacggcg guggcgggag cuucuccacg gccgaccagc uggagauggu gaccgagcug 360
cugggaggag acauggugaa ccagaguuuc aucugcgacc cggacgacga gaccuucauc 420
aaaaacauca ucauccagga cuguaugugg agcggcuucu cggccgccgc caagcucguc 480
ucagagaagc uggccuccua ccaggcugcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc 540
cgcggccaca gcgucugcuc caccuccagc uuguaccugc aggaucugag cgccgccgcc 600
ucagagugca ucgaccccuc gguggucuuc cccuacccuc ucaacgacag cagcucgccc 660
aaguccugcg ccucgcaaga cuccagcgcc uucucuccgu ccucggauuc ucugcucucc 720
ucgacggagu ccuccccgca gggcagcccc gagccccugg ugcuccauga ggagacaccg 780
cccaccacca gcagcgacuc ugaggaggaa caagaagaug aggaagaaau cgauguuguu 840
ucuguggaaa agaggcaggc uccuggcaaa aggucagagu cuggaucacc uucugcugga 900
ggccacagca aaccuccuca cagcccacug guccucaaga ggugccacgu cuccacacau 960
cagcacaacu acgcagcgcc ucccuccacu cggaaggacu auccugcugc caagaggguc 1020
aaguuggaca gugucagagu ccugagacag aucagcaaca accgaaaaug caccagcccc 1080
agguccucgg acaccgagga gaaugucaag aggcgaacac acaacgucuu ggagcgccag 1140
aggaggaacg agcuaaaacg gagcuuuuuu gcccugcgug accagauccc ggaguuggaa 1200
aacaaugaaa aggcccccaa gguaguuauc cuuaaaaaag ccacagcaua cauccugucc 1260
guccaagcag aggagcaaaa gcucauuucu gaagaggacu uguugcggaa acgacgagaa 1320
caguugaaac acaaacuuga acagcuacgg aacucuugug cguaa 1365
<210> 79
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 80
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 81
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120
ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180
aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240
ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300
gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360
gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420
aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480
caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca ctga 534
<210> 82
<211> 2842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 82
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccacgtg tcttgtccag agctcgccac catgtacaga atgcagctgc tgagctgtat 420
cgccctgtct ctggccctgg tcacaaatag cgcccctacc agcagcagca ccaagaaaac 480
acagctgcaa ctggaacacc tcctgctgga cctgcagatg atcctgaacg gcatcaacaa 540
ctacaagaac cccaagctga cccggatgct gaccttcaag ttctacatgc ccaagaaggc 600
caccgagctg aagcacctcc agtgcctgga agaggaactg aagcccctgg aagaagtgct 660
gaatctggcc cagagcaaga acttccacct gaggcctagg gacctgatca gcaacatcaa 720
cgtgatcgtg ctggaactga aaggcagcga gacaaccttc atgtgcgagt acgccgacga 780
gacagctacc atcgtggaat ttctgaaccg gtggatcacc ttctgccaga gcatcatcag 840
caccctgacc tgaggtacct ggagcacaag actggcctca tgggccttcc gctcactgcc 900
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960
tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020
aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1860
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1920
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1980
gcaatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 2040
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 2100
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 2160
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2220
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2280
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2340
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2400
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2460
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2520
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2580
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2640
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2700
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2760
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2820
acatttcccc gaaaagtgcc ac 2842
<210> 83
<211> 2839
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 83
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccacgtg tcttgtccag agctcgccac catgctgaaa ctgctgctgc tcctgtgtat 420
cgccctgtct ctggccgcca caaatagcgc ccctaccagc agctccacca agaaaacaca 480
gctgcaactg gaacatctgc tgctggacct gcagatgatc ctgaacggca tcaacaacta 540
caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac cttcaagttc tacatgccca agaaggccac 600
cgagctgaag cacctccagt gcctggaaga ggaactgaag cccctggaag aagtgctgaa 660
tctggcccag agcaagaact tccacctgag gcctagggac ctgatcagca acatcaacgt 720
gatcgtgctg gaactgaaag gcagcgagac aaccttcatg tgcgagtacg ccgacgagac 780
agctaccatc gtggaatttc tgaaccggtg gatcaccttc tgccagagca tcatcagcac 840
cctgacctga ggtacctgga gcacaagact ggcctcatgg gccttccgct cactgcccgc 900
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaacat ggtcatagct gtttccttgc 960
gtattgggcg ctctccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcgggtaaa 1020
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ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 1140
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 1200
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 1260
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 1320
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 1380
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 1440
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 1500
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 1560
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 1620
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 1680
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 1740
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 1800
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 1860
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 1920
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 1980
atgataccgc gagaaccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 2040
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 2100
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 2160
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 2220
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 2280
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 2340
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 2400
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 2460
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 2520
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 2580
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 2640
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 2700
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 2760
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 2820
tttccccgaa aagtgccac 2839
<210> 84
<211> 2842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 84
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccacgtg tcttgtccag agctcgccac catgttgttg ctgctgctcg cctgtattgc 420
cctggcctct acagccgccg ctacaaattc tgcccctacc agcagctcca ccaagaaaac 480
ccagctgcaa ctggaacatc tgctgctgga cctgcagatg atcctgaacg gcatcaacaa 540
ctacaagaac cccaagctga cccggatgct gaccttcaag ttctacatgc ccaagaaggc 600
caccgagctg aagcacctcc agtgcctgga agaggaactg aagcccctgg aagaagtgct 660
gaatctggcc cagagcaaga acttccacct gaggcctagg gacctgatca gcaacatcaa 720
cgtgatcgtg ctggaactga aaggcagcga gacaaccttc atgtgcgagt acgccgacga 780
gacagctacc atcgtggaat ttctgaaccg gtggatcacc ttctgccaga gcatcatcag 840
caccctgacc tgaggtacct ggagcacaag actggcctca tgggccttcc gctcactgcc 900
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct 960
tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt 1020
aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1080
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1140
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1200
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1260
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1320
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1380
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1440
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1500
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1560
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1620
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1680
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1740
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1800
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1860
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tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1980
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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<211> 4251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 94
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<213> 人工序列
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<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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agctgcatta acatggtcat agctgtttcc ttgcgtattg ggcgctctcc gcttcctcgc 1260
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggg taaagcctgg ggtgcctaat gagcaaaagg 1320
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 1380
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 1440
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 1500
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 1560
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 1620
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 1680
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 1740
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 1800
tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 1860
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1920
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 1980
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 2040
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 2100
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 2160
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 2220
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagaac cacgctcacc 2280
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 2340
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 2400
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 2460
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 2520
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 2580
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 2640
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 2700
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 2760
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 2820
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 2880
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 2940
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 3000
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 3060
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 3113
<210> 97
<211> 3113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 97
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg ccaccatgag aatcagcaag ccccacctga gatccatcag catccagtgc 420
tacctgtgcc tgctgctgaa cagccacttt ctgacagagg ccggcatcca cgtgttcatc 480
ctgggctgtt tttctgccgg cctgcctaag accgaggcca actgggttaa cgtgatcagc 540
gacctgaaga agatcgagga cctgatccag agcatgcaca tcgacgccac actgtacacc 600
gagagcgacg tgcaccctag ctgtaaagtg accgccatga agtgctttct gctggaactg 660
caagtgatca gcctggaaag cggcgacgcc agcatccacg acaccgtgga aaacctgatc 720
atcctggcca acaacagcct gagcagcaac ggcaatgtga ccgagtccgg ctgcaaagag 780
tgcgaggaac tggaagagaa gaatatcaaa gagttcctgc agagcttcgt gcacatcgtg 840
cagatgttca tcaacaccag ctgaatagtg agtcgtatta acgtaccaac aaggagtacc 900
ctgatgagat cacttggatc tcatcagggt actcctttat cttagaggca tatccctacg 960
taccaacaag aaggttcagc atagtagcta acttgtagct actatgctga accttcttta 1020
tcttagaggc atatccctac gtaccaacaa ggacgacgag accttcatca aacttgttga 1080
tgaaggtctc gtcgtccttt atcttagagg catatccctt ttatcttaga ggcatatccc 1140
tctgggcctc atgggccttc cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 1200
agctgcatta acatggtcat agctgtttcc ttgcgtattg ggcgctctcc gcttcctcgc 1260
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggg taaagcctgg ggtgcctaat gagcaaaagg 1320
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 1380
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 1440
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 1500
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 1560
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 1620
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 1680
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 1740
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 1800
tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 1860
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1920
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 1980
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 2040
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 2100
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 2160
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 2220
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagaac cacgctcacc 2280
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 2340
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 2400
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 2460
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 2520
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 2580
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 2640
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 2700
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 2760
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 2820
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 2880
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 2940
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 3000
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 3060
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 3113
<210> 98
<211> 3162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 98
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg ccaccatgtt ccacgtgtcc ttccggtaca tcttcggcct gcctccactg 420
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cagtacgaga gcgtgctgat ggtgtccatc gaccagctgc tggacagcat gaaggaaatc 540
ggcagcaact gcctgaacaa cgagttcaac ttcttcaagc ggcacatctg cgacgccaac 600
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aagagcctgg aagagaacaa gtccctgaaa gagcagaaga agctgaacga cctctgcttc 840
ctgaagcggc tgctgcaaga gatcaagacc tgctggaaca agatcctgat gggcaccaaa 900
gaacactgaa tagtgagtcg tattaacgta ccaacaagaa ggttcagcat agtagctaac 960
ttgtagctac tatgctgaac cttctttatc ttagaggcat atccctacgt accaacaagc 1020
gaattactgt gaaagtcaaa cttgttgact ttcacagtaa ttcgctttat cttagaggca 1080
tatccctacg taccaacaag accagcacac tgagaatcaa acttgttgat tctcagtgtg 1140
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ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1440
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accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1560
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1620
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1680
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1740
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1800
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 1860
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 1920
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 1980
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2040
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2100
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2160
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2220
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2280
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccagatt 2340
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2400
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2460
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2520
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2580
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2640
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2700
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2760
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2820
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2880
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2940
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3000
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3060
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3120
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 3162
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 99
gctgcaaggc gattaagttg 20
<210> 100
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<220>
<221> 来源
<223> /注释=组合的DNA/RNA分子的描述: 合成的引物
<400> 100
uuuttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
cagctatgac catgttaatg cag 143
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 101
gctctgtcta agggttggcc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 102
ccatgtcgtc gatgagccta 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 103
gagtccccaa tggaggagga 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 104
tccatcagcc ggacaacatt 20
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 105
gcagaccggc gaggag 16
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 106
ctgttcgtga cactgtgca 19
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 107
tacctcatcc cacagcagg 19
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 108
gctgtcttcc ttgatgggac 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 109
gtacagtgca atgagggacc a 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 110
cacaaagaaa gccctcccca 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 111
catgcatgac aacagcccag 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 112
agcttcaggg gcatcaaaca 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 113
ttgccttgct gctctacctc 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 114
ggagggcaga atcatcacga 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 115
cccaaatcac ctggcactca 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 116
ctcaaagctc tcgtgctcca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 117
gttgaaggac cagctctccc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 118
cttgtagtcg gcaccaccat 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 119
actgtatgtg gagcggcttc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 120
caggtacaag ctggaggtgg 20
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 121
acccgttgaa ccccattcgt ga 22
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的引物
<400> 122
gcctcactaa accatccaat cgg 23
<210> 123
<211> 1848
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
cctcgcacgc actgcgggct ccggcgctgc gggctggccg ggcgctgcgg gctgaccggg 60
cgctccggga actcggctcg ggaacctcgt ctgcggtggg cggggccggc ccggagcccc 120
gccccggctc agtccctgaa acccaggcgc ggaccggctg cagtctcaga agggagctgc 180
tgtctgcgga ggaaactgca tcgacggacg gccgcccagc tacgggagga cctggagtgg 240
cactgggcgc ccgacggacc atccccggga cccgcctgcc cctcggcgcc ccgccccgcc 300
gggccgctcc ccgtcgggtt ccccagccac agccttacct acgggctcct gactccgcaa 360
ggcttccaga agatgctcga accaccggcc ggggcctcgg ggcagcagtg agggaggcgt 420
ccagcccccc actcagctct tctcctcctg tgccaggggc tccccggggg atgagcatgg 480
tggttttccc tcggagcccc ctggctcggg acgtctgaga agatgccggt catgaggctg 540
ttcccttgct tcctgcagct cctggccggg ctggcgctgc ctgctgtgcc cccccagcag 600
tgggccttgt ctgctgggaa cggctcgtca gaggtggaag tggtaccctt ccaggaagtg 660
tggggccgca gctactgccg ggcgctggag aggctggtgg acgtcgtgtc cgagtacccc 720
agcgaggtgg agcacatgtt cagcccatcc tgtgtctccc tgctgcgctg caccggctgc 780
tgcggcgatg agaatctgca ctgtgtgccg gtggagacgg ccaatgtcac catgcagctc 840
ctaaagatcc gttctgggga ccggccctcc tacgtggagc tgacgttctc tcagcacgtt 900
cgctgcgaat gccggcctct gcgggagaag atgaagccgg aaaggtgcgg cgatgctgtt 960
ccccggaggt aacccacccc ttggaggaga gagaccccgc acccggctcg tgtatttatt 1020
accgtcacac tcttcagtga ctcctgctgg tacctgccct ctatttatta gccaactgtt 1080
tccctgctga atgcctcgct cccttcaaga cgaggggcag ggaaggacag gaccctcagg 1140
aattcagtgc cttcaacaac gtgagagaaa gagagaagcc agccacagac ccctgggagc 1200
ttccgctttg aaagaagcaa gacacgtggc ctcgtgaggg gcaagctagg ccccagaggc 1260
cctggaggtc tccaggggcc tgcagaagga aagaaggggg ccctgctacc tgttcttggg 1320
cctcaggctc tgcacagaca agcagccctt gctttcggag ctcctgtcca aagtagggat 1380
gcggatcctg ctggggccgc cacggcctgg ctggtgggaa ggccggcagc gggcggaggg 1440
gatccagcca cttccccctc ttcttctgaa gatcagaaca ttcagctctg gagaacagtg 1500
gttgcctggg ggcttttgcc actccttgtc ccccgtgatc tcccctcaca ctttgccatt 1560
tgcttgtact gggacattgt tctttccggc caaggtgcca ccaccctgcc ccccctaaga 1620
gacacataca gagtgggccc cgggctggag aaagagctgc ctggatgaga aacagctcag 1680
ccagtgggga tgaggtcacc aggggaggag cctgtgcgtc ccagctgaag gcagtggcag 1740
gggagcaggt tccccaaggg ccctggcacc cccacaagct gtccctgcag ggccatctga 1800
ctgccaagcc agattctctt gaataaagta ttctagtgtg gaaacgct 1848
<210> 124
<211> 4391
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
agcggcggcc ggaagctggc tgagccggcc tttggtaacg ccacctgcac ttctgggggc 60
gtcgagcctg gcggtagaat cttcccagta ggcggcgcgg gagggaaaag aggattgagg 120
ggctaggccg ggcggatccc gtcctccccc gatgtgagca gttttccgaa accccgtcag 180
gcgaaggctg cccagagagg tggagtcggt agcggggccg ggaacatgag gcagtctctc 240
ctattcctga ccagcgtggt tcctttcgtg ctggcgccgc gacctccgga tgacccgggc 300
ttcggccccc accagagact cgagaagctt gattctttgc tctcagacta cgatattctc 360
tctttatcta atatccagca gcattcggta agaaaaagag atctacagac ttcaacacat 420
gtagaaacac tactaacttt ttcagctttg aaaaggcatt ttaaattata cctgacatca 480
agtactgaac gtttttcaca aaatttcaag gtcgtggtgg tggatggtaa aaacgaaagc 540
gagtacactg taaaatggca ggacttcttc actggacacg tggttggtga gcctgactct 600
agggttctag cccacataag agatgatgat gttataatca gaatcaacac agatggggcc 660
gaatataaca tagagccact ttggagattt gttaatgata ccaaagacaa aagaatgtta 720
gtttataaat ctgaagatat caagaatgtt tcacgtttgc agtctccaaa agtgtgtggt 780
tatttaaaag tggataatga agagttgctc ccaaaagggt tagtagacag agaaccacct 840
gaagagcttg ttcatcgagt gaaaagaaga gctgacccag atcccatgaa gaacacgtgt 900
aaattattgg tggtagcaga tcatcgcttc tacagataca tgggcagagg ggaagagagt 960
acaactacaa attacttaat agagctaatt gacagagttg atgacatcta tcggaacact 1020
tcatgggata atgcaggttt taaaggctat ggaatacaga tagagcagat tcgcattctc 1080
aagtctccac aagaggtaaa acctggtgaa aagcactaca acatggcaaa aagttaccca 1140
aatgaagaaa aggatgcttg ggatgtgaag atgttgctag agcaatttag ctttgatata 1200
gctgaggaag catctaaagt ttgcttggca caccttttca cataccaaga ttttgatatg 1260
ggaactcttg gattagctta tgttggctct cccagagcaa acagccatgg aggtgtttgt 1320
ccaaaggctt attatagccc agttgggaag aaaaatatct atttgaatag tggtttgacg 1380
agcacaaaga attatggtaa aaccatcctt acaaaggaag ctgacctggt tacaactcat 1440
gaattgggac ataattttgg agcagaacat gatccggatg gtctagcaga atgtgccccg 1500
aatgaggacc agggagggaa atatgtcatg tatcccatag ctgtgagtgg cgatcacgag 1560
aacaataaga tgttttcaaa ctgcagtaaa caatcaatct ataagaccat tgaaagtaag 1620
gcccaggagt gttttcaaga acgcagcaat aaagtttgtg ggaactcgag ggtggatgaa 1680
ggagaagagt gtgatcctgg catcatgtat ctgaacaacg acacctgctg caacagcgac 1740
tgcacgttga aggaaggtgt ccagtgcagt gacaggaaca gtccttgctg taaaaactgt 1800
cagtttgaga ctgcccagaa gaagtgccag gaggcgatta atgctacttg caaaggcgtg 1860
tcctactgca caggtaatag cagtgagtgc ccgcctccag gaaatgctga agatgacact 1920
gtttgcttgg atcttggcaa gtgtaaggat gggaaatgca tccctttctg cgagagggaa 1980
cagcagctgg agtcctgtgc atgtaatgaa actgacaact cctgcaaggt gtgctgcagg 2040
gacctttctg gccgctgtgt gccctatgtc gatgctgaac aaaagaactt atttttgagg 2100
aaaggaaagc cctgtacagt aggattttgt gacatgaatg gcaaatgtga gaaacgagta 2160
caggatgtaa ttgaacgatt ttgggatttc attgaccagc tgagcatcaa tacttttgga 2220
aagtttttag cagacaacat cgttgggtct gtcctggttt tctccttgat attttggatt 2280
cctttcagca ttcttgtcca ttgtgtggat aagaaattgg ataaacagta tgaatctctg 2340
tctctgtttc accccagtaa cgtcgaaatg ctgagcagca tggattctgc atcggttcgc 2400
attatcaaac cctttcctgc gccccagact ccaggccgcc tgcagcctgc ccctgtgatc 2460
ccttcggcgc cagcagctcc aaaactggac caccagagaa tggacaccat ccaggaagac 2520
cccagcacag actcacatat ggacgaggat gggtttgaga aggacccctt cccaaatagc 2580
agcacagctg ccaagtcatt tgaggatctc acggaccatc cggtcaccag aagtgaaaag 2640
gctgcctcct ttaaactgca gcgtcagaat cgtgttgaca gcaaagaaac agagtgctaa 2700
tttagttctc agctcttctg acttaagtgt gcaaaatatt tttatagatt tgacctacaa 2760
atcaatcaca gcttgtattt tgtgaagact gggaagtgac ttagcagatg ctggtcatgt 2820
gtttgaactt cctgcaggta aacagttctt gtgtggtttg gcccttctcc ttttgaaaag 2880
gtaaggtgaa ggtgaatcta gcttattttg aggctttcag gttttagttt ttaaaatatc 2940
ttttgacctg tggtgcaaaa gcagaaaata cagctggatt gggttatgaa tatttacgtt 3000
tttgtaaatt aatcttttat attgataaca gcactgacta gggaaatgat cagttttttt 3060
ttatacactg taatgaaccg ctgaatatga ggcatttggc atttatttgt gatgacaact 3120
ggaatagttt tttttttttt tttttttttt tgccttcaac taaaaacaaa ggagataaat 3180
ctagtataca ttgtctctaa attgtgggtc tatttctagt tattacccag agtttttatg 3240
tagcagggaa aatatatatc taaatttaga aatcatttgg gttaatatgg ctcttcataa 3300
ttctaagact aatgctctct agaaacctaa ccacctacct tacagtgagg gctatacatg 3360
gtagccagtt gaatttatgg aatctaccaa ctgtttaggg ccctgatttg ctgggcagtt 3420
tttctgtatt ttataagtat cttcatgtat ccctgttact gatagggata catgctctta 3480
gaaaattcac tattggctgg gagtggtggc tcatgcctgt aatcccagca cttggagagg 3540
ctgaggttgc gccactacac tccagcctgg gtgacagagt gagactctgc ctcaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaaaattc actatctaca aacctagaat atttaaaata caaagattgc 3660
ctgttttcaa acactattga ataagagggt gagatatttc ttaacaacaa caacaacaaa 3720
aaaaacaggt tgttttgaat gtgatgagcc agccaggaga tagaatacta cctgccctta 3780
gggttggggg ctgtccccac aagacttgat acttcagaaa ccctttttat tgacccacaa 3840
gcagatattt gaattacttc ttactttatt gctccaggat tctggatggg ctgcatttac 3900
tgtgtgaagg ataaaaatca ttagcctgga ttctgatttc tataaattgc cattaaaagc 3960
tttttttccc ctaagaactg aaatgtgctc accagccaaa acattttaac ttgtaaattt 4020
tgagggcagt taaccaaacc tgtgactaat catatctcct cctacccccc atttccaagg 4080
acatttgtta ctcagatact tgttatacta atacttgaac ttgtacctta tggtatttgc 4140
tatcttttaa ctagtcatga tattcttata ctttagttac acttttggaa tttgatacaa 4200
ggttgagtgg ggtgtgtggg tgtatgtatg agtgaaacag ttctcaaaag aatgtaagaa 4260
aaaccatttt tataaaattg tgacttttta aaaacatagt ctttgtcatt tatagaatta 4320
acaagctgct cagggtatat tttatagctg tagcactgat atctgcatta ataaatactg 4380
tcgaaacaca a 4391
<210> 125
<211> 468
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 125
gccaccaugu acagaaugca gcugcugagc uguaucgccc ugucucuggc ccuggucaca 60
aauagcgccc cuaccagcag cagcaccaag aaaacacagc ugcaacugga acaccuccug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
augcugaccu ucaaguucua caugcccaag aaggccaccg agcugaagca ccuccagugc 240
cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
agcgagacaa ccuucaugug cgaguacgcc gacgagacag cuaccaucgu ggaauuucug 420
aaccggugga ucaccuucug ccagagcauc aucagcaccc ugaccuga 468
<210> 126
<211> 465
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 126
gccaccaugc ugaaacugcu gcugcuccug uguaucgccc ugucucuggc cgccacaaau 60
agcgccccua ccagcagcuc caccaagaaa acacagcugc aacuggaaca ucugcugcug 120
gaccugcaga ugauccugaa cggcaucaac aacuacaaga accccaagcu gacccggaug 180
cugaccuuca aguucuacau gcccaagaag gccaccgagc ugaagcaccu ccagugccug 240
gaagaggaac ugaagccccu ggaagaagug cugaaucugg cccagagcaa gaacuuccac 300
cugaggccua gggaccugau cagcaacauc aacgugaucg ugcuggaacu gaaaggcagc 360
gagacaaccu ucaugugcga guacgccgac gagacagcua ccaucgugga auuucugaac 420
cgguggauca ccuucugcca gagcaucauc agcacccuga ccuga 465
<210> 127
<211> 468
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 127
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc cgccgcuaca 60
aauucugccc cuaccagcag cuccaccaag aaaacccagc ugcaacugga acaucugcug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
augcugaccu ucaaguucua caugcccaag aaggccaccg agcugaagca ccuccagugc 240
cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
agcgagacaa ccuucaugug cgaguacgcc gacgagacag cuaccaucgu ggaauuucug 420
aaccggugga ucaccuucug ccagagcauc aucagcaccc ugaccuga 468
<210> 128
<211> 468
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 128
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc ccuggucacc 60
aauucugccc cuaccagcag cuccaccaag aaaacccagc ugcaacugga acaucugcug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
augcugaccu ucaaguucua caugcccaag aaggccaccg agcugaagca ccuccagugc 240
cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
agcgagacaa ccuucaugug cgaguacgcc gacgagacag cuaccaucgu ggaauuucug 420
aaccggugga ucaccuucug ccagagcauc aucagcaccc ugaccuga 468
<210> 129
<211> 749
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 129
gccaccaugu acagaaugca gcugcugagc uguaucgccc ugucucuggc ccuggucaca 60
aauagcgccc cuaccagcag cagcaccaag aaaacacagc ugcaacugga acaccuccug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
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cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
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uaucccuuuu aucuuagagg cauaucccu 749
<210> 130
<211> 749
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 130
gccaccaugu acagaaugca gcugcugagc uguaucgccc ugucucuggc ccuggucaca 60
aauagcgccc cuaccagcag cagcaccaag aaaacacagc ugcaacugga acaccuccug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
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uaucccuuuu aucuuagagg cauaucccu 749
<210> 131
<211> 749
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 131
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc cgccgcuaca 60
aauucugccc cuaccagcag cuccaccaag aaaacccagc ugcaacugga acaucugcug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
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cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
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uaucccuuuu aucuuagagg cauaucccu 749
<210> 132
<211> 911
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 132
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc cgccgcuaca 60
aauucugccc cuaccagcag cuccaccaag aaaacccagc ugcaacugga acaucugcug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
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uccgcagacg uguaaaugua cuugacauuu acacgucugc ggaucuuuau cuuagaggca 720
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ggcauauccc u 911
<210> 133
<211> 737
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 133
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc cgccgcuaca 60
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cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
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auuaacguac caacaaggag uacccugaug agaucacuug gaucucauca ggguacuccu 540
uuaucuuaga ggcauauccc uacguaccaa caaggaguac ccugaugaga ucacuuggau 600
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gaugagauca cuuggaucuc aucaggguac uccuuuaucu uagaggcaua ucccuuuuau 720
cuuagaggca uaucccu 737
<210> 134
<211> 807
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 134
gccaccaugu uguugcugcu gcucgccugu auugcccugg ccucuacagc cgccgcuaca 60
aauucugccc cuaccagcag cuccaccaag aaaacccagc ugcaacugga acaucugcug 120
cuggaccugc agaugauccu gaacggcauc aacaacuaca agaaccccaa gcugacccgg 180
augcugaccu ucaaguucua caugcccaag aaggccaccg agcugaagca ccuccagugc 240
cuggaagagg aacugaagcc ccuggaagaa gugcugaauc uggcccagag caagaacuuc 300
caccugaggc cuagggaccu gaucagcaac aucaacguga ucgugcugga acugaaaggc 360
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aaccggugga ucaccuucug ccagagcauc aucagcaccc ugaccugaau agugagucgu 480
auuaacguac caacaaggag ggcagaauca ucacgaagug gugaaguacu ugacuucacc 540
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aauguuccac uugggaacau uuacacgucu gcggaucuug uacuuuaucu uagaggcaua 780
ucccuuuuau cuuagaggca uaucccu 807
<210> 135
<211> 1910
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 135
gccaccaugu gucaccagca gcuggucauc agcugguuca gccugguguu ccuggccucu 60
ccucuggugg ccaucuggga gcugaagaaa gacguguacg ugguggaacu ggacugguau 120
cccgaugcuc cuggcgagau gguggugcug accugcgaua ccccugaaga ggacggcauc 180
accuggacac uggaucaguc uagcgaggug cucggcagcg gcaagacccu gaccauccaa 240
gugaaagagu uuggcgacgc cggccaguac accugucaca aaggcggaga agugcugagc 300
cacagccugc ugcugcucca caagaaagag gauggcauuu ggagcaccga cauccugaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccuuc cugagaugcg aggccaagaa cuacagcggc 420
cgguucacau guugguggcu gaccaccauc agcaccgacc ugaccuucag cgugaagucc 480
agcagaggca gcagugaucc ucagggcguu acauguggcg ccgcuacacu gucugccgaa 540
agagugcggg gcgacaacaa agaauacgag uacagcgugg aaugccaaga ggacagcgcc 600
uguccagccg ccgaagaguc ucugccuauc gaagugaugg uggacgccgu gcacaagcug 660
aaguacgaga acuacaccuc cagcuuuuuc auccgggaca ucaucaagcc cgauccucca 720
aagaaccugc agcugaagcc ucugaagaac agcagacagg uggaaguguc cugggaguac 780
cccgacaccu ggucuacacc ccacagcuac uucagccuga ccuuuugcgu gcaagugcag 840
ggcaagucca agcgcgagaa aaaggaccgg guguucaccg acaagaccag cgccaccgug 900
aucugcagaa agaacgccag caucagcguc agagcccagg accgguacua cagcagcucu 960
uggagcgaau gggccagcgu gccauguucu gguggcggag gaucuggcgg agguggaagc 1020
ggcggaggcg gaucuagaaa ucugccugug gccacuccug auccuggcau guucccuugu 1080
cugcaccaca gccagaaccu gcugagagcc guguccaaca ugcugcagaa ggccagacag 1140
acccuggaau ucuaccccug caccagcgag gaaaucgacc acgaggacau caccaaggau 1200
aagaccagca ccguggaagc cugccugccu cuggaacuga ccaagaacga gagcugccug 1260
aacagccggg aaaccagcuu caucaccaac ggcucuugcc uggccagcag aaagaccucc 1320
uucaugaugg cccugugccu gagcagcauc uacgaggacc ugaagaugua ccagguggaa 1380
uucaagacca ugaacgccaa gcugcugaug gaccccaagc ggcagaucuu ccuggaccag 1440
aauaugcugg ccgugaucga cgagcugaug caggcccuga acuucaacag cgagacagug 1500
ccccagaagu cuagccugga agaacccgac uucuacaaga ccaagaucaa gcugugcauc 1560
cugcugcacg ccuuccggau cagagccgug accaucgaca gagugaugag cuaccugaac 1620
gccuccugaa uagugagucg uauuaacgua ccaacaaguu ccuuccaaau ggcucuguac 1680
uugacagagc cauuuggaag gaacuuuauc uuagaggcau aucccuacgu accaacaagc 1740
aucguucacc gagaucugaa cuugucagau cucggugaac gaugcuuuau cuuagaggca 1800
uaucccuacg uaccaacaag accagcagcg gacaaauaaa acuuguuuau uuguccgcug 1860
cuggucuuua ucuuagaggc auaucccuuu uaucuuagag gcauaucccu 1910
<210> 136
<211> 1938
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 136
gccaccaugu gucaccagca gcuggucauc agcugguuca gccugguguu ccuggccucu 60
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gugaaagagu uuggcgacgc cggccaguac accugucaca aaggcggaga agugcugagc 300
cacagccugc ugcugcucca caagaaagag gauggcauuu ggagcaccga cauccugaag 360
gaccagaaag agcccaagaa caagaccuuc cugagaugcg aggccaagaa cuacagcggc 420
cgguucacau guugguggcu gaccaccauc agcaccgacc ugaccuucag cgugaagucc 480
agcagaggca gcagugaucc ucagggcguu acauguggcg ccgcuacacu gucugccgaa 540
agagugcggg gcgacaacaa agaauacgag uacagcgugg aaugccaaga ggacagcgcc 600
uguccagccg ccgaagaguc ucugccuauc gaagugaugg uggacgccgu gcacaagcug 660
aaguacgaga acuacaccuc cagcuuuuuc auccgggaca ucaucaagcc cgauccucca 720
aagaaccugc agcugaagcc ucugaagaac agcagacagg uggaaguguc cugggaguac 780
cccgacaccu ggucuacacc ccacagcuac uucagccuga ccuuuugcgu gcaagugcag 840
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acccuggaau ucuaccccug caccagcgag gaaaucgacc acgaggacau caccaaggau 1200
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<210> 137
<211> 1910
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 137
gccaccaugu gucaccagca gcuggucauc agcugguuca gccugguguu ccuggccucu 60
ccucuggugg ccaucuggga gcugaagaaa gacguguacg ugguggaacu ggacugguau 120
cccgaugcuc cuggcgagau gguggugcug accugcgaua ccccugaaga ggacggcauc 180
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ggcaagucca agcgcgagaa aaaggaccgg guguucaccg acaagaccag cgccaccgug 900
aucugcagaa agaacgccag caucagcguc agagcccagg accgguacua cagcagcucu 960
uggagcgaau gggccagcgu gccauguucu gguggcggag gaucuggcgg agguggaagc 1020
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cugcaccaca gccagaaccu gcugagagcc guguccaaca ugcugcagaa ggccagacag 1140
acccuggaau ucuaccccug caccagcgag gaaaucgacc acgaggacau caccaaggau 1200
aagaccagca ccguggaagc cugccugccu cuggaacuga ccaagaacga gagcugccug 1260
aacagccggg aaaccagcuu caucaccaac ggcucuugcc uggccagcag aaagaccucc 1320
uucaugaugg cccugugccu gagcagcauc uacgaggacc ugaagaugua ccagguggaa 1380
uucaagacca ugaacgccaa gcugcugaug gaccccaagc ggcagaucuu ccuggaccag 1440
aauaugcugg ccgugaucga cgagcugaug caggcccuga acuucaacag cgagacagug 1500
ccccagaagu cuagccugga agaacccgac uucuacaaga ccaagaucaa gcugugcauc 1560
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cuguccuuua ucuuagaggc auaucccuuu uaucuuagag gcauaucccu 1910
<210> 138
<211> 1910
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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agcagaggca gcagugaucc ucagggcguu acauguggcg ccgcuacacu gucugccgaa 540
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ggcggaggcg gaucuagaaa ucugccugug gccacuccug auccuggcau guucccuugu 1080
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acccuggaau ucuaccccug caccagcgag gaaaucgacc acgaggacau caccaaggau 1200
aagaccagca ccguggaagc cugccugccu cuggaacuga ccaagaacga gagcugccug 1260
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<210> 139
<211> 772
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 139
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<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 140
gccaccauga gaaucagcaa gccccaccug agauccauca gcauccagug cuaccugugc 60
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<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
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<210> 142
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala
20
<210> 143
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala
20
<210> 144
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala
20 25
<210> 145
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser
20 25
<210> 146
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
atgtgtccag cgcgcagcct cctccttgtg gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt 60
ttggcc 66
<210> 147
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 147
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggcc 66
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<211> 87
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagct 87
<210> 149
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
atgttccacg tgtccttccg gtacatcttc ggcctgcctc cactgatcct ggtgctgctg 60
cctgtggcca gcagc 75
<210> 150
<211> 220
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(220)
<223> /注释=此序列可以包含1-220核苷酸
<220>
<221> 来源
<223> /注释=关于替代和优选的实施方案参见说明书的详细描述
<400> 150
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 220
<210> 151
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(200)
<223> /注释=此序列可以包含1-200核苷酸
<220>
<221> 来源
<223> /注释=关于替代和优选的实施方案参见说明书的详细描述
<400> 151
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200
<210> 152
<211> 220
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(220)
<223> /注释=此序列可以包含20-220核苷酸
<220>
<221> 来源
<223> /注释=关于替代和优选的实施方案参见说明书的详细描述
<400> 152
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 220
<210> 153
<211> 120
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 153
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
<210> 154
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 154
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
Claims (147)
1.一种组合物，包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码调节与肿瘤增生相关的基因表达的遗传元件。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中细胞因子是白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15、IL-7、其片段或其功能性变体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中细胞因子包含选自SEQ ID NOs:24、44、47、68和80的序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中细胞因子包含信号肽。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的信号肽序列或修饰的信号肽序列。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中未修饰的信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:26和125-128的序列。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中IL-2包含信号肽。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中未修饰的IL-2信号肽序列包含在SEQ ID NO:26中所列的序列。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中信号肽包含通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中第一RNA是信使RNA(mRNA)。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中siRNA能够结合与肿瘤增生相关的基因的mRNA。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更丰富种类的siRNA。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中与肿瘤增生相关的基因包含与血管生成相关的基因。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中与血管生成相关的基因编码血管内皮生长因子(VEGF)、其片段或其功能性变体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中VEGF是VEGFA、其片段或其功能性变体。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中VEGFA包含在SEQ ID NO:35中所列的序列。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中VEGF是VEGFA同工型、其片段或其功能性变体。
23.根据权利要求19所述的组合物，其中VEGF是胎盘生长因子(PIGF)、其片段或其功能性变体。
24.根据权利要求1所述的组合物，其中与肿瘤增生相关的基因包括异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)、雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、分化抗原簇(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)或myc原癌基因(c-Myc)。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中与肿瘤增生相关的基因包含选自SEQ ID NOs:50、53、56、59、62、65、71、74和77的序列。
26.根据权利要求1所述的组合物，其中第一RNA通过接头与第二RNA连接。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中接头包含tRNA接头或包含在SEQ ID NO:21中所列序列的接头。
28.根据权利要求1所述的组合物，还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中第一RNA和第二RNA均为重组性。
30.一种组合物，包含与第二RNA连接的第一RNA，其中第一RNA编码细胞因子，并且其中第二RNA编码调节与免疫系统识别相关的基因表达的遗传元件。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中细胞因子是白介素-2(IL-2)、其片段或其功能性变体。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中IL-2包含了含有SEQ ID NO:24的序列。
33.根据权利要求31所述的组合物，其中IL-2包含信号肽。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中IL-2信号肽序列包含在SEQ ID NO:26中所列的序列。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中信号肽包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
38.根据权利要求所述30的组合物，其中第一RNA是信使RNA(mRNA)。
39.根据权利要求所述30的组合物，其中第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中siRNA能够结合与免疫系统识别相关的基因的mRNA。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中与免疫系统识别相关的基因编码MHC I类链相关序列A(MICA)、其片段或其功能性变体。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中MICA包含在SEQ ID NO:38中所列的序列。
43.根据权利要求40所述的组合物，其中与免疫系统识别相关的基因编码MHC I类链相关序列B(MICB)、其片段或其功能性变体。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中MICB包含在SEQ ID NO:41中所列的序列。
45.根据权利要求40所述的组合物，其中与免疫系统识别相关的基因编码内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中ADAM是ADAM17。
47.根据权利要求39所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。
48.根据权利要求39所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更丰富种类的siRNA。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
50.根据权利要求所述30的组合物，其中第一RNA通过接头与第二RNA连接。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中接头包含tRNA接头或包含在SEQ ID NO:21中所列序列的接头。
52.根据权利要求30所述的组合物，还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。
53.根据权利要求30-52中任一项所述的组合物，其中第一RNA和第二RNA均为重组RNA。
54.组合物，包含：
编码白介素-2(IL-2)、IL-15、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节血管内皮生长因子A(VEGFA)、VEGFA同工型、胎盘生长因子(PIGF)、分化抗原簇155(CD155)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、myc原癌基因(c-Myc)、其片段或其功能性变体的表达。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中第一RNA是信使RNA(mRNA)。
56.根据权利要求54所述的组合物，其中IL-2包含了含有SEQ ID NO:24的序列。
57.根据权利要求54所述的组合物，其中IL-2包含信号肽。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中IL-2信号肽序列包含在SEQ ID NO:26中所列的序列。
60.根据权利要求57所述的组合物，其中信号肽包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
62.根据权利要求54所述的组合物，其中IL-15包含了含有SEQ ID NO:68的序列。
63.根据权利要求54所述的组合物，其中IL-15包含信号肽。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-15信号肽序列。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中未修饰的IL-15信号肽序列包含在SEQ ID NO:144中所列的序列。
66.根据权利要求所述54的组合物，其中第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中siRNA能够与VEGFA、VEGFA同工型、PIGF、CD155、PD-L1或c-Myc的mRNA结合。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中VEGFA包含了含有SEQ ID NO:35的序列。
69.根据权利要求67所述的组合物，其中CD155包含了含有SEQ ID NO:71的序列。
70.根据权利要求67所述的组合物，其中PD-L1包含了含有SEQ ID NO:74的序列。
71.根据权利要求67所述的组合物，其中c-Myc包含了含有SEQ ID NO:77的序列。
72.根据权利要求66所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。
73.根据权利要求66所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更丰富种类的siRNA。
74.根据权利要求72或73所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
75.根据权利要求所述54的组合物，其中第一RNA通过接头与第二RNA连接。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中接头包含tRNA接头或包含了含有SEQ ID NO:21的序列的接头。
77.根据权利要求54所述的组合物，还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。
78.根据权利要求54-77中任一项所述的组合物，其中第一RNA和第二RNA均为重组RNA。
79.组合物，包含：
编码白介素-2(IL-2)、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节MHC I类链相关序列A(MICA)、MHC I类链相关序列B(MICB)、内质网蛋白(ERp5)、解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)、基质金属蛋白酶(MMP)、其片段或其功能性变体的表达。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中ADAM是ADAM17。
81.根据权利要求79所述的组合物，其中第一RNA是信使RNA(mRNA)。
82.根据权利要求79所述的组合物，其中IL-2包含了含有SEQ ID NO:24的序列。
83.根据权利要求79所述的组合物，其中IL-2包含信号肽。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-2信号肽序列。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中IL-2信号肽序列包含在SEQ ID NO:26中所列的序列。
86.根据权利要求83所述的组合物，其中信号肽包含通过插入、缺失和/或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中通过插入、缺失或置换至少一个氨基酸所修饰的IL-2信号肽序列包含选自SEQ ID NOs:27-29的序列。
88.根据权利要求所述79的组合物，其中第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中siRNA能够与MICA、MICB、ERp5、ADAM或MMP的mRNA结合。
90.根据权利要求89所述的组合物，其中MICA包含了含有SEQ ID NO:38的序列。
91.根据权利要求89所述的组合物，其中MICB包含了含有SEQ ID NO:41的序列。
92.根据权利要求89所述的组合物，其中ADAM是ADAM17。
93.根据权利要求88所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。
94.根据权利要求88所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更丰富种类的siRNA。
95.根据权利要求93或94所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
96.根据权利要求所述79的组合物，其中第一RNA通过接头与第二RNA连接。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中接头包含tRNA接头或包含在SEQ ID NO:21中所列序列的接头。
98.根据权利要求79所述的组合物，还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。
99.根据权利要求79-98中任一项所述的组合物，其中第一RNA和第二RNA均为重组RNA。
100.组合物，包含：
编码白介素-12(IL-12)、IL-7、其片段或其功能性变体的第一RNA，其与编码遗传元件的第二RNA连接，所述遗传元件调节异柠檬酸脱氢酶(IDH1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDK6、表皮生长因子受体(EGFR)，雷帕霉素的机理性靶(mTOR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)、其片段或其功能性变体的表达。
101.根据权利要求100所述的组合物，其中第一RNA是信使RNA(mRNA)。
102.根据权利要求100所述的组合物，其中IL-12包含了含有SEQ ID NO:44或SEQ IDNO:47的序列。
103.根据权利要求100所述的组合物，其中IL-12包含信号肽。
104.根据权利要求103所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-12信号肽。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中未修饰的IL-12信号肽包含在SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:143中所列的序列。
106.根据权利要求100所述的组合物，其中IL-7包含了含有SEQ ID NO:80的序列。
107.根据权利要求100所述的组合物，其中IL-7包含信号肽。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中信号肽包含未修饰的IL-7信号肽。
109.根据权利要求108所述的组合物，其中未修饰的IL-7信号肽包含在SEQ ID NO:128中所列的序列。
110.根据权利要求100所述的组合物，其中第二RNA是小干扰性RNA(siRNA)。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中siRNA能够与IDH1、CDK4、CDK6、EGFR、mTOR、KRAS或PD-L1的mRNA结合。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中IDH1包含了含有SEQ ID NO:50的序列。
113.根据权利要求111所述的组合物，其中CDK4包含了含有SEQ ID NO:53的序列。
114.根据权利要求111所述的组合物，其中CDK6包含了含有SEQ ID NO:56的序列。
115.根据权利要求111所述的组合物，其中mTOR包含了含有SEQ ID NO:62的序列。
116.根据权利要求111所述的组合物，其中EGFR包含了含有SEQ ID NO:59的序列。
117.根据权利要求111所述的组合物，其中KRAS包含了含有SEQ ID NO:65的序列。
118.根据权利要求111所述的组合物，其中PD-L1包含了含有SEQ ID NO:74的序列。
119.根据权利要求110所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA，其中每个种类的siRNA包含靶向同一mRNA的不同区域的不同序列。
120.根据权利要求110所述的组合物，其中第二RNA包含1、2、3、4、5个或更丰富种类的siRNA。
121.根据权利要求119或120所述的组合物，其中1、2、3、4、5个或更多个种类的siRNA中每个种类均由包含SEQ ID NO:22中所列序列的接头连接。
122.根据权利要求所述100的组合物，其中第一RNA通过接头与第二RNA连接。
123.根据权利要求122所述的组合物，其中接头包含tRNA接头或包含了含有SEQ IDNO:21的序列的接头。
124.根据权利要求100所述的组合物，还包含聚腺苷酸尾、5’帽或Kozak序列。
125.根据权利要求100-124中任一项所述的组合物，其中第一RNA和第二RNA均为重组RNA。
126.药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1-125中任一项所述的组合物和可药用辅料。
127.治疗癌症的方法，包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求1-125或根据权利要求126所述的药物组合物。
128.根据权利要求127所述的方法，其中癌症是实体瘤。
129.根据权利要求127所述的方法，其中癌症是黑素瘤。
130.根据权利要求127所述的方法，其中癌症是肾细胞癌。
131.根据权利要求127所述的方法，其中癌症是头颈癌。
132.根据权利要求131所述的方法，其中头颈癌是头颈鳞状细胞癌。
133.根据权利要求131所述的方法，其中头颈癌是喉癌、下咽癌、鼻腔癌症、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、唾液腺癌、脑肿瘤、食管癌、眼癌、甲状旁腺癌、头颈肉瘤或甲状腺癌。
134.根据权利要求127所述的方法，其中癌症位于上呼吸消化道处。
135.根据权利要求134所述的方法，其中上呼吸消化道包括鼻旁窦、鼻腔、口腔、唾液腺、舌、鼻咽、口咽、下咽或喉。
136.根据权利要求127所述的方法，其中受试者患有头颈癌。
137.根据权利要求136所述的方法，其中患有头颈癌的受试者具备烟草使用史。
138.根据权利要求136所述的方法，其中患有头颈癌的受试者具有人乳头瘤病毒(HPV)DNA。
139.根据权利要求127-138任一项所述的方法，其中受试者是人。
140.组合物，包含重组多核酸构建体，所述重组多核酸构建体包含选自SEQ ID NOs:1-17和125-141的核酸序列。
141.根据权利要求1-125中任一项所述的组合物，用于调节细胞中两个或更多个基因的表达。
142.细胞，包含根据权利要求1-125中任一项所述的组合物。
143.载体，包含重组多核酸构建体，所述构建体编码根据权利要求1-125中任一项所述的组合物。
144.在细胞中从单一RNA转录物产生siRNA和mRNA的方法，包括向所述细胞引入根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体。
145.调节蛋白质表达的方法，包括向细胞中引入根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体，其中与没有根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体的细胞相比，第二RNA编码的蛋白质的表达减少。
146.调节蛋白质表达的方法，包括向细胞中引入根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体，其中与没有根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体的细胞相比，第一RNA编码的蛋白质的表达增加。
147.调节蛋白质表达的方法，包括向细胞中引入根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体，其中与没有根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体的细胞相比，第二RNA编码的蛋白质的表达减少，并且其中与没有根据权利要求1-125中任一项所述的组合物或根据权利要求143所述的载体的细胞相比，第一RNA编码的蛋白质的表达增加。
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