CN109996874A - 10-甲基硬脂酸的异源性产生 - Google Patents
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Abstract
本发明公开包括甲基转移酶基因和/或还原酶基因的核酸和细胞。这些核酸和细胞可用于产生支化(甲基)脂质，例如10‑甲基硬脂酸酯。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求对2016年9月20日提交的美国临时专利申请序列第62/396,870号的优先权，所述临时申请以引用方式整体并入本文。
背景技术
衍生自农业植物油和动物油的脂肪酸可用作工业润滑剂、液压液、油脂和其他专用流体以及加工用油化学原料。这些脂肪酸的物理和化学性质的大部分源自其碳链长度和不饱和双键数。脂肪酸通常为16:0(16个碳，0个双键)、16:1(16个碳，1个双键)、18:0、18:1、18:2或18:3。重要的是，无双键(饱和)脂肪酸具有高氧化稳定性，但其在低温下固化。双键提高低温流动性，但降低氧化稳定性。这种折衷对润滑剂和其他专用流体制剂造成困难，因为需要在宽范围操作温度下的一致性长期性能(高氧化稳定性)。高18:1(油酸)脂肪酸油提供低温流动性和相对良好的氧化稳定性。因此，已研发具有高油酸组成的若干种商品，例如高油酸大豆油、高油酸葵花油和高油酸藻油。但油酸是烯烃，并且易发生氧化降解。
发明内容
本文所述的核酸、细胞和方法通常可用于产生支化(甲基)脂质，例如10-甲基硬脂酸，以及包括所述脂质的组合物。如10-甲基硬脂酸的饱和支化(甲基)脂质具有有利的低温流动性和有利的氧化稳定性，这是润滑剂和专用流体所需的性质。
各个方面涉及核酸，包括编码甲基转移酶蛋白质的重组tmsB基因、编码还原酶蛋白质的重组tmsA基因和/或编码tmsC蛋白质的重组tmsC基因。甲基转移酶蛋白质、还原酶蛋白质和/或tmsC蛋白质可以是由放线菌(Actinobacteria)物种表达的蛋白质，并且重组tmsB基因、重组tmsA基因和/或重组tmsC基因可进行密码子优化以用于在不同细菌门(例如，变形菌门(Proteobacterium))中或在真核生物(例如，酵母，例如腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)(也称作腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)或腺嘌呤毛孢子菌(Trichosporon adeninivorans))、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))中的表达。重组tmsB基因、重组tmsA基因或重组tmsC基因可以可操作连接到能驱动在除了放线菌(例如，变形菌门)以外的细菌门中或在真核生物(例如，酵母)中表达的启动子。核酸可以是质粒或染色体。
一些方面涉及包括如本文所述核酸的细胞。细胞可包括支化(甲基)脂质，例如10-甲基硬脂酸；和/或环外亚甲基取代的脂质，例如10-亚甲基硬脂酸。细胞可以是真核细胞，例如藻类细胞、酵母细胞或植物细胞。
一些方面涉及通过培养包括如本文所述细胞的细胞培养物来产生的组合物。油组合物可包含支化(甲基)脂质，例如10-甲基硬脂酸；和/或环外亚甲基取代的脂质，例如10-亚甲基硬脂酸。
附图说明
图1描绘油酸转化为10-甲基硬脂酸的一种可能机制。油酸底物可作为甘油脂或磷脂的酰基链存在。捐献甲基的甲硫氨酸底物可作为S-腺苷甲硫氨酸存在。油酸和甲硫氨酸底物可转化为10-亚甲基硬脂酸(例如，作为甘油脂或磷脂的酰基链存在)和高半胱氨酸(例如，作为S-腺苷高半胱氨酸存在)。该反应可由如本文所述的tmsB蛋白质催化，见下文。10-亚甲基硬脂酸(例如，作为甘油脂或磷脂的酰基链存在)可还原为10-甲基硬脂酸。该反应可由如本文所述的tmsA蛋白质催化，见下文，例如使用NADPH作为还原剂。但说明书和权利要求书的语言并不限于任何特定反应机制。
图2描绘油酸转化为10-甲基硬脂酸的一种可能机制。作为羧酸存于胞质溶胶中的油酸可添加到单酰甘油-3-磷酸酯以形成包括油酸酰基的二酰甘油-3-磷酸酯。“10-甲基合酶”可将包括油酸酰基的二酰甘油-3-磷酸酯转化为包括10-甲基硬脂酸酰基的二酰甘油-3-磷酸酯。二酰基-3-磷酸酯可随后转化为三酰甘油，转化为另一磷脂，例如磷脂酰胆碱，或转化回单酰甘油-3-磷酸酯(例如，由此将游离的10-甲基硬脂酸根释放到胞质溶胶中)。但说明书和权利要求书的语言并不限于任何特定反应机制。
图3描绘来自16个不同细菌物种的编码催化甲基转移到烷基链的酶的原核操纵子，标记为A-P。tmsA和tmsB基因对于甲基化烷基链特别重要。tmsC基因对于甲基化烷基链也可很重要。这些基因的核苷酸序列和其所编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1-76中。
图4是质粒pNC704的图谱，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)基因tmsA(SEQ ID NO:1)和tmsB(SEQ ID NO:3)。质粒pNC738的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:77中。
图5是质粒pNC738的图谱，其可用于在酵母(例如腺嘌呤阿氏酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母)中表达耻垢分枝杆菌基因tmsA(SEQ ID NO:80)和tmsB(SEQ ID NO:81)的密码子优化形式。质粒pNC738的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:78中。
图6是质粒BS-10MS_ER的图谱，其可用于在酵母(例如腺嘌呤阿氏酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母)中表达耻垢分枝杆菌基因tmsA(SEQ ID NO:80)和tmsB(SEQ ID NO:81)的密码子优化形式。质粒BS-10MS_ER的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:79中。
图7A和7B由多种脂肪酸标准品和从多个样品提取的脂质的重叠的气相色谱(GC)迹线组成。标准品为硬脂酸、10-甲基硬脂酸和油酸。在分析前将每一样品和标准品转酯化为脂肪酸甲基酯(FAME)。图7A描绘从表达来自耻垢分枝杆菌的tmsA和tmsB基因的大肠杆菌制备的FAME的GC迹线以及每一标准品的GC迹线。tmsA/tmsB样品显示在约10.777分钟的峰，对应于10-甲基硬脂酸标准品。图7B描绘图7A的每个迹线和两个额外迹线。第一额外迹线对应于从表达来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的ufa基因的大肠杆菌制备的FAME。该样品显示在约10.777分钟的峰，对应于10-甲基硬脂酸标准品。第二额外迹线对应于从已经空载体转染的大肠杆菌制备的FAME。该对照不显示在10.777分钟的峰，表明在经转化大肠杆菌中tmsA和tmsB基因合成10-甲基硬脂酸。
图8A和8B描绘GC-MS结果。图8A是从GC柱洗脱的脂质的气相色谱(GC)迹线。脂质是从已经编码耻垢分枝杆菌基因tmsA和tmsB的pNC704转染的大肠杆菌纯化，并且脂质转化为脂肪酸甲基酯。图8B是20.388到20.447分钟的A组在GC运行期间洗脱的脂质的质谱图。针对具有312的分子量的10-甲基硬脂酸脂肪酸甲基酯对质谱图进行选通。光谱还显示在313m/z的峰，对应于包括天然丰度同位素(例如，单一13C)的10-甲基硬脂酸甲基酯。
图9A-9D描绘以下载体的图谱，所述载体可用于表达所指示物种的tmsA和tmsB基因：pNC721(范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaaleni))(SEQ ID NO:83)、pNC755(浅黄拟无枝酸球菌(Amycolicicoccus subflavus))(SEQ ID NO:84)、pNC757(甘氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glyciniphilum))(SEQ ID NO:85)、pNC 904(浑浊红球菌(Rhodococcus opacus))(SEQ ID NO:86)、pNC905(嗜热子囊菌(Thermobifida fusca))(SEQ ID NO:87)、pNC906(弯曲嗜热单胞菌(Thermomonospora curvata))(SEQ ID NO:88)、pNC907(谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))(SEQ ID NO:89)、pNC908(苏别蒂山农霉菌(Agromycies subbeticus))(SEQ ID NO:90)、pNC910(淡黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum))(SEQ ID NO:91)、pNC911(紫檀分枝杆菌(Mycobacteriumsp.indicus))(SEQ ID NO:92)。
图10描绘以下载体的图谱：pNC985(SEQ ID NO:93)，其可用于在红球菌属(Rhodococcus)细菌中表达耻垢分枝杆菌tmsAB基因，和pNC986(SEQ ID NO:94)，其可用于在红球菌属细菌中表达嗜热子囊菌tmsAB基因。
图11描绘以下载体的图谱：pNC963(SEQ ID NO:95)，其编码在组成型tac启动子控制下的弯曲嗜热单胞菌tmsB基因，和pNC964(SEQ ID NO:96)，其编码在组成型tac启动子控制下的弯曲嗜热单胞菌tmsA基因。
图12是显示表达来自多种生物体的tmsB基因的解脂假丝酵母中的10-亚甲基硬脂酸的气相色谱检测的图表。
图13是显示在含有编码弯曲嗜热单胞菌tmsB的质粒的腺嘌呤阿氏酵母的8种转化体中，10-亚甲基脂肪酸与总脂肪酸相比的百分比的图表。最右侧的两种分离物经空载体对照转化。
图14是显示在含有弯曲嗜热单胞菌tmsB基因的稳定整合拷贝，并且经表达来自谷氨酸棒状杆菌(C.gl.)、弯曲嗜热单胞菌(T.cu.)或嗜热子囊菌(T.fu.)的tmsA的质粒或空载体对照(最右侧的两种转化体)转化的解脂耶氏酵母中，10-亚甲基脂肪酸和10-甲基脂肪酸的重量百分比的图表。
图15是显示在经空载体(-)或编码弯曲嗜热单胞菌tmsA(T.cu.tmsA)、弯曲嗜热单胞菌tmsB(T.cu.tmsB)或弯曲嗜热单胞菌tmsA和tmsB二者(T.cu.tmsA+tmsB)的载体转化的酿酒酵母的转化体中，10-亚甲基脂肪酸和10-甲基脂肪酸与总脂肪酸相比的重量百分比的图表。
图16是显示在含有tmsA-B融合蛋白质、tmsB-A融合蛋白质或空载体(-)的酿酒酵母的转化体中，10-亚甲基脂肪酸和10-甲基脂肪酸与总脂肪酸相比的重量百分比的图表。
图17是显示在含有tmsA-B融合蛋白质、tmsB-A融合蛋白质或空载体(-)的解脂假丝酵母的转化体中，10-亚甲基脂肪酸和10-甲基脂肪酸与总脂肪酸相比的重量百分比的图表。
图18是显示在含有tmsA-B融合蛋白质或空载体(-)的腺嘌呤阿氏酵母的转化体中，10-亚甲基脂肪酸和10-甲基脂肪酸与总脂肪酸相比的重量百分比的图表。
图19A-19D显示对以下序列的CLUSTAL OMEGA比对：由来自耻垢分枝杆菌(SEQ IDNO:4)、范巴伦氏分枝杆菌(SEQ ID NO:54)、浅黄拟无枝酸球菌(SEQ ID NO:12)、甘氨酸棒状杆菌(SEQ ID NO:20)、谷氨酸棒状杆菌(SEQ ID NO:16)、浑浊红球菌(SEQ ID NO:60)、苏别蒂山农霉菌(SEQ ID NO:8)、气生诺尔氏菌(Knoellia aerolata)(SEQ ID NO:26)、淡黄分枝杆菌(SEQ ID NO:36)、紫檀分枝杆菌(SEQ ID NO:42)、嗜热子囊菌(SEQ ID NO:70)和弯曲嗜热单胞菌(SEQ ID NO:76)的tmsB基因编码的tmsB蛋白质序列，以及来自大肠杆菌(Escherichia coli)的环丙烷脂肪酸合酶(Cfa)酶。
图20A-20E显示对以下序列的CLUSTAL OMEGA比对：由来自耻垢分枝杆菌(SEQ IDNO:2)、范巴伦氏分枝杆菌(SEQ ID NO:52)、浅黄拟无枝酸球菌(SEQ ID NO:10)、甘氨酸棒状杆菌(SEQ ID NO:18)、谷氨酸棒状杆菌(SEQ ID NO:14)、浑浊红球菌(SEQ ID NO:58)、苏别蒂山农霉菌(SEQ ID NO:6)、气生诺尔氏菌(SEQ ID NO:24)、淡黄分枝杆菌(SEQ ID NO:34)、紫檀分枝杆菌(SEQ ID NO:40)、嗜热子囊菌(SEQ ID NO:68)和弯曲嗜热单胞菌(SEQID NO:74)的tmsA基因编码的tmsA蛋白质序列，以及来自大肠杆菌的乙醇酸氧化酶亚单位GlcD酶。
具体实施方式
定义
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。例如，“一要素”一个要素或多于一个要素。
术语“生物活性部分”是指氨基酸序列，其小于全长氨基酸序列，但展现全长序列的至少一种活性。例如，甲基转移酶的生物活性部分可是指tmsB的一个或多个结构域，其具有将油酸(例如，包括油酸酯的磷脂)和甲硫氨酸(例如，S-腺苷甲硫氨酸)转化为10-亚甲基硬脂酸(例如，包括10-亚甲基硬脂酸酯的磷脂)的生物活性。还原酶的生物活性部分可是指tmsA的一个或多个结构域，其具有将10-亚甲基硬脂酸(例如，包括10-亚甲基硬脂酸酯的磷脂)和还原剂(例如，NADH、NADPH、FAD、FADH2、FMNH2)转化为10-甲基硬脂酸(例如，包括10-甲基硬脂酸酯的磷脂)的生物活性。蛋白质的生物活性部分包括肽或多肽，其包括与所述蛋白质的氨基酸序列足够同一或衍生自所述蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列，例如以下序列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74或76，其包括少于全长蛋白质的氨基酸，并展现所述蛋白质的至少一种活性，尤其是甲基转移酶或还原酶活性。蛋白质的生物活性部分可包括、包括至少或包括至多例如100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500或更多氨基酸，或其中可导出的任何范围。通常，生物活性部分包括结构域或基序，其具有催化活性，例如产生10-亚甲基硬脂酸或10-甲基硬脂酸的催化活性。蛋白质的生物活性部分包括与全长肽具有相同活性的蛋白质部分和具有高于背景的活性的每一部分。例如，相对于全长酶，酶的生物活性部分可具有、具有至少或具有至多0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％、100.1％、100.2％、100.3％、100.4％、100.5％、100.6％、100.7％、100.8％、100.9％、101％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％、400％或更高活性(或其中可导出的任何范围)。蛋白质的生物活性部分可包括缺少将蛋白质靶向细胞隔室的结构域的蛋白质部分。
术语“密码子优化”和“针对细胞进行密码子优化”是指编码核苷酸序列(例如，基因)，其已经改变以用在宿主细胞中相对普遍的同义密码子替换在所需宿主细胞中相对罕见的至少一个密码子。密码子优化由此容许通过使重组基因的密码子与宿主细胞的tRNA相匹配更好地利用宿主细胞的tRNA。例如，放线菌(原核生物)物种的密码子使用与酵母(真核生物)的密码子使用不同。编码放线菌蛋白质的mRNA在酵母宿主细胞中的翻译效率可通过用在特定酵母物种中更普遍的密码子替换相应放线菌基因的密码子来提高。密码子优化的基因由此具有与天然存在的基因不同的核苷酸序列。
术语“组成型启动子”是指独立于特定刺激(例如，独立于诸如异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷等试剂的存在)介导可操作连接的基因的转录的启动子。
术语“DGAT1”是指编码1型二酰甘油酰基转移酶蛋白质的基因，例如编码酵母DGA2蛋白质的基因。
术语“DGAT2”是指编码2型二酰甘油酰基转移酶蛋白质的基因，例如编码酵母DGA1蛋白质的基因。
“二酰基甘油酯”、“二酰甘油”和“甘油二酯”是包括甘油和两个脂肪酸的酯。
术语“二酰甘油酰基转移酶”和“DGA”是指催化从二酰甘油形成三酰基甘油酯的任何蛋白质。二酰甘油酰基转移酶包括1型二酰甘油酰基转移酶(DGA2)、2型二酰甘油酰基转移酶(DGA1)和3型二酰甘油酰基转移酶(DGA3)和催化上文所提到的反应的所有同系物。
术语“二酰甘油酰基转移酶，1型”和“1型二酰甘油酰基转移酶”是指DGA2和DGA2同源体。
术语“二酰甘油酰基转移酶，2型”和“2型二酰甘油酰基转移酶”是指DGA1和DGA1同源体。
术语“结构域”是指蛋白质的氨基酸序列的一部分，其能折叠成独立于蛋白质的其余部分的稳定三维结构。
术语“药物”是指任何分子，其抑制细胞生长或增殖，由此提供针对含有赋予针对所述药物的抗性的基因的细胞的选择性优点。药物包括抗生素、抗微生物剂、毒素和杀虫剂。
“干重”和“细胞干重”意指在水的相对不存在下确定的重量。例如，提到产油细胞包括以干重计指定百分比的特定组分时意指，所述百分比是基于在移除基本上全部水后细胞的重量来计算。术语“干重％”在涉及具体脂肪酸(例如，油酸或10-甲基硬脂酸)时包括作为羧酸根、酯、硫酯和酰胺存在的脂肪酸。例如，以细胞干重％计以总脂肪酸的百分比包括10-甲基硬脂酸的细胞包括10-甲基硬脂酸、10-甲基硬脂酸根、包括10-甲基硬脂酸酯的二酰甘油的10-甲基硬脂酸根部分、包括10-甲基硬脂酸酯的三酰甘油的10-甲基硬脂酸根部分、包括10-甲基硬脂酸酯的磷脂的10-甲基硬脂酸根部分和10-甲基硬脂酸CoA的10-甲基硬脂酸根部分。术语“干重％”在涉及具体类型的脂肪酸(例如，C16脂肪酸、C18脂肪酸)时包括作为如上文所述的羧酸根、酯、硫酯和酰胺存在的脂肪酸(例如，对于10甲基硬脂酸)。
术语“编码”是指包括编码区、编码区的部分或其补体的核酸。DNA和RNA都可编码基因。DNA和RNA都可编码蛋白质。
如本文所用的术语“酶”是指可催化化学反应的蛋白质。
术语“表达”是指细胞中的核酸或氨基酸序列(例如，肽、多肽或蛋白质)的量。基因的表达增加是指该基因的转录增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的表达增加是指编码所述氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的核酸的翻译增加。
如本文所用的术语“基因”可涵盖含有外显子的基因组序列，尤其是编码具体活性中所涉及的多肽序列的多核苷酸序列。所述术语进一步涵盖并非衍生自基因组序列的合成核酸。在某些实施方案中，基因缺少内含子，因为所述基因是基于cDNA和蛋白质序列的已知DNA序列来合成。在其他实施方案中，基因是合成的非天然cDNA，其中密码子已基于密码子使用针对在解脂假丝酵母或腺嘌呤阿氏酵母中的表达经优化。所述术语还可进一步包括包含上游、下游和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。
术语“诱导型启动子”是指响应特定刺激介导可操作连接的基因的转录的启动子。
术语“整合的”是指作为细胞基因组中的插入物维持于细胞中的核酸，例如染色体中的插入物，包括质体基因组中的插入物。
“呈可操作连接”是指两个核酸序列之间，例如控制序列(通常启动子)与所连接序列(通常编码蛋白质的序列，也称为编码序列)之间的功能性连接。如果启动子可介导基因的转录，那么所述启动子与所述基因呈可操作连接。
术语“敲除突变”或“敲除”是指阻止天然基因转录并翻译为功能蛋白质的遗传修饰。
术语“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可实施任何功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括经修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在聚合物装配之前或之后给予对核苷酸结构的修饰。多核苷酸可进一步经修饰，例如通过与标记组分接合来修饰。在本文中提供的所有核酸序列中，U核苷酸可与T核苷酸互换。
术语“磷脂”是指包括甘油、两个脂肪酸和磷酸根的酯。磷酸根可共价连接到甘油的碳-3并且不包括进一步取代，即磷脂可以是磷脂酸。磷酸根可经以下基团取代：乙醇胺(例如，磷脂酰乙醇胺)、胆碱(例如，磷脂酰胆碱)、丝氨酸(例如，磷脂酰丝氨酸)、肌醇(例如，磷脂酰肌醇)、磷酸肌醇(例如，磷脂酰肌醇-3-磷酸、磷脂酰肌醇-4-磷酸、磷脂酰肌醇-5-磷酸)、肌醇二磷酸(例如，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸)或肌醇三磷酸(例如，磷脂酰肌醇-3,4,5-二磷酸)。
如本文所用，术语“质粒”是指物理上与生物体的基因组DNA分离的环状DNA分子。质粒可在引入宿主细胞中之前经线性化(在本文中称作线性化质粒)。线性化质粒可能无法自复制，但可整合到生物体的基因组DNA中并用所述基因组DNA来复制。
“启动子”是引导核酸转录的核酸控制序列。如本文所用，启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列。
术语“蛋白质”是指包括氨基酸序列的分子，其中所述氨基酸通过肽键连接。
“转化”是指核酸转移到宿主生物体中或转移到宿主生物体的基因组中，得到遗传上稳定的继承性。含有经转化核酸的宿主生物体称为“重组”、“转基因”或“经转化”生物体。因此，可将本发明的核酸纳入能引入宿主细胞中并在所述宿主细胞中复制的重组构建体(通常DNA构建体)中。所述构建体可以是载体，其包括复制系统和能在给定宿主细胞中转录并翻译多肽编码序列的序列。通常，表达载体包括例如在5'和3'调节序列的转录控制下的一个或多个经克隆基因以及可选择标记物。所述载体还可含有启动子调节区(例如，控制诱导型或组成型、环境调节或发育调节、或位置特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
术语“经转化细胞”是指已经历转化的细胞。因此，经转化细胞包括亲代基因组和可遗传的遗传修饰。
术语“三酰基甘油酯”、“三酰甘油”、“甘油三酯”和“TAG”是包括甘油和三个脂肪酸的酯。
微生物工程化
A.概述
基因和基因产物可引入微生物宿主细胞中。适用于表达基因和核酸分子的宿主细胞是可在真菌或细菌家族内广泛发现的微生物宿主。适宜宿主菌株的示例包括但不限于真菌或酵母物种，例如阿氏酵母属(Arxula)、曲霉菌属(Aspegillus)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)、念珠菌属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银霉属(Cunninghamella)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、欧格酵母属(Ogataea)、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉菌属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、毛孢子菌属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)；或细菌物种，例如蛋白菌和放线菌的成员，以及以下属：不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、短颈细菌属(Brevibacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒状杆菌属(Cornyebacterium)。解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母适合用作宿主微生物，因为其可将其重量的大部分积累为三酰甘油。
含有引导外来蛋白质高水准表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员已知的。这些中的任一者可用于构建嵌合基因以产生瞬时序列的任一种基因产物。随后可通过转化技术将这些嵌合基因引入适当微生物中，以提供酶的高水准表达。
例如，可将编码酶的基因克隆于适宜质粒中，并且作为宿主的上述起始亲代菌株可经所得质粒转化。该方法可增加每一编码酶的基因的拷贝数，并且因此可增加酶的活性。质粒并不特定受限，只要其赋予可遗传给微生物后代的所需遗传修饰即可。
可用于转化适宜宿主细胞的载体或盒众所周知。通常，载体或盒含有引导相关基因转录和翻译的序列、可选择标记物以及容许自主复制或染色体整合的序列。适宜载体包括基因5'的具有转录起始控制序列的区域，以及DNA片段3'的控制转录终止的区域。在某些实施方案中，两个控制区域都衍生自与经转化宿主细胞同源的基因，但应理解，所述控制区域无需衍生自对于选择作为产生宿主的具体物种为天然的基因。
载体的启动子、cDNA和3'UTR以及其他元件可通过克隆技术使用从天然来源分离的片段生成(参见，例如，Green和Sambrook，分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),(第4版，2012)；美国专利第4,683,202号(以引用方式并入))。或者，元件可使用已知方法以合成方式生成(参见，例如，Gene 164:49-53(1995))。
B.同源重组
同源重组是互补DNA序列比对并交换同源性区域的能力。将含有与所靶向基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA(“供体”)引入生物体中，并随后使其经历在相应同源基因组序列的位点重组到基因组中。
在宿主生物体中实施同源重组的能力对可在分子遗传水平上进行的过程具有多种实际影响，并且可用于生成可产生所需产物的微生物。就性质而言，同源重组是精确基因靶向事件，并且因此大多数以相同靶向序列生成的转基因系将在表型方面基本同一，使得筛选显著更少的转化事件成为必需。同源重组还靶向宿主染色体中的基因插入事件，即使在遗传选择不存在下也可能获得极佳遗传稳定性。由于不同染色体基因座将可能影响基因表达，即使来自外源启动子/UTR，同源重组可以是在不熟悉的基因组环境中询问基因座并评价这些环境因素对基因表达的影响的方法。
特别有用的使用同源重组的遗传工程化方法是增选特异性宿主调节元件，例如启动子/UTR，以用高特异性方式驱动异源基因表达。
由于同源重组是精确基因靶向事件，其可用于精确修饰所关注基因或区域内的任何核苷酸，只要已鉴别足够的侧翼区域即可。因此，同源重组可用作修饰影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列的手段。其可还可用于修饰蛋白质编码区，致力于修饰酶活性，例如底物特异性、亲和性和Km，由此影响宿主细胞代谢中的所需变化。同源重组提供操作宿主基因组的有效手段，从而实现基因靶向、基因转化、基因缺失、基因复制、基因倒位，以及交换基因表达调节元件，例如启动子、增强子和3'UTR。
同源重组可通过使用靶向构建体来实现，所述靶向构建体含有内源序列的碎片以“靶向”内源宿主细胞基因组内的所关注基因或区域。所述靶向序列可位于所关注基因或区域的5'，所关注基因/区域的3'，或甚至所关注基因/区域的侧翼。所述靶向构建体可作为具有额外载体主链的超螺旋质粒DNA、无载体主链的PCR产物或作为线性化分子，转化到宿主细胞中。在一些情形中，可有利地首先通过用限制性酶切割转基因DNA暴露转基因DNA(供体DNA)内的同源序列。该步骤可增加重组效率并减少不需要事件的发生率。其他增加重组效率的方法包括使用PCR生成含有与所靶向基因组序列同源的线性末端的转化转基因DNA。
C.载体和载体组分
用于根据本发明转化微生物的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术根据本文公开内容来制备。载体通常含有一个或多个基因，其中每一基因编码所需产物(基因产物)的表达，并且可操作连接到一个或多个调节基因表达或将基因产物靶向到重组细胞中的特定位置的控制序列。
1.控制序列
控制序列是调节编码序列的表达或将基因产物引导到细胞内或细胞外的特定位置的核酸。调节表达的控制序列包括例如调节编码序列的转录的启动子和终止编码序列的转录的终止子。另一控制序列是位于编码序列末端的编码多聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。将基因产物引导到特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些控制序列，其将其所附接的蛋白质引导到细胞内侧或外侧的特定位置。
因此，用于微生物中的基因表达的示例性载体设计含有所需基因产物(例如，可选择标记物，或酶)的编码序列，其与在酵母中具有活性的启动子可操作连接。或者，如果载体不含与所关注编码序列可操作连接的启动子，那么可将编码序列转化到细胞中，使得其在载体整合时与内源启动子可操作连接。
用于表达基因的启动子可以是天然连接到该基因的启动子或不同启动子。
启动子通常可表征为组成型或诱导型。组成型启动子通常在所有时间(或在细胞生命周期的某些时间)以相同水准具有活性或起作用以驱动表达。相反，诱导型启动子仅响应刺激而具有活性(或变得无活性)或被显著上调或下调。两种类型的启动子都可应用于本发明方法中。可用于本发明中的诱导型启动子包括那些响应刺激介导可操作连接的基因的转录的启动子，所述刺激例如外源提供的小分子、温度(热或冷)、培养基中缺少氮等。适宜启动子可激活基本上沉默的基因的转录，或上调(例如显著地)以低水准转录的可操作连接的基因的转录。
包括终止区控制序列是可选的，并且如果采用，那么所述选择主要是便利性选择，因为终止区是相对可互换的。终止区可针对转录起始区(启动子)是天然的，可针对所关注DNA序列是天然的，或可从另一来源获得(参见，例如，Chen和Orozco，Nucleic AcidsResearch 16:8411(1988))。
2.基因和密码子优化
通常，基因包括启动子、编码序列和终止控制序列。在通过重组DNA技术装配时，基因可称作表达盒并且可侧接限制性位点，以便于插入用于将重组基因引入宿主细胞中的载体中。表达盒可侧接来自基因组或其他核酸靶的DNA序列，以有利于通过同源重组将表达盒稳定整合到基因组中。或者，载体和其表达盒可保持未整合(例如，附加体)，在所述情形中，载体通常包括能提供载体DNA的复制的复制原点。
存于载体上的常见基因是编码蛋白质的基因，其表达容许含有所述蛋白质的重组细胞与不表达所述蛋白质的细胞相区分。所述基因和其相应的基因产物称为可选择标记物或选择标记物。众多种可选择标记物中的任一种可用于转基因构建体中，所述转基因构建体可用于转化本发明生物体。
对于重组蛋白质的最佳表达，有益地采用产生具有待转化宿主细胞最佳使用的密码子的mRNA的编码序列。因此，转基因的适当表达可能需要，转基因的密码子使用与所述转基因在其中表达的生物体的具体密码子偏好相匹配。产生该效应的准确机制有很多，但包括可用氨基酰化tRNA池与在细胞中合成的蛋白质的适当平衡，且在满足该需求时与转基因信使RNA(mRNA)的更有效翻译相偶联。在转基因中的密码子使用未经优化时，可用tRNA池不足以容许转基因mRNA的有效翻译，导致核糖体失速和终止以及可能的转基因mRNA不稳定。基因序列的密码子优化的资源描述于Puigbo等(Nucleic Acids Research 35:W126-31(2007))中，并且密码子优化策略的基础原理描述于Angov(Biotechnology Jornal 6:650-69(2011))中。提供不同生物体的密码子使用的统计学的公共数据库是可用的，包括www.kazusa.or.jp/codon/和其他公众可用的数据库和资源。
D.转化
可通过任何适宜技术转化细胞，包括例如生物弹道学、电穿孔、玻璃珠转化和碳化硅晶须转化。本发明中可采用将转基因引入微生物中的任何便捷技术。转化可通过例如以下方法来实现：D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68:326(1979))、用氯化钙增加受体细胞对DNA的通透性的方法(Mandel和Higa,J.Molecular Biology,53:159(1970))等。
在产油酵母(例如，解脂耶氏酵母)中表达转基因的示例可发现于文献中(Bordes等,J.Microbiological Methods,70:493(2007)；Chen等,Applied Microbiology&Biotechnology 48:232(1997))。在诸如大肠杆菌等细菌中表达外源基因的示例众所周知(Green和Sambrook,分子克隆：实验室手册(第4版，2012))。
用于根据本发明转化微生物的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术来制备。在一个实施方案中，用于在微生物中表达基因的示例性载体设计含有与在所述微生物中具有活性的启动子可操作连接的编码酶的基因。或者，如果载体不含与所关注基因可操作连接的启动子，那么可将基因转化到细胞中，使得其在载体整合时与天然启动子可操作连接。载体还可含有编码蛋白质的第二基因。任选地，一个或两个基因之后是含有多聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码两个基因的表达盒可物理上连接于载体中或连接在单独载体上。还可使用微生物的共转化，其中同时使用不同载体分子来转化细胞(Protist 155:381-93(2004))。经转化细胞可任选地基于在缺少抗性盒的细胞不会生长的条件下在抗生素或其他可选择标记物存在下生长的能力来选择。
示例性细胞、核酸、组合物和方法
A.经转化细胞
在一些实施方案中，经转化细胞是原核细胞，例如细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、禽类细胞、植物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母。本领域技术人员将认识到，丝状真菌的多种形式产生酵母样生长，并且本文中酵母的定义涵盖所述细胞。细胞可选自由藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母组成的组。细胞可以是酵母、真菌或酵母样藻类。细胞可选自破囊壶菌(橙壶菌属)和无叶绿素单细胞藻类(原壁菌属)。
细胞可选自由以下组成的组：阿氏酵母属、曲霉菌属、橙壶菌属、念珠菌属、麦角菌属、隐球菌属、小克银霉属、地丝菌属(Geotrichum)、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、柯达酵母属(Kodamaea)、白冬孢酵母属、油脂酵母属、被孢霉属、欧格酵母属、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉菌属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、毛孢子菌属、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和耶氏酵母属。明确预期，这些细胞类型中的一种或多种可从本发明的实施方案中排除。
细胞可选自由以下组成的组：腺嘌呤阿氏酵母、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus orzyae)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、紫麦角菌(Clavicepspurpurea)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、拉米隐球菌(Cryptococcus ramirezgomezianus)、土生隐球菌(Cryptococcus terreus)、威氏隐球菌(Cryptococcus wieringae)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、山茶小克银汉霉(Cunninghamella japonica)、发酵地霉酵母(Geotrichum fermentans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、克雷氏白冬孢酵母(Leucosporidiella creatinivora)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、多形欧格酵母(Ogataeapolymorpha)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichiastipites)、饶氏原壁菌(Prototheca zopfii)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、贝吉维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、恩氏银耳(Tremella enchepala)、皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、威克汉姆西弗酵母(Wickerhamomyces ciferrii)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。明确预期，这些细胞类型中的一种或多种可从本发明的实施方案中排除。
细胞可以是酿酒酵母、解脂耶氏酵母或腺嘌呤阿氏酵母。
在某些实施方案中，如通过细胞干重％所测量，经转化细胞包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％或更多脂质，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，经转化细胞包括以下作为细胞中总C16和C18脂肪酸的百分比的浓度的C18脂肪酸：至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，经转化细胞包括以下作为细胞中总C16和C18脂肪酸的百分比的浓度的油酸：至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％或更高，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，经转化细胞包括以下作为细胞中总脂肪酸的百分比的浓度的链长度为14-20个碳并且在Δ9、Δ10或Δ11位置具有甲基分支的线性脂肪酸(例如，10-甲基硬脂酸)：以重量计至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高，或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，脂肪酸的链长度为14、15、16、17、18、19或20个碳，或其中可导出的任何范围。
细胞可经修饰以提高其油酸酯含量，其用作10-甲基硬脂酸酯合成的底物。提高油酸脂含量的遗传修饰是已知的(参见，例如，2016年6月16日公开的PCT专利申请公开第WO16/094520号，其在此以引用方式整体并入)。例如，细胞可包括Δ12去饱和酶敲低或敲除，其有利于积累油酸酯并且不利于产生亚油酸酯。细胞可包括重组Δ9去饱和酶基因，其有利于产生油酸酯并且不利于积累硬脂酸酯。重组Δ9去饱和酶基因可以是例如来自解脂假丝酵母、腺嘌呤阿氏酵母或禾柄锈菌(Puccinia graminis)的Δ9去饱和酶基因。细胞可包括重组延长酶1基因，其有利于产生油酸酯并且不利于积累棕榈酸酯和棕榈油酸酯。重组延长酶1基因可以是来自解脂假丝酵母的延长酶1基因。细胞可包括重组延长酶2基因，其有利于产生油酸酯并且不利于积累棕榈酸酯和棕榈油酸酯。重组延长酶2基因可以是来自褐鼠(R.norvegicus)的延长酶2基因。
细胞可经修饰以提高其三酰甘油含量，由此提高其10-甲基硬脂酸酯含量。提高三酰甘油含量的遗传修饰是已知的(参见，例如，2016年6月16日公开的PCT专利申请公开第WO16/094520号，其在此以引用方式整体并入)。细胞可包括重组二酰甘油酰基转移酶基因(例如，DGAT1、DGAT2或DGAT3)，其有利于产生三酰甘油并且不利于积累二酰甘油。重组二酰甘油酰基转移酶基因可以是例如来自解脂假丝酵母的DGAT2(编码蛋白质DGA1)、来自紫麦角菌的DGAT1(编码蛋白质DGA2)或来自圆红冬孢酵母的DGAT2(编码蛋白质DGA1)。细胞可包括甘油-3-磷酸酯酰基转移酶基因(Sct1)敲低或敲除，根据细胞类型，其可有利于积累三酰甘油。细胞可包括重组甘油-3-磷酸酯酰基转移酶基因(Sct1)，例如来自腺嘌呤阿氏酵母的Sct1基因，其可有利于积累三酰甘油。细胞可包括三酰甘油脂肪酶基因(TGL)敲低或敲除，其可有利于在细胞中积累三酰甘油。
本发明的各个方面涉及经转化细胞。经转化细胞可包括重组甲基转移酶基因(例如，tmsB基因)、重组还原酶基因(例如，tmsA基因)、环外亚甲基替换的脂质和/或支化(甲基)脂质。经转化细胞可包括tmsC基因。支化(甲基)脂质可以是羧酸(例如，10-甲基硬脂酸、10-甲基棕榈酸、12-甲基油酸、13-甲基油酸、10-甲基-十八-12-烯酸)、羧酸酯(例如，10-甲基硬脂酸盐、10-甲基棕榈酸盐、12-甲基油酸盐、13-甲基油酸盐、10-甲基-十八-12-烯酸盐)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-甲基硬脂酰基CoA、10-甲基棕榈酰基CoA、12-甲基油酰基CoA、13-甲基油酰基CoA、10-甲基-十八-12-烯酰基CoA)或酰胺。环外亚甲基替换的脂质可以是羧酸(例如，10-亚甲基硬脂酸、10-亚甲基棕榈酸、12-亚甲基油酸、13-亚甲基油酸、10-亚甲基-十八-12-烯酸)、羧酸盐(例如，10-亚甲基硬脂酸盐、10-亚甲基棕榈酸盐、12-亚甲基油酸盐、13-亚甲基油酸盐、10-亚甲基-十八-12-烯酸盐)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-亚甲基硬脂酰基CoA、10-亚甲基棕榈酰基CoA、12-亚甲基油酰基CoA、13-亚甲基油酰基CoA、10-亚甲基-十八-12-烯酰基CoA)或酰胺。明确预期，上述脂质中的一种或多种可从本发明的实施方案中排除。
“脂肪酸”通常作为磷脂或三酰甘油存在于细胞中，但其也可作为单酰甘油或二酰甘油存在，例如作为代谢中间产物存在。游离脂肪酸也以相对丰富的羧酸根阴离子与相对稀少的电中性酸之间的平衡存在于细胞中。在生物合成或氧化期间，脂肪酸可作为硫酯、尤其作为具有辅酶A(CoA)的硫酯存在于细胞中。例如在共价结合到蛋白质以将蛋白质锚定到膜时，脂肪酸可作为酰胺存在于细胞中。
细胞可包括本文所述的任一核酸，见下文(参见，例如，下文章节B)。
支化(甲基)脂质可包括饱和支化脂肪族链(例如，10-甲基硬脂酸、10-甲基棕榈酸)或不饱和支化脂肪族链(例如，12-甲基油酸、13-甲基油酸、10-甲基-十八-12-烯酸)。支化(甲基)脂质可包括包含支化甲基的饱和或不饱和支化脂肪族链。
环外亚甲基取代的脂质可包括支化脂肪族链(例如，10-亚甲基硬脂酸、10-亚甲基棕榈酸、12-亚甲基油酸、13-亚甲基油酸、10-亚甲基-十八-12-烯酸)。脂肪族链可因脂肪族链经环外亚甲基取代而经支化。
支化(甲基)脂质可以是10-甲基硬脂酸根，或其酸(10-甲基硬脂酸)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-甲基硬脂酰基CoA)或酰胺(例如，10-甲基硬脂酰基酰胺)。例如，支化(甲基)脂质可以是二酰甘油、三酰甘油或磷脂，并且所述二酰甘油、三酰甘油或磷脂可包括10-甲基硬脂酸酯。
环外亚甲基取代的脂质可以是10-亚甲基硬脂酸根，或其酸(10-亚甲基硬脂酸)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-亚甲基硬脂酰基CoA)或酰胺(例如，10-亚甲基硬脂酰基酰胺)。例如，环外亚甲基取代的脂质可以是二酰甘油、三酰甘油或磷脂，并且所述二酰甘油、三酰甘油或磷脂可包括10-亚甲基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，如通过细胞干重％所测量，细胞中约、至多约或至少约1％的脂肪酸可以是10-甲基硬脂酸。如通过细胞干重％所测量，细胞中约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的脂肪酸可以是10-甲基硬脂酸，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，如通过细胞干重％所测量，细胞中约、至少约或至多约1％的脂肪酸可以是10-亚甲基硬脂酸。如通过细胞干重％所测量，细胞中约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的脂肪酸可以是10-亚甲基硬脂酸，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，细胞中以重量计约、至少约或至多约1％的脂肪酸可以是本文所述支化(甲基)脂质中的一种或多种。细胞中以重量计约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的脂肪酸可以是本文所述支化(甲基)脂质中的一种或多种，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，细胞中以重量计约、至少约或至多约1％的脂肪酸可以是本文所述支化(甲基)脂质中的一种或多种(例如，链长度为14-20个碳并且在Δ9、Δ10或Δ11位置具有甲基分支的线性脂肪酸)。细胞中约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的脂肪酸可以是本文所述支化(甲基)脂质中的一种或多种(例如，链长度为14-20个碳并且在Δ9、Δ10或Δ11位置具有甲基分支的线性脂肪酸)，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，如通过细胞干重％所测量，细胞可包括约、至少约或至多约1％的10-甲基硬脂酸。如通过细胞干重％所测量，细胞可包括约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的10-甲基硬脂酸，或其中可导出的任何范围。
在一些实施方案中，如通过细胞干重％所测量，细胞可包括约、至少约或至多约1％的10-亚甲基硬脂酸。如通过细胞干重％所测量，细胞可包括约、至少约或至多约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的10-亚甲基硬脂酸，或其中可导出的任何范围。
与本发明细胞具有相同类型(例如，物种)的未经修饰细胞可不包括10-甲基硬脂酸酯，或其酸(10-甲基硬脂酸)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-甲基硬脂酰基CoA)或酰胺(例如，10-甲基硬脂酰基酰胺)(例如，其中未经修饰的细胞不包括重组甲基转移酶基因或重组还原酶基因)。与本发明细胞具有相同类型(例如，物种)的未经修饰细胞可不包括10-亚甲基硬脂酸酯，或其酸(10-亚甲基硬脂酸)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-亚甲基硬脂酰基CoA)或酰胺(例如，10-亚甲基硬脂酰基酰胺)(例如，其中未经修饰的细胞不包括重组甲基转移酶基因或重组还原酶基因)。在一些实施方案中，与所述细胞为相同物种的未经修饰的细胞不包括支化(甲基)脂质和/或环外亚甲基取代的脂质。在一些实施方案中，与所述细胞为相同物种的未经修饰的细胞不包括本文所述支化(甲基)脂质或环外亚甲基取代的脂质中的一种或多种。
细胞可组成型表达由重组甲基转移酶基因编码的蛋白质。细胞可组成型表达由重组还原酶基因编码的蛋白质。细胞可组成型表达由重组tmsC基因编码的蛋白质。细胞可组成型表达甲基转移酶蛋白质。细胞可组成型表达还原酶蛋白质。细胞可组成型表达tmsC蛋白质。
B.核酸
本发明的各个方面涉及包括重组甲基转移酶基因、重组还原酶基因或二者的核酸。核酸可以是例如质粒。在一些实施方案中，重组甲基转移酶基因和/或重组还原酶基因整合到细胞基因组中，并且因此核酸可以是染色体。在一些实施方案中，本发明涉及包括重组甲基转移酶基因的细胞，例如其中重组甲基转移酶基因存于质粒或染色体中。在一些实施方案中，本发明涉及包括重组还原酶基因的细胞，例如其中重组还原酶基因存于质粒或染色体中。重组甲基转移酶基因和重组还原酶基因可存于细胞中的同一核酸(例如，同一质粒或染色体)中或不同核酸(例如，不同质粒或染色体)中。
核酸可能可遗传给经转化细胞的后代。例如重组甲基转移酶基因或重组还原酶基因的基因可以是可遗传的，因为其驻留在质粒或染色体上。在某些实施方案中，基因可以是可遗传的，因为其整合到经转化细胞的基因组中。
基因可包括保守替换、缺失和/或插入，同时仍编码具有活性的蛋白质。例如，可针对特定宿主细胞优化密码子，不同密码子可以是便捷起见经替换，例如以引入限制位点或产生最佳PCR引物，或者密码子可以是另一目的经替换。类似地，核苷酸序列可经改变以产生保守氨基酸替换、缺失和/或插入。
蛋白质可包括保守替换、缺失和/或插入，同时仍维持活性。保守替换表为本领域所熟知(Creighton，蛋白质(Proteins)(第2d版，1992))。
氨基酸替换、缺失和/或插入可使用重组DNA操作技术容易地实现。操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。这些方法包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB,Cleveland,OH)、快速变化定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导定点诱变和其他定点诱变方案。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可比对序列用于最佳比较目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以获得最佳比对，并且为了比较目的可忽视不相同序列)。为了比较目的比对的参考序列的长度可以是所述参考序列的长度的至少95％。随后可比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置同一(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比随序列共有的同一性位置数而变，并考虑为了两个序列的最佳比对需要引入的空位数和每个空位的长度。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。除非另外指定，否则在本文中提到两个氨基酸序列之间的同一性百分比时是指如使用Needleman和Wunsch(J.Molecular Biology 48:444-453(1970))算法确定的同一性百分比，所述算法已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)的GAP程序中，使用Blosum62矩阵、空位权重为10，并且长度权重为4。在一些实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是通过Needleman和Wunsch算法使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵来确定，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6。除非另外指定，否则在本文中提到两个核苷酸序列之间的同一性百分比时是指如使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)的GAP程序确定的同一性百分比，其使用NWSgapdna.CMP矩阵，并且空位权重为60，且长度权重为4。在另一实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。在另一实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可使用E.Meyers和W.Miller的算法(ComputerApplications in the Biosciences 4:11-17(1988))来确定，所述算法已并入ALIGN程序(2.0或2.0U版)中，其使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
可用于确定两个序列之间的同一性的示例性电脑程序包括但不限于BLAST程序套件，例如BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP，以及Clustal程序，例如ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。
在相对于GenBank DNA序列和其他公众数据库中的核酸序列评估给定核酸序列时，序列搜索通常是使用BLASTN程序来实施。BLASTX程序可有效针对GenBank蛋白质序列和其他公众数据库中的氨基酸序列搜索已在所有阅读框中经翻译的核酸序列。
比对所选序列以确定两个或更多个序列之间的“同一性％”是使用例如CLUSTAL-W程序来进行。
“编码序列”或“编码区”是指具有在表达序列时产生蛋白质产物(例如氨基酸或多肽)所需的序列信息的核酸分子。编码序列可包括翻译区内的非翻译序列(包括内含子或5'或3'非翻译区)和/或由其组成，或可缺少所述介入的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。
在说明书通篇中用于提到包括核苷酸序列和/或由核苷酸序列组成的核酸的缩写是常规的单字母缩写。因此，当包括于核酸中时，天然存在的编码核苷酸缩写如下：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同样，除非另外指定，否则本文中呈现的核酸序列是5'→3'方向。
如本文所用，术语“互补”和其衍生词用于指通过熟知规则进行核酸配对，其中A与T或U配对，C与G配对。互补物可以是“部分”或“完整”互补物。在部分互补物中，仅一些核酸碱基根据碱基配对原则匹配；而在完整或完全互补物中，所有碱基都根据配对原则匹配。核酸链之间的互补程度可对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响，如本领域所熟知。所述杂交的效率和强度取决于检测方法。
在本文中称作与SEQ ID NO中所述的序列具有一定序列同一性百分比的任何核酸包括与SEQ ID NO中所述序列的互补物具有一定序列同一性百分比的核酸。
i.包括重组甲基转移酶基因的核酸
甲基转移酶基因(例如，重组甲基转移酶基因)编码甲基转移酶蛋白质，其为能将碳原子和一个或多个与其结合的质子从例如S-腺苷甲硫氨酸的底物转移到例如油酸的脂肪酸的酶(例如，其中脂肪酸是作为游离脂肪酸、羧酸酯、磷脂、二酰甘油或三酰甘油存在)。甲基转移酶基因(例如，重组甲基转移酶基因)可包括以下序列中所述的任一核苷酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:81。甲基转移酶基因(例如，重组甲基转移酶基因)可以是如本文所述的10-甲基硬脂酸B基因(tmsB)或其生物活性部分(即，其中其生物活性部分包括甲基转移酶活性)。
甲基转移酶基因(例如，重组甲基转移酶基因)可衍生自放线菌的革兰氏阳性物种，例如分枝杆菌属(Mycobacteria)、棒杆菌属(Corynebacteria)、诺卡尔菌属(Nocardia)、链霉菌属或红球菌属。甲基转移酶基因(例如，重组甲基转移酶基因)可选自由以下组成的组：耻垢分枝杆菌基因tmsB、苏别蒂山农霉菌基因tmsB、浅黄拟无枝酸球菌基因tmsB、谷氨酸棒状杆菌基因tmsB、甘氨酸棒杆菌(Corynebacterium glyciniphilium)基因tmsB、气生诺尔氏菌(Knoella aerolata)基因tmsB、南非分枝杆菌(Mycobacteriumaustroafricanum)基因tmsB、淡黄分枝杆菌基因tmsB、普拉尼亚分枝杆菌(Mycobacteriumindicus pranii)基因tmsB、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)基因tmsB、结核分枝杆菌基因tmsB、范巴伦氏分枝杆菌基因tmsB、浑浊红球菌基因tmsB、拉格西斯链霉菌(Streptomyces regnsis)基因tmsB、嗜热子囊菌基因tmsB和弯曲嗜热单胞菌基因tmsB。明确预期，可从本发明的实施方案排除上文一种或多种甲基转移酶基因。
重组甲基转移酶基因可以是重组体，因为其可操作连接到甲基转移酶基因的天然存在的启动子以外的启动子。所述基因可用于驱动特定物种细胞中的转录。重组甲基转移酶基因可以是重组体，因为其相对于天然存在的甲基转移酶基因含有一个或多个核苷酸替换。所述基因可用于提高特定物种细胞中的甲基转移酶基因的mRNA转录物的翻译效率。
核酸可包括重组甲基转移酶基因和启动子，其中重组甲基转移酶基因和启动子是可操作连接。重组甲基转移酶基因和启动子可衍生自不同物种。例如，重组甲基转移酶基因可编码放线菌的革兰氏阳性物种的甲基转移酶蛋白质，并且重组甲基转移酶基因可以可操作连接到启动子，所述启动子可驱动另一细菌门(例如，变形菌门，例如大肠杆菌)或真核生物(例如，藻类细胞、酵母细胞或植物细胞)中的转录。启动子可以是真核启动子。细胞可包括核酸，并且启动子可能够驱动所述细胞中的转录。细胞可包括重组甲基转移酶基因，并且重组甲基转移酶基因可以可操作连接到能在细胞中驱动重组甲基转移酶基因转录的启动子。细胞可以是酵母物种，并且启动子可以是酵母启动子。细胞可以是细菌物种，并且启动子可以是细菌启动子(例如，其中细菌启动子并非来自放线菌的启动子)。细胞可以是藻类物种，并且启动子可以是藻类启动子。细胞可以是植物物种，并且启动子可以是植物启动子。
重组甲基转移酶基因可以可操作连接到无法驱动重组甲基转移酶基因在为重组甲基转移酶基因的来源的细胞中转录的启动子。例如，启动子可不能结合重组甲基转移酶基因源自的细胞的RNA聚合酶。在一些实施方案中，启动子无法结合原核RNA聚合酶和/或起始由原核RNA聚合酶介导的转录。在一些实施方案中，重组甲基转移酶基因可操作连接到无法驱动所述基因编码的蛋白质在该基因起源的的细胞中的转录的启动子。例如，启动子可不能结合天然表达由重组甲基转移酶基因编码的甲基转移酶的细胞的RNA聚合酶。
启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子可以是2016年1月28日公开的PCT专利申请公开第WO 2016/014900号(其在此以引用方式整体并入)中所述的任一启动子。WO 2016/014900描述衍生自酵母物种解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母的多种启动子，其可特别可用作用于驱动酵母细胞中的重组基因的转录的启动子。启动子可以是来自编码以下产物的基因的启动子：翻译延长因子EF-1α；甘油-3-磷酸酯脱氢酶；磷酸丙糖异构酶1；果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；磷酸甘油酸酯变位酶；丙酮酸激酶；输出蛋白质EXP1；核糖体蛋白质S7；醇脱氢酶；磷酸甘油酸酯激酶；己糖转运蛋白；一般氨基酸通透酶；丝氨酸蛋白酶；异柠檬酸裂合酶；酰基-CoA氧化酶；ATP-硫酸化酶；己糖激酶；3-磷酸甘油酸酯脱氢酶；丙酮酸脱氢酶α亚基；丙酮酸脱氢酶β亚基；顺乌头酸酶；烯醇化酶；肌动蛋白；多药耐药蛋白(ABC转运蛋白)；泛素；GTP酶；质膜Na+/Pi协同转运蛋白；丙酮酸脱羧酶；植酸酶；或α-淀粉酶，例如其中所述基因是酵母基因，例如来自解脂耶氏酵母或腺嘌呤阿氏酵母的基因。
重组甲基转移酶基因可包括与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:75或SEQ ID NO:81中所述核苷酸序列具有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。重组甲基转移酶基因可包括与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:81中所述核苷酸序列的在以下核苷酸位置开始的150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个连续碱基对(或其中可导出的任何范围)具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中可导出的任何范围)的核苷酸序列：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199或1200。重组甲基转移酶可具有或可不具有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQ IDNO:81中所述任一核苷酸序列的100％序列同一性。重组甲基转移酶基因可具有或可不具有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:81中所述核苷酸序列的150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个连续碱基对的100％序列同一性。重组甲基转移酶基因可包括与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQID NO:81中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，并且重组甲基转移酶基因可编码与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所述氨基酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的甲基转移酶蛋白质。例如，SEQ ID NO:81是针对酵母中的表达经密码子优化的基因。SEQ ID NO:81与SEQ ID NO:3具有约70％序列同一性(69.86％序列同一性)，并且SEQ ID NO:81编码的蛋白质与SEQ ID NO:4中所述氨基酸序列具有100％序列同一性。因此，即使SEQ ID NO:81与SEQ ID NO:3具有69.86％序列同一性，但是所述两个核苷酸序列编码相同氨基酸序列。
重组甲基转移酶基因可与天然存在的甲基转移酶基因不同，因为重组甲基转移酶基因可经密码子优化以在真核细胞，例如植物细胞、藻类细胞或酵母细胞中表达。细胞可包括重组甲基转移酶基因，其中重组甲基转移酶基因针对所述细胞经密码子优化。
确切地，重组甲基转移酶基因的至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个密码子可与天然存在的甲基转移酶基因不同或可相对于天然存在的甲基转移酶基因不变。例如，重组甲基转移酶基因可包括与SEQID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:75中所述天然存在的核苷酸序列具有至少约65％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列，并且重组甲基转移酶基因的核苷酸序列的至少5个密码子可与天然存在的核苷酸序列不同(例如，至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个密码子(其中可导出的任何范围))。
甲基转移酶基因编码甲基转移酶蛋白质。甲基转移酶蛋白质可以是由放线菌的革兰氏阳性物种表达的蛋白质，例如分枝杆菌属、棒杆菌属、诺卡尔菌属、链霉菌属或红球菌属。即使重组甲基转移酶基因并非天然存在的甲基转移酶基因，所述重组甲基转移酶基因也可编码天然存在的甲基转移酶蛋白质。例如，重组甲基转移酶基因可与天然存在的甲基转移酶基因不同，因为重组甲基转移酶基因针对在具体细胞中的表达经密码子优化。然而，经密码子优化的重组甲基转移酶基因和天然存在的甲基转移酶基因可编码相同的天然存在的甲基转移酶蛋白质。
重组甲基转移酶基因可编码选自以下的甲基转移酶蛋白质：耻垢分枝杆菌酶tmsB、苏别蒂山农霉菌酶tmsB、浅黄拟无枝酸球菌酶tmsB、谷氨酸棒状杆菌酶tmsB、甘氨酸棒状杆菌酶tmsB、气生诺尔氏菌酶tmsB、南非分枝杆菌酶tmsB、淡黄分枝杆菌酶tmsB、普拉尼亚分枝杆菌酶tmsB、草分枝杆菌酶tmsB、结核分枝杆菌酶tmsB、范巴伦氏分枝杆菌酶tmsB、浑浊红球菌酶tmsB、拉格西斯链霉菌酶tmsB、嗜热子囊菌酶tmsB和弯曲嗜热单胞菌酶tmsB。明确预期，可从本发明的实施方案排除上文一种或多种甲基转移酶蛋白质。重组甲基转移酶基因可编码甲基转移酶蛋白质，并且甲基转移酶蛋白质可与前述任一种酶基本上相同，但重组甲基转移酶基因可与编码所述酶的天然存在的基因不同。重组甲基转移酶基因可与天然存在的基因不同，因为重组甲基转移酶基因可针对在细胞的具体门、纲、目、科、属、种或菌株中的表达经密码子优化。
天然存在的甲基转移酶蛋白质的序列陈述于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:70或SEQ ID NO:76中。重组甲基转移酶基因可编码或可不编码包括与SEQ ID NO:4、SEQID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所述氨基酸序列的100％序列同一性的蛋白质。例如，重组甲基转移酶基因可编码与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQID NO:76中所述氨基酸序列的生物活性部分具有100％序列同一性的蛋白质。
重组甲基转移酶基因可编码与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQID NO:76中所述氨基酸序列或其生物活性部分具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中可导出的任何范围)的甲基转移酶蛋白质。重组甲基转移酶基因可编码相对于包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQID NO:76中所述氨基酸序列的蛋白质具有至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％、100.1％、100.2％、100.3％、100.4％、100.5％、100.6％、100.7％、100.8％、100.9％、101％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％或400％甲基转移酶活性(其中可导出的任何范围)的甲基转移酶蛋白质。重组甲基转移酶基因可编码与在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQID NO:70或SEQ ID NO:76的以下氨基酸位置开始的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个连续氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％序列同一性的蛋白质：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。
甲基转移酶蛋白质的底物可包括长14到20个碳并在Δ9、Δ10或Δ11位置具有不饱和双键的任何脂肪酸。甲基转移酶蛋白质可能够催化在所述底物的Δ9、Δ10或Δ11位置的亚甲基取代的形成。
在一些实施方案中，重组甲基转移酶基因编码包括S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域的甲基转移酶蛋白质。在一些实施方案中，根据图19A-D中所示的比对，S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域与弯曲嗜热单胞菌tmsB(SEQ ID NO:76)的氨基酸192-291或与来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌或嗜热子囊菌的TmsB的相应部分具有、具有至少或具有至多70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，重组甲基转移酶基因编码具有相对于SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所述氨基酸序列不变的具体氨基酸的甲基转移酶蛋白质。根据图19A-D中所示的比对，不变的氨基酸可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个选自以下的氨基酸：弯曲嗜热单胞菌tmsB(SEQ ID NO:76)的D23、G24、A59、H128、F147、Y148、L180、L193、M203、G236、A241、R313、R318、E320、L359、L400、V196、G197、C198、G199、W200、G201、G202、T219、L220、Q246、D247、Y248和D262，或来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌或嗜热子囊菌的TmsB中的相应氨基酸。
ii.包括重组还原酶基因的核酸
还原酶基因(例如，重组还原酶基因)编码还原酶蛋白质，其为能通常以NADPH依赖性方式还原脂肪酸的双键的酶(例如，其中脂肪酸是作为游离脂肪酸、羧酸酯、磷脂、二酰甘油或三酰甘油存在)。还原酶基因(例如，重组还原酶基因)可包括以下序列中所述的任一核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:80。还原酶基因(例如，重组还原酶基因)可以是如本文所述的10-甲基硬脂酸A基因(tmsA)或其生物活性部分(即，其中其生物活性部分包括还原酶活性)。
还原酶基因(例如，重组还原酶基因)可衍生自放线菌的革兰氏阳性物种，例如分枝杆菌属、棒杆菌属、诺卡尔菌属、链霉菌属或红球菌属。还原酶基因(例如，重组还原酶基因)可选自由以下组成的组：耻垢分枝杆菌基因tmsA、苏别蒂山农霉菌基因tmsA、浅黄拟无枝酸球菌基因tmsA、谷氨酸棒状杆菌基因tmsA、甘氨酸棒状杆菌基因tmsA、气生诺尔氏菌基因tmsA、南非分枝杆菌基因tmsA、淡黄分枝杆菌基因tmsA、普拉尼亚分枝杆菌基因tmsA、草分枝杆菌基因tmsA、结核分枝杆菌基因tmsA、范巴伦氏分枝杆菌基因tmsA、浑浊红球菌基因tmsA、拉格西斯链霉菌基因tmsA、嗜热子囊菌基因tmsA和弯曲嗜热单胞菌基因tmsA。明确预期，可从本发明的实施方案排除上文一种或多种还原酶基因。
重组还原酶基因可以是重组体，因为其可操作连接到还原酶基因的天然存在的启动子以外的启动子。所述基因可用于驱动特定物种细胞中的转录。重组还原酶基因可以是重组体，因为其相对于天然存在的还原酶基因含有一个或多个核苷酸替换。所述基因可用于提高特定物种的细胞中还原酶基因的mRNA转录物的翻译效率。
核酸可包括重组还原酶基因和启动子，其中重组还原酶基因和启动子可操作连接。重组还原酶基因和启动子可衍生自不同物种。例如，重组还原酶基因可编码放线菌的革兰氏阳性物种的还原酶蛋白质，并且重组还原酶基因可以可操作连接到启动子，所述启动子可驱动另一细菌门(例如，变形菌门，例如大肠杆菌)或真核生物(例如，藻类细胞、酵母细胞或植物细胞)中的转录。启动子可以是真核启动子。细胞可包括核酸，并且启动子可能够驱动所述细胞中的转录。细胞可包括重组还原酶基因，并且重组还原酶基因可以可操作连接到能驱动细胞中的重组还原酶基因的转录的启动子。细胞可以是酵母物种，并且启动子可以是酵母启动子。细胞可以是细菌物种，并且启动子可以是细菌启动子(例如，其中细菌启动子并非来自放线菌的启动子)。细胞可以是藻类物种，并且启动子可以是藻类启动子。细胞可以是植物物种，并且启动子可以是植物启动子。
重组还原酶基因可以可操作连接到无法驱动重组还原酶基因在该重组还原酶基因起源的细胞中转录的启动子。例如，启动子可不能结合重组还原酶基因起源的细胞的RNA聚合酶。在一些实施方案中，启动子无法结合原核RNA聚合酶和/或起始由原核RNA聚合酶介导的转录。在一些实施方案中，重组还原酶基因可操作连接到无法在所述基因编码的蛋白质起源的细胞中驱动转录的启动子。例如，启动子可不能结合天然表达由重组还原酶基因编码的还原酶的细胞的RNA聚合酶。
启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子可以是2016年1月28日公开的PCT专利申请公开第WO 2016/014900号(其在此以引用方式整体并入)中所述的任一启动子。WO 2016/014900描述衍生自酵母物种解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母的多种启动子，其可特别可用作用于驱动酵母细胞中的重组基因的转录的启动子。启动子可以是来自编码以下产物的基因的启动子：翻译延长因子EF-1α；甘油-3-磷酸酯脱氢酶；磷酸丙糖异构酶1；果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；磷酸甘油酸酯变位酶；丙酮酸激酶；输出蛋白质EXP1；核糖体蛋白质S7；醇脱氢酶；磷酸甘油酸酯激酶；己糖转运蛋白；一般氨基酸通透酶；丝氨酸蛋白酶；异柠檬酸裂合酶；酰基-CoA氧化酶；ATP-硫酸化酶；己糖激酶；3-磷酸甘油酸酯脱氢酶；丙酮酸脱氢酶α亚基；丙酮酸脱氢酶β亚基；顺乌头酸酶；烯醇化酶；肌动蛋白；多药耐药蛋白(ABC转运蛋白)；泛素；GTP酶；质膜Na+/Pi协同转运蛋白；丙酮酸脱羧酶；植酸酶；或α-淀粉酶，例如其中所述基因是酵母基因，例如来自解脂耶氏酵母或腺嘌呤阿氏酵母的基因。
重组还原酶基因可包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:80中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。重组还原酶基因可包括与SEQ ID NO:1、SEQID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所述核苷酸序列的在以下核苷酸位置开始的150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个连续碱基对具有、具有至少、具有至多65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199或1200。重组还原酶可具有或可不具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所述任一核苷酸序列的100％序列同一性。重组还原酶基因可具有或可不具有与SEQ ID NO:1、SEQID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所述核苷酸序列的150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个连续碱基对的100％序列同一性。重组还原酶基因可包括与SEQID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，并且重组还原酶基因可编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所述氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的还原酶蛋白质。例如，SEQ ID NO:80是针对酵母中的表达经密码子优化的基因。SEQ ID NO:80与SEQ IDNO:1具有约70％序列同一性(70.09％序列同一性)，并且SEQ ID NO:80编码的蛋白质与SEQID NO:2中所述氨基酸序列具有至少约99％序列同一性。SEQ ID NO:1编码的蛋白质与SEQID NO:2中所述氨基酸序列具有100％序列同一性。
重组还原酶基因可与天然存在的还原酶基因不同，因为重组还原酶基因可针对真核细胞，例如植物细胞、藻类细胞或酵母细胞中的表达经密码子优化。细胞可包括重组还原酶基因，其中重组还原酶基因针对所述细胞经密码子优化。
确切地，重组还原酶基因的至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个密码子可与天然存在的还原酶基因不同或可相对于天然存在的还原酶基因不变。例如，重组还原酶基因可包括与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:73中所述天然存在的核苷酸序列具有至少65％序列同一性的核苷酸序列(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，并且重组还原酶基因的核苷酸序列的至少5个密码子可与天然存在的核苷酸序列不同(例如，至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个密码子)。
还原酶基因编码还原酶蛋白质。还原酶蛋白质可以是由放线菌的革兰氏阳性物种表达的蛋白质，例如分枝杆菌属、棒杆菌属、诺卡尔菌属、链霉菌属或红球菌属。即使重组还原酶基因并非天然存在的还原酶基因，所述重组还原酶基因也可编码天然存在的还原酶蛋白质。例如，重组还原酶基因可与天然存在的还原酶基因不同，因为重组还原酶基因针对具体细胞中的表达经密码子优化。然而，经密码子优化的重组还原酶基因和天然存在的还原酶基因可编码相同的天然存在的还原酶蛋白质。
重组还原酶基因可编码选自以下的还原酶蛋白质：耻垢分枝杆菌酶tmsA、苏别蒂山农霉菌酶tmsA、浅黄拟无枝酸球菌酶tmsA、谷氨酸棒状杆菌酶tmsA、甘氨酸棒状杆菌酶tmsA、气生诺尔氏菌酶tmsA、南非分枝杆菌酶tmsA、淡黄分枝杆菌酶tmsA、普拉尼亚分枝杆菌酶tmsA、草分枝杆菌酶tmsA、结核分枝杆菌酶tmsA、范巴伦氏分枝杆菌酶tmsA、浑浊红球菌酶tmsA、拉格西斯链霉菌酶tmsA、嗜热子囊菌酶tmsA和弯曲嗜热单胞菌酶tmsA。明确预期，可从本发明的实施方案排除上文一种或多种还原酶蛋白质。重组还原酶基因可编码还原酶蛋白质，并且还原酶蛋白质可与前述任一种酶基本上相同，但重组还原酶基因可与编码所述酶的天然存在的基因不同。重组还原酶基因可与天然存在的基因不同，因为重组还原酶基因可针对在具体门、纲、目、科、属、种或菌株的细胞中的表达经密码子优化。
天然存在的还原酶蛋白质的序列陈述于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:68或SEQ ID NO:74中。重组还原酶基因可编码或可不编码包括与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所述氨基酸序列的100％序列同一性的蛋白质。例如，重组还原酶基因可编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ IDNO:74中所述氨基酸序列的生物活性部分具有100％序列同一性的蛋白质。
重组还原酶基因可编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQID NO:74中所述氨基酸序列或其生物活性部分具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的还原酶蛋白质。重组还原酶基因可编码相对于包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所述氨基酸序列的蛋白质具有约、至少约或至多约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％、100.1％、100.2％、100.3％、100.4％、100.5％、100.6％、100.7％、100.8％、100.9％、101％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、220％、240％、260％、280％、300％、320％、340％、360％、380％或400％还原酶活性的还原酶蛋白质。重组还原酶基因可编码与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所述氨基酸序列的在以下氨基酸位置开始的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个连续氨基酸具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500。
还原酶蛋白质的底物可包括长14到20个碳并在Δ9、Δ10或Δ11位置中具有亚甲基替换的任何脂肪酸。脂肪酸底物的长度可以是14、15、16、17、18、19或20个碳或其中可导出的任何范围。还原酶蛋白质可能够催化亚甲基替换的脂肪酸底物到(甲基)脂质的还原。还原酶蛋白质与甲基转移酶蛋白质一起可能够催化来自长14到20个碳并在Δ9、Δ10或Δ11位置中具有不饱和双键的任何脂肪酸的甲基化分支的产生。
在一些实施方案中，重组还原酶基因编码包括黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域的还原酶蛋白质。在一些实施方案中，根据图20A-E中所示的比对，FAD结合结构域与弯曲嗜热单胞菌tmsA(SEQ ID NO:74)的氨基酸9-141或与来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌或嗜热子囊菌的TmsA的相应部分具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，重组还原酶基因编码包括含有FAD/FMN的脱氢酶结构域的还原酶蛋白质。在一些实施方案中，根据图20A-E中所示的比对，含有FAD/FMN的脱氢酶结构域与弯曲嗜热单胞菌tmsA(SEQ ID NO:74)的氨基酸22-444或与来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌或嗜热子囊菌的TmsA的相应部分具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，重组还原酶基因编码具有相对于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所述氨基酸序列不变的具体氨基酸的还原酶蛋白质。根据图20A-E中所示的比对，不变的氨基酸可包括弯曲嗜热单胞菌tmsA(SEQ ID NO:74)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113个或氨基酸或氨基酸R31、A33、S37、N38、L39、F40、R43、D52、V59、D63、G73、M74、T76、Y77、D79、L80、V81、L85、P91、V93、V94、Q96、L97、T99、I100、T101、A105、G108、G110、E112、S113、S115、F116、R117、N118、P121、H122、E123、V125、E127、G133、P154、N155、Y157、Y162、L166、E171、V173、V177、H181、V208、G213、F216、Y222、L223、S236、D237、Y238、T239、Y245、S247、D254、T257、Y261、W263、R264、W265、D266、D268、W269、C272、A275、G277、Q279、R284、W287、R293、S294、G318、E232、V325、P328、E330、F339、F343、W353、C355、P356、W363、L365、Y366、P367、N376、F379、W380、V383、P384、N395、E399、G407、H408、K409、S410、L411、Y412、S413、Y417、F422、Y426、G428、R443、L447和V452或来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌或嗜热子囊菌的TmsA中的相应氨基酸。
iii.包含重组tmsC基因的核酸.
核酸可包括如本文所述的10-甲基硬脂酸C基因(tmsC)。tmsC基因(例如，重组tmsC基因)可包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:71中所述的任一核苷酸序列。tmsC基因(例如，重组tmsC基因)可衍生自放线菌的革兰氏阳性物种，例如分枝杆菌属、棒杆菌属、诺卡尔菌属、链霉菌属或红球菌属。tmsC基因(例如，重组tmsC基因)可选自由以下组成的组：甘氨酸棒状杆菌基因tmsC、南非分枝杆菌基因tmsC、淡黄分枝杆菌基因tmsC、范巴伦氏分枝杆菌基因tmsC、拉格西斯链霉菌基因tmsC和嗜热子囊菌基因tmsC。
重组tmsC基因可以是重组体，因为其可操作连接到tmsC基因的天然存在的启动子以外的启动子。所述基因可用于驱动特定物种细胞中的转录。重组tmsC基因可以是重组体，因为其相对于天然存在的tmsC基因含有一个或多个核苷酸替换。所述基因可用于提高特定物种的细胞中tmsC基因的mRNA转录物的翻译效率。
核酸可包括重组tmsC基因和启动子，其中重组tmsC基因和启动子可操作连接。重组tmsC基因和启动子可衍生自不同物种。例如，重组tmsC基因可编码放线菌的革兰氏阳性物种的tmsC蛋白质，并且重组tmsC基因可以可操作连接到启动子，所述启动子可驱动另一细菌门(例如，变形菌门，例如大肠杆菌)或真核生物(例如，藻类细胞、酵母细胞或植物细胞)中的转录。启动子可以是真核启动子。细胞可包括核酸，并且启动子可能够驱动所述细胞中的转录。细胞可包括重组tmsC基因，并且重组tmsC基因可以可操作连接到能驱动细胞中的重组tmsC基因的转录的启动子。细胞可以是酵母物种，并且启动子可以是酵母启动子。细胞可以是细菌物种，并且启动子可以是细菌启动子(例如，其中细菌启动子并非来自放线菌的启动子)。细胞可以是藻类物种，并且启动子可以是藻类启动子。细胞可以是植物物种，并且启动子可以是植物启动子。
重组tmsC基因可以可操作连接到无法驱动在重组tmsC基因起源的细胞中的转录的启动子。例如，启动子可不能结合重组tmsC基因源起源的细胞的RNA聚合酶。在一些实施方案中，启动子无法结合原核RNA聚合酶和/或起始由原核RNA聚合酶介导的转录。在一些实施方案中，重组tmsC基因可操作连接到无法在所述基因编码的蛋白质起源的细胞中驱动转录的启动子。例如，启动子可不能结合天然表达由重组tmsC基因编码的tmsC酶的细胞的RNA聚合酶。
启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子可以是2016年1月28日公开的PCT专利申请公开第WO 2016/014900号(其在此以引用方式整体并入)中所述的任一启动子。WO 2016/014900描述衍生自酵母物种解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母的多种启动子，其可特别可用作用于驱动酵母细胞中的重组基因的转录的启动子。启动子可以是来自编码以下产物的基因的启动子：翻译延长因子EF-1α；甘油-3-磷酸酯脱氢酶；磷酸丙糖异构酶1；果糖-1,6-二磷酸醛缩酶；磷酸甘油酸酯变位酶；丙酮酸激酶；输出蛋白质EXP1；核糖体蛋白质S7；醇脱氢酶；磷酸甘油酸酯激酶；己糖转运蛋白；一般氨基酸通透酶；丝氨酸蛋白酶；异柠檬酸裂合酶；酰基-CoA氧化酶；ATP-硫酸化酶；己糖激酶；3-磷酸甘油酸酯脱氢酶；丙酮酸脱氢酶α亚基；丙酮酸脱氢酶β亚基；顺乌头酸酶；烯醇化酶；肌动蛋白；多药耐药蛋白(ABC转运蛋白)；泛素；GTP酶；质膜Na+/Pi协同转运蛋白；丙酮酸脱羧酶；植酸酶；或α-淀粉酶，例如其中所述基因是酵母基因，例如来自解脂耶氏酵母或腺嘌呤阿氏酵母的基因。
重组tmsC基因可包括与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:71中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。重组tmsC可与SEQ ID NO:21、SEQID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:71中所述任一核苷酸序列具有或可不具有100％序列同一性。重组tmsC基因可包括与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:71中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，并且重组tmsC基因可编码与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:56、SEQID NO:66和SEQ ID NO:72中所述氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的tmsC蛋白质。
重组tmsC基因可与天然存在的tmsC基因不同，因为重组tmsC基因可针对真核细胞，例如植物细胞、藻类细胞或酵母细胞中的表达经密码子优化。细胞可包括重组tmsC基因，其中重组tmsC基因针对所述细胞经密码子优化。
确切地，重组tmsC基因的至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个密码子可与天然存在的tmsC基因不同或可相对于天然存在的tmsC基因保持不变。例如，重组tmsC基因可包括与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:71中所述天然存在的核苷酸序列具有至少约65％序列同一性的核苷酸序列(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，并且重组tmsC基因的核苷酸序列的至少5个密码子可与天然存在的核苷酸序列不同(例如，至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个密码子)。
tmsC基因编码tmsC蛋白质。tmsC蛋白质可以是由放线菌的革兰氏阳性物种表达的蛋白质，例如分枝杆菌属、棒杆菌属、诺卡尔菌属、链霉菌属或红球菌属。即使重组tmsC基因并非天然存在的tmsC基因，所述重组tmsC基因也可编码天然存在的tmsC蛋白质。例如，重组tmsC基因可与天然存在的tmsC基因不同，因为重组tmsC基因针对具体细胞中的表达经密码子优化。然而，经密码子优化的重组tmsC基因和天然存在的tmsC基因可编码相同的天然存在的tmsC蛋白质。
重组tmsC基因可编码选自以下的tmsC蛋白质：甘氨酸棒状杆菌酶tmsC、南非分枝杆菌酶tmsC、淡黄分枝杆菌酶tmsC、范巴伦氏分枝杆菌酶tmsC、拉格西斯链霉菌酶tmsC和嗜热子囊菌酶tmsC。重组tmsC基因可编码tmsC蛋白质，并且tmsC蛋白质可与前述任一种酶基本上相同，但重组tmsC基因可与编码所述酶的天然存在的基因不同。重组tmsC基因可与天然存在的基因不同，因为重组tmsC基因可针对在具体门、纲、目、科、属、种或菌株的细胞中的表达经密码子优化。
天然存在的tmsC蛋白质的序列陈述于SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:72中。重组tmsC基因可编码或可不编码包括与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:66和SEQ IDNO:72中所述氨基酸序列的100％序列同一性的蛋白质。例如，重组tmsC基因可编码与SEQID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:72中所述氨基酸序列的生物活性部分具有100％序列同一性的蛋白质。重组tmsC基因可编码与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:66或SEQ ID NO:72中所述氨基酸序列或其生物活性部分具有至少约95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的tmsC蛋白质。
iv.包括重组甲基转移酶基因和重组还原酶基因的核酸
核酸可包括重组甲基转移酶基因和重组还原酶基因二者。重组甲基转移酶基因和重组还原酶基因可编码来自相同物种或来自不同物种的蛋白质。核酸可包括重组甲基转移酶基因、重组还原酶基因和/或tmsC基因。重组甲基转移酶基因、重组还原酶基因和tmsC基因可编码来自1、2或3个不同物种的蛋白质(即，基因可各自来自相同物种，两个基因可来自相同物种，或所有三个基因可来自不同物种)。
核酸可包括SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79中所述的核苷酸序列。核酸可包括与SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、、SEQ ID NO:85、、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92中所述核苷酸序列具有、具有至少或具有至多65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码同时包括甲基转移酶和还原酶或其片段的融合蛋白质。在本发明上下文中，“融合蛋白质”意指单一蛋白质分子，其含有通过单一肽链中的肽键共价连接的两种或更多种不同蛋白质或其片段。在一些实施方案中，融合蛋白质包括来自甲基转移酶蛋白质和还原酶蛋白质二者的酶活性结构域。核酸可进一步编码甲基转移酶与还原酶之间的连接体肽。在一些实施方案中，连接体肽包括氨基酸序列AGGAEGGNGGGA。连接体可包括约或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸或其中可导出的任何范围。核酸可包括本文所述甲基转移酶和还原酶基因中的任一种，并且所述核酸编码的融合蛋白质可包括本文所述甲基转移酶和还原酶蛋白质中的任一种，包括其生物活性片段。在一些实施方案中，融合蛋白质是tmsA-B蛋白质，其中tmsA蛋白质比tmsB蛋白质更靠近N末端。所述tmsA-B蛋白质的示例是由SEQ ID NO:97的核酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白质是tmsB-A蛋白质，其中tmsB蛋白质比tmsA蛋白质更靠近N末端。所述tmsB-A蛋白质的示例是由SEQ ID NO:98的核酸序列编码。在一些实施方案中，融合蛋白质与SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98编码的融合蛋白质的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性。
C.组合物
本发明的各个方面涉及通过本文所述细胞产生的组合物。组合物可以是包括约或至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％脂质的油组合物。组合物可包含支化(甲基)脂质和/或环外亚甲基取代的脂质。支化(甲基)脂质可以是羧酸(例如，10-甲基硬脂酸、10-甲基棕榈酸、12-甲基油酸、13-甲基油酸、10-甲基-十八-12-烯酸)、羧酸酯(例如，10-甲基硬脂酸酯、10-甲基棕榈酸酯、12-甲基油酸酯、13-甲基油酸酯、10-甲基-十八-12-烯酸酯)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-甲基硬脂酰基CoA、10-甲基棕榈酰基CoA、12-甲基油酰基CoA、13-甲基油酰基CoA、10-甲基-十八-12-烯酰基CoA)或酰胺。环外亚甲基取代的脂质可以是羧酸(例如，10-亚甲基硬脂酸、10-亚甲基棕榈酸、12-亚甲基油酸、13-亚甲基油酸、10-亚甲基-十八-12-烯酸)、羧酸酯(例如，10-亚甲基硬脂酸酯、10-亚甲基棕榈酸酯、12-亚甲基油酸酯、13-亚甲基油酸酯、10-亚甲基-十八-12-烯酸酯)、酯(例如，二酰甘油、三酰甘油、磷脂)、硫酯(例如，10-亚甲基硬脂酰基CoA、10-亚甲基棕榈酰基CoA、12-亚甲基油酰基CoA、13-亚甲基油酰基CoA、10-亚甲基-十八-12-烯酰基CoA)或酰胺。10-甲基脂质、10-亚甲基脂质或二者。明确预期，可从某些实施方案排除上文一种或多种脂质。
在一些方面中，组合物是通过以下方式来产生：培养包括本文所述任何细胞的培养物，和从细胞培养物回收油组合物。培养物中的细胞可含有本文所述任何重组甲基转移酶基因和/或本文所述任何重组还原酶基因。培养基和条件可基于要培养的细胞的种类来选择，并且可经优化以提供所需脂质谱的最大产量。
已知从细胞培养物回收油组合物的多种方法。例如，脂质、脂质衍生物和烃可用例如己烷的疏水溶剂萃取。脂质和脂质衍生物也可使用液化、油液化和超临界CO2萃取来萃取。回收过程可包括例如通过过滤或离心收获所培养细胞，溶解细胞以产生溶解物，和使用疏水溶剂萃取脂质/烃组分。
除了在细胞内积累以外，本文所述脂质可由细胞分泌。在该情形中，回收脂质的过程可能不需要从细胞产生溶解物，而是从培养基收集所分泌的脂质。因此，本文所述组合物可通过培养分泌本文所述脂质之一的细胞来制造，所述脂质例如链长度为14-20个碳并且在Δ9、Δ10或Δ11位置具有甲基分支的线性脂肪酸。
在一些实施方案中，油组合物包含以重量计约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的支化(甲基)脂质(例如10-甲基脂肪酸)或其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，10-甲基脂肪酸占组合物中的脂肪酸以重量计约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或其中可导出的任何范围。
D.产生支化(甲基)脂质的方法
本发明的各个方面涉及产生支化(甲基)脂质的方法。所述方法可包括用培养基孵育如上文所述的细胞或多个细胞。培养基可任选地补充有未支化不饱和脂肪酸，例如油酸，其用作甲基化的底物。培养基可任选地补充有甲硫氨酸或s-腺苷甲硫氨酸，其可类似地用作底物。因此，所述方法可包括使细胞或多个细胞与油酸、甲硫氨酸或二者接触。所述方法可包括在生物反应器中孵育如上文所述的细胞或多个细胞。所述方法可包括例如通过用有机溶剂萃取从细胞和/或从培养基回收脂质。
所述方法可包括使细胞或多个细胞脱胶，例如以移除蛋白质。所述方法可包括对细胞的脂质进行转酯化或酯化。可使用例如甲醇或乙醇的醇进行转酯化或酯化，例如由此产生脂肪酸甲基酯或脂肪酸乙基酯。
实施例
通过以下实施例进一步阐释本说明书，所述实施例不应视为以任何方式进行限制。
实施例1：10-甲基硬脂酸基因tmsA、tmsB和tmsC的鉴别
已鉴别两种不同基因负责结核分枝杆菌中的10-甲基硬脂酸酯产生(参见Meena,L.S.和P.E.Kolattukudy,Biotechnology&Applied Biochemistry 60(4):412(2013)；和Meena,L.S.等Biological Chemistry 394(7):871(2013))。令人好奇的是，两种基因在每个产生10-甲基硬脂酸酯的放线菌物种中都不保守。虽然放线菌的不同物种可能各自独立地进化合成10-甲基硬脂酸酯的基因，但所述趋同进化较为罕见。较简单的解释是，单一共同基因或基因集负责放线菌中的10-甲基硬脂酸酯产生。
为了鉴别可能负责放线菌中10-甲基硬脂酸酯产生的基因，将来自产生10-甲基硬脂酸酯的放线菌的多个物种的与编码催化脂质合成反应的酶的基因具有序列同源性的基因比对。鉴别出两种独特基因并命名为10-甲基硬脂酸A(tmsA)和10-甲基硬脂酸B(tmsB)，其各自在放线菌的每一产生10-甲基硬脂酸酯的物种内的相同操纵子中出现(图3)。第三种基因名为10-甲基硬脂酸C(tmsC)，对于一些产生10-甲基硬脂酸酯的物种，经鉴别为在与tmsA和tmsB相同的操纵子中出现。
10-甲基硬脂酸酯B基因与环丙烷合酶具有序列同源性，这表明10-甲基硬脂酸酯B基因可能够将甲基转移到脂肪酸。10-甲基硬脂酸A基因与氧化还原酶具有序列同源性，这表明其可能够还原支化脂肪酸的环外亚甲基。
将来自耻垢分枝杆菌的10-甲基硬脂酸酯A和10-甲基硬脂酸酯B基因克隆到质粒(名为pNC704)中用于在大肠杆菌中表达(图4)。使用具有耻垢分枝杆菌tmsA和tmsB的pNC704质粒转化大肠杆菌。使经转化细胞在37℃下在补充有100μg/mL油酸的LB培养基中生长20小时。将大肠杆菌用空载体pNC53(SEQ ID NO:81)转化并平行生长作为对照。两个经pNC704转化的大肠杆菌集落各自以占细胞中总脂肪酸的2.0％和2.1％的浓度产生10-甲基硬脂酸酯(表1)。对照未产生10-甲基硬脂酸酯。
表1.以总细胞脂肪酸百分比计的脂肪酸浓度。
“10-MS”对应于10-甲基硬脂酸酯
在HCl的甲醇溶液中将细胞脂质转酯化以产生脂肪酸甲基酯(FAME)。将硬脂酸、10-甲基硬脂酸和油酸转酯化为FAME作为标准品。将每一样品/标准品萃取到异辛烷中并通过各种气相色谱法来分析(图7和8)。首先通过毛细管气相色谱使用火焰离子化检测器(GC-FID)分析FAME。从大肠杆菌产生的FAME展示对应于10-甲基硬脂酸FAME标准品的GC峰，其表明耻垢分枝杆菌tmsA和tmsB基因表达能合成10-甲基硬脂酸的蛋白质(图7A)。
FAME也从经空载体pNC53转化的大肠杆菌产生并如上文通过GC-FID加以分析。这个样品未展示对应于10-甲基硬脂酸FAME的GC峰，从而进一步表明耻垢分枝杆菌tmsA和tmsB基因表达能合成10-甲基硬脂酸的蛋白质(图7B)。
使用以单离子监测模式(SIM)配置的GC-MS分析从tmsA/tmsB样品产生的FAME，其监测在312.3和313.3amu处的m/z。质谱图展示在312.3amu处的峰，对应于10-甲基硬脂酸甲基酯的分子量(图8B)。另外，在312.3amu的峰与在313.3amu的峰的比率表明，在312.3amu处观察到的离子含有20.6个碳，其对应于10-甲基硬脂酸甲基酯中的实际碳数(20)。
实施例2：使用来自不同供体生物体的tmsB和tmsA基因在大肠杆菌中10-甲基脂肪
酸的产生
方法：
供体细菌基因组DNA是从德国微生物保藏中心(DSMZ,德国)获得。质粒是通过标准分子生物学技术使用“酵母缺口修复”方法来构建(Shanks,等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48:232(1997))。将空大肠杆菌表达载体pNC53(SEQ ID NO:82)用酶PmeI(New England Biolabs,MA)限制性消化，在该载体上的tac启动子与trpT的终止子序列之间产生双链断裂。将tmsAB基因操纵子从基因组DNA用引物侧翼序列进行PCR扩增，使得tmsB ATG开始位点通过同源重组整合到tac启动子末端中。大肠杆菌转录和翻译是由tac启动子驱动。tmsA基因的终止密码子类似地整合到trpT的终止子区的开始部分中。嵌入操纵子的tmsA基因的大肠杆菌翻译依赖于来自供体生物体DNA的天然翻译信号。如果需要，将tmsB的第一个密码子从GTG或TTG改变为ATG；否则天然密码子序列保持在大肠杆菌表达载体中。
通过DNA测序和限制性消化检查载体的正确构建。针对该实施例产生的载体图解说明于图9中。然后使用转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)中的载体进行发酵研究。将细胞接种于50mL补充有100mg/L氨苄西林和100mg/L油酸的LB培养基中，所述油酸来自100mg/mL油酸于乙醇中的原液。将培养物在37℃和200rpm下于三角瓶中孵育41小时。在培养结束时，通过在Eppendorf 5810 R医用离心机中以4000rpm离心15分钟来收获细胞，用等体积的去离子水洗涤一次，再悬浮于0.1mL去离子水中，并在-80℃下冷冻。然后将细胞冻干到干燥并用于以0.5N HCl于甲醇中的溶液(20x 1mL安瓿,Sigma)在85℃下进行酸催化的转酯化90分钟。在转酯化完成后，通过添加水和异辛烷使用双液相体系萃取将反应混合物中的脂质可溶组分与水溶性组分分离，并且之后用配备有机器人注射器、火焰离子化检测器(Agilent Technologies 7890B GC系统和7396自动采样器)和HP-INNOWAX毛细管柱(30m x0.25mm x 0.15微米,Agilent)的毛细管气相色谱(GC)来分析。10-甲基硬脂酸参考标准品是从Larodan AB(Sweden)获得。
结果：
对于所测试11种载体中的4种观察到油酸转化为10-甲基硬脂酸。使用来自嗜热子囊菌(22％)和弯曲嗜热单胞菌(38％)的tmsAB基因时出现最高转化百分比，如下表2中所指示。
表2
实施例3：浑浊红球菌PD630中的tmsB和tmsA表达
产油细菌浑浊红球菌可天然以低水平产生10-甲基脂肪酸(总脂肪酸的0.2％(等,Microbiology,72:5027(2006))，并且另外具有tmsB和tmsA基因的天然同系物，但所述同系物尚未在文献中得到鉴别。在这个实施例中，发明人测试浑浊红球菌中tmsB和tmsA基因的过表达是否可增加10-甲基支化脂肪酸含量。
方法：
浑浊红球菌PD630是从德国微生物保藏中心(DSMZ)的原料DSM 44193获得。通过用4mL LB培养基稀释来使培养物复苏，并在鼓式滚筒中在30℃下孵育3天。一旦出现明显生长，将10μL肉汤加入LB平板上的单一集落中并在30℃下再孵育3天。分离一个集落并命名为菌株NS1104。
所有浑浊红球菌生长都是在30℃下进行。在补充有适当抗生素的LB培养基中进行常规培养。在如Kalscheuer等所改良的营养肉汤培养基中进行遗传转化(Appl.Microbiol.and Biotechnol.,52:508(1999)),所述营养肉汤含有5g/L蛋白胨、2g/L酵母提取物、1g/L牛肉膏、5g/L NaCl、8.5g/L甘氨酸和10g/L蔗糖。脂质产生是在含有以下组分并用NaOH调节到pH 7.6并在使用前经过滤灭菌的确定成分培养基中进行。
浑浊红球菌发酵培养基
质粒是通过标准分子生物学技术使用“酵母缺口修复”方法来构建(Shanks等,Applied and Environmental Biology 72:5207-36(2006))。使用含有红球菌属repA复制起点和庆大霉素抗性标记物的合成DNA序列(Lessard,BMC Microbiol.,4:15(2004))从两种含有在tac启动子控制下的来自耻垢分枝杆菌和嗜热子囊菌的tmsAB基因的质粒产生浑浊红球菌-大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体。简单来说，repA和genR合成DNA是用tmsAB目的质粒的约50bp侧翼同源性区域来构建。用PacI对目的质粒进行限制性消化，并且侧翼同源性区域修复缺口，使得能通过酿酒酵母中的ura3基因进行遗传选择。从酿酒酵母通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来分离DNA，并用于转化大肠杆菌。通过mini-prep(Qiagen,USA)分离正确质粒构建体，并通过限制性消化进行筛选。分离含有耻垢分枝杆菌tmsAB的质粒pNC985(SEQ ID NO:93)和含有嗜热子囊菌tmsAB的pNC986(SEQ ID NO:94)(图10)并用于转化浑浊红球菌。
遵循Kalscheuer等(Kalscheuer 1999)所述的方案转化浑浊红球菌。使细胞在改良营养肉汤中生长过夜，随后以0.13的起始光学密度转移到50mL改良营养肉汤培养基中。在OD 0.36收获细胞，在50mL冰冷水中洗涤两次，并且再悬浮于1.7mL冰冷水中。然后将细胞细分为350μL体积加入2μL 400-600ng/μL浓度的质粒DNA。将细胞加DNA在39℃下孵育5分钟，之后立即在冰上冷却并进行电转化。使用2mm间隙杯以2kV脉冲(600Ω,25μF,12ms时间常数)递送电脉冲。然后用600μL SOC培养基稀释细胞并在30℃下孵育过夜。然后将200μL过夜细胞肉汤平铺于含有10μg/mL庆大霉素的LB琼脂上，并在30℃下再孵育4天以供形成集落。挑选庆大霉素抗性集落用于进一步分析，在不添加质粒DNA的对照板上未见到抗性集落。
在30℃下在250mL摇瓶中以200rpm进行4天发酵(25mL工作体积，使用确定成分培养基，酌情添加10μg/mL庆大霉素)。从LB+10μg/mL庆大霉素中的48小时生长培养物制备接种物。接种量为最终体积的1:25v/v。在发酵结束时，收获细胞并再悬浮于1mL蒸馏水中并在-80℃下冷冻。冷冻后，将细胞冻干到干燥，并随后用甲醇HCl在80℃下将完整细胞原位转酯化，之后萃取到异辛烷中并通过气相色谱法和火焰离子化检测进行定量。
结果：
浑浊红球菌经两种载体转化，这两种载体是表达耻垢分枝杆菌tmsAB基因的pNC985和表达嗜热子囊菌tmsAB基因的pNC986。如下表3中所示，pNC986转化的一种分离物菌株NS1155以总脂肪酸的7.2重量％产生10-甲基硬脂酸，与之相比，对照菌株NS1104以总脂肪酸的3.6重量％产生10-甲基硬脂酸。
表3：在经tmsAB表达载体转化的浑浊红球菌菌株中测量的10-甲基硬脂酸的重量百分比。
实施例4：用于tmsB和tmsA的酰基链底物范围
发明人进行以下实验以确定来自弯曲嗜热单胞菌的tmsB和tmsA酶的酰基链底物范围，特别是脂肪酸链长度和双键位置。
方法：
不饱和脂肪酸购自Nu-Check Prep公司，Elysian MN。将脂肪酸以100mg/mL的浓度溶解于DMSO中，棕榈油酸、油酸和异油酸除外，将其以100mg/mL的浓度溶解于乙醇中。10-甲基硬脂酸参考标准品是从Larodan AB(Sweden)获得。
大肠杆菌菌株NS1161和NS1162用于该实验中；菌株NS1161是通过将对照(空)载体质粒转化到保持天然大肠杆菌环丙烷脂肪酸合酶(cfa)基因的kanR断裂的大肠杆菌CGSC9407(也称为JW1653-1Keio保藏物)中来构建。菌株NS1162是通过将含有在组成型tac启动子控制下的弯曲嗜热单胞菌tmsB和tmsA基因的质粒pNC906(SEQ ID NO:88)(图9B)转化到大肠杆菌CGSC 9407中来构建。
使大肠杆菌菌株在补充有100mg/L氨苄西林和100mg/L脂肪酸的LB培养基中生长。用过夜预培养物的1:1000稀释物接种培养物并使其在37℃下在旋转鼓式滚筒中在具有5mL工作体积的14mL塑料培养管中生长24小时。在培养结束时，通过在Eppendorf 5810 R医用离心机中以4000rpm离心15分钟来收获细胞，用等体积的去离子水洗涤一次，再悬浮于0.1mL去离子水中，并在-80℃下冷冻。然后将细胞冻干到干燥并用于进行HCl-甲醇催化的转酯化反应以产生脂肪酸甲基酯(FAME)。将这些样品溶解于异辛烷中并注入配备有火焰离子化检测器的气相色谱系统(Agilent Technologies)中。
结果：
在饲喂外源游离脂肪酸时，大肠杆菌可将所述游离脂肪酸纳入其磷脂和其他脂质结构中。将菌株NS1161和NS1162与18种不同的不饱和脂肪酸一起并在不补充脂肪酸的对照培养基中培养，并且比较两种菌株的FAME谱。为了鉴别新的不饱和脂肪酸，通过如与无补充的参考培养物相比的菌株NS1161 FAME谱来鉴别对应于所补充脂肪酸的GC峰。并且随后针对相同GC峰检查菌株NS1162 FAME谱，并且检查对应于甲基化脂肪酸的在特征性保留时间漂移的新峰(0.24向前漂移到0.08分钟，且相对漂移随着总保留时间增加而减小)。使用10-甲基硬脂酸参考标准品(Larodan AB,Sweden)作为对照以将保留时间分配给10-甲基硬脂酸。
如下表4中所观察到的，甲基化发生于具有14、15、16、17、18、19和20个碳的脂肪酸上，并且发生于Δ9、Δ10和Δ11双键位置上。转化为甲基化脂肪酸的最高百分比发生在16和18个碳的脂肪酸上，在Δ9和Δ11位置处。
表4
实施例5：tmsA辅因子使用
发明人进行以下实验以确定tmsA酶(10-亚甲基还原酶)使用哪种氧化还原辅因子从中间体10-亚甲基脂肪酸产生全饱和10-甲基脂肪酸。
方法：
大肠杆菌菌株NS1161、NS1163和NS1164用于该实验中；菌株NS1161是通过将对照(空)载体质粒pNC53转化到保持天然大肠杆菌环丙烷脂肪酸合酶(cfa)基因的kanR断裂的大肠杆菌CGSC 9407(也称为JW1653-1Keio保藏物)中来构建。菌株NS1163是通过将含有在组成型tac启动子控制下的弯曲嗜热单胞菌tmsB基因的质粒pNC963(SEQ ID NO:95)(图11)转化到大肠杆菌CGSC 9407中来构建。菌株NS1164是通过将含有在组成型tac启动子控制下的弯曲嗜热单胞菌tmsA基因的质粒pNC964(SEQ ID NO:96)(图11)转化到大肠杆菌CGSC9407中来构建。
使菌株NS1163在37℃下在1L补充有100mg/L氨苄西林的LB培养基中生长24小时(2x500mL，在2L三角瓶中)。培养后，通过在Eppendorf 5810 R医用离心机中以4000rpm离心15分钟来收获细胞，并在100mL PBS缓冲液中洗涤两次。在浓缩到40mL PBS缓冲液中之后，将细胞在85℃下热灭活30min。然后将灭活细胞分配到1mL等份中并用0.3克0.1mm玻璃珠使用“大肠杆菌”设定的MP fastprep-24(MP biomedicals,LLC)粉碎。通过以2000xg微离心30秒以移除珠粒来收集全细胞溶解悬浮液，并且之后将每管0.7mL悬浮液转移到新管中并在-80℃下冷冻直到进一步使用为止。
在测定当天，通过在37℃和200rpm下在三角摇瓶中在50mL补充有100mg/L氨苄西林的LB培养基中接种过夜培养物(1:1000稀释)来使菌株NS1161和NS1164生长。在培养4小时后，在5℃下收获细胞，在冰冷PBS中洗涤1x并且随后再悬浮于1mL塑料螺旋管中的750μLPBS中。添加0.3克0.1mm玻璃珠粒并用“大肠杆菌”设定的MP fastprep-24溶解细胞。然后将细胞悬浮液以12,000xg微量离心5min，并将上清液转移到新管中并且保持在冰上直到测定为止。
测定反应：700μL NS1163全溶解物、200μL 37.2mg/mL NADPH溶液(测定浓度10mM)、33.2mg/mL NADH溶液(测定浓度10mM)或PBS缓冲液，以及100μL无细胞提取物或PBS缓冲液。将测定管密封并在37℃下在鼓式滚筒上旋转16小时。为了结束测定，将管在-80℃下冷冻，然后冻干到干燥，之后用甲醇HCL进行原位萃取和转酯化。通过具有火焰离子化检测的GC确定脂肪酸谱，并且比较10-甲基脂肪酸峰面积与总脂肪酸峰面积以确定测定活性。
结果：
使通过表达弯曲嗜热单胞菌tmsB基因积累10-亚甲基中间体脂肪酸的菌株NS1163生长，将其收获、灭活并溶解，以用作tmsA(10-亚甲基还原酶)测定的底物。向该底物无细胞提取物添加表达弯曲嗜热单胞菌tmsA基因的大肠杆菌菌株NS1164或含有空表达载体的大肠杆菌菌株NS1161，以及NADPH或NADH。如下表5中所观察到的，在此测定中仅弯曲嗜热单胞菌tmsA和NADPH的存在导致10-甲基脂肪酸的合成。
表5
ND＝该测定未检测
实施例6：tmsB基因在酵母解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母中的表达
将编码来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌、嗜热子囊菌和弯曲嗜热单胞菌的天然细菌密码子tmsB序列的序列克隆到标准耶氏酵母属表达载体中，所述标准耶氏酵母属表达载体由解脂假丝酵母TEF1启动子驱动并且含有ARS68解脂假丝酵母复制起点、用于选择的诺尔斯菌素抗生素抗性基因以及用于在酿酒酵母中的高拷贝维持的2μ起点和URA3基因。克隆是使用酵母缺口修复方法(Shanks 2006)和在尿嘧啶缺陷型培养基上选择来进行。遵循标准乙酸锂热激方案和在补充有500μg/mL诺尔丝菌素(nourseothricin)的YPD培养基上选择来转化解脂假丝酵母。选择集落并转移到每孔含有300μL氮限制脂质产生培养基的96孔板中，并在30℃和900rpm振荡下孵育96小时。培养基含有100g/L葡萄糖、0.5g/L尿素、1.5g/L酵母提取物、0.85g/L酪蛋白氨基酸、1.7g/L无氨基酸YNB基料和5.1g/L邻苯二甲酸氢钾，pH 5.5。发酵后，将细胞离心，用蒸馏水洗涤，并在-80℃下冷冻，之后冻干到干燥。用0.5N HCl的甲醇溶液将干燥细胞在85℃下原位转酯化90分钟，以产生适合进行气相色谱分析的脂肪酸甲基酯(FAME)。将这些样品溶解于异辛烷中并注入配备有火焰离子化检测器的气相色谱系统(Agilent Technologies)中。基于已知标准品以及在大肠杆菌tms表达实验中鉴别的10亚甲基和10甲基脂肪酸对总C16和C18支化脂肪酸进行鉴别和定量。在独立实验中通过质谱验证10-甲基脂肪酸和10-亚甲基脂肪酸身份。图12显示，用来自嗜热子囊菌和弯曲嗜热单胞菌的tmsB转化的解脂假丝酵母产生最高量的10-亚甲基硬脂酸。
为了测试腺嘌呤阿氏酵母中的tmsB活性，将来自耶氏酵母属弯曲嗜热单胞菌tmsB(SEQ ID NO:75)的表现最好的tmsB基因克隆到在阿氏酵母属ADH1启动子控制下的组成型表达载体中，得到质粒pNC1065。分离个别转化体集落并使其在40℃下在标准工业培养基(具有高C:N比率以促进脂质积累)中生长4天。分离细胞沉淀，用水洗涤一次并冻干。如同耶氏酵母属菌株一样，将总C16和C18脂肪酸转酯化并通过GC分析。图13显示，用来自弯曲嗜热单胞菌的tmsB转化的腺嘌呤阿氏酵母产生10-亚甲基脂肪酸。
实施例7：解脂耶氏酵母和酿酒酵母中的tmsA和tmsB共表达
发明人发现，在酵母菌属和耶氏酵母属酵母菌株中，tmsA和tmsB基因的同时表达可分别产生支化10-甲基和10-亚甲基脂肪酸。对于在耶氏酵母属中的表达，将组成型表达来自弯曲嗜热单胞菌(pNC984)、嗜热子囊菌(pNC983)和谷氨酸棒状杆菌(pNC991)的tmsA的天然细菌序列的质粒各自转化到含有弯曲嗜热单胞菌tmsB基因(从上文实施例6分离)的稳定整合拷贝的菌株NS1117中。分离个别转化体并使其在30℃下在摇瓶培养基中生长4天。分离脂肪酸并如实施例6中通过GC分析。如图14中所示，与亲代菌株相比，所分析的所有tmsA基因都在耶氏酵母属中以可检测水平产生10甲基脂肪酸。弯曲嗜热单胞菌tmsA基因产生的10-甲基脂肪酸多于所分析的其他tmsA基因。
对于在酵母菌属中的表达，将在耶氏酵母属中具有已证实基因活性的质粒pNC984(具有NAT标记物的弯曲嗜热单胞菌tmsA)和pNC1025(具有HYG标记物的弯曲嗜热单胞菌tmsB)个别且一起地转化到酿酒酵母菌株NS20中，并且在含有适当抗生素的培养基上选择转化体。使个别转化分离物在YPD培养基中在30℃下生长2天。加工细胞沉淀，并且如同耶氏酵母属分析总脂肪酸。如图15中所示，仅用tmsB转化的菌株仅产生10-亚甲基脂肪酸，并且用tmsA和tmsB二者转化的菌株产生相对高百分比的10-甲基脂肪酸。
实施例8：tmsA-B融合蛋白质在大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏
酵母中的表达
发明人发现，在单一多肽中表达tmsA和tmsB酶提高10-亚甲基脂肪酸到10-甲基脂肪酸的转化率。同时含有tmsA和tmsB的活性的单一蛋白质是通过在框中融合弯曲嗜热单胞菌tmsA和tmsB的基因来产生，两个基因通过柔性连接体结构域隔开。选择弯曲嗜热单胞菌tmsA和tmsB酶是因为其在酵母中产生的10-甲基支化脂肪酸最多。选择在耶氏酵母属FAS2基因中天然存在的具有序列AGGAEGGNGGGA的12个氨基酸的短连接体来连接两种酶。测试两种融合酶在细菌和酵母中的活性，即tmsA-B(NG540；由SEQ ID NO:97编码)和tmsB-A(NG541；由SEQ ID NO:98编码)。
对于大肠杆菌表达，将含有弯曲嗜热单胞菌tmsA-B和tmsB-A基因以及tac启动子和trpT的终止子的质粒pNC1069和pNC1070各自转化到大肠杆菌CGSC 9407中。使个别转化的菌株生长并如上文实施例2中测定总脂肪酸。如下表6中所示，tmsA-B和tmsB-A基因二者都导致在大肠杆菌中产生甲基化硬脂酸。
表6.将油酸和异油酸的甲基化计算为转化为10-甲基脂肪酸和12-甲基脂肪酸的C18:1脂肪酸的百分比。
对于酿酒酵母和解脂耶氏酵母表达，将NG540(SEQ ID NO:97)和NG541(SEQ IDNO:98)各自克隆到含有用于酵母菌属中的高拷贝保持的酵母2u复制起点的标准耶氏酵母属表达载体中，得到相应载体pNC1067和pNC1068。
通过标准方案将质粒pNC1067和pNC1068转化到酵母菌属菌株NS20中，并且选择个别转化的菌株用于支化脂肪酸产生的测定。使菌株在30℃下在25ml YPD培养基中生长2天。冻干细胞沉淀并如实施例2中通过基本转酯化和GC分析对总脂肪酸进行分析。图16显示，tmsA-B和tmsB-A二者在酿酒酵母中的表达都导致产生10甲基脂肪酸。
通过标准热激方案将质粒pNC1067和pNC1068转化到解脂耶氏酵母中。选择个别得到的转化体菌株用于10-亚甲基和10-甲基脂肪酸产生的分析。使菌株生长并如在实施例7中通过GC分析。图17显示，tmsA-B和tmsB-A二者在解脂假丝酵母中的表达都导致产生10甲基脂肪酸，但tmsA-B在将10-亚甲基脂肪酸转化为10-甲基脂肪酸方面更有效。
为了在腺嘌呤阿氏酵母中表达，将NG540克隆到含有组成型阿氏酵母属ADH1启动子的标准表达载体中，得到pNC1151。将pNC1151转化到阿氏酵母属菌株NS1166中，并选择个别转化体以测定10-甲基脂肪酸的产生。使阿氏酵母属菌株生长并如在实施例7中通过GC分析。
这些实验显示，在大肠杆菌(表6)、酿酒酵母(图16)、解脂耶氏酵母(图17)和腺嘌呤阿氏酵母(图18)中检测到10-甲基C16和C18脂肪酸，指示融合酶同时含有tmsA和tmsB活性。10-亚甲基中间体的低产量(在大肠杆菌和酿酒酵母菌中没有检测到，在解脂耶氏酵母和腺嘌呤阿氏酵母属中为低水平)指示，融合蛋白质有效地将不饱和脂肪酸转化为10甲基脂肪酸。
实施例9：tmsB序列分析
用CLUSTAL OMEGA软件程序(European Molecular Biology Laboratory,EMBL)将由来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌、嗜热子囊菌和弯曲嗜热单胞菌的tmsB基因编码的tmsB蛋白质序列与来自大肠杆菌的环丙烷脂肪酸合酶(Cfa)酶比对。图19A-D显示这些蛋白质序列的比对。大肠杆菌Cfa与TmsB酶共享同源性并实施与TmsB类似的反应，使脂肪酸磷脂双键甲基化，但产生环丙烷部分而不是亚甲基部分。
大肠杆菌Cfa酶的某些氨基酸被认为结合活性位点碳酸氢根离子。Iwig等，J.Am.Chem.Soc.127:11612-13(2005)。这些氨基酸是大肠杆菌酶的C139、E239、H266、I268和Y317，其在共有tmsB蛋白质序列中是保守的(弯曲嗜热单胞菌tmsB序列SEQ ID NO:76上的C160、E266、H293、I295和Y348)。
另外，有16个氨基酸残基对于所有12种tmsB蛋白质序列是保守的，但在大肠杆菌Cfa序列中不保守。这些氨基酸可特异性用于10-亚甲基加成到脂肪酸磷脂，而不是由大肠杆菌Cfa蛋白质进行的环丙烷加成。这些根据弯曲嗜热单胞菌tmsB序列编号的保守氨基酸是SEQ ID NO:76的D23、G24、A59、H128、F147、Y148、L180、L193、M203、G236、A241、R313、R318、E320、L359、L400。
BLASTp保守结构域分析(National Center for Biotechnology Information,NCBI)鉴别来自弯曲嗜热单胞菌tmsB的氨基酸192-291的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域。S-腺苷甲硫氨酸结合位点氨基酸残基经鉴别为V196、G197、C198、G199、W200、G201、G202、T219、L220、Q246、D247、Y248和D262。
表7显示所指示蛋白质相对于弯曲嗜热单胞菌tmsB的序列同一性百分比：
表7.
如表7中所示，在来自不同物种的tmsB蛋白质序列之间存在大量变异。然而，虽然序列有变异，但若干种蛋白质在本文中显示具有相同的催化亚甲基取代的脂质产生的能力。
实施例10：tmsA序列分析
用CLUSTAL OMEGA软件程序(European Molecular Biology Laboratory,EMBL)将来自耻垢分枝杆菌、范巴伦氏分枝杆菌、浅黄拟无枝酸球菌、甘氨酸棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、浑浊红球菌、苏别蒂山农霉菌、气生诺尔氏菌、淡黄分枝杆菌、紫檀分枝杆菌、嗜热子囊菌和弯曲嗜热单胞菌的tmsA基因编码的tmsA蛋白质序列与来自大肠杆菌的乙醇酸氧化酶亚单位GlcD酶比对。大肠杆菌GlcD酶似乎不进行与TmsA相似的酶反应，但其为与大肠杆菌基因组中的TmsA最密切同源的蛋白质。
图20A-E显示tmsA蛋白质的比对。有114个氨基酸残基对于所有12种tmsA蛋白质序列是保守的，但在大肠杆菌GlcD序列中不保守。这些氨基酸是(根据弯曲嗜热单胞菌序列(SEQ ID NO:74)编号)：R31、A33、S37、N38、L39、F40、R43、D52、V59、D63、G73、M74、T76、Y77、D79、L80、V81、L85、P91、V93、V94、Q96、L97、T99、I100、T101、A105、G108、G110、E112、S113、S115、F116、R117、N118、P121、H122、E123、V125、E127、G133、P154、N155、Y157、Y162、L166、E171、V173、V177、H181、V208、G213、F216、Y222、L223、S236、D237、Y238、T239、Y245、S247、D254、T257、Y261、W263、R264、W265、D266、D268、W269、C272、A275、G277、Q279、R284、W287、R293、S294、G318、E232、V325、P328、E330、F339、F343、W353、C355、P356、W363、L365、Y366、P367、N376、F379、W380、V383、P384、N395、E399、G407、H408、K409、S410、L411、Y412、S413、Y417、F422、Y426、G428、R443、L447和V452。
BLASTp保守结构域分析(National Center for Biotechnology Information,NCBI)鉴别来自弯曲嗜热单胞菌tmsA(SEQ ID NO:74)的氨基酸9-141的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合结构域，以及来自氨基酸22-444的含有FAD/FMN的脱氢酶结构域。表8显示所指示蛋白质相对于弯曲嗜热单胞菌tmsA的序列同一性百分比：
表8.
如表8中所示，在来自不同物种的tmsA蛋白质序列之间存在大量变异。然而，虽然序列有变异，但若干种蛋白质在本文中显示具有相同的催化甲基取代的脂质产生的能力。
以引用方式并入
本文引用的每一专利、已公开专利申请和非专利参考文献在此以引用方式整体并入。
等同内容
本领域技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能确定本文所述的发明的具体实施方案的多种等同方案。以下权利要求书计划涵盖所述等同方案。
序列表
<110> 诺沃吉公司
<120> 10-甲基硬脂酸的异源性产生
<130> NOVG.P0005WO
<140> 未知的
<141> 2017-09-20
<150> 62396870
<151> 2016-09-20
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 耻垢分枝杆菌
<400> 1
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Asn Val Lys Gly Leu Asp Val Ser Gly Leu Thr Gly Val Ile Gly Val
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<211> 437
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<213> 耻垢分枝杆菌
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325 330 335
Ile Gly Arg Thr Val Gly Phe Leu Glu Trp Phe Leu Ala Asn Val Pro
340 345 350
Ile Glu Pro Ile Trp Leu Cys Pro Leu Arg Leu Arg Gly Asp Arg Gly
355 360 365
Trp Pro Leu Tyr Pro Ile Arg Pro Gln Gln Thr Tyr Val Asn Ile Gly
370 375 380
Phe Trp Ser Thr Val Pro Val Gly Gly Ser Glu Gly Glu Thr Asn Arg
385 390 395 400
Ser Ile Glu Arg Ala Val Ser Glu Phe Asp Gly His Lys Ser Leu Tyr
405 410 415
Ser Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg Glu Glu Phe Glu Glu Leu Tyr Gly Gly
420 425 430
Glu Ala Tyr Arg Ala Val Lys Arg Arg Tyr Asp Pro Asp Ser Arg Leu
435 440 445
Leu Asp Leu Tyr Ala Lys Ala Val Gln Arg Arg
450 455
<210> 7
<211> 1254
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 苏别蒂山农霉菌
<400> 7
atcctcgaga tcgtcgtcgc cggtcggctg ccgctgaggt tcaccgccta cgacgggagc 60
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ctggtcttca agctgccacc gccgcgggtg atgacccaga tcatccgttc gatcggcgtc 300
gaacatctgc ggccgatcgc gccgccgccg caagaggtgc cgccccggtg gcgccgcatc 360
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atggtgcgct acgccgcgcg ccacggcgtg caggcgttgg gcgtgaccct gtcgcgagag 660
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<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 苏别蒂山农霉菌
<400> 8
Ile Leu Glu Ile Val Val Ala Gly Arg Leu Pro Leu Arg Phe Thr Ala
1 5 10 15
Tyr Asp Gly Ser Ser Ala Gly Pro Pro Asp Ala Leu Phe Gly Leu Asp
20 25 30
Leu Lys Thr Pro Arg Gly Thr Thr Tyr Leu Ala Thr Gly Arg Gly Asp
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Leu Gly Leu Ala Arg Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Leu Glu Ile Gln Gly
50 55 60
Val His Pro Gly Asp Pro Tyr Glu Leu Leu Lys Ala Leu Ala Asp Ser
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Leu Val Phe Lys Leu Pro Pro Pro Arg Val Met Thr Gln Ile Ile Arg
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Ser Ile Gly Val Glu His Leu Arg Pro Ile Ala Pro Pro Pro Gln Glu
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Val Pro Pro Arg Trp Arg Arg Ile Ala Glu Gly Leu Arg His Ser Lys
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Gly Arg Asp Ala Glu Ala Ile His His His Tyr Asp Val Ser Asn Thr
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Phe Tyr Glu Trp Val Leu Gly Pro Ser Met Thr Tyr Thr Cys Ala Cys
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Tyr Pro Gly Leu Asp Ala Ser Leu Asp Glu Ala Gln Gln Asn Lys Tyr
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Arg Leu Val Phe Glu Lys Leu Arg Leu Lys Pro Gly Asp Arg Leu Leu
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Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Arg Tyr Ala Ala Arg His
195 200 205
Gly Val Gln Ala Leu Gly Val Thr Leu Ser Arg Glu Gln Thr Ala Trp
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Ala Gln Gln Ala Ile Ala Val Glu Gly Leu Ala Asp Leu Ala Glu Val
225 230 235 240
Arg Tyr Gly Asp Tyr Arg Asp Ile Ala Glu Asp Gly Phe Asp Ala Val
245 250 255
Ser Ser Ile Gly Leu Leu Glu His Ile Gly Val Arg Asn Tyr Ala Ser
260 265 270
Tyr Phe Gly Phe Leu Gln Ser Arg Leu Arg Pro Gly Gly Leu Leu Leu
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Asn His Cys Ile Thr Arg Pro Asp Asn Arg Ser Glu Pro Ser Ala Arg
290 295 300
Gly Phe Ile Asp Arg Tyr Val Phe Pro Asp Gly Glu Leu Thr Gly Ser
305 310 315 320
Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ala Gln Asp Val Gly Phe Glu Val Leu His
325 330 335
Glu Glu Asn Leu Arg Gln His Tyr Ala Leu Thr Leu Arg Asp Trp Cys
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Ala Asn Leu Val Ala His Trp Glu Glu Ala Val Ala Glu Val Gly Leu
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Pro Thr Ala Lys Val Trp Gly Leu Tyr Met Ala Gly Ser Arg Leu Ala
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Phe Glu Ser Gly Gly Ile Gln Leu His Gln Val Leu Ala Val Arg Pro
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Asp Asp Arg Ser Asp Ala Ala Gln Leu Pro Leu Arg Pro Trp Trp Thr
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Pro
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<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 浅黄拟无枝酸球菌
<400> 9
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<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 浅黄拟无枝酸球菌
<400> 10
Met Thr Pro Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Ala Ala Ala Val Asp Arg
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Leu Ile His Ser Tyr Arg Ala Ile Pro Asp Asp Ala Pro Val Arg Leu
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Ala Lys Lys Thr Ser Asn Leu Phe Arg His Arg Glu Lys Thr Ser Ala
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Pro Gly Leu Asp Val Ser Gly Leu Ala Arg Val Ile Gly Ile Asp Ser
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Asp Thr Arg Thr Ala Asp Val Gly Gly Met Cys Thr Tyr Glu Asp Leu
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Val Ala Ala Thr Leu Glu Tyr Asp Leu Val Pro Leu Val Val Pro Gln
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Leu Lys Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Leu Gly Ile Glu
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Ser Thr Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val Leu Glu Met
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Asp Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Val Val Thr Ala Gly Pro Glu Gly
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Pro His Ser Asp Leu Tyr Trp Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly Thr Leu
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Gly Tyr Ala Thr Arg Leu Arg Ile Glu Leu Glu Pro Val Glu Pro Tyr
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Val Glu Leu Arg His Leu Arg Phe Thr Ser Leu Asp Glu Leu Gln Glu
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Thr Leu Asp Thr Val Ser Tyr Glu His Thr Tyr Asp Gly Glu Pro Val
195 200 205
His Tyr Val Asp Gly Val Met Phe Ser Ala Thr Glu Ser Tyr Leu Thr
210 215 220
Leu Gly Arg Gln Thr Ser Glu Pro Gly Pro Val Ser Asp Tyr Thr Gly
225 230 235 240
Asn Gln Ile Tyr Tyr Arg Ser Ile Gln His Gly Gly Ala Glu Thr Pro
245 250 255
Val Val Asp Arg Met Thr Ile His Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp Thr
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Asp Trp Phe Trp Cys Ser Arg Ala Phe Gly Thr Gln His Pro Val Val
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Arg Arg Phe Trp Pro Arg Arg Tyr Arg Arg Ser Ser Phe Tyr Trp Lys
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Leu Ile Ala Leu Asp Arg Gln Val Gly Leu Ala Asp Phe Ile Glu Gln
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Arg Lys Gly Asn Leu Pro Arg Glu Arg Val Val Gln Asp Ile Glu Val
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Pro Ile Glu Asn Thr Ala Ser Phe Leu Arg Trp Phe Leu Ala Asn Val
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Pro Ile Glu Pro Val Trp Leu Cys Pro Leu Arg Leu Arg Lys Thr Arg
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Ser Pro Gly Leu Pro Ser Pro Thr Ser Pro Ala Ser Arg Pro Trp Pro
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Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Gln Arg Thr Tyr Val Asn Val Gly Phe Trp
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Ser Ala Val Pro Val Val Ala Gly Gln Pro Glu Gly His Thr Asn Arg
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Met Ile Glu Asn Glu Val Asp Arg Leu Asp Gly His Lys Ser Leu Tyr
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Ser Asp Ala Phe Tyr Glu Arg Lys Glu Phe Asp Ala Leu Tyr Gly Gly
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Leu Asp Leu Tyr Ala Lys Ala Val Gln Gly Arg
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<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 浅黄拟无枝酸球菌
<400> 11
atgaaggcag tgttgacggc gtttacggct ccccaactcg aaaggatgaa cgtcgctgag 60
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<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 浅黄拟无枝酸球菌
<400> 12
Met Lys Ala Val Leu Thr Ala Phe Thr Ala Pro Gln Leu Glu Arg Met
1 5 10 15
Asn Val Ala Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Gly Arg Asp Phe Pro Ile
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Arg Phe Thr Ala Tyr Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Glu Thr Ala Arg
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Ala Pro Gly Asp Leu Gly Leu Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Asp Leu
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Glu Val Ser Gly Val His Gln Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Met Lys Ile
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Leu Ala His Asp Val Arg Val Arg Arg Pro Ser Pro Ala Thr Ile Ala
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Ser Ile Met Arg Ser Leu Gly Trp Glu Arg Leu Arg Pro Val Ala Pro
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Pro Pro Gln Glu Asn Met Pro Arg Trp Arg Arg Met Ala Leu Gly Leu
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Leu His Ser Lys Ser Arg Asp Ala Ala Ala Ile His His His Tyr Asp
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Val Ser Asn Glu Phe Tyr Glu His Ile Leu Gly Pro Ser Met Thr Tyr
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Thr Cys Ala Ala Tyr Pro Ser Ala Asp Ser Ser Leu Glu Glu Ala Gln
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Asp Asn Lys Tyr Arg Leu Val Phe Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ala Gly
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Asp Arg Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Arg Phe
210 215 220
Ala Ala Lys Arg Gly Val His Val Ile Gly Ala Thr Leu Ser Arg Lys
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Gln Ala Glu Trp Ala Gln Lys Met Ile Ala His Glu Gly Leu Gly Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Val Arg Phe Cys Asp Tyr Arg Asp Val Thr Glu Ala Gly
260 265 270
Phe Asp Ala Val Ser Ser Ile Gly Leu Thr Glu His Ile Gly Leu Ala
275 280 285
Asn Tyr Pro Ser Tyr Phe Gly Phe Leu Lys Asp Lys Leu Arg Pro Gly
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Gly Arg Leu Leu Asn His Cys Ile Thr Arg Pro Asn Asn Leu Gln Ser
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Asn Arg Ala Gly Asp Phe Ile Asp Arg Tyr Val Phe Pro Asp Gly Glu
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Leu Ala Gly Pro Gly Phe Ile Ile Ser Ala Val His Asp Ala Gly Phe
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Ala Ser Asp Glu Gly Thr Ala Arg Val Trp Gly Leu Tyr Ile Ser Gly
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Ser Arg Val Ala Phe Glu Thr Asn Ser Ile Gln Leu His Gln Val Leu
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Ala Val Lys Thr Ala Arg Asn Gly Glu Ala Gln Val Pro Leu Gly Gln
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Trp Trp Thr Arg
435
<210> 13
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 13
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cctggcccca ccagcgatta caccagggat ttaagctact accgctccct gcaacaccca 840
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<211> 515
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 14
Met Ser Gly Leu Val Asp Pro Asp Ser Thr Phe Leu Lys Thr Ile Gly
1 5 10 15
Lys Leu Ser Asn Ser Leu Ser Ile Gly Arg Gly Val Asp Gln Lys Glu
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Val Ile Pro Lys Gly Trp Asn Ala His Trp Glu Ala Ile Thr Lys Leu
35 40 45
Lys Arg Ser Phe Asp Ala Ile Pro Ala Gly Glu Arg Val Arg Leu Ala
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Lys Lys Thr Ser Asn Leu Phe Arg Gly Arg Ser Asp Ala Gly His Gly
65 70 75 80
Leu Asp Val Ala Ala Leu Gly Gly Val Ile Ala Ile Asp Pro Val Asn
85 90 95
Ala Thr Ala Asp Val Gln Gly Met Cys Thr Tyr Glu Asp Leu Val Asp
100 105 110
Ala Thr Leu Ser Tyr Gly Leu Met Pro Leu Val Val Pro Gln Leu Lys
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Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Met Gly Val Glu Ser Thr
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Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val Leu Glu Met Asp Ile
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Phe Thr Gly Thr Gly Glu Ile Val Thr Cys Ser Pro Thr Glu Asn Val
165 170 175
Asp Leu Tyr Arg Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly Ser Leu Gly Tyr Ala
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Val Arg Leu Lys Ile Glu Leu Glu Pro Val Gln Asp Tyr Val Gln Leu
195 200 205
Arg His Val Arg Phe Asn Asp Leu Glu Ser Leu Thr Lys Ala Ile Glu
210 215 220
Glu Val Ala Ser Ser Leu Glu Phe Asp Asn Gln Pro Val Asp Tyr Leu
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Asp Gly Val Val Phe Ser Pro Thr Glu Ala Tyr Leu Val Leu Gly Thr
245 250 255
Gln Thr Ser Gln Pro Gly Pro Thr Ser Asp Tyr Thr Arg Asp Leu Ser
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Tyr Tyr Arg Ser Leu Gln His Pro Glu Gly Ile Thr Tyr Asp Arg Leu
275 280 285
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290 295 300
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Leu Gly Gly His Lys Ser Leu Tyr Ser Glu Ala Phe Tyr Thr Arg Glu
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<213> 谷氨酸棒状杆菌
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actgcaccca tcccattcca catcactgcc ttcgatggaa gcttcactgg ccctgaagat 120
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ccaacgccag aatcaagttt ggaagaagcc caagaaaaca aataccgcct catctttgaa 600
aaactgcgtc tgaaagaagg cgatcgcctc ctagacgtgg gatgcggttg gggaggcatg 660
gtccgctacg ccgccaaaca cggtgtgaaa gccatcggag ttacgctgtc tgaacagcaa 720
tatgagtggg gtcaagcaga gatcaaacgc caaggtttgg aagacctcgc ggaaattcgc 780
ttcatggatt accgcgatgt tccagaaact ggattcgatg cgatctcagc aatcggcatc 840
attgaacaca tcggtgtgaa caactatccc gactactttg aattgctcag cagcaaactc 900
aaaacaggcg gactgatgct caaccacagc atcacctacc cagacaaccg cccccgccac 960
gcaggtgcat ttattgatcg ctacattttc cccgacggtg aactcactgg ctctggcacc 1020
ctgatcaagc acatgcagga caacggtttc gaagtgctgc acgaagaaaa cctccgcttt 1080
gattaccaac gcaccctgca cgcgtggtgc gaaaacctca aagaaaattg ggaggaagca 1140
gttgaactcg ccggtgaacc cactgcacga ctctttggcc tgtacatggc aggttcggaa 1200
tggggatttg cccacaacat cgtccagctg caccaagtac tgggtgtgaa actcgatgag 1260
cagggaagtc gcggagaagt tcctgaaaga atgtggtgga ctatctaa 1308
<210> 16
<211> 435
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 16
Met Ser Asn Ala Val Ala Gln Asp Leu Met Thr Ile Ala Asp Ile Val
1 5 10 15
Glu Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ile Pro Phe His Ile Thr Ala Phe Asp
20 25 30
Gly Ser Phe Thr Gly Pro Glu Asp Ala Pro Tyr Gln Leu Phe Val Ala
35 40 45
Asn Thr Asp Ala Val Ser Tyr Ile Ala Thr Ala Pro Gly Asp Leu Gly
50 55 60
Leu Ala Arg Ala Tyr Leu Met Gly Asp Leu Ile Val Glu Gly Glu His
65 70 75 80
Pro Gly His Pro Tyr Gly Ile Phe Asp Ala Leu Lys Glu Phe Tyr Arg
85 90 95
Cys Phe Lys Arg Pro Asp Ala Ser Thr Thr Leu Gln Ile Met Trp Thr
100 105 110
Leu Arg Lys Met Asn Ala Leu Lys Phe Gln Glu Ile Pro Pro Met Glu
115 120 125
Gln Ala Pro Ala Trp Arg Lys Ala Leu Ile Asn Gly Leu Ala Ser Arg
130 135 140
His Ser Lys Ser Arg Asp Lys Lys Ala Ile Ser Tyr His Tyr Asp Val
145 150 155 160
Gly Asn Glu Phe Tyr Ser Leu Phe Leu Asp Asp Ser Met Thr Tyr Thr
165 170 175
Cys Ala Tyr Tyr Pro Thr Pro Glu Ser Ser Leu Glu Glu Ala Gln Glu
180 185 190
Asn Lys Tyr Arg Leu Ile Phe Glu Lys Leu Arg Leu Lys Glu Gly Asp
195 200 205
Arg Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Arg Tyr Ala
210 215 220
Ala Lys His Gly Val Lys Ala Ile Gly Val Thr Leu Ser Glu Gln Gln
225 230 235 240
Tyr Glu Trp Gly Gln Ala Glu Ile Lys Arg Gln Gly Leu Glu Asp Leu
245 250 255
Ala Glu Ile Arg Phe Met Asp Tyr Arg Asp Val Pro Glu Thr Gly Phe
260 265 270
Asp Ala Ile Ser Ala Ile Gly Ile Ile Glu His Ile Gly Val Asn Asn
275 280 285
Tyr Pro Asp Tyr Phe Glu Leu Leu Ser Ser Lys Leu Lys Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Met Leu Asn His Ser Ile Thr Tyr Pro Asp Asn Arg Pro Arg His
305 310 315 320
Ala Gly Ala Phe Ile Asp Arg Tyr Ile Phe Pro Asp Gly Glu Leu Thr
325 330 335
Gly Ser Gly Thr Leu Ile Lys His Met Gln Asp Asn Gly Phe Glu Val
340 345 350
Leu His Glu Glu Asn Leu Arg Phe Asp Tyr Gln Arg Thr Leu His Ala
355 360 365
Trp Cys Glu Asn Leu Lys Glu Asn Trp Glu Glu Ala Val Glu Leu Ala
370 375 380
Gly Glu Pro Thr Ala Arg Leu Phe Gly Leu Tyr Met Ala Gly Ser Glu
385 390 395 400
Trp Gly Phe Ala His Asn Ile Val Gln Leu His Gln Val Leu Gly Val
405 410 415
Lys Leu Asp Glu Gln Gly Ser Arg Gly Glu Val Pro Glu Arg Met Trp
420 425 430
Trp Thr Ile
435
<210> 17
<211> 1458
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 17
gtgaccgtcg ccggcaggat cactgacgcg gtacgcatag gaaatggact tgaccagcga 60
gatctagccc ccgtcgggtg gtacgcacac gaacaggccg tggcgcgact gaaggccagt 120
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cgcttcgatg acgttcagtc gctcaccgac gccctcgaca acatcgtcgt ggacaaggag 660
tacgagggtg aacgggtcga ctatctcgac ggtgtggtct tcagcctgga ggagagctac 720
ctcgtcctgg gacgggcgac cagcgaggcc ggccccgtta gcgactacac ccgcgagcgc 780
agttactacc gttctctgca gcatccgtcg ggggtcctgc gcgacaagtt gaccatccgc 840
gactacctct ggcggtggga cgtcgactgg ttctggtgca accgggcctt cggtacccag 900
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atcatcggct gggaccgacg cttcgacatc gcggaccgga tcgaggcaca caacgggcgc 1020
cccgcacgcg agcgcgtcgt ccaggacatc gaggtcaccc ccgacaacct gccggagttc 1080
ctcacgtggt tcttcaccca ctgcgagatc gagccggtgt ggctgtgccc cattcgactg 1140
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accgtgggcg gcgtctga 1458
<210> 18
<211> 485
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 18
Val Thr Val Ala Gly Arg Ile Thr Asp Ala Val Arg Ile Gly Asn Gly
1 5 10 15
Leu Asp Gln Arg Asp Leu Ala Pro Val Gly Trp Tyr Ala His Glu Gln
20 25 30
Ala Val Ala Arg Leu Lys Ala Ser Phe Asp Ala Val Pro Ala Gly Arg
35 40 45
Arg Val Arg Leu Ala Lys Lys Thr Ser Asn Leu Phe Arg Gly Arg Ser
50 55 60
Gly Glu Ala Val Gly Leu Asp Val Ser Gly Leu His Gly Val Ile Ala
65 70 75 80
Val Asp Pro Val Glu Gly Thr Ala Asp Val Gln Gly Met Cys Thr Tyr
85 90 95
Glu Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Pro Tyr Gly Leu Ala Pro Thr Val
100 105 110
Val Pro Gln Leu Lys Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Met
115 120 125
Gly Val Glu Ser Thr Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ala Val
130 135 140
Leu Glu Met Asp Val Leu Thr Gly Thr Gly Asp Ile Leu Thr Cys Ser
145 150 155 160
Pro Thr Gln Asn Thr Asp Leu Tyr Arg Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly
165 170 175
Ser Leu Gly Tyr Ser Val Arg Leu Lys Val Arg Cys Glu Arg Val Glu
180 185 190
Pro Tyr Val Asp Leu Arg His Val Arg Phe Asp Asp Val Gln Ser Leu
195 200 205
Thr Asp Ala Leu Asp Asn Ile Val Val Asp Lys Glu Tyr Glu Gly Glu
210 215 220
Arg Val Asp Tyr Leu Asp Gly Val Val Phe Ser Leu Glu Glu Ser Tyr
225 230 235 240
Leu Val Leu Gly Arg Ala Thr Ser Glu Ala Gly Pro Val Ser Asp Tyr
245 250 255
Thr Arg Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Leu Gln His Pro Ser Gly Val
260 265 270
Leu Arg Asp Lys Leu Thr Ile Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp Val
275 280 285
Asp Trp Phe Trp Cys Asn Arg Ala Phe Gly Thr Gln Asn Pro Thr Ile
290 295 300
Arg Thr Leu Trp Pro Arg Asp Leu Leu Arg Ser Ser Phe Tyr Trp Lys
305 310 315 320
Ile Ile Gly Trp Asp Arg Arg Phe Asp Ile Ala Asp Arg Ile Glu Ala
325 330 335
His Asn Gly Arg Pro Ala Arg Glu Arg Val Val Gln Asp Ile Glu Val
340 345 350
Thr Pro Asp Asn Leu Pro Glu Phe Leu Thr Trp Phe Phe Thr His Cys
355 360 365
Glu Ile Glu Pro Val Trp Leu Cys Pro Ile Arg Leu Ala Asp Asp Ser
370 375 380
Gly Glu Arg Thr Pro Trp Pro Leu Tyr Pro Leu Ser Pro Gly Asp Thr
385 390 395 400
Trp Val Asn Val Gly Phe Trp Ser Ser Val Pro Ala Asp Leu Met Gly
405 410 415
Lys Asp Ala Pro Thr Gly Ala Phe Asn Arg Glu Val Glu Arg Val Val
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Ser Asp Leu Gly Gly His Lys Ser Leu Tyr Ser Glu Ala Phe Tyr Ser
435 440 445
Glu Glu Gln Phe Ala Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Arg Pro Ala Gln Leu
450 455 460
Lys Ala Val Phe Asp Pro Asp Asp Arg Phe Pro Gly Leu Tyr Glu Lys
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Thr Val Gly Gly Val
485
<210> 19
<211> 1368
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 19
atgagcaggg gattcacgcc gctgacggtg ggacagatcg tggacaaggt catcacaccg 60
ccggcaccgt tccgggtgac cgctttcgac ggatccaccg cggggccggc agacgcggaa 120
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cggcactctc cggaacggga caaggaggtc gtgagccgcc actacgacgt gggcaatgac 480
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<210> 20
<211> 455
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 20
Met Ser Arg Gly Phe Thr Pro Leu Thr Val Gly Gln Ile Val Asp Lys
1 5 10 15
Val Ile Thr Pro Pro Ala Pro Phe Arg Val Thr Ala Phe Asp Gly Ser
20 25 30
Thr Ala Gly Pro Ala Asp Ala Glu Leu Ala Leu Glu Ile Thr Ser Pro
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Asp Ala Leu Ala Tyr Ile Val Thr Ala Pro Gly Asp Leu Gly Leu Ala
50 55 60
Arg Ala Tyr Ile Thr Gly Ser Leu Arg Val Thr Gly Asp Glu Pro Gly
65 70 75 80
His Pro Tyr Leu Val Phe Asp His Leu Gln His Leu Tyr Asp Gln Ile
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Arg Arg Pro Ser Ala Lys Asp Leu Leu Asp Ile Ala Arg Ser Leu Lys
100 105 110
Ala Met Gly Ala Ile Lys Val Gln Pro Ala Pro Glu Gln Glu Thr Leu
115 120 125
Pro Gly Trp Lys Arg Ala Ile Leu Glu Gly Leu Ser Arg His Ser Pro
130 135 140
Glu Arg Asp Lys Glu Val Val Ser Arg His Tyr Asp Val Gly Asn Asp
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Phe Tyr Glu Leu Phe Leu Gly Asp Ser Met Ala Tyr Thr Cys Ala Tyr
165 170 175
Tyr Pro Glu Phe Asp Gly Glu Asn Gln Val Thr Gly Pro Thr Gly Gly
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Trp Arg Tyr Asp Asp Trp Glu Lys Gly Pro Thr Ala Asn Gly Pro Leu
195 200 205
Thr Gln Ala Gln Asp Asn Lys His Arg Leu Val Phe Asp Lys Leu Arg
210 215 220
Leu Asn Pro Gly Asp Arg Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly
225 230 235 240
Met Val Arg Tyr Ala Ala Arg His Gly Val Lys Ala Ile Gly Val Thr
245 250 255
Leu Ser Arg Glu Gln Tyr Glu Trp Gly Lys Ala Lys Ile Glu Glu Glu
260 265 270
Gly Leu Gln Asp Leu Ala Glu Val Arg Cys Met Asp Tyr Arg Asp Val
275 280 285
Pro Glu Ser Asp Phe Asp Ala Val Ser Ala Ile Gly Ile Leu Glu His
290 295 300
Ile Gly Val Pro Asn Tyr Glu Asp Tyr Phe Thr Arg Leu Phe Ala Lys
305 310 315 320
Leu Arg Pro Gly Gly Arg Met Leu Asn His Cys Ile Thr Arg Pro His
325 330 335
Asn Arg Lys Thr Lys Thr Gly Gln Phe Ile Asp Arg Tyr Ile Phe Pro
340 345 350
Asp Gly Glu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Ile Ile Thr Ile Met Gln Asp
355 360 365
Thr Gly Phe Asp Val Val His Glu Glu Asn Leu Arg Pro His Tyr Gln
370 375 380
Arg Thr Leu His Asp Trp Cys Glu Leu Leu Ala Thr Asn Trp Asp Gln
385 390 395 400
Ala Val His Leu Val Gly Glu Glu Thr Ala Arg Leu Phe Gly Leu Tyr
405 410 415
Met Ala Gly Ser Glu Trp Gly Phe Glu His Asn Val Ile Gln Leu His
420 425 430
Gln Val Leu Gly Val Lys Pro Asp Ala Ala Gly Ser Ser Gly Val Pro
435 440 445
Val Arg Gln Trp Trp Arg Ser
450 455
<210> 21
<211> 588
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 21
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<210> 22
<211> 195
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 甘氨酸棒状杆菌
<400> 22
Val Ala Val Leu Cys Thr Pro Leu Leu Leu Gly Ala Cys Thr Ile Gly
1 5 10 15
Asp Ala Gly Pro Gly Asp Glu Thr Thr Asp Pro Val Val Asp Thr Glu
20 25 30
Ala Pro Pro Asp Lys Pro Val Pro Asp Ser Ala Ala Glu Ser Gly Ala
35 40 45
Glu Asp Gly Pro Asp Ser Glu Val Pro Asp Asp Pro Asp Gln Pro Asp
50 55 60
Ala Glu Pro Val Glu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Gly Ala Arg Gly Leu
65 70 75 80
Ala Ile Gly Asp Cys Val Ala Asp Met Asp Gln Leu Asp Gly Thr Gly
85 90 95
Asp Ile Asp Val Val Asp Cys Ala Gly Pro His Ala Gly Glu Val Tyr
100 105 110
Ala Gln Ala Asp Ile Ala Gly Lys Asn Leu Phe Pro Gly Asn Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Gln Glu Ala Gly Ala Ile Cys Gly Gly Asp Ser Phe Thr Gly
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Tyr Val Gly Ile Gly Phe Pro Glu Ser Ser Leu Asp Val Val Thr Met
145 150 155 160
Met Pro Ser Lys Glu Ser Trp Ala Gln Glu Asp Arg Thr Val Thr Cys
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Val Val Thr Asp Pro Asn Leu Glu Gln Ile Ala Gly Thr Leu Glu Gln
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Ser Trp Arg
195
<210> 23
<211> 1395
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 气生诺尔氏菌
<400> 23
atgagcatgg accggaccgg accggccagg gtgcggaccg tgggggagcg gcggctgctc 60
gagagcttcg ccgccgtccc cccgggcgaa cgcgtgcggc tggccaagcg cacgtccaac 120
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acctacgtca acgtggggtt ctggtcgacc gtgccggggc ccggaccggg cgaggagctg 1200
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tactccgact cctactactc ccggtccgac ttcgacgccc tctacggcgg ggacgcgtat 1320
gccgtgctga aggccaccta cgacccggac gggcggttcc ctcacctcta cgacaaggcg 1380
gtgcgacacg catga 1395
<210> 24
<211> 464
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 气生诺尔氏菌
<400> 24
Met Ser Met Asp Arg Thr Gly Pro Ala Arg Val Arg Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Glu Ser Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Val
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Arg Leu Ala Lys Arg Thr Ser Asn Leu Phe Arg Ala Arg Glu Gly Thr
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Ser Thr Arg Gly Leu Asp Thr Ser Gly Leu Thr Gly Val Arg Val Val
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Asp Ala Gly Thr Leu Thr Ala Asp Val Asp Gly Met Cys Thr Tyr Glu
65 70 75 80
Asp Leu Val Ala Ala Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Pro Leu Val Val
85 90 95
Pro Gln Leu Arg Thr Ile Thr Val Gly Gly Ala Val Thr Gly Leu Gly
100 105 110
Ile Glu Ser Thr Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val Leu
115 120 125
Glu Met Asp Val Leu Thr Gly Ala Gly Glu Ile Val Thr Ala Thr Ala
130 135 140
Asp Asn Glu His Ala Asp Leu Phe Arg Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly
145 150 155 160
Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Cys Leu Arg Ile Glu Leu Glu Arg Val Gly
165 170 175
Thr Cys Val Glu Val Arg His Val Arg Phe His Asp Leu Asp Ala Leu
180 185 190
Cys Ala Ala Ile Ala Glu Val Val Ala Thr Arg Ser His Glu Gly Glu
195 200 205
Glu Val Asp His Val Asp Gly Val Val Phe Ser Arg Asp Glu Ala Tyr
210 215 220
Leu Thr Leu Gly Arg His Ser Asp Arg Thr Gly Pro Thr Ser Asp Tyr
225 230 235 240
Thr Gly Gln Gln Val Tyr Tyr Arg Ser Ile Gln His Asp Gly Pro Ser
245 250 255
Pro Arg Arg Asp Leu Leu Thr Thr His Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp
260 265 270
Thr Asp Trp Phe Trp Cys Ser Arg Ala Phe Gly Ala Gln Asp Pro Arg
275 280 285
Val Arg Arg Trp Trp Pro Arg Arg Trp Arg Arg Ser Ser Val Tyr Trp
290 295 300
Arg Leu Val Ala Ala Asp Arg Arg Val Gly Phe Ser Asp Arg Leu Glu
305 310 315 320
Ala Arg Arg Gly Asn Pro Pro Arg Glu Arg Val Val Gln Asp Val Glu
325 330 335
Ile Pro Leu Gly Gln Thr Ala Ala Phe Leu His Trp Phe Leu Asp Glu
340 345 350
Val Pro Ile Glu Pro Ile Trp Leu Cys Pro Leu Arg Leu Arg Asp His
355 360 365
Gln Arg Trp Pro Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Gly Arg Thr Tyr Val Asn
370 375 380
Val Gly Phe Trp Ser Thr Val Pro Gly Pro Gly Pro Gly Glu Glu Leu
385 390 395 400
Gly Ala Thr Asn Arg Ala Ile Glu Arg Arg Val Asp Glu Val Gly Gly
405 410 415
His Lys Ser Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg Ser Asp Phe Asp
420 425 430
Ala Leu Tyr Gly Gly Asp Ala Tyr Ala Val Leu Lys Ala Thr Tyr Asp
435 440 445
Pro Asp Gly Arg Phe Pro His Leu Tyr Asp Lys Ala Val Arg His Ala
450 455 460
<210> 25
<211> 1284
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 气生诺尔氏菌
<400> 25
atgagccaca cgaccgatga gatccgcacg gtcgccgacc tcgtcgacga ggtggtcgtc 60
ggcccgctgc cggtgcgggt cacggcctac gacgggtcga agacggggcc ggacagcgcc 120
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tag 1263
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Met Ala Ala Ser Arg Val Gly Phe Glu Gln Asn Ser Ile Gln Leu His
405 410 415
Gln Val Leu Ala Val Lys Leu Asp Glu Arg Gly Gly Asp Gly Gly Leu
420 425 430
Pro Leu Arg Pro Trp Trp Thr Ala
435 440
<210> 55
<211> 381
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 范巴伦氏分枝杆菌
<400> 55
gtgatccgct ttctgctgcg cgtcgcggtc tttctcggat cgtcggcgat cgggctactg 60
gtggccggct ggctggtgcc gggggtgtcg ctgtcggtgc tgggcttcgt caccgcggtg 120
gtgatcttca cggtggcaca agggattctg tcgccgttct tcctgaagat ggccagccgc 180
tacgcgtcgg ccttcctcgg cggcatcggc ctggtgtcca cgttcgtggc gctgctgctc 240
gcgtcgctgc tgtccaacgg gctcagcatc cgcggcgtcg ggtcgtggat cgcggccacg 300
gtggtggtct ggctggtcac agccctggcg accgtcgtgc tgcccgttct ggtgctgcgg 360
gagaagaaga aagcagcctg a 381
<210> 56
<211> 126
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 范巴伦氏分枝杆菌
<400> 56
Val Ile Arg Phe Leu Leu Arg Val Ala Val Phe Leu Gly Ser Ser Ala
1 5 10 15
Ile Gly Leu Leu Val Ala Gly Trp Leu Val Pro Gly Val Ser Leu Ser
20 25 30
Val Leu Gly Phe Val Thr Ala Val Val Ile Phe Thr Val Ala Gln Gly
35 40 45
Ile Leu Ser Pro Phe Phe Leu Lys Met Ala Ser Arg Tyr Ala Ser Ala
50 55 60
Phe Leu Gly Gly Ile Gly Leu Val Ser Thr Phe Val Ala Leu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Ser Leu Leu Ser Asn Gly Leu Ser Ile Arg Gly Val Gly Ser Trp
85 90 95
Ile Ala Ala Thr Val Val Val Trp Leu Val Thr Ala Leu Ala Thr Val
100 105 110
Val Leu Pro Val Leu Val Leu Arg Glu Lys Lys Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 57
<211> 1452
<212> DNA
<213> 浑浊红球菌
<400> 57
atgcgggagg gtggacgccc cttccgtgcg catcgcactc tgcccgtcac cgggatcgac 60
gctcaccgcg ccggcgtcga acggcttctc gcgtcctacc gcgcgattcc cacggacgcc 120
accgtgcgac tcgcgaagaa gacgtccaac ctgttccggg cgcgggccca gaccagcgca 180
cccggcctcg acgtctccgg gctcggcgga gtcatctcgg tcgacgagca ggaccggacc 240
gcggatgtcg ccggaatgtg cacgtacgaa gacctggtgg acgccaccct cccgtacggg 300
ctggcgccgc tggtggttcc gcaactcaag accatcacac tcggcggcgc ggtcaccggc 360
ctcggcatcg agtcgacgtc gttccgcaac gggctccccc acgaatcggt cctcgagatc 420
gacgtcctga ccggaagcgg cgacatcgtc accgcgagac cggaaggcga gaactccgac 480
ctgttctggg ggttccccaa ctcctacgga accctcggct actccacccg actgcgcatc 540
cagctcgaac ccgtcaaacg gtatgtggca ctgcgccatc tgcgtttcga ctccctggac 600
gagctgcagt cggcaatgga tcgcatcgtc accgagcgcg tccacgacgg catccccgtc 660
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accgacgagg gcggccccgt cagcgactac accgggcaga acatcttcta ccggtccatc 780
cagcacagtt ccgtgaacca ccccaaaacg gacaaactca ccatccgaga ctacctgtgg 840
cgctgggaca ccgactggtt ctggtgctcg cgcgccttcg gcgcccagaa ccccaccatc 900
cgccggctgt ggccgaagaa cctcctccgc agcagcttct actggaagct catcgccctc 960
gaccacaagt acgacatcgg cgaccgactc gagaagcgca agggcaaccc gccacgcgaa 1020
cgcgtcgtgc aggacgtcga agtgcccatc gagcgcaccg cggacttcgt ccgctggttc 1080
ctcgacgaaa tcccgatcga accgctgtgg ctgtgcccgt tgcggttgcg ggaacctgcc 1140
cccgccggcg cgtcctcgca acgcccctgg cccctgtacc ccctcgaacc gaaacgcacg 1200
tacgtgaaca tcggattctg gtcatcggtg cccatcgttc cgggccgacc cgagggggcc 1260
gcgaatcggc tgatcgaaga caaggtcagt gacttcgacg gacacaagtc cctctactcc 1320
gattcgtact attcacgcga agatttcgaa cgcctctact acggcggcga tcgatacacg 1380
gaactgaaaa aacgctacga cccgaaatca cgattactgg accttttctc caaggcggtg 1440
caacgtcgat ga 1452
<210> 58
<211> 483
<212> PRT
<213> 浑浊红球菌
<400> 58
Met Arg Glu Gly Gly Arg Pro Phe Arg Ala His Arg Thr Leu Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Ile Asp Ala His Arg Ala Gly Val Glu Arg Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Tyr Arg Ala Ile Pro Thr Asp Ala Thr Val Arg Leu Ala Lys Lys Thr
35 40 45
Ser Asn Leu Phe Arg Ala Arg Ala Gln Thr Ser Ala Pro Gly Leu Asp
50 55 60
Val Ser Gly Leu Gly Gly Val Ile Ser Val Asp Glu Gln Asp Arg Thr
65 70 75 80
Ala Asp Val Ala Gly Met Cys Thr Tyr Glu Asp Leu Val Asp Ala Thr
85 90 95
Leu Pro Tyr Gly Leu Ala Pro Leu Val Val Pro Gln Leu Lys Thr Ile
100 105 110
Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Leu Gly Ile Glu Ser Thr Ser Phe
115 120 125
Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val Leu Glu Ile Asp Val Leu Thr
130 135 140
Gly Ser Gly Asp Ile Val Thr Ala Arg Pro Glu Gly Glu Asn Ser Asp
145 150 155 160
Leu Phe Trp Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly Thr Leu Gly Tyr Ser Thr
165 170 175
Arg Leu Arg Ile Gln Leu Glu Pro Val Lys Arg Tyr Val Ala Leu Arg
180 185 190
His Leu Arg Phe Asp Ser Leu Asp Glu Leu Gln Ser Ala Met Asp Arg
195 200 205
Ile Val Thr Glu Arg Val His Asp Gly Ile Pro Val Asp Tyr Leu Asp
210 215 220
Gly Val Val Phe Thr Ala Ser Glu Ser Tyr Leu Thr Leu Gly His Gln
225 230 235 240
Thr Asp Glu Gly Gly Pro Val Ser Asp Tyr Thr Gly Gln Asn Ile Phe
245 250 255
Tyr Arg Ser Ile Gln His Ser Ser Val Asn His Pro Lys Thr Asp Lys
260 265 270
Leu Thr Ile Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp Thr Asp Trp Phe Trp
275 280 285
Cys Ser Arg Ala Phe Gly Ala Gln Asn Pro Thr Ile Arg Arg Leu Trp
290 295 300
Pro Lys Asn Leu Leu Arg Ser Ser Phe Tyr Trp Lys Leu Ile Ala Leu
305 310 315 320
Asp His Lys Tyr Asp Ile Gly Asp Arg Leu Glu Lys Arg Lys Gly Asn
325 330 335
Pro Pro Arg Glu Arg Val Val Gln Asp Val Glu Val Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ala Asp Phe Val Arg Trp Phe Leu Asp Glu Ile Pro Ile Glu Pro
355 360 365
Leu Trp Leu Cys Pro Leu Arg Leu Arg Glu Pro Ala Pro Ala Gly Ala
370 375 380
Ser Ser Gln Arg Pro Trp Pro Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Lys Arg Thr
385 390 395 400
Tyr Val Asn Ile Gly Phe Trp Ser Ser Val Pro Ile Val Pro Gly Arg
405 410 415
Pro Glu Gly Ala Ala Asn Arg Leu Ile Glu Asp Lys Val Ser Asp Phe
420 425 430
Asp Gly His Lys Ser Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Tyr Ser Arg Glu Asp
435 440 445
Phe Glu Arg Leu Tyr Tyr Gly Gly Asp Arg Tyr Thr Glu Leu Lys Lys
450 455 460
Arg Tyr Asp Pro Lys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Phe Ser Lys Ala Val
465 470 475 480
Gln Arg Arg
<210> 59
<211> 1302
<212> DNA
<213> 浑浊红球菌
<400> 59
atgacaactc tgaaagcttc acgctcccag gaccacaagc tgaccatcgc agagattctc 60
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cgcggcgtcc accccggcga cccgtacgag atcctccgcg tgatgggcga cgaactgcac 300
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ctgcgcccca tcgcccctcc cccgcaggag catctcccgc ggtggcgtcg agtcgcggaa 420
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<210> 60
<211> 433
<212> PRT
<213> 浑浊红球菌
<400> 60
Met Thr Thr Leu Lys Ala Ser Arg Ser Gln Asp His Lys Leu Thr Ile
1 5 10 15
Ala Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ser Asp Gly Met Leu Pro Leu Arg Phe
20 25 30
Ser Ala Tyr Asp Gly Ser Ala Ala Gly Pro Glu Asp Ala Pro Tyr Gly
35 40 45
Leu His Leu Lys Thr Thr Arg Gly Thr Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Pro
50 55 60
Gly Asp Leu Gly Met Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Asp Leu Glu Ala
65 70 75 80
Arg Gly Val His Pro Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Leu Arg Val Met Gly
85 90 95
Asp Glu Leu His Phe Arg Arg Pro Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ile
100 105 110
Thr Arg Ser Leu Gly Trp Asp Leu Leu Arg Pro Ile Ala Pro Pro Pro
115 120 125
Gln Glu His Leu Pro Arg Trp Arg Arg Val Ala Glu Gly Leu Arg His
130 135 140
Ser Lys Ser Arg Asp Ala Glu Val Ile His His His Tyr Asp Val Ser
145 150 155 160
Asn Thr Phe Tyr Glu Tyr Val Leu Gly Pro Ser Met Thr Tyr Thr Cys
165 170 175
Ala Cys Tyr Glu Asn Ala Glu Gln Thr Leu Glu Glu Ala Gln Asp Asn
180 185 190
Lys Tyr Arg Leu Val Phe Glu Lys Leu Gly Leu Gln Pro Gly Asp Arg
195 200 205
Leu Leu Asp Ile Gly Cys Gly Trp Gly Ser Met Val Arg Tyr Ala Ala
210 215 220
Arg Arg Gly Val Lys Val Ile Gly Ala Thr Leu Ser Arg Glu Gln Ala
225 230 235 240
Glu Trp Ala Gln Lys Ala Ile Ala Glu Glu Gly Leu Ser Asp Leu Ala
245 250 255
Glu Val Arg Phe Ser Asp Tyr Arg Asp Val Pro Glu Thr Gly Phe Asp
260 265 270
Ala Ile Ser Ser Ile Gly Leu Thr Glu His Ile Gly Val Gly Asn Tyr
275 280 285
Pro Ala Tyr Phe Gly Leu Leu Gln Ser Lys Leu Arg Glu Gly Gly Arg
290 295 300
Leu Leu Asn His Cys Ile Thr Arg Pro Asp Asn Gln Ser Gln Ala Arg
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Ile Asp Arg Tyr Val Phe Pro Asp Gly Glu Leu Thr
325 330 335
Gly Ser Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ile Gln Asn Val Gly Leu Glu Val
340 345 350
Arg His Glu Glu Asn Leu Arg Glu His Tyr Ala Leu Thr Leu Ala Gly
355 360 365
Trp Cys Gln Asn Leu Val Asp Asn Trp Asp Ala Cys Val Ala Glu Val
370 375 380
Gly Glu Gly Thr Ala Arg Val Trp Gly Leu Tyr Met Ala Gly Ser Arg
385 390 395 400
Leu Gly Phe Glu Arg Asn Val Val Gln Leu His Gln Val Leu Ala Val
405 410 415
Lys Leu Gly Pro Lys Gly Glu Ala His Val Pro Leu Arg Pro Trp Trp
420 425 430
Lys
<210> 61
<211> 1428
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 61
atgatcacac tggcaggccg ggccggtgcg cgcgatcatg ggtgtatggc cttcggtgcc 60
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cgctcgatca gggagaagac ggtcgaccat ctgccgatcc gcgactacct gtggcggtgg 840
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ccgctgtacg agctcgaccc ggacgagctg tacgtcaact tcggtttctg gggcacggtg 1200
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aacgggagat tgctggacct gtacgccaag tgcgttcaag cgaggtga 1428
<210> 62
<211> 475
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 62
Met Ile Thr Leu Ala Gly Arg Ala Gly Ala Arg Asp His Gly Cys Met
1 5 10 15
Ala Phe Gly Ala Ala Ile Pro Thr Gly Ser Gly His Ala Gly Tyr Ala
20 25 30
Glu Arg Val Ala Thr Leu Arg Ala His Leu Ala Asp Leu Pro Glu Gly
35 40 45
Thr Pro Val Arg Leu Ala Lys Gly Thr Ser Asn Leu Phe Arg Pro Arg
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ala Gly Leu Asp Val Ser Ala Phe Asp His Val Leu
65 70 75 80
Ser Ile Asp Pro Gln Asn Arg Thr Ala Asp Val Glu Gly Met Val Thr
85 90 95
Tyr Glu Arg Leu Val Asp Ala Thr Leu Pro His Gly Leu Met Pro Leu
100 105 110
Val Val Pro Gln Leu Lys Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly
115 120 125
Leu Gly Ile Glu Ser Ser Ser Phe Arg Glu Gly Met Pro His Glu Ser
130 135 140
Val Val Glu Met Asp Ile Leu Thr Gly Ala Gly Asp Val Val Thr Ala
145 150 155 160
Thr Pro Asp Gly Glu His Ser Asp Leu Phe Phe Gly Phe Pro Asn Ser
165 170 175
Tyr Gly Thr Leu Gly Tyr Ala Leu Arg Leu Arg Ile Glu Leu Ala Pro
180 185 190
Val Arg Pro Tyr Val Arg Leu Glu His Leu Arg Phe Ser Asp Pro Ala
195 200 205
Arg Tyr Phe Glu Arg Leu Ala Arg Ala Cys Arg Asp Arg Glu Ala Asp
210 215 220
Phe Val Asp Gly Thr Val Phe Ala Pro Asp Glu Leu Tyr Leu Thr Leu
225 230 235 240
Ala Thr Phe Ser Gly Glu Pro Asp Glu Val Ser Asp Tyr Thr Trp Met
245 250 255
Asp Val Tyr Tyr Arg Ser Ile Arg Glu Lys Thr Val Asp His Leu Pro
260 265 270
Ile Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp Thr Asp Trp Phe Trp Cys Ser
275 280 285
Arg Ala Leu Gly Ala Gln Asn Arg Leu Val Arg Leu Leu Ala Gly Pro
290 295 300
Arg Leu Leu Arg Ser Asp Val Tyr Trp Lys Ile Val Gly Phe Glu Arg
305 310 315 320
Arg His Arg Leu Trp Glu Arg Ala Ser Arg Leu Leu Gly Arg Pro Glu
325 330 335
Arg Glu Ala Val Met Gln Asp Ile Glu Val Pro Val His Arg Ala Glu
340 345 350
Glu Phe Leu Thr Phe Leu His Arg Glu Ile Pro Ile Ser Pro Val Trp
355 360 365
Ile Cys Pro Leu Ser Gly Arg Asp Ala Arg Arg Trp Pro Leu Tyr Glu
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Leu Asp Pro Asp Glu Leu Tyr Val Asn Phe Gly Phe Trp Gly Thr Val
385 390 395 400
Pro Leu Glu Pro Gly Glu Pro Gln Gly Ser His Asn Arg Arg Val Glu
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Asn Val Val Thr Glu Leu Asp Gly Arg Lys Ser Leu Tyr Ser Glu Ser
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Phe Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Trp Arg Leu Tyr Gly Gly Asn Gln Gly
435 440 445
Gln Thr Tyr Gln Ala Leu Lys His Arg Tyr Asp Pro Asn Gly Arg Leu
450 455 460
Leu Asp Leu Tyr Ala Lys Cys Val Gln Ala Arg
465 470 475
<210> 63
<211> 1317
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 63
ttggcgtcgt cggggccacc gctgcccgcc agggcggggt cccgatcggc tgactcgacg 60
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ggcatggtcg cccacgccgt ggagcactac ggggtgcggg cgatcggcgt caccctctcg 720
cgccagcagg cggagtgggg acagcgggac ctcgaggcca ggggcctggc cgatcgcggc 780
gagatccgcc atctggacta ccgcgacgtg cccgagaccg ggttcgacgc ggtgtcgtcc 840
atcgggctca ccgaacacat cggcgcgcgg aacctgccgt cgtacttccg cttcctgcac 900
tcgaagttgc gtcccggcgg acggttgctc aaccactgca tcgtgcgccc gcacacctac 960
gactcccatc ggacgggccc gttcatcgac cgctacgtct tcccggacgg cgaactcgag 1020
ggcgtcggga cgatcgtgtc ggcgatgcag gaccacgggt tcgaggtacg gcacgcggag 1080
aacctgcggg aacactacgg gcgcaccctc gcggcgtggt gcgccaatct cgacgcgcac 1140
tgggaggcgg cggtggccga ggcgggcgtg cagcgggcca gggtgtgggc gctgtacatg 1200
gcggcctccc ggctgtcgtt cgaacgtcat gagctcgagc tgcagcaggt gctcggcgtg 1260
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<210> 64
<211> 438
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 64
Leu Ala Ser Ser Gly Pro Pro Leu Pro Ala Arg Ala Gly Ser Arg Ser
1 5 10 15
Ala Asp Ser Thr Ala Leu Asp Ala Ile Leu Arg Arg Val Leu Gly Asp
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Asp Pro Pro Val Ala Val Thr Ala Phe Asp Gly Thr Val Val Gly Asp
35 40 45
Pro Asp Ser Ala Leu Gln Leu His Ile Arg Thr Pro Thr Ala Leu Ser
50 55 60
Tyr Val Leu Thr Ala Pro Asn Glu Leu Gly Leu Ala Arg Ala Tyr Val
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115 120 125
Ile Pro Val Glu Glu Ala Pro Ser Arg Leu Arg Arg Thr Ala Arg Gly
130 135 140
Leu Arg His Ser Lys Ala Arg Asp Ser Asp Ala Ile Ser Arg His Tyr
145 150 155 160
Asp Val Ser Asn Arg Phe Tyr Glu Leu Val Leu Gly Pro Ser Met Ala
165 170 175
Tyr Thr Cys Ala Cys Tyr Pro Glu Asp Ala Ala Thr Leu Glu Gln Ala
180 185 190
Gln Phe His Lys Phe Asp Leu Val Cys Arg Lys Leu Gly Leu Lys Pro
195 200 205
Gly Met Arg Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Ala
210 215 220
His Ala Val Glu His Tyr Gly Val Arg Ala Ile Gly Val Thr Leu Ser
225 230 235 240
Arg Gln Gln Ala Glu Trp Gly Gln Arg Asp Leu Glu Ala Arg Gly Leu
245 250 255
Ala Asp Arg Gly Glu Ile Arg His Leu Asp Tyr Arg Asp Val Pro Glu
260 265 270
Thr Gly Phe Asp Ala Val Ser Ser Ile Gly Leu Thr Glu His Ile Gly
275 280 285
Ala Arg Asn Leu Pro Ser Tyr Phe Arg Phe Leu His Ser Lys Leu Arg
290 295 300
Pro Gly Gly Arg Leu Leu Asn His Cys Ile Val Arg Pro His Thr Tyr
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Arg Pro Asp Trp Gly Val
435
<210> 65
<211> 501
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 65
gtgcgcgtgg caccgccccg catcggtgcc acacccggcg cggtgggcgc accggactac 60
gcctccgcct tccgcgtgcc gacggcggcg gcccgcaggc gttcgccgcg ggaatggacg 120
cgtgcggtgt tcgagggcgc gcccgcgccg ttggcgctgt tcgtgcgttg gggatggctg 180
gccgtgctcc ggttgcgcct cagtgaggac cccgaggcgg tggcgggctg gagacccacg 240
acgctcgacc ccggcacctc cgacgccccc gacacctctg agacagccgg aaactccgac 300
gctgccgcac tggaggccga atcgccgctg ctggaggcgt gcaacgtggc gttcgtcgac 360
gacgacggtg tcacgtgggc gacctacgtc cggttccgtg gtggcctcgg ccgcgcggtg 420
tgggcggtgg cggcgcggat ccaccacgtc gtcatcccct acctgctgcg gcgggcggtg 480
cggcgcacgg aacgggagtg a 501
<210> 66
<211> 166
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 拉格西斯链霉菌
<400> 66
Val Arg Val Ala Pro Pro Arg Ile Gly Ala Thr Pro Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Ala Pro Asp Tyr Ala Ser Ala Phe Arg Val Pro Thr Ala Ala Ala Arg
20 25 30
Arg Arg Ser Pro Arg Glu Trp Thr Arg Ala Val Phe Glu Gly Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Leu Ala Leu Phe Val Arg Trp Gly Trp Leu Ala Val Leu Arg
50 55 60
Leu Arg Leu Ser Glu Asp Pro Glu Ala Val Ala Gly Trp Arg Pro Thr
65 70 75 80
Thr Leu Asp Pro Gly Thr Ser Asp Ala Pro Asp Thr Ser Glu Thr Ala
85 90 95
Gly Asn Ser Asp Ala Ala Ala Leu Glu Ala Glu Ser Pro Leu Leu Glu
100 105 110
Ala Cys Asn Val Ala Phe Val Asp Asp Asp Gly Val Thr Trp Ala Thr
115 120 125
Tyr Val Arg Phe Arg Gly Gly Leu Gly Arg Ala Val Trp Ala Val Ala
130 135 140
Ala Arg Ile His His Val Val Ile Pro Tyr Leu Leu Arg Arg Ala Val
145 150 155 160
Arg Arg Thr Glu Arg Glu
165
<210> 67
<211> 1413
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 67
gtgaactgtc agtcttccgc gtccaacctc gccaaccaca tcaacgcggt gtacgagctg 60
cgccgcgcct atgcgcggct gtccgccgac aagccggtgc gcctggcgaa gaccacctcc 120
aacctcttcc gcttccgcag ccgggacgat gccgcgcgtc tcgacgtcag cgctttcacc 180
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cgcacgatca ccctgggcgg tgcggtcacc gggctgggga tcgaatcctc gtccttccgc 360
aacgggctcc cgcacgagtc agtggaagag atggagatcc tcaccggcag cggccaggtg 420
gtggtggccc ggcgcgacaa cgagcaccgc gacctgttct acggtttccc caactcgtac 480
ggcaccctcg gttacgcgct gcggctccgc atccagctcg aaccggtccg cccctacgtc 540
cacctgcggc acctgcggtt caccgatgcc gcagcggcca tggccgcgct ggagcagatc 600
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cgcaacgagc tgtacctgac cttggggacg ttcaccgacc gggctccgtg gaccagcgac 720
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gactacctca ccacgcacga ctacctgtgg cggtgggaca ccgactggtt ctggtgctcc 840
cgcgccttcg gactgcagca tcccgtggtg cgccgcctgt ggccgcgttc cttgaaacgc 900
tccgacgtct accgcaagct cgtcgcctgg gaccggcgca ctgacgcgag ccgcctgctc 960
gactactacc gcgggcgccc gcccaaggaa ccggtgatcc aggacatcga ggttgaggtg 1020
gggcgggctg ccgagttcct cgacttcttc cacaccgaga tcggcatgtc cccggtgtgg 1080
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taccccctca aaccccgccg cctctacgtc aacttcgggt tttggggcct cgttccgatc 1200
cgtcccggtg gaggcaggac ataccacaac cggctgatcg aaaaagaagt gacccggttg 1260
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gacctgtaca ccaagtgcgt cggcggcggg tga 1413
<210> 68
<211> 470
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 68
Val Asn Cys Gln Ser Ser Ala Ser Asn Leu Ala Asn His Ile Asn Ala
1 5 10 15
Val Tyr Glu Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Leu Ser Ala Asp Lys Pro
20 25 30
Val Arg Leu Ala Lys Thr Thr Ser Asn Leu Phe Arg Phe Arg Ser Arg
35 40 45
Asp Asp Ala Ala Arg Leu Asp Val Ser Ala Phe Thr Ser Val Ile Ser
50 55 60
Ile Asp Thr Glu Ala Arg Val Ala Glu Val Gly Gly Met Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Val Ala Ala Thr Leu Arg His Gly Leu Met Pro Pro Val
85 90 95
Val Pro Gln Leu Arg Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Leu
100 105 110
Gly Ile Glu Ser Ser Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val
115 120 125
Glu Glu Met Glu Ile Leu Thr Gly Ser Gly Gln Val Val Val Ala Arg
130 135 140
Arg Asp Asn Glu His Arg Asp Leu Phe Tyr Gly Phe Pro Asn Ser Tyr
145 150 155 160
Gly Thr Leu Gly Tyr Ala Leu Arg Leu Arg Ile Gln Leu Glu Pro Val
165 170 175
Arg Pro Tyr Val His Leu Arg His Leu Arg Phe Thr Asp Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Met Ala Ala Leu Glu Gln Ile Cys Ala Asp Arg Thr His Asp Gly
195 200 205
Glu Thr Val Asp Phe Val Asp Gly Val Val Phe Ala Arg Asn Glu Leu
210 215 220
Tyr Leu Thr Leu Gly Thr Phe Thr Asp Arg Ala Pro Trp Thr Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Thr Gly Thr Asp Ile Tyr Tyr Arg Ser Ile Pro Arg Tyr Ala Gly
245 250 255
Pro Gly Pro Gly Asp Tyr Leu Thr Thr His Asp Tyr Leu Trp Arg Trp
260 265 270
Asp Thr Asp Trp Phe Trp Cys Ser Arg Ala Phe Gly Leu Gln His Pro
275 280 285
Val Val Arg Arg Leu Trp Pro Arg Ser Leu Lys Arg Ser Asp Val Tyr
290 295 300
Arg Lys Leu Val Ala Trp Asp Arg Arg Thr Asp Ala Ser Arg Leu Leu
305 310 315 320
Asp Tyr Tyr Arg Gly Arg Pro Pro Lys Glu Pro Val Ile Gln Asp Ile
325 330 335
Glu Val Glu Val Gly Arg Ala Ala Glu Phe Leu Asp Phe Phe His Thr
340 345 350
Glu Ile Gly Met Ser Pro Val Trp Leu Cys Pro Leu Arg Leu Arg Glu
355 360 365
Asp Thr Ala Asp Asp Thr Glu Pro Val Trp Pro Leu Tyr Pro Leu Lys
370 375 380
Pro Arg Arg Leu Tyr Val Asn Phe Gly Phe Trp Gly Leu Val Pro Ile
385 390 395 400
Arg Pro Gly Gly Gly Arg Thr Tyr His Asn Arg Leu Ile Glu Lys Glu
405 410 415
Val Thr Arg Leu Gly Gly His Lys Ser Leu Tyr Ser Asp Ala Phe Tyr
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Asp Glu Asp Glu Phe Trp Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Ile Tyr Arg Lys
435 440 445
Leu Lys Ala Ala Tyr Asp Pro Asp Gly Arg Leu Leu Asp Leu Tyr Thr
450 455 460
Lys Cys Val Gly Gly Gly
465 470
<210> 69
<211> 1272
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 69
atgcgactgg cggaggtatt cgaacgtgtc gtcggacccg atgcgcccgt ccacttccgg 60
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ccgctgcctt aa 1272
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<211> 423
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 70
Met Arg Leu Ala Glu Val Phe Glu Arg Val Val Gly Pro Asp Ala Pro
1 5 10 15
Val His Phe Arg Ala Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Gly Asp Pro Arg Ser
20 25 30
Glu Val Ala Ile Val Val Arg His Pro Ala Ala Val Asn Tyr Ile Val
35 40 45
Gln Ala Pro Gly Ala Leu Gly Leu Thr Arg Ala Tyr Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Leu Asp Val Glu Gly Asp Met Tyr Thr Ala Leu Arg Ala Met Ala Asp
65 70 75 80
Val Val Phe Gln Asp Arg Pro Arg Leu Ser Pro Gly Glu Leu Leu Arg
85 90 95
Ile Ile Arg Gly Ile Gly Trp Val Lys Phe Val Asn Arg Leu Pro Pro
100 105 110
Pro Pro Gln Glu Val Arg Gln Ser Arg Leu Ala Ala Leu Gly Trp Arg
115 120 125
His Ser Lys Gln Arg Asp Ala Glu Ala Ile Gln His His Tyr Asp Val
130 135 140
Ser Asn Ala Phe Tyr Ala Leu Val Leu Gly Glu Ser Met Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Cys Ala Val Tyr Pro Thr Glu Gln Ala Thr Leu Glu Gln Ala Gln Phe
165 170 175
Phe Lys His Glu Leu Ile Ala Arg Lys Leu Gly Leu Ala Pro Gly Ile
180 185 190
Arg Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Ile His Ala
195 200 205
Ala Arg Glu His Gly Val Lys Ala Leu Gly Val Thr Leu Ser Lys Glu
210 215 220
Gln Ala Glu Trp Ala Gln Lys Arg Ile Ala His Glu Gly Leu Gly Asp
225 230 235 240
Leu Ala Glu Val Arg His Met Asp Tyr Arg Asp Leu Pro Asp Gly Glu
245 250 255
Tyr Asp Ala Ile Ser Ser Ile Gly Leu Thr Glu His Val Gly Lys Lys
260 265 270
Asn Val Pro Ala Tyr Phe Ala Ser Leu Tyr Arg Lys Leu Val Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Leu Leu Asn His Cys Ile Thr Arg Pro Arg Asn Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Phe Lys Arg Gly Gly Val Ile Asn Arg Tyr Val Phe Pro Asp Gly
305 310 315 320
Glu Leu Glu Gly Pro Gly Trp Leu Gln Ala Ala Met Asn Asp Ala Gly
325 330 335
Phe Glu Ile Arg His Gln Glu Asn Leu Arg Glu His Tyr Ala Arg Thr
340 345 350
Leu Arg Asp Trp Leu Ala Asn Leu Asp Arg Asn Trp Asp Ala Ala Val
355 360 365
Arg Glu Val Gly Glu Gly Thr Ala Arg Val Trp Arg Leu Tyr Met Ala
370 375 380
Gly Cys Val Leu Gly Phe Glu Arg Asn Val Val Gln Leu His Gln Ile
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Leu Gly Val Lys Leu Asp Gly Thr Glu Ala Arg Met Pro Leu Arg Pro
405 410 415
Asp Phe Glu Pro Pro Leu Pro
420
<210> 71
<211> 447
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 71
atggctgcga ccgatgacga ccggcaccac accaccgtcg ccctcgacct catcgacgcg 60
tatgtgcgcg ccgaccgcag aatgatcggt gaacgttccg cggggatcag cgcggaggcg 120
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<210> 72
<211> 148
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> 嗜热子囊菌
<400> 72
Met Ala Ala Thr Asp Asp Asp Arg His His Thr Thr Val Ala Leu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Asp Ala Tyr Val Arg Ala Asp Arg Arg Met Ile Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ala Gly Glu Arg Ile Val Ser Thr Leu
35 40 45
Lys Val Cys Ala Ala Phe Leu Ala Arg Arg Val Gln Glu Thr Gly Val
50 55 60
Pro Trp Arg Ala Ala Asp Ser Arg Glu Ala Val Ala Arg Thr Val Ala
65 70 75 80
Asp Leu Leu Glu Pro Glu Val Glu Phe Ala Val Val Ser Ala Trp Glu
85 90 95
Ala Tyr Ala Ile Gly Glu His Glu Ala Ala Trp Val Arg Ala His Gly
100 105 110
Asp Pro Leu Val Phe Val His Met Leu Ala Ala Phe Ser Ala Ala Ile
115 120 125
Gly Thr Ala Val Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Leu Pro Thr Leu Arg Arg
130 135 140
Val Thr Ala Arg
145
<210> 73
<211> 1368
<212> DNA
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 73
atgtcacagc tggcggtcac agaccaccac gagcgagcgg tcgaggcgct gcgcaggtcg 60
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cagcacatct actaccggtc gatccagcag cggtcgatcg actttttgac catccgcgac 780
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gacgcgcgcc tgctcgacct ctacgacaag tgcgtgcggg gacgctga 1368
<210> 74
<211> 455
<212> PRT
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 74
Met Ser Gln Leu Ala Val Thr Asp His His Glu Arg Ala Val Glu Ala
1 5 10 15
Leu Arg Arg Ser Tyr Ala Ala Ile Pro Pro Gly Thr Pro Val Arg Leu
20 25 30
Ala Lys Gln Thr Ser Asn Leu Phe Arg Phe Arg Glu Pro Thr Ala Ala
35 40 45
Pro Gly Leu Asp Val Ser Gly Phe Asn Arg Val Leu Ala Val Asp Pro
50 55 60
Asp Ala Arg Thr Ala Asp Val Gln Gly Met Thr Thr Tyr Glu Asp Leu
65 70 75 80
Val Asp Ala Thr Leu Pro His Gly Leu Met Pro Leu Val Val Pro Gln
85 90 95
Leu Lys Thr Ile Thr Leu Gly Gly Ala Val Thr Gly Leu Gly Ile Glu
100 105 110
Ser Thr Ser Phe Arg Asn Gly Leu Pro His Glu Ser Val Leu Glu Met
115 120 125
Gln Ile Ile Thr Gly Ala Gly Glu Val Val Thr Ala Thr Pro Asp Gly
130 135 140
Glu His Ser Asp Leu Phe Trp Gly Phe Pro Asn Ser Tyr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Ala Leu Lys Leu Lys Ile Glu Leu Glu Pro Val Lys Pro Tyr
165 170 175
Val Arg Leu Arg His Leu Arg Phe Asp Asp Ala Gly Glu Cys Ala Ala
180 185 190
Lys Leu Ala Glu Leu Ser Glu Ser Arg Glu His Glu Gly Asp Glu Val
195 200 205
His Phe Leu Asp Gly Thr Phe Phe Gly Pro Arg Glu Met Tyr Leu Thr
210 215 220
Leu Gly Thr Phe Thr Asp Thr Ala Pro Tyr Val Ser Asp Tyr Thr Gly
225 230 235 240
Gln His Ile Tyr Tyr Arg Ser Ile Gln Gln Arg Ser Ile Asp Phe Leu
245 250 255
Thr Ile Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Trp Asp Thr Asp Trp Phe Trp Cys
260 265 270
Ser Arg Ala Leu Gly Val Gln Asn Pro Leu Ile Arg Arg Val Trp Pro
275 280 285
Lys Ser Ala Lys Arg Ser Asp Val Tyr Arg Lys Leu Val Ala Tyr Glu
290 295 300
Lys Arg Tyr Gln Phe Lys Ala Arg Ile Asp Arg Trp Thr Gly Lys Pro
305 310 315 320
Pro Arg Glu Asp Val Ile Gln Asp Ile Glu Val Pro Ala Glu Arg Leu
325 330 335
Pro Glu Phe Leu Glu Phe Phe His Asp Lys Ile Gly Met Ser Pro Val
340 345 350
Trp Leu Cys Pro Leu Arg Ala Arg His Arg Trp Pro Leu Tyr Pro Leu
355 360 365
Lys Pro Gly Val Thr Tyr Val Asn Ala Gly Phe Trp Gly Thr Val Pro
370 375 380
Leu Gln Pro Gly Gln Met Pro Glu Tyr His Asn Arg Leu Ile Glu Arg
385 390 395 400
Lys Val Ala Gln Leu Asp Gly His Lys Ser Leu Tyr Ser Thr Ala Phe
405 410 415
Tyr Ser Arg Glu Glu Phe Trp Arg His Tyr Asp Gly Glu Thr Tyr Arg
420 425 430
Arg Leu Lys Asp Thr Tyr Asp Pro Asp Ala Arg Leu Leu Asp Leu Tyr
435 440 445
Asp Lys Cys Val Arg Gly Arg
450 455
<210> 75
<211> 1263
<212> DNA
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 75
atgacgctgg ccaaggtctt cgaggagctg gtcggggcgg acgcccctgt ggagctcacc 60
gcctacgacg gatcgagagc cggacgcctg ggcagtgatc tgcgggtcca cgtgaagtcg 120
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ggccgcacct cctggttccg gcacaccaag cggcgggacg ccaaggccat ctcccaccac 420
tacgacgtgt ccaacacctt ctatgagtgg gtgctgggcc cgtcgatgac ctacacctgc 480
gcctgtttcc ccaccgagga cgccaccttg gaggaggcgc agttccacaa gcacgacctg 540
gtcgccaaga agctcgggct gcggccgggc atgcggctgc tggacgtggg ctgcggctgg 600
ggcggcatgg tgatgcacgc cgccaagcac tacggggtgc gggcgctggg cgtcacgctg 660
tccaagcagc aggccgagtg ggcgcagaag gccatcgccg aggcgggcct gagcgacctg 720
gccgaggtcc gccaccagga ctaccgggac gtcaccgagg gcgacttcga cgccatcagc 780
tcgatcggcc tcaccgagca catcggcaag gccaacctgc cgtcctactt cggcttcctg 840
tacggcaagc tcaagccggg cgggcggctg ctcaaccact gcatcacccg gcccgacaac 900
acccagccgg ccatgaagaa ggacgggttc atcaaccggt acgtcttccc cgacggggag 960
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tga 1263
<210> 76
<211> 420
<212> PRT
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 76
Met Thr Leu Ala Lys Val Phe Glu Glu Leu Val Gly Ala Asp Ala Pro
1 5 10 15
Val Glu Leu Thr Ala Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Gly Arg Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Leu Arg Val His Val Lys Ser Pro Tyr Ala Val Ser Tyr Leu Val
35 40 45
His Ser Pro Ser Ala Leu Gly Leu Ala Arg Ala Tyr Val Ala Gly His
50 55 60
Leu Asp Ala Tyr Gly Asp Met Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Met Thr Gln
65 70 75 80
Leu Thr Glu Ala Leu Thr Pro Lys Ala Arg Leu Arg Leu Leu Ala Gly
85 90 95
Val Leu Gln Asp Pro Leu Leu Arg Ala Ala Ala Ser Arg Arg Leu Pro
100 105 110
Pro Pro Pro Gln Glu Val Arg Thr Gly Arg Thr Ser Trp Phe Arg His
115 120 125
Thr Lys Arg Arg Asp Ala Lys Ala Ile Ser His His Tyr Asp Val Ser
130 135 140
Asn Thr Phe Tyr Glu Trp Val Leu Gly Pro Ser Met Thr Tyr Thr Cys
145 150 155 160
Ala Cys Phe Pro Thr Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Ala Gln Phe His
165 170 175
Lys His Asp Leu Val Ala Lys Lys Leu Gly Leu Arg Pro Gly Met Arg
180 185 190
Leu Leu Asp Val Gly Cys Gly Trp Gly Gly Met Val Met His Ala Ala
195 200 205
Lys His Tyr Gly Val Arg Ala Leu Gly Val Thr Leu Ser Lys Gln Gln
210 215 220
Ala Glu Trp Ala Gln Lys Ala Ile Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Ala Glu Val Arg His Gln Asp Tyr Arg Asp Val Thr Glu Gly Asp Phe
245 250 255
Asp Ala Ile Ser Ser Ile Gly Leu Thr Glu His Ile Gly Lys Ala Asn
260 265 270
Leu Pro Ser Tyr Phe Gly Phe Leu Tyr Gly Lys Leu Lys Pro Gly Gly
275 280 285
Arg Leu Leu Asn His Cys Ile Thr Arg Pro Asp Asn Thr Gln Pro Ala
290 295 300
Met Lys Lys Asp Gly Phe Ile Asn Arg Tyr Val Phe Pro Asp Gly Glu
305 310 315 320
Leu Glu Gly Pro Gly Tyr Leu Gln Thr Gln Met Asn Asp Ala Gly Phe
325 330 335
Glu Ile Arg His Gln Glu Asn Leu Arg Glu His Tyr Ala Arg Thr Leu
340 345 350
Ala Gly Trp Cys Arg Asn Leu Asp Glu His Trp Asp Glu Ala Val Ala
355 360 365
Glu Val Gly Glu Gly Thr Ala Arg Val Trp Arg Leu Tyr Met Ala Gly
370 375 380
Ser Arg Leu Gly Phe Glu Leu Asn Trp Ile Gln Leu His Gln Ile Leu
385 390 395 400
Gly Val Lys Leu Gly Glu Arg Gly Glu Ser Arg Met Pro Leu Arg Pro
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Asp Trp Gly Val
420
<210> 77
<211> 7102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 77
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cgcacaggct gcccatgccg ccggcgtctc gcgtcttctg gccagctacc gggcgatccc 180
gcccagcgcg acagtgcgcc ttgcgaaacc gacgtccaac ctgttccgcg cccgcgcccg 240
caccaatgtg aagggtctcg acgtctcggg cctgaccggt gtgatcggtg tcgacccgga 300
cgcgcgcacc gccgatgtgg cgggcatgtg cacctacgag gacctggtgg cggccacgct 360
tccgtacggc cttgccccac tggtggtgcc gcagctcaag accatcacgc tcggtggcgc 420
ggtcaccggt ctgggcatcg agtccacgtc gttccgcaac ggtctgccgc acgaaagtgt 480
cctggagatg gacatcttga ccggttcggg cgagatcgtc acggcctcac cggatcagca 540
ctcggatctg ttccatgcgt tccccaattc atatggaacc cttggttatt ccacccggct 600
gcgcatcgaa ctggagcccg tgcacccgtt tgtggcgttg cgccacctgc gctttcactc 660
gatcaccgat ctggtcgcgg cgatggaccg gatcatcgag accggcgggc tggacggtga 720
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<211> 10766
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 78
ttatcgatga taagctgtca aagatgagaa ttaattccac ggactataga ctatactaga 60
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cttctctata ttcattcttg aattaaacac acatcaacaa tgaccacctt caaagaaaga 6360
gaaacttcta ccgctgatag aaagttgacc ttggctgaaa ttttggaaat tttcgctgct 6420
ggtaaagaac cattgaagtt cactgcttat gatggttctt ctgctggtcc tgaagatgct 6480
actatgggtt tggatttgaa aactccaaga ggtactactt acttggctac tgctccaggt 6540
gatttgggtt tggctagagc ttatgtttct ggtgacttgg aaccacatgg tgttcatcct 6600
ggtgatccat atccattatt gagagcttta gccgaaagaa tggaattcaa aagaccacca 6660
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ccaccaccac aagaagcttt gccaagatgg agaagaatta tggaaggttt gagacactct 6780
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catggtgtaa aagctttggg tgttactttg tctagagaac aagctacttg ggctcaaaaa 7080
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gatagatacg ttttcccaga tggtgaattg actggttccg gtagaattat tactgaagca 7380
caagatgtcg gtttggaagt tatccatgaa gaaaacttga gaaaccatta cgccatgact 7440
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ttgccaactg ctaaagtttg gggtttgtat atggctggtt ctagattagg ttttgaaact 7560
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aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 8760
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 8820
gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 8880
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ggtaataact gatataatta aattgaagct ctaatttgtg agtttagtat acatgcattt 9780
acttataata cagtttttta gttttgctgg ccgcatcttc tcaaatatgc ttcccagcct 9840
gcttttctgt aacgttcacc ctctacctta gcatcccttc cctttgcaaa tagtcctctt 9900
ccaacaataa taatgtcaga tcctgtagag accacatcat ccacggttct atactgttga 9960
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ccttcatctc ttccacccat gtctctttga gcaataaagc cgataacaaa atctttgtcg 10080
ctcttcgcaa tgtcaacagt acccttagta tattctccag tagctaggga gcccttgcat 10140
gacaattctg ctaacatcaa aaggcctcta ggttcctttg ttacttcttc cgccgcctgc 10200
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ggatgagtag cagcacgttc cttatatgta gctttcgaca tgatttatct tcgtttcctg 10620
caggtttttg ttctgtgcag ttgggttaag aatactgggc aatttcatgt ttcttcaaca 10680
ccacatatgc gtatatatac caatctaagt ctgtgctcct tccttcgttc ttccttctgc 10740
tcggagatta ccgaatcaaa gctagc 10766
<210> 79
<211> 10970
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 79
ttatcgatga taagctgtca aagatgagaa ttaattccac ggactataga ctatactaga 60
tactccgtct actgtacgat acacttccgc tcaggtcctt gtcctttaac gaggccttac 120
cactcttttg ttactctatt gatccagctc agcaaaggca gtgtgatcta agattctatc 180
ttcgcgatgt agtaaaacta gctagaccga gaaagagact agaaatgcaa aaggcacttc 240
tacaatggct gccatcatta ttatccgatg tgacgctgca gcttctcaat gatattcgaa 300
tacgctttga ggagatacag cctaatatcc gacaaactgt tttacagatt tacgatcgta 360
cttgttaccc atcattgaat tttgaacatc cgaacctggg agttttccct gaaacagata 420
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tttcggttcc tggagaaact attgcatcta ttgcataggt aatcttgcac gtcgcatccc 540
cggttcattt tctgcgtttc catcttgcac ttcaatagca tatctttgtt aacgaagcat 600
ctgtgcttca ttttgtagaa caaaaatgca acgcgagagc gctaattttt caaacaaaga 660
atctgagctg catttttaca gaacagaaat gcaacgcgaa agcgctattt taccaacgaa 720
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aacaaagaat ctgagctgca tttttacaga acagaaatgc aacgcgagag cgctatttta 840
ccaacaaaga atctatactt cttttttgtt ctacaaaaat gcatcccgag agcgctattt 900
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ttgataactt tttgcactgt aggtccgtta aggttagaag aaggctactt tggtgtctat 1020
tttctcttcc ataaaaaaag cctgactcca cttcccgcgt ttactgatta ctagcgaagc 1080
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gcgcatactt tgtgaacaga aagtgatagc gttgatgatt cttcattggt cagaaaatta 1200
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caaatgggtt gagggggtga ttgatgtcac tggtacacca acaggggaat gctcggcgtt 1860
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caccaaggtt ttccctgacg atgagtcgga cgatgagtct gacgctggag aggacggcga 2580
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cccccttctc cccacatatc aaacctcccc cggttcccac acttgccgtt aagggcgtag 3360
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ggactttagc caagggtata aaagaccacc gtccccgaat tacctttcct cttcttttct 3540
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attcaaaatg aagttctcta tgccatcttg gggtgttgtt ttttacgctt tgttggtttg 3660
tttgttgcca ttcttgtcta aggctggtgt tcaagctatg tccgttgtta ccaccgatgc 3720
tcaagctgct catgctgctg gtgtttctag attattggct tcttatagag ccattccacc 3780
atctgctact gttagattgg ctaagccaac ttctaatttg ttcagagcta gagctagaac 3840
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tagaactgct gatgttgctg gtatgtgtac ttacgaagat ttggttgctg ctactttgcc 3960
atatggtttg gctccattgg ttgttccaca attgaaaact attactttgg gtggtgctgt 4020
taccggtttg ggtattgaat ctacttcttt cagaaacggt ttgccacacg aatctgtttt 4080
ggaaatggat attttgaccg gttccggtga aatagttact gcttctccag atcaacactc 4140
cgatttgttt catgcttttc caaactctta cggtacattg ggttactcta ccagattgag 4200
aattgaattg gaaccagttc atccattcgt tgccttgaga catttgagat tccattccat 4260
tactgatttg gtcgcagcca tggatagaat tattgaaact ggtggtttag acggtgaacc 4320
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catccaacat gatggtgata ctggtgctga aaaacatgat agattgacca tccatgacta 4500
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tctcgtcaag atggtaggat gatgggggaa tacattactg ctctcgtcaa ggaaaccaca 5460
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<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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<212> DNA
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<210> 92
<211> 7123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 92
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caccgcttta gccgcaaccc gttctacaca ggcaaagccc ctaccgctta tcgttggtat 960
aggcagcaca accgggtgat gcgccttgga gacttgataa agcaggtaag ggatatggca 1020
ggacacgacc agttcaaccc caccccacgc cagcaattca gctctggccg cgaacttatc 1080
aacgcggtca agacccgccg tgaagaagcc caagcattca aagcactcgc ccaggacgta 1140
gacgcggaaa tcgccggtgg tctcgaccag tatgacccgg aacttatcga cggtgtgcgt 1200
gtgctctgga ttgtccaagg aaccgcagca cgcgacgaaa cagcctttag acatgcgctt 1260
aagactggcc accgcttgcg ccagcaaggc caacgcctga cagacgcagc aatcatcgac 1320
gcctatgagc acgcctacaa cgtcgcacac acccacggcg gtgcaggccg cgacaacgag 1380
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tccaagagcg agacctacag cggctctaac gcaccaggta aagccaccag cagcgagcgg 1500
aaagccttgg ccacgatggg acgcagaggc ggacaaaaag ccgcacaacg ctggaaaaca 1560
gaccccgagg gcaaatatgc gcaagcacaa aggtcgaagc ttgaaaagac gcaccgtaag 1620
aaaaaggctc aaggacgatc tacgaagtcc cgtattagcc aaatggtgaa cgatcagtat 1680
ttccagacag ggacagttcc cacgtgggct gaaatagggg cagaggtagg agtctctcgc 1740
gccacggttg ctaggcatgt cgcggagcta aagaagagcg gtgactatcc ggacgtttaa 1800
ggggtctcat accgtaagca atatacggtt cccctgccgt taggcagtta gataaaacct 1860
cacttgaaga aaaccttgag gggcagggca gcttatatgc ttcaaagcat gacttcctct 1920
gttctcctag acctcgcaac cctccgccat aacctcaccc tgctctgcga ggctggccgg 1980
ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccgcggccgg 2040
gaagccgatc tcggcttgaa cgaattgtta ggtggcggta cttgggtcga tatcaaagtg 2100
catcacttct tcccgtatgc ccaactttgt atagagagcc actgcgggat cgtcaccgta 2160
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cctggagatg gacatcttga ccggttcggg cgagatcgtc acggcctcac cggatcagca 3300
ctcggatctg ttccatgcgt tccccaattc atatggaacc cttggttatt ccacccggct 3360
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cttcaagacg aaaacgccgg ggccggtcag cgattacaca ggtcagcaga tcttctaccg 3600
gtcgatccag catgacggcg acaccggcgc cgagaaacac gaccggctga ccatccacga 3660
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cgtcaacatc ggtttctggt catcagtgcc ggtgggcccc gaggagggcc acaccaaccg 4080
cctcatcgag aaaaaagtcg cggagctgga cgggcacaaa tctttgtact cggacgctta 4140
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tgtttacatt ttcgtattgt tttcgattca ctctatgaat agttcttact acaatttttt 9720
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gttcaaggag cgaaaggtgg atgggta 9807
<210> 94
<211> 10293
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 94
gtttgtggaa gcggtattcg caatttaatt aacgcttacc ttggccgtta gacatcatgg 60
taaatctgcg cagacagccc tgtgcagctg aaacgcggtt acgtatagct tgccatatgt 120
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cgccgcctct acgtcaactt cgggttttgg ggcctcgttc cgatccgtcc cggtggaggc 4020
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<211> 5654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
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tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 2880
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 2940
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 3000
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 3060
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 3120
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 3180
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 3240
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 3300
aaaataaaca gcgatcgcgc ggccgcgggt aataactgat ataattaaat tgaagctcta 3360
atttgtgagt ttagtataca tgcatttact tataatacag ttttttagtt ttgctggccg 3420
catcttctca aatatgcttc ccagcctgct tttctgtaac gttcaccctc taccttagca 3480
tcccttccct ttgcaaatag tcctcttcca acaataataa tgtcagatcc tgtagagacc 3540
acatcatcca cggttctata ctgttgaccc aatgcgtctc ccttgtcatc taaacccaca 3600
ccgggtgtca taatcaacca atcgtaacct tcatctcttc cacccatgtc tctttgagca 3660
ataaagccga taacaaaatc tttgtcgctc ttcgcaatgt caacagtacc cttagtatat 3720
tctccagtag ctagggagcc cttgcatgac aattctgcta acatcaaaag gcctctaggt 3780
tcctttgtta cttcttccgc cgcctgcttc aaaccgctaa caatacctgg gcccaccaca 3840
ccgtgtgcat tcgtaatgtc tgcccattct gctattctgt atacacccgc agagtactgc 3900
aatttgactg tattaccaat gtcagcaaat tttctgtctt cgaagagtaa aaaattgtac 3960
ttggcggata atgcctttag cggcttaact gtgccctcca tggaaaaatc agtcaagata 4020
tccacatgtg tttttagtaa acaaattttg ggacctaatg cttcaactaa ctccagtaat 4080
tccttggtgg tacgaacatc caatgaagca cacaagtttg tttgcttttc gtgcatgata 4140
ttaaatagct tggcagcaac aggactagga tgagtagcag cacgttcctt atatgtagct 4200
ttcgacatga tttatcttcg tttcctgcag gtttttgttc tgtgcagttg ggttaagaat 4260
actgggcaat ttcatgtttc ttcaacacca catatgcgta tatataccaa tctaagtctg 4320
tgctccttcc ttcgttcttc cttctgctcg gagattaccg aatcaaagct agcttatcga 4380
tgataagctg tcaaagatga gaattaattc cacggactat agactatact agatactccg 4440
tctactgtac gatacacttc cgctcaggtc cttgtccttt aacgaggcct taccactctt 4500
ttgttactct attgatccag ctcagcaaag gcagtgtgat ctaagattct atcttcgcga 4560
tgtagtaaaa ctagctagac cgagaaagag actagaaatg caaaaggcac ttctacaatg 4620
gctgccatca ttattatccg atgtgacgct gcagcttctc aatgatattc gaatacgctt 4680
tgaggagata cagcctaata tccgacaaac tgttttacag atttacgatc gtacttgtta 4740
cccatcattg aattttgaac atccgaacct gggagttttc cctgaaacag atagtatatt 4800
tgaacctgta taataatata tagtctagcg ctttacggaa gacaatgtat gtatttcggt 4860
tcctggagaa actattgcat ctattgcata ggtaatcttg cacgtcgcat ccccggttca 4920
ttttctgcgt ttccatcttg cacttcaata gcatatcttt gttaacgaag catctgtgct 4980
tcattttgta gaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag 5040
ctgcattttt acagaacaga aatgcaacgc gaaagcgcta ttttaccaac gaagaatctg 5100
tgcttcattt ttgtaaaaca aaaatgcaac gcgacgagag cgctaatttt tcaaacaaag 5160
aatctgagct gcatttttac agaacagaaa tgcaacgcga gagcgctatt ttaccaacaa 5220
agaatctata cttctttttt gttctacaaa aatgcatccc gagagcgcta tttttctaac 5280
aaagcatctt agattacttt ttttctcctt tgtgcgctct ataatgcagt ctcttgataa 5340
ctttttgcac tgtaggtccg ttaaggttag aagaaggcta ctttggtgtc tattttctct 5400
tccataaaaa aagcctgact ccacttcccg cgtttactga ttactagcga agctgcgggt 5460
gcattttttc aagataaagg catccccgat tatattctat accgatgtgg attgcgcata 5520
ctttgtgaac agaaagtgat agcgttgatg attcttcatt ggtcagaaaa ttatgaacgg 5580
tttcttctat tttgtctcta tatactacgt ataggaaatg tttacatttt cgtattgttt 5640
tcgattcact ctatgaatag ttcttactac aatttttttg tctaaagagt aatactagag 5700
ataaacataa aaaatgtaga ggtcgagttt agatgcaagt tcaaggagcg aaaggtgga 5759
<210> 97
<211> 2664
<212> DNA
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 97
atgtcacagc tggcggtcac agaccaccac gagcgagcgg tcgaggcgct gcgcaggtcg 60
tatgcggcga tcccgccggg cacaccggtc cgcttggcca agcagacctc caacctgttc 120
cgcttccgcg agccgacggc cgcgcccggc ctggacgtgt ccggcttcaa ccgggtgctg 180
gcggtggacc cggatgcgcg caccgccgac gtgcagggca tgaccaccta cgaggacctg 240
gtcgacgcca ccctgccgca cgggctgatg ccgctggtgg tgccccagct caagacgatc 300
acgctgggcg gggcggtgac cggcctgggc atcgagtcca cctccttccg caacggcctg 360
ccgcacgagt cggtgctgga gatgcagatc atcaccggcg ccggcgaagt ggtcaccgcc 420
accccggacg gggagcactc cgacctgttc tggggcttcc ccaactccta cgggacgctg 480
gggtacgccc tgaagctgaa gatcgaactg gagccggtca agccgtacgt ccggctgcgg 540
cacctgcgct tcgacgacgc cggcgagtgc gccgccaagc tcgccgagct gagcgaaagc 600
cgcgagcacg agggcgatga ggtgcacttt ttggacggca ccttcttcgg gccgcgcgag 660
atgtacctga cgctcggcac gttcaccgac accgccccct atgtgtcgga ctacaccggg 720
cagcacatct actaccggtc gatccagcag cggtcgatcg actttttgac catccgcgac 780
tacctgtggc gctgggacac cgactggttc tggtgctcgc gcgccctggg cgtgcagaac 840
ccgctgatcc ggcgggtgtg gccgaagagc gccaagcggt cggatgtgta ccgcaagctg 900
gtggcctacg aaaagcgcta ccagttcaag gcgcgcatcg accggtggac gggcaagccg 960
ccgcgcgagg acgtcatcca ggacatcgag gtgccggcag aacgcctgcc ggagttcctg 1020
gagttcttcc acgacaagat cgggatgagc ccggtgtggc tgtgcccgct gcgggcgcgc 1080
caccgctggc cgctgtaccc gctcaagccc ggcgtcacct acgtcaacgc cggcttctgg 1140
gggacggtgc cgctgcagcc ggggcagatg cccgagtacc acaaccggct gatcgaacgg 1200
aaggtcgccc aactggacgg ccacaagtct ctgtactcga cggcgttcta ctcgcgtgag 1260
gagttctggc ggcactacga cggggaaacc taccggcgtc tgaaggacac ctacgacccc 1320
gacgcgcgcc tgctcgacct ctacgacaag tgcgtgcggg gacgcgctgg tggtgccgag 1380
ggtggcaatg gcggtggcgc catgacgctg gccaaggtct tcgaggagct ggtcggggcg 1440
gacgcccctg tggagctcac cgcctacgac ggatcgagag ccggacgcct gggcagtgat 1500
ctgcgggtcc acgtgaagtc gccgtacgcg gtgtcctacc tggtgcactc gccgagcgcg 1560
ctcgggctgg cccgcgcgta cgtggccggg cacctggacg cctacggcga catgtacacg 1620
ctgctgcggg agatgacgca gctgaccgag gcgctgacgc ccaaggcccg gctgcggctg 1680
ctggccggtg tcctgcagga tccgctgctg cgcgcggcgg ccagccgccg tctgccgccc 1740
ccgccgcagg aggtgcggac cggccgcacc tcctggttcc ggcacaccaa gcggcgggac 1800
gccaaggcca tctcccacca ctacgacgtg tccaacacct tctatgagtg ggtgctgggc 1860
ccgtcgatga cctacacctg cgcctgtttc cccaccgagg acgccacctt ggaggaggcg 1920
cagttccaca agcacgacct ggtcgccaag aagctcgggc tgcggccggg catgcggctg 1980
ctggacgtgg gctgcggctg gggcggcatg gtgatgcacg ccgccaagca ctacggggtg 2040
cgggcgctgg gcgtcacgct gtccaagcag caggccgagt gggcgcagaa ggccatcgcc 2100
gaggcgggcc tgagcgacct ggccgaggtc cgccaccagg actaccggga cgtcaccgag 2160
ggcgacttcg acgccatcag ctcgatcggc ctcaccgagc acatcggcaa ggccaacctg 2220
ccgtcctact tcggcttcct gtacggcaag ctcaagccgg gcgggcggct gctcaaccac 2280
tgcatcaccc ggcccgacaa cacccagccg gccatgaaga aggacgggtt catcaaccgg 2340
tacgtcttcc ccgacgggga gctggagggg cccggctacc tgcagaccca gatgaacgac 2400
gccggttttg agatccgcca ccaggagaac ctgcgcgagc actacgcccg caccctggcc 2460
ggatggtgcc gcaacctcga tgagcactgg gacgaggcgg tggccgaggt cggcgagggc 2520
accgcgcggg tgtggcggct gtacatggcc ggcagccggc tcggtttcga gctcaactgg 2580
atccagctgc accagatcct gggcgtcaag ctcggcgagc gcggcgagtc ccgcatgccg 2640
ttgcggcccg actggggcgt gtga 2664
<210> 98
<211> 2664
<212> DNA
<213> 弯曲嗜热单胞菌
<400> 98
atgacgctgg ccaaggtctt cgaggagctg gtcggggcgg acgcccctgt ggagctcacc 60
gcctacgacg gatcgagagc cggacgcctg ggcagtgatc tgcgggtcca cgtgaagtcg 120
ccgtacgcgg tgtcctacct ggtgcactcg ccgagcgcgc tcgggctggc ccgcgcgtac 180
gtggccgggc acctggacgc ctacggcgac atgtacacgc tgctgcggga gatgacgcag 240
ctgaccgagg cgctgacgcc caaggcccgg ctgcggctgc tggccggtgt cctgcaggat 300
ccgctgctgc gcgcggcggc cagccgccgt ctgccgcccc cgccgcagga ggtgcggacc 360
ggccgcacct cctggttccg gcacaccaag cggcgggacg ccaaggccat ctcccaccac 420
tacgacgtgt ccaacacctt ctatgagtgg gtgctgggcc cgtcgatgac ctacacctgc 480
gcctgtttcc ccaccgagga cgccaccttg gaggaggcgc agttccacaa gcacgacctg 540
gtcgccaaga agctcgggct gcggccgggc atgcggctgc tggacgtggg ctgcggctgg 600
ggcggcatgg tgatgcacgc cgccaagcac tacggggtgc gggcgctggg cgtcacgctg 660
tccaagcagc aggccgagtg ggcgcagaag gccatcgccg aggcgggcct gagcgacctg 720
gccgaggtcc gccaccagga ctaccgggac gtcaccgagg gcgacttcga cgccatcagc 780
tcgatcggcc tcaccgagca catcggcaag gccaacctgc cgtcctactt cggcttcctg 840
tacggcaagc tcaagccggg cgggcggctg ctcaaccact gcatcacccg gcccgacaac 900
acccagccgg ccatgaagaa ggacgggttc atcaaccggt acgtcttccc cgacggggag 960
ctggaggggc ccggctacct gcagacccag atgaacgacg ccggttttga gatccgccac 1020
caggagaacc tgcgcgagca ctacgcccgc accctggccg gatggtgccg caacctcgat 1080
gagcactggg acgaggcggt ggccgaggtc ggcgagggca ccgcgcgggt gtggcggctg 1140
tacatggccg gcagccggct cggtttcgag ctcaactgga tccagctgca ccagatcctg 1200
ggcgtcaagc tcggcgagcg cggcgagtcc cgcatgccgt tgcggcccga ctggggcgtg 1260
gctggtggtg ccgagggtgg caatggcggt ggcgccatgt cacagctggc ggtcacagac 1320
caccacgagc gagcggtcga ggcgctgcgc aggtcgtatg cggcgatccc gccgggcaca 1380
ccggtccgct tggccaagca gacctccaac ctgttccgct tccgcgagcc gacggccgcg 1440
cccggcctgg acgtgtccgg cttcaaccgg gtgctggcgg tggacccgga tgcgcgcacc 1500
gccgacgtgc agggcatgac cacctacgag gacctggtcg acgccaccct gccgcacggg 1560
ctgatgccgc tggtggtgcc ccagctcaag acgatcacgc tgggcggggc ggtgaccggc 1620
ctgggcatcg agtccacctc cttccgcaac ggcctgccgc acgagtcggt gctggagatg 1680
cagatcatca ccggcgccgg cgaagtggtc accgccaccc cggacgggga gcactccgac 1740
ctgttctggg gcttccccaa ctcctacggg acgctggggt acgccctgaa gctgaagatc 1800
gaactggagc cggtcaagcc gtacgtccgg ctgcggcacc tgcgcttcga cgacgccggc 1860
gagtgcgccg ccaagctcgc cgagctgagc gaaagccgcg agcacgaggg cgatgaggtg 1920
cactttttgg acggcacctt cttcgggccg cgcgagatgt acctgacgct cggcacgttc 1980
accgacaccg ccccctatgt gtcggactac accgggcagc acatctacta ccggtcgatc 2040
cagcagcggt cgatcgactt tttgaccatc cgcgactacc tgtggcgctg ggacaccgac 2100
tggttctggt gctcgcgcgc cctgggcgtg cagaacccgc tgatccggcg ggtgtggccg 2160
aagagcgcca agcggtcgga tgtgtaccgc aagctggtgg cctacgaaaa gcgctaccag 2220
ttcaaggcgc gcatcgaccg gtggacgggc aagccgccgc gcgaggacgt catccaggac 2280
atcgaggtgc cggcagaacg cctgccggag ttcctggagt tcttccacga caagatcggg 2340
atgagcccgg tgtggctgtg cccgctgcgg gcgcgccacc gctggccgct gtacccgctc 2400
aagcccggcg tcacctacgt caacgccggc ttctggggga cggtgccgct gcagccgggg 2460
cagatgcccg agtaccacaa ccggctgatc gaacggaagg tcgcccaact ggacggccac 2520
aagtctctgt actcgacggc gttctactcg cgtgaggagt tctggcggca ctacgacggg 2580
gaaacctacc ggcgtctgaa ggacacctac gaccccgacg cgcgcctgct cgacctctac 2640
gacaagtgcg tgcggggacg ctga 2664
Claims (49)
1.一种细胞，其包括重组甲基转移酶基因和支化(甲基)脂质，其中：
所述支化(甲基)脂质是羧酸、羧酸酯、酯、硫酯或酰胺；并且
所述支化(甲基)脂质包括包含支化甲基的饱和或不饱和支化脂肪族链。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述支化(甲基)脂质包括具有14-20个碳的链长度和在Δ9、Δ10或Δ11位置的甲基分支的线性脂质。
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述支化(甲基)脂质是二酰甘油、三酰甘油或磷脂，并且所述二酰甘油、三酰甘油或磷脂包括10-甲基硬脂酸酯的酯。
4.一种细胞，其包括重组甲基转移酶基因和环外亚甲基取代的脂质，其中：
所述环外亚甲基取代的脂质是羧酸、羧酸酯、酯、硫酯或酰胺；
所述环外亚甲基取代的脂质包括支化脂肪族链；并且
所述脂肪族链是支化的是因为所述脂肪族链经环外亚甲基取代。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述环外亚甲基取代的脂质包括具有14-20个碳的链长度和在Δ9、Δ10或Δ11位置的亚甲基部分的线性脂质。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述环外亚甲基取代的脂质是二酰甘油、三酰甘油或磷脂，并且所述二酰甘油、三酰甘油或磷脂包括10-亚甲基硬脂酸酯的酯。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的细胞，其中所述细胞的以重量计至少约1％的脂肪酸是一种或多种具有14-20个碳的链长度和在Δ9、Δ10或Δ11位置的甲基分支的线性脂肪酸。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的细胞，其中如通过细胞干重％所测量，所述细胞包括至少约1％脂质。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的细胞，其中所述重组甲基转移酶基因编码来自放线菌的革兰氏阳性物种的甲基转移酶蛋白质。
10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述放线菌的革兰氏阳性物种是分枝杆菌属(Mycobacteria)、棒杆菌属(Corynebacteria)、诺卡尔菌属(Nocardia)、链霉菌属(Streptomyces)或红球菌属(Rhodococcus)。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的细胞，其中所述重组甲基转移酶基因编码选自以下的甲基转移酶蛋白质：耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)酶tmsB、苏别蒂山农霉菌(Agromyces subbeticus)酶tmsB、浅黄拟无枝酸球菌(Amycolicicoccus subflavus)酶tmsB、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)酶tmsB、甘氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glyciniphilium)酶tmsB、气生诺尔氏菌(Knoella aerolata)酶tmsB、南非分枝杆菌(Mycobacterium austroafricanum)酶tmsB、淡黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)酶tmsB、普拉尼亚分枝杆菌(Mycobacterium indicus pranii)酶tmsB、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)酶tmsB、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)酶tmsB、范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)酶tmsB、浑浊红球菌(Rhodococcusopacus)酶tmsB、拉格西斯链霉菌(Streptomyces regnsis)酶tmsB、嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)酶tmsB和弯曲嗜热单胞菌(Thermomonospora curvata)酶tmsB。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的细胞，其进一步包括重组还原酶基因。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述重组还原酶基因编码选自以下的还原酶蛋白质：耻垢分枝杆菌酶tmsA、苏别蒂山农霉菌酶tmsA、浅黄拟无枝酸球菌酶tmsA、谷氨酸棒状杆菌酶tmsA、甘氨酸棒状杆菌酶tmsA、气生诺尔氏菌酶tmsA、南非分枝杆菌酶tmsA、淡黄分枝杆菌酶tmsA、普拉尼亚分枝杆菌酶tmsA、草分枝杆菌酶tmsA、结核分枝杆菌酶tmsA、范巴伦氏分枝杆菌酶tmsA、浑浊红球菌酶tmsA、拉格西斯链霉菌酶tmsA、嗜热子囊菌酶tmsA和弯曲嗜热单胞菌酶tmsA。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的细胞，其中：
所述重组甲基转移酶基因针对所述细胞经密码子优化；或
所述细胞进一步包括重组还原酶基因并且所述重组还原酶基因针对所述细胞经密码子优化。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的细胞，其中：
所述重组甲基转移酶基因操作性连接到能在所述细胞中驱动所述重组甲基转移酶基因转录的启动子；或
所述细胞进一步包括重组还原酶基因并且所述重组还原酶基因操作性连接到能在所述细胞中驱动所述重组还原酶基因转录的启动子。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中：
所述细胞是酵母物种并且所述启动子是酵母启动子；
所述细胞是细菌物种并且所述启动子是细菌启动子；
所述细胞是藻类物种并且所述启动子是藻类启动子；或
所述细胞是植物物种并且所述启动子是植物启动子。
17.根据权利要求15或16所述的细胞，其中所述启动子是组成型启动子。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母组成的组。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是酵母、真菌或酵母样藻类。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：阿氏酵母属(Arxula)、曲霉属(Aspegillus)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)、念珠菌属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地丝菌属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、柯达酵母属(Kodamaea)、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、欧格酵母属(Ogataea)、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉菌属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、毛孢子菌属(Trichosporon)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillusorzyae)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、紫麦角菌(Claviceps purpurea)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、拉米隐球菌(Cryptococcus ramirezgomezianus)、土生隐球菌(Cryptococcus terreus)、威氏隐球菌(Cryptococcus wieringae)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、山茶小克银汉霉(Cunninghamella japonica)、发酵地霉酵母(Geotrichum fermentans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、克雷氏白冬孢酵母(Leucosporidiella creatinivora)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、多形欧格酵母(Ogataeapolymorpha)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichiastipites)、饶氏原壁菌(Prototheca zopfii)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、贝吉维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、沼泽生红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、恩氏银耳(Tremella enchepala)、皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、威克汉姆西弗酵母(Wickerhamomyces ciferrii)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：腺嘌呤阿氏酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的细胞，其中所述细胞包括由所述重组甲基转移酶基因编码的甲基转移酶蛋白质，并且所述甲基转移酶蛋白质包括以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的细胞，其中所述重组甲基转移酶基因包括以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:81中所示核苷酸序列具有至少约95％序列同一性的核苷酸序列；或
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:81中所示的核苷酸序列。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的细胞，其中所述细胞包括由重组还原酶基因编码的还原酶蛋白质，并且所述还原酶蛋白质包括以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示的序列。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的细胞，其中所述细胞包括重组还原酶基因，并且所述重组还原酶基因包括以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所示核苷酸序列具有至少约95％序列同一性的核苷酸序列；或
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:80中所示的核苷酸序列。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的细胞，其中与所述细胞为相同物种的未经修饰的细胞不包括所述支化(甲基)脂质或环外亚甲基取代的脂质。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的细胞，其中所述细胞组成型表达由所述重组甲基转移酶基因编码的蛋白质。
29.一种产生支化(甲基)脂质或环外亚甲基取代的脂质的方法，其包括使根据权利要求1到28中任一项所述的细胞与油酸、甲硫氨酸或油酸和甲硫氨酸二者接触。
30.一种核酸，其包括重组甲基转移酶基因和操作性连接到所述重组甲基转移酶基因的组成型启动子，其中所述启动子是真核启动子，并且所述重组甲基转移酶基因编码以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列。
31.根据权利要求30所述的核酸，其中：
所述重组甲基转移酶基因编码来自放线菌的革兰氏阳性物种的蛋白质；并且
所述重组甲基转移酶基因针对在酵母、藻类或植物中的表达经密码子优化。
32.根据权利要求30或31所述的核酸，其进一步包括重组还原酶基因，其中所述重组还原酶基因编码以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示的序列。
33.一种核酸，其包括重组还原酶基因和操作性连接到所述重组还原酶基因的组成型启动子，其中所述启动子是真核启动子，并且所述重组还原酶基因编码以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:74中所示的序列。
34.根据权利要求33所述的核酸，其中：
所述重组还原酶基因编码来自放线菌的革兰氏阳性物种的蛋白质；并且
所述重组还原酶基因针对在酵母、藻类或植物中的表达经密码子优化。
35.根据权利要求33或34所述的核酸，其进一步包括重组甲基转移酶基因，其中所述重组甲基转移酶基因编码以下两者中的任一项：
与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；或
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的核酸，其中：
所述重组甲基转移酶基因编码来自放线菌的革兰氏阳性物种的蛋白质；并且
所述重组甲基转移酶基因针对在酵母、藻类或植物中的表达经密码子优化。
37.根据权利要求35或36所述的核酸，其中所述重组甲基转移酶基因和所述重组还原酶基因是编码融合蛋白质的单一开放阅读框的一部分。
38.根据权利要求25所述的细胞，其中所述还原酶蛋白质和所述甲基转移酶蛋白质是单一融合蛋白质的一部分。
39.根据权利要求26所述的细胞，其中所述重组还原酶基因和所述重组甲基转移酶基因是编码融合蛋白质的单一开放阅读框的一部分。
40.一种油组合物，其是通过培养包括根据权利要求1到28中任一项所述的细胞的细胞培养物和从所述细胞培养物回收所述油组合物来产生的。
41.根据权利要求40所述的油组合物，其包含具有14-20个碳的链长度和在Δ9、Δ10或Δ11位置的甲基分支的一种或多种脂肪酸。
42.根据权利要求41所述的油组合物，其中所述一种或多种脂肪酸占所述油组合物中总脂肪酸的重量的至少1％。
43.根据权利要求46或47所述的油组合物，其中所述一种或多种脂肪酸占所述组合物中总脂肪酸的重量的至少约15％。
44.一种油组合物，其是通过培养细胞培养物和从所述细胞培养物回收所述油组合物来产生，其中所述油组合物包含10-甲基脂肪酸，并且其中所述10-甲基脂肪酸占所述油组合物中总脂肪酸的重量的至少约1％。
45.根据权利要求49所述的油组合物，其中所述10-甲基脂肪酸占所述油组合物中总脂肪酸的重量的至少约15％。
46.根据权利要求44所述的油组合物，其中所述细胞培养物包括根据权利要求1到28中任一项所述的细胞。
47.一种产生油组合物的方法，所述方法包括：
培养包括根据权利要求1到28中任一项所述的细胞的细胞培养物；
从所述细胞培养物回收所述油组合物。
48.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括使所述细胞培养物与油酸、甲硫氨酸或油酸和甲硫氨酸二者接触。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中从所述细胞培养物回收所述油组合物包括回收已由所述细胞分泌的脂质。
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