KR20210080375A - 암 면역요법을 위한 재조합 폭스바이러스 - Google Patents

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Abstract

본원은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암의 치료, 예방, 및/또는 개선에 관한 방법 및 조성물을 개시한다. 특정 양태에서, 본 기술은 OX40L을 발현하도록 조작된 E3L의 결실을 포함하는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA) 바이러스(MVAΔE3L)(MVAΔE3L-OX40L), OX40L을 발현하도록 조작된 C7L의 결실을 포함하는 MVA 바이러스(MVAΔC7L)(MVAΔC7L-OX40L), OX40L 및 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 발현하도록 조작된 MVAΔC7L(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L), E5R의 결실을 포함하는 MVA(MVAΔE5R), OX40L을 발현하도록 조작된 C7L의 결실을 포함하는 백시니아 바이러스(VACVΔC7L)(VACVΔC7L-OX40L), OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된 VACVΔC7L(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L), E5R의 결실을 포함하는 VACV(VACVΔE5R), M31R의 결실을 포함하는 점액종 바이러스(MYXV)(MYXVΔM31R), 또는 이의 조합을 포함하는 유전적으로 조작된 또는 재조합 폭스바이러스 단독 또는 종양세포붕괴성 및 면역치료제 조성물과 같은 다른 약제와의 조합의 용도에 관한 것이다.

Description

암 면역요법을 위한 재조합 폭스바이러스
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2018년 9월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/731,876호, 2018년 11월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/767,485호, 및 2019년 4월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/828,975호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
연방 기금 연구의 성명서
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 AI073736, AI095692, AR068118, 및 CA008748 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명의 기술은 일반적으로 종양학, 바이러스학, 및 면역요법에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된, E3L의 결실을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(modified vaccinia Ankara)(MVA) 바이러스(MVAΔE3L)(MVAΔE3L-OX40L); OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된, C7L의 결실을 포함하는 재조합 MVA 바이러스(MVAΔC7L)(MVAΔC7L-OX40L); OX40L 및 hFlt3L을 발현하도록 조작된 재조합 MVAΔC7L(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L); C7L의 결실, E5R의 결실을 포함하고, hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L); E5R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE5R); E5R의 결실을 포함하고 hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L); E3L의 결실, E5R의 결실을 포함하고, hFtl3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40L); E5R의 결실, C11R의 결실을 포함하고, hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L-ΔC11R); E3L의 결실, E5R의 결실, C11R의 결실을 포함하고, hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40L-ΔC11R); OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된, C7L의 결실을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACVΔC7L)(VACVΔC7L-OX40L); OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 VACVΔC7L(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L); E5R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVΔE5R); E5R의 결실, 티미딘 키나아제(TK)의 결실을 포함하고, 항-CTLA-4, hFlt3L, 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 VACV(VACV-TK--항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L); B2R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVΔB2R); E3LΔ83N 결실 및 B2R 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVE3LΔ83NΔB2R); E5R 결실 및 B2R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVΔE5RΔB2R); E3LΔ83N 결실, E5R 결실, 및 B2R 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVE3LΔ83NΔE5RΔB2R); E3LΔ83N 결실, 티미딘 키나아제(TK)의 결실, 및 E5R 결실을 포함하고, 항-CTLA-4, hFlt3L, OX40L, 및 IL-12를 발현하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVE3LΔ83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12); E3LΔ83N 결실, 티미딘 키나아제(TK)의 결실, E5R 결실, 및 B2R 결실을 포함하고, 항-CTLA-4, hFlt3L, OX40L, 및 IL-12를 발현하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVE3LΔ83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12-ΔB2R); M31R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV(MYXVΔM31R); M31R의 결실을 포함하고 hFl3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MYXV(MYXVΔM31R-hFlt3L-OX40L); M63R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV(MYXVΔM63R); M64R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV(MYXVΔM64R); WR199의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 MVA(MVAΔWR199); E5R의 결실, WR199의 결실을 포함하고, hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 MVA(MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L-ΔWR199); 또는 이의 조합을 포함하는 폭스바이러스(poxvirus) 단독 또는 면역치료제로서 면역 체크포인트 차단제, 면역조절제, 및/또는 항암 약물 및/또는 종양세포붕괴성 조성물과의 조합의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 기술은 특정 관심 유전자(SG), 예컨대, 비제한적으로, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L을 포함하는 면역조절 단백질 중 임의의 하나 이상을 코딩하는 유전자를 발현하도록 추가로 변형된 상술한 바이러스 중 임의의 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 백본은, 비제한적으로, 티미딘 키나아제(TK), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 및/또는 WR199를 포함하는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 포함하도록 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 기술은 백신 아쥬반트로서 상술한 바이러스 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 암 백신에서 종양 항원에 대한 백신 아쥬반트로서 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L, MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L, MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L, 및 열-불활성화된 MVAΔE5R 단독 또는 암 면역치료제로서 사용하기 위한 면역 체크포인트 차단제(ICB) 항체와의 조합의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 기술은 백신 벡터로서 상술한 바이러스 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 암 백신용 백신 벡터로서 MVAΔE5R 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 기술은
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, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 재조합 폭스바이러스 단독 또는 면역치료제로서 면역 체크포인트 차단제, 면역조절제, 및/또는 항암 약물 및/또는 종양세포붕괴성 조성물과의 조합에 관한 것이다.
배경
다음 내용은 독자의 이해를 돕기 위해 제공된다. 제공된 정보 또는 원용된 참고문헌 중 어느 것도 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다.
흑색종과 같은 악성 종양은 종래 요법 및 현재의 상당한 치료적 도전에 대해 선천적으로 저항성이다. 면역요법은 특정 유형의 암의 치료를 위한 연구의 발달하는 영역이며 선택적 옵션이다. 면역요법 접근법은 면역계가 자극되어, 종양 세포를 확인하고 파괴를 위해 이들을 표적화할 수 있는 근거에 의지한다. 암 세포에 의한 항원의 제시 및 종양 세포에 대해 잠재적으로 반응할 수 있는 면역 세포의 존재에도 불구하고, 많은 경우에 면역계는 활성화되지 않거나 확정적으로 억제되지 않는다. 이 현상에 대한 핵심은 면역계의 다른 세포를 억제하도록 강제하는 면역계의 세포에 의한 면역 반응으로부터 이들 자신을 보호하는 종양의 능력이다. 종양은 항종양 면역 반응을 회피하기 위한 다수의 면역조절 메커니즘을 발달시킨다. 따라서, 숙주 항종양 면역을 향상시키고 파괴를 위해 종양 세포를 표적화하기 위한 개선된 면역치료 접근법이 필요하다.
요약
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 본 기술의 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자를 포함하는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVA 바이러스는 상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법은 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법은 조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, MVAΔC7L-OX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E3 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE3L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 바이러스는 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 포함한다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 재조합 MVA 바이러스는 상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E3 유전자는 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진은 상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, MVAΔE3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔC7L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 백시니아 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L). E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-12를 코딩하는 이종 핵산 및 항-huCTLA-4를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(VACVΔC7L-항-huCTLA-4-hFlt3L-OX40L-hIL-12). 일부 실시양태에서, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스는 상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L와 면역 체크포인트 차단제의 조합은 VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, MVA가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열을 제공한다. 본 기술의 MVA 바이러스의 일부 실시양태에서, 서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859의 핵산 서열은 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 위치 75,798 내지 75,868의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하거나 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, MVA가 E3 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, VACV가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV) 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 VACV는 서열번호 2의 위치 15,716 내지 16,168의 핵산 서열이 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술 중 어느 하나의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술 중 어느 하나의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E3 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 항원 및 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 포함하는 아쥬반트의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산을 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 항원 및 아쥬반트를 하나 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함하고/하거나 항원 및 아쥬반트는 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트는 면역 체크포인트 차단제의 투여와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 대상체에 전달된다.
일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진은 (i) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 T-세포에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 발현의 수준 증가; (ii) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 항원-특이적 T-세포의 수준 증가; 및 (iii) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 혈청에서 항원-특이적 면역글로불린의 수준 증가 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원-특이적 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2이다.
일부 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트는 종양내, 근육내, 피내, 또는 피하 투여되도록 제형화된다.
일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 대장암, 유방암, 방광암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 난소암, 피부의 편평세포 암종, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 위암, 간암, 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 약 105 내지 약 1010 플라크-형성 단위(plaque-forming unit)(pfu)의 투여 당 투여량으로 투여된다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항원 및 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 사용 설명서, 용기 수단, 및 본 기술의 (a) 항원; 및 (b) 아쥬반트 각각의 별도 부분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트의 일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 키트는 (c) 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다.
본 기술의 방법의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00002
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
본 기술의 면역원성 조성물의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00003
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
본 기술의 키트의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00004
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE5R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E5R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MVAΔE5R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MVAΔE5R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MVAΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MVAΔE5R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조작된 MVAΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조작된 MVAΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔE5R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E5R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔE5R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(VACVΔE5R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔE5R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 VACVΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 VACVΔE5R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 VACVΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 VACVΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 M31R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 점액종(myxoma) 바이러스(MYXV)(MYXVΔM31R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199의 점액종 올소로그(ortholog) 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 M31R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MYXVΔM31R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(MYXVΔM31R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MYXVΔM31R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백시니아 바이러스 유전자의 점액종 올소로그 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 C7 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MYXVΔM31R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MYXVΔM31R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 MYXVΔM31R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 MYXVΔM31R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자를 포함하는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVA 바이러스는 상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법은 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법은 조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, MVAΔC7L-OX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E3 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE3L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 바이러스는 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 포함한다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 재조합 MVA 바이러스는 상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 본 기술의 바이러스의 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E3 유전자는 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진은 상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, MVAΔE3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제의 조합은 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔC7L-OX40L)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 백시니아 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L). E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-12를 코딩하는 이종 핵산 및 항-huCTLA-4를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(VACVΔC7L-항-huCTLA-4-hFlt3L-OX40L-hIL-12). 일부 실시양태에서, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스는 상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도; 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소의 특징 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 흑색종 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 약학적 허용 아쥬반트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료는 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L와 면역 체크포인트 차단제의 조합은 VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 바이러스(예를 들어, VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L) 또는 본 기술의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, MVA가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열을 제공한다. 본 기술의 MVA 바이러스의 일부 실시양태에서, 서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859의 핵산 서열은 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 위치 75,798 내지 75,868의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하거나 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, MVA가 E3 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032의 핵산 서열이 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, VACV가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV) 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 VACV는 서열번호 2의 위치 15,716 내지 16,168의 핵산 서열이 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술 중 어느 하나의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술 중 어느 하나의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 본 기술의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E3 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술은 돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 항원 및 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 포함하는 아쥬반트의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L). 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산을 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스는 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L). 일부 실시양태에서, OX40L은 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, OX40L은 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L은 C7 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 투여 단계는 항원 및 아쥬반트를 하나 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함하고/하거나 항원 및 아쥬반트는 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트는 면역 체크포인트 차단제의 투여와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 대상체에 전달된다.
일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진은 (i) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 T-세포에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 발현의 수준 증가; (ii) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 항원-특이적 T-세포의 수준 증가; 및 (iii) 미처치된 대조군 샘플과 비교하여 혈청에서 항원-특이적 면역글로불린의 수준 증가 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원-특이적 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2이다.
일부 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트는 종양내, 근육내, 피내, 또는 피하 투여되도록 제형화된다.
일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 대장암, 유방암, 방광암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 난소암, 피부의 편평세포 암종, 메르켈 세포 암종, 위암, 간암, 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 약 105 내지 약 1010 플라크-형성 단위(pfu)의 투여 당 투여량으로 투여된다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항원 및 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 사용 설명서, 용기 수단, 및 본 기술의 (a) 항원; 및 (b) 아쥬반트 각각의 별도 부분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트의 일부 실시양태에서, 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 키트는 (c) 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다.
본 기술의 방법의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00005
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
본 기술의 면역원성 조성물의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00006
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
본 기술의 키트의 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00007
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원이다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE5R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E5R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MVAΔE5R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MVAΔE5R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L 바이러스는 돌연변이체 C11R 유전자를 추가로 포함하였다(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L-ΔC11R). 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C11R 유전자는 이종 핵산 분자을 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C11R 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L 바이러스는 돌연변이체 WR199 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L-ΔWR199). 일부 실시양태에서, 돌연변이체 WR199 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 WR199 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는 돌연변이체 E3L 유전자(ΔE3L)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E3L 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E3L 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MVAΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MVAΔE5R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조작된 MVAΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조작된 MVAΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔE5R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 E5R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔE5R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(VACVΔE5R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔE5R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 VACVΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 VACVΔE5R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 VACVΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 VACVΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 M31R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 점액종 바이러스(MYXV)(MYXVΔM31R)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199의 점액종 올소로그 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 M31R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MYXVΔM31R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(MYXVΔM31R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(MYXVΔM31R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R 유전자(WR200), E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백시니아 바이러스 유전자의 점액종 올소로그 내부로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TK 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 C7 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 C7 유전자는 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MYXVΔM31R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 MYXVΔM31R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 MYXVΔM31R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 조작된 MYXVΔM31R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체 B2R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔB2R)를 제공한다.
일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스는 VACVΔE3L83NΔB2R, VACVΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-huCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-hIL-12-ΔB2R 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 B2R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔB2R-OX40L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다(VACVΔB2R-OX40L-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 카세트는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함한다(VACVΔB2R-hFlt3L). 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 VACVΔB2R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 VACVΔB2R 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 VACVΔB2R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 기술의 VACVΔB2R 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 기술의 VACVΔB2R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 돌연변이체 M63R 유전자(MYXVΔM63R); (ii) 돌연변이체 M64R 유전자(MYXVΔM64R); 및 (iii) 돌연변이체 M62R 유전자(MYXVΔM62R)로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이체를 포함하도록 유전적으로 조작된 점액종 바이러스(MYXV)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199(ΔWR199)의 점액종 올소로그, 또는 점액종 M31R(ΔM31R) 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 M63R 유전자, M64R 유전자, 및/또는 M62R 유전자는 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B2R 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백시니아 바이러스 유전자의 점액종 올소로그 내부로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 기술의 MYXV 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 기술의 MYXV 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM62R, MYXVΔM63R, 및/또는 MYXVΔM64R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXVΔM62R, MYXVΔM63R, 및/또는 MYXVΔM64R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXV 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 MYXV 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 MYXV 바이러스를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-12를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 C11R 유전자를 추가로 포함한다(MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12ΔC11R). 일부 실시양태에서, 바이러스는 hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 돌연변이체 ΔE3L83N, 돌연변이체 티미딘 키나아제(ΔTK), 돌연변이체 B2R(ΔB2R), 돌연변이체 WR199(ΔWR199), 및 돌연변이체 WR200(ΔSR200)을 추가로 포함하고, 항-CTLA-4를 코딩하는 핵산 분자 및 IL-12를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200). 일부 실시양태에서, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200 바이러스는 hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200- hIL-15/IL-15Rα). 일부 실시양태에서, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200 바이러스는 돌연변이체 C11R 유전자(ΔC11R)를 추가로 포함한다(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200ΔC11R). 일부 실시양태에서, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200ΔC11R 바이러스는 hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200- hIL-15/IL-15Rα ΔC11R).
일부 실시양태에서, 본 기술의 MYXV 바이러스는 돌연변이체 M62R 유전자(ΔM62R), 돌연변이체 M63R 유전자(ΔM63R), 및 돌연변이체 M64R 유전자(ΔM64R)를 포함하도록 유전적으로 조작된다(MYXVΔM62RΔM63RΔM64R).
일 실시양태에서, 본 발명은
Figure pct00008
로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 폭스바이러스를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 폭스바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 종양은 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폭스바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 재조합 폭스바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 또는 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 하나 이상의 항암 약물은 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 폭스바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합은 재조합 폭스바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는다.
도면의 간단한 설명
도 1은 티미딘 키나아제 유전자(TK; J2R) 유전자좌에서 플라스미드 DNA pCB 벡터와 MVAΔE3L 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 개략도이다. pCB-gpt 플라스미드를 사용하여, 뮤린 OX40L 유전자를 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터의 제어 하에 TK 유전자좌 내로 삽입하였다. 이 경우에, 약물 선택 마커는 백시니아 p7.5 프로모터의 제어 하에 있다. 발현 카세트를 각 측면 상의 TK 유전자 측면 영역의 부분 서열(TK-L 및 TK-R) 측면에 위치시켰다.
도 2a-2b는 재조합 바이러스 MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L로부터의 OX40L 발현의 검증을 나타낸다. 도 2a는 MVAΔE3L 및 MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L 바이러스 게놈에서 mOX40L 유전자 및 TK 유전자의 PCR 증폭의 이미지이다. 도 2b: MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L로 감염된 B16-F10 세포에서 mOX40L의 발현을 나타내는 대표적인 FACS 도포. 간단하게는, B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 10의 MOI에서 24 시간 동안 감염시켰다. 그 다음에, 세포를 PE-접합된 항-mOX40L 항체로 염색하였다.
도 3a-3h는 MVAΔE3L-OX40L의 종양내 주사가 B16-F10 양측 종양 모델에서의 MVAΔE3L과 비교하여 원거리 종양에서 더욱 활성화된 종양-침윤성 이펙터 T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. B16-F10 뮤린 흑색종 양측 종양 이식 모델을 사용하였다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 2 x 107 pfu의 MVAΔE3L, MVAΔE3L-OX40L, 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 3 일 간격으로 2 회 주사하였다. 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양 침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다. 도 3a-3c: MVAΔE3L, MVAΔE3L-OX40L, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임(Granzyme) B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표. 도 3d: CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=3 또는 4)이다. (**P < 0.01; t 검정). 도 3e-3g: MVAΔE3L, MVAΔE3L-OX40L, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표. 도 3h: CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=3 또는 4)이다. (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 4a 및 4b는 MVAΔE3L-OX40L의 IT 주사가 MVA와 비교하여 비장에서 더욱 항종양 CD8+ T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 대표적인 ELISPOT 블롯 및 그래프이다. B16-F10-보유 마우스를 2 x 107 pfu의 MVAΔE3L, MVAΔE3L-hFlt3L, 또는 PBS의 IT 주사로 3 일 간격으로 2 회 처치하였다. 비장을 2 차 주사 후 2 일에 수집하였다. 96-웰 플레이트에서 조사된 B16-F10 세포(150,000) 및 정제된 CD8+ T 세포(300,000)를 공동-배양함으로써 ELISPOT 분석을 수행하였다. 도 4a: 좌측으로부터 우측으로 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지. 도 4b: 300,000 정제된 CD8+ T 세포 당 IFN-γ+ 스폿의 그래프. 각각의 막대는 개별 마우스(n=3 또는 4)로부터의 비장 샘플을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L을 생성하기 위한 2-단계 상동 재조합의 개략도를 나타낸다. 도 5a: 제1 단계: hFlt3L 및 GFP 발현 카세트를 C7 유전자좌 내로 삽입(C7 유전자를 치환)하기 위한 C7 유전자좌 측면의 C6 및 C8 유전자에서 플라스미드 DNA pUC57 벡터와 MVA 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합. 인간 Flt3L 유전자는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 있다. GFP는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하에 있다. 도 5b: 제2 단계: muOX40L 및 약물 선택 마커 발현 카세트를 TK(J2R) 유전자좌 내로 삽입하기 위한 TK(J2R) 유전자좌에서 플라스미드 DNA pCB 벡터와 MVAΔC7L-hFlt3L 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합. 뮤린 OX40L 유전자는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 있다. 약물 선택 마커 gpt는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하에 있다. 도 5c는 바이러스 게놈 DNA를 PCR에 의해 분석하여, OX40L 및 hFlt3L의 발현을 검증하고 트랜스유전자의 삽입을 확인하였다는 것을 나타낸다.
도 6은 MVAΔC7L-hFlt3L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L로 감염된 B16-F10 및 SK-MEL-28 세포주에서 hFlt3L 발현을 나타내는 FACS 분석으로부터의 일련의 점 도표이다. 세포를 항체 염색 및 FACS 분석 전에 10의 MOI에서 24 시간 동안 감염시켰다. MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L-감염된 세포는 GFP 마커를 발현하였다.
도 7은 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L로 감염된 B16-F10 및 SK-MEL-28 세포주에서 뮤린 OX40L 발현을 나타내는 FACS 분석으로부터의 일련의 점 도표이다. 세포를 항체 염색 및 FACS 분석 전에 10의 MOI에서 24 시간 동안 감염시켰다.
도 8a-8c는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L의 종양내 주사가 B16-F10 양측 뮤린 흑색종 모델에서의 MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L과 비교하여 원거리 종양에서 더욱 활성화된 종양-침윤성 이펙터 CD8+ T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L의 종양내(IT) 주사(2 x 107 pfu)를 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 3 일 간격으로 2 회 수행하였다. 비-주사된 원거리 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양-침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다. 도 8a: PBS, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, MVAΔC7L-hFlt3L-muOX40L, 또는 열-iMVAΔC7L-hFlt3L로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표. 도 8b: 원거리 비-주사된 종양의 그램 당 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=4 또는 5)이다. (*P < 0.05; **P < 0.01; t 검정). 도 8c: 원거리 비-주사된 종양의 그램 당 그랜자임 B+CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=4 또는 5)이다. (*P < 0.05; **P < 0.01, t 검정).
도 9a-9c는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L의 종양내 주사가 B16-F10 양측 뮤린 흑색종 모델에서의 MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L과 비교하여 원거리 종양에서 더욱 활성화된 종양-침윤성 이펙터 CD4+ T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L의 종양내(IT) 주사(2 x 107 pfu)를 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 3 일 간격으로 2 회 수행하였다. 원거리 비-주사된 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양-침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다. 도 9a: PBS, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, MVAΔC7L-hFlt3L-muOX40L, 또는 열-iMVAΔC7L-hFlt3L로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표. 도 9b: 원거리 비-주사된 종양의 그램 당 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=4 또는 5)이다. (*P < 0.05; **P < 0.01; t 검정). 도 9c: 원거리 비-주사된 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM(n=4 또는 5)이다. (*P < 0.05; **P < 0.01, t 검정).
도 10a 및 10b는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L의 IT 주사가 MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L과 비교하여 비장에서 강한 항종양 CD8+ T 세포 반응을 생성하였다는 것을 나타내는 대표적인 ELISPOT 블롯 및 그래프이다. B16-F10-보유 마우스를 2 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 열-불활성화된 MVAΔC7L-hFlt3L의 IT 주사로 3 일 간격으로 2 회 처치하였다. 비장을 2 차 주사 후 2 일에 수집하였다. 96-웰 플레이트에서 조사된 B16-F10 세포(150,000) 및 정제된 CD8+ T 세포(300,000)를 공동-배양함으로써 ELISPOT 분석을 수행하였다. 도 10a: 좌측으로부터 우측으로 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지. 도 4b: 300,000 정제된 CD8+ T 세포 당 IFN-γ+ 스폿의 그래프. 각각의 막대는 개별 마우스(n=5)로부터의 비장 샘플을 나타낸다.
도 11a-11g는 IT MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L과 전신 전달 면역 체크포인트 차단 항체 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1의 조합이 뮤린 B16-F10 흑색종 양측 종양 이식 모델에서 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시킨다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. 도 11a는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 9 일에, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L의 종양내 주사(2 x 107 pfu)를 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 매주 2 회 수행하였다. 마우스 당 250 ㎍의 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1 항체가 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다. 도 11b 및 11c는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-CTLA-4 항체, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치 후 수일에 걸친 주사된(도 11b) 및 비-주사된(도 11c) 종양의 크기를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. 도 11d 및 11e는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-CTLA-4 항체, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치 후 7 일차 및 11 일차에 주사된(도 11d) 및 비-주사된(도 11e) 종양의 초기 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. 도 11f는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-CTLA-4 항체, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선의 그래프이다. (n=10, **P < 0.01; ***P < 0.001; 만텔-콕스(Mantel-Cox) 검정). 도 11g는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-CTLA-4 항체, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 중간값을 나타내는 표이다.
도 12는 B16-F10 편측 대규모 종양 모델에서 처치된 마우스에서의 종양 성장 곡선을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(5 x 105 세포). 이식 후 11 일에, 바이러스를 주 당 2 회 종양내로 주사하였으며, 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1 항체를 복강내로 주 당 2 회 주사하였다.
도 13a 및 13b는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-huOX40L을 생성하기 위한 2-단계 상동 재조합의 개략도를 나타낸다. 도 13a: 제1 단계: hFlt3L 및 GFP 발현 카세트를 C7 유전자좌 내로 삽입(C7 유전자를 치환)하기 위한 C7 유전자좌 측면의 C6 및 C8 유전자에서 플라스미드 DNA pUC57 벡터와 MVA 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합. 인간 Flt3L 유전자는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 있다. GFP는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하에 있다. 도 13b: 제2 단계: huOX40L 및 mCherry 발현 카세트를 TK(J2R) 유전자좌 내로 삽입하기 위한 J2R(TK) 유전자 측면의 J1R 및 J3R(TK-R 및 TK-L) 유전자좌에서 플라스미드 DNA pUC57ΔTK-hOX40L-mCherry와 MVAΔC7L-hFlt3L 바이러스 게놈 DNA 사이의 상동 재조합. 인간 OX40L 유전자는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 있다. mCherry는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하에 있다. 도 13c: hOX40L 유전자 및 hFlt3L 유전자 삽입을 함유하지만, TK(J2R) 유전자가 결여된 재조합 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-huOX40L의 3 개의 독립적 클론의 PCR 검증. H1, h2 및 H3은 개별 재조합 MVA이다. "+": PCR 반응에 대한 양성 대조군.
도 14a 및 14b는 원발성 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 모 MVA 및 MVAΔC7L-hFlt3L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L을 포함한 재조합 바이러스의 다단계 성장을 나타내는 2 개의 그래프이다. 도 14a는 CEF에서 이들 바이러스의 다단계 성장 곡선이다. 간단하게는, CEF를 0.05의 MOI에서 상술한 바이러스로 감염시켰다. 세포를 1, 24, 48 및 72 시간에 수집하였다. 연속 희석 및 공초점 현미경 하에서 GFP+ foci 계수에 의해 BHK21 세포에 대한 바이러스 역가를 확인하였다. 도 14b는 감염 후 1 시간에 대한 감염 후 72 시간의 바이러스 역가의 log(배수 변화)를 나타낸다.
도 15a 및 15b는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L 바이러스에 의해 감염된 BHK21 세포 및 인간 단핵구-유래된 수지상 세포(mo-DC)에서 hOX40L의 발현을 나타내는 FACS 데이터의 일련의 대표적인 점 도표이다. 도 15a: BHK21 세포를 모의-감염시키거나, 10의 MOI에서 MVAΔC7L-hFlt3L로 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시켰다. 세포를 감염 후 24 시간에 수집하고 FACS 분석 전에 PE-접합된 항-hOX40L 항체로 염색하였다. 도 15b: 인간 moDC를 10 ㎍/mL의 폴리 I:C로 처치하거나, 1의 MOI에서 열-iMVA, MVAΔC7L-TK(-), 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시켰다. 감염 후 24 시간에, 세포를 수집하고 FACS 분석 전에 PE-접합된 항-hOX40L 항체로 염색하였다. 미처치된 뮤린 B16-F10 흑색종 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 16a 및 16b는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L-감염된 BHK21(도 16a) 및 B16-F10 세포(도 16b)에서의 hOX40L mRNA 수준을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. BHK21 또는 B16-F10 세포를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시켰다. 감염 후 8 및 16 시간에, 세포를 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, 바이러스 E3L 유전자 및 hOX40L 유전자의 발현을 시험하였다.
도 17은 백시니아 바이러스 바이러스 초기 유전자 발현 플라스미드를 구축하는 작업흐름을 나타내는 개략도이다. 72 개 바이러스 초기 유전자를 선택하였다. PCR을 수행하여, 백시니아 바이러스 게놈으로부터 관심 유전자를 증폭시켰다. 어댑터를 제2 라운드의 PCR에 의해 PCR 생성물의 양측 단부에 첨가하였다. 그 다음에, DNA 단편을 포유동물 발현 벡터인 pDONRTM/ZEO, 및 그 다음에 pcDNATM3.2-DEST로 클로닝하였다. DNA 구축물을 시퀀싱에 의해 추후에 검증하였다. 그 다음에 플라스미드 DNA를 사용하여, 하기에 기재될 다른 플라스미드와 함께 HEK-293T 세포 내로 형질주입하였다.
도 18은 이중 루시퍼라아제 스크리닝 전략을 나타낸다. HEK293T 세포에서, cGAS 및 STING 발현 플라스미드를 IFN-β 루시퍼라아제 플라스미드 및 pRL-TK로 공동-형질주입하였다. 바이러스 유전자 발현 플라스미드 또는 벡터를 함께 형질주입하였다. 24 시간 후, 루시퍼라아제 신호를 측정하였다. 상대적 루시퍼라아제 활성은 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 활성에 대해 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 정규화함으로써 임의 단위로서 나타내었다.
도 19a-19c는 cGAS/STING-의존적 IFNβ-luc 활성을 억제하는 백시니아 바이러스 ORF의 이중 루시퍼라아제 스크리닝 결과를 나타낸다. 도 19a-19c: HEK293T 세포를 나타낸 바와 같은 IFNβ-luc 리포터, 뮤린 cGAS, 인간 STING 및 백시니아 바이러스 ORF를 발현하는 플라스미드로 형질주입하였다. 이중 루시퍼라아제 분석을 형질주입 후 24 시간에 수행하였다. 아데노바이러스 E1A 유전자를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 20a-20e. 백시니아 바이러스 B18, E5, K7, C11 및 B14는 cGAS/STING-유도된 IFNβ 프로모터 활성을 억제한다. HEK293T 세포를 나타낸 바와 같은 IFNB 루시퍼라아제 리포터, cGAS, STING 및 발현 플라스미드로 형질주입하고, 루시퍼라아제 활성을 형질주입 후 24 시간에 분석하였다. 도 20a: 마우스 cGAS를 발현 플라스미드로 공동-형질주입하였다. 도 20b: 인간 cGAS를 발현 플라스미드로 공동-형질주입하였다. 도 20c: 마우스 cGAS를 K7R, E5R, B14R, C11R, 및 B18R의 FLAG-태그된 백시니아 ORF로 공동-형질주입하였다. 도 20d 및 20e는 열-iMVA 감염(도 20d) 또는 ISD 처치(도 20e)에 의해 E5, B14, K7, 또는 B18을 과잉-발현하는 세포에서 IFNB의 유도를 나타내는 차트이다.
도 21은 cGAS/STING-의존적 IFNβ-luc 활성을 억제하는 백시니아 바이러스 ORF의 추가 이중 루시퍼라아제 스크리닝 결과를 나타낸다. HEK293T 세포를 나타낸 바와 같은 IFNβ-luc 리포터, 뮤린 cGAS, 인간 STING 및 백시니아 바이러스 ORF를 발현하는 플라스미드로 형질주입하였다. 이중 루시퍼라아제 분석을 형질주입 후 24 시간에 수행하였다. 아데노바이러스 E1A 유전자를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 22는 서열번호 1로 기재되고, GenBank 수탁번호 U94848.1로 주어진 바와 같은 MVA 게놈 서열을 나타낸다.
도 23은 서열번호 2로 기재되고, GenBank 수탁번호 AY243312.1로 주어진 바와 같은 백시니아 바이러스 (웨스턴 리저브 균주(Western Reserve strain); WR) 게놈 서열을 나타낸다.
도 24a 및 24b는 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4, E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L, 및 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L을 포함한 백시니아 및 재조합 바이러스의 다단계 성장을 나타내는 2 개의 그래프이다. 도 24a는 B16-F10 세포에서 이들 바이러스의 다단계 성장이다. 간단하게는, B16-F10 세포를 0.1의 MOI에서 상술한 바이러스로 감염시켰다. 세포를 감염 후 1, 24, 48 및 72 시간에 수집하고 바이러스 수율(log pfu)을 BSC40 세포에 대해 적정함으로써 확인하였다. 바이러스 수율을 감염 후 시간에 대해 도표화하였다. 도 24b는 감염 후 1 시간에 대한 감염 후 72 시간의 바이러스 역가의 log(배수 변화)를 나타낸다.
도 25는 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4 또는 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스-감염된 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 항-mCTLA-4 항체, 뮤린 OX40L, 및 인간 Flt3L 발현의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 나타낸다. B16-F10 세포를 10의 MOI에서 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4 또는 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 세포 용해물을 감염 후 7, 24 및 48 시간에 수집하고, 세포 용해물 중 폴리펩티드를 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하였다. HRP-접합된 항-마우스 IgG(중쇄 및 경쇄), 항-mOX40L 항체, 및 항-인간 Flt3L 항체를 사용하여, 각각 항-mCTLA-4 항체, 뮤린 OX40L, 및 인간 Flt3L 단백질을 검출하였다.
도 26은 E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-mCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스 감염된 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 뮤린 OX40L 단백질의 표면 발현을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 세포를 5의 MOI에서 E3LΔ83N-TK--벡터, E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--벡터, E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L, 또는 VAC-TK--항-mCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 세포를 감염 후 24 시간에 수집하고, PE-접합된 항-mOX40L 항체로 염색하고, FACS에 의해 분석하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 분석하였다.
도 27은 B16-F10 뮤린 흑색종 편측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식을 나타낸다. 간단하게는, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 9 일에, 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L을 매주 2 회 종양내로 주사하였다. 마우스 당 250 ㎍의 항-PD-L1 항체가 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 28a-28c는 PBS(도 28a), MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(도 28b), 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체(도 28c) 처치 후 수일에 걸친 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 29a 및 29b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 연구를 나타낸다. 도 29a는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선의 그래프이다. (n=5~10, **P < 0.01; ***P < 0.001; 만텔-콕스 검정). 도 29b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 중간값을 나타내는 표이다.
도 30은 MC38 편측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식을 나타낸다. 간단하게는, 5 x 105 MC38 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 9 일에, 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L을 매주 2 회 종양내로 주사하였다. 마우스 당 250 ㎍의 항-PD-L1 항체가 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 31a-31c는 PBS(도 31A), MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(도 31B), 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체(도 31C) 처치 후 수일에 걸친 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 32a 및 32b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 연구를 나타낸다. 도 32a는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선의 그래프이다. (n=4~8, **P < 0.01; ***P < 0.001; 만텔-콕스 검정). 도 32b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 중간값을 나타내는 표이다.
도 33은 MB49 편측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식을 나타낸다. 간단하게는, 2.5 x 105 MB49 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 8 일에, 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L을 매주 2 회 종양내로 주사하였다. 마우스 당 250 ㎍의 항-PD-L1 항체가 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 34a-34d는 PBS(도 34a), MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(도 34b), MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체(도 34v), 또는 항-PD-L1 항체(도 34d) 처치 후 수일에 걸친 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 35a 및 35b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L1 항체 처치로 처치된 마우스의 생존 연구를 나타낸다. 도 35a는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L1 항체 처치로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선의 그래프이다. (n=10, *P < 0.05, **P < 0.01; ***P < 0.001; 만텔-콕스 검정). 도 35b는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체, 또는 항-PD-L1 항체로 처치된 마우스의 생존 중간값을 나타내는 표이다.
도 36은 암컷 MMTV-PyVmT 마우스로부터 단리된 종양의 대표적인 그래프를 나타낸다. 간단하게는, 마우스를 92 일령의 평균 잠복기를 갖는 만질 수 있는 유방 종양이 발생한 후, PBS, 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 주사로 매주 2 회 처치하였다. 마우스 당 250 ㎍의 항-PD-L1 항체가 매주 2 회 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 37은 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 항체 처치 후 수일에 걸친 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. (P0 - PBS; V1 - MVAΔC7L-hFlt3L-muOX40L; C1, C2, C3 - MVAΔC7L-hFlt3L-muOX40L + 항-PD-L1).
도 38은 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치 후 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다.
도 39는 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치 후 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD8+CD69+CD103+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다.
도 40은 PBS, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L + 항-PD-L1 항체로 처치 후 주사된 및 비-주사된 종양에서 CD4+CD69+CD103+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다.
도 41a 및 41b는 B16-F10-hFlt3L 또는 B16-F10-mOX40L 안정 세포주에 의한 hFlt3L(도 41a) 또는 mOX40L(도 41b)의 발현을 나타낸는 대표적인 FACS 도표이다.
도 42는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식이다. 간단하게는, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하고 5 x 105 B16-F10-hFlt3L 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 9 일에, PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L을 양측 옆구리 상의 종양에 매주 2 회 종양 내로 주사하였다. 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양 침윤성 림프구(TIL)를 FACS에 의해 분석하였다.
도 43a-43d는 PBS 또는 MVAΔC7L 처치 후 수일에 걸친 C57B/6J 마우스의 우측 또는 좌측 옆구리에서의 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 44a-44e는 PBS 또는 MVAΔC7L 처치 후 종양 침윤성 CD8+(도 44a), CD8+그랜자임B+(도 44b), CD4+(도 44c), CD4+그랜자임B+(도 44d), 및 CD4+FoxP3+(도 44e) T 세포의 비율의 그래프이다. (n=5, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, ****P < 0.0001; 일원 ANOVA).
도 45a-45e는 PBS, MVAΔC7L 처치 후 종양의 그램 당 종양 침윤성 CD8+(도 45a), CD8+그랜자임B+(도 45b), CD4+(도 45c), CD4+그랜자임B+(도 45d), CD4+FoxP3+(도 45e) T 세포의 비율의 그래프이다. (n=5, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, ****P < 0.0001; 일원 ANOVA).
도 46은 B16-F10 양측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식이다. 간단하게는, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하고 5 x 105 B16-F10-OX40L 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 9 일에, PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L을 양측 옆구리 상의 종양에 매주 2 회 종양 내로 주사하였다. 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양 침윤성 림프구(TIL)를 FACS에 의해 분석하였다.
도 47a-47d는 PBS 또는 MVAΔC7L 처치 후 수일에 걸친 C57B/6J 마우스의 우측 또는 좌측 옆구리에서의 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 48a-48e는 PBS, MVAΔC7L 처치 후 종양 침윤성 CD8+(도 48a), CD8+그랜자임B+(도 48b), CD4+(도 48c), CD4+그랜자임B+(도 48d), CD4+FoxP3+(도 48e) T 세포의 비율의 그래프이다. (n=5, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, ****P < 0.0001; 일원 ANOVA).
도 49a-49e는 PBS, MVAΔC7L 처치 후 종양의 그램 당 종양 침윤성 CD8+(도 49a), CD8+그랜자임B+(도 49b), CD4+(도 49c), CD4+그랜자임B+(도 49d), CD4+FoxP3+(도 49e) T 세포의 비율의 그래프이다. (n=5, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, ****P < 0.0001; 일원 ANOVA).
도 50a 및 50b는 FTY720의 작용의 메커니즘 및 이의 화학 구조를 나타낸다. 도 50a는 Gong et al. Front. Immunol. (2014),
Figure pct00009
T cells circulate between lymphoid organs and blood의 도면으로부터 채택된다. 감염 또는 종양 이식시, 항원-제시 세포는 프라임 동족 T 세포에 대한 항원을 제시하며, 이는 그 다음에 증폭되고 이펙터 T 세포 및 기억 T 세포로 분화된다. 이펙터 T 세포는 감염 부위 또는 종양으로 동원되고 기억 T 세포는 재순환된다. FTY720(도 50b), 스핑고신-1-포스페이트 수용체 조절제는 림프 기관으로부터의 림프구의 퇴장을 차단한다.
도 51은 B16-F10 편측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식이다. 간단하게는, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 9 일에 PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L을 2 회 종양내로 주사하였다. 마우스 당 25 ㎍의 FTY720이 1 차 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L 주사 1 일 전에 출발하여 처치 동안 매일 복강내로 주어졌다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 52a-52d는 FTY720 처치와 함께 또는 없이 PBS 또는 MVAΔC7L 처치 후 수일에 걸친 C57B/6J 마우스에서에서의 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 53a 및 53b는 FTY720 처치와 함께 또는 없이 PBS 또는 MVAΔC7L 처치 후 수일에 걸친 C57B/6J 마우스에서의 종양의 부피를 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 53c 및 53d는 FTY720과 함께 또는 없이 PBS 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선의 그래프이다(n=5~10, **P < 0.01; ***P < 0.001; 만텔-콕스 검정).
도 54a 및 54b는 폭스바이러스 패밀리 중에서 백시니아 E5의 도메인 조직 및 서열 보존을 나타낸다. 도 54a는 백시니아 E5의 개략도이다. E5는 2 개의 BEN 도메인이 뒤따르는 N-말단 도메인으로 구성된 328-aa 단백질이다. BEN은 BANP/SMAR1, 폭스바이러스 E5R, 및 NAC1에서 이의 존재 후 명명된다. 단백질을 함유한 BEN 도메인은 염색질 조직, 전사 조절, 및 가능하게는 바이러스 DNA 조직에 관여한다. 도 54b는 백시니아 E5가 폭스바이러스 패밀리에서 고도로 보존된다는 것을 나타내는 개략도이다.
도 55a-55c는 VACVΔE5R이 비강내 감염 모델에서 고도로 약화된다는 것을 나타낸다. 도 55a는 백시니아 게놈의 E5R 유전자 측면의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 VACVΔE5R 바이러스를 생성하기 위한 도식을 나타낸다. 도 55b는 WT VACV(2 x 106 pfu), VACVΔE5R(2 x 106 pfu), 또는 VACVΔE5R(2 x 107 pfu)로 비강내 감염 후 수일에 걸친 체중 감소를 나타낸다. 도 55c는 WT VACV(2 x 106 pfu) 또는 VACVΔE5R(2 x 106 pfu 또는 2 x 107 pfu)로 감염된 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 56a 및 56b는 BMDC의 VACVΔE5R을 이용한 감염이 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 56a는 10의 MOI에서 MVA, VACV, 또는 VACVΔE5R로 감염된 BMDC의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 세포를 감염 후 8 시간에 수집하였다. RNA를 추출하고 RT-PCR을 수행하였다. 도 56b는 BMDC가 10의 MOI에서 MVA, VACV, 또는 VACVΔE5R로 감염되었다는 것을 나타낸다. 상청액을 감염 후 21 시간에 수집하였다. IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 57a-57d는 BMDC 및 BMDM에서 MVAΔE5R 및 MVAΔK7R에 의한 IFNB 유전자 유도를 나타낸다. 도 57a는 MVA 게놈의 E5R 유전자 측면의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 MVAΔE5R 바이러스를 생성하기 위한 도식을 나타낸다. 도 57b는 MVA 게놈의 K7R 유전자 측면의 K5,6L 및 F1L 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 MVAΔK7R 바이러스를 생성하기 위한 도식을 나타낸다. 도 57c는 BMDC가 10의 MOI에서 MVA, MVAΔE5R, 또는 MVAΔK7R로 감염되었다는 것을 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. IFNB 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 측정하였다. 도 57d는 BMDM이 10의 MOI에서 MVA, MVAΔE5R, 또는 MVAΔK7R로 감염되었다는 것을 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. IFNB 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 측정하였다.
도 58a-58c는 BMDC가 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염되었다는 것을 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. IFNA(도 58a), CCL4(도 58b), 및 CCL5(도 58c) 유전자 발현을 정량적 RT-PCR에 의해 확인하였다.
도 59a-59c는 BMDC의 MVAΔE5R 감염이 BMDC로부터 높은 수준의 IFNB 및 바이러스 E3R 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 59a 및 59b는 MVAΔE5R 또는 열-불활성화된 MVAΔE5R("열-iMVAΔE5R")에 의해 유도된 IFNB(도 59a) 및 바이러스 E3R(도 59b) 유전자 발현의 실시간 정량적 PCR(RT-PCR) 분석을 나타낸다. BMDC를 mGM-CSF의 존재 하에 골수 세포를 배양함으로써 생성하였다. 세포를 0.25, 1, 3, 또는 10의 MOI에서 MVAΔE5R 또는 열-iMVAΔE5R 바이러스로 감염시켰다. 세포를 감염 1 시간 후에 세척하고 신선한 배지를 첨가하였다. 세포를 감염 후 14 시간에 수집하였다. IFNB 및 E3 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 확인하였다. 도 59c BMDC를 0.25, 1, 3, 또는 10의 MOI에서 MVAΔE5R 또는 열-iMVAΔE5R 바이러스로 감염시켰다. 상청액을 감염 후 14 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 60a-60d는 MVAΔE5R-유도된 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 분비가 cGAS에 의존하였다는 것을 나타낸다. 도 60a는 WT 및 cGAS-/- BMDC에서 MVAΔE5R에 의한 IFNA 유도를 나타낸다. 도 60b는 WT 및 cGAS-/- BMDC에서 MVAΔE5R에 의한 IFNA 유도를 나타낸다. 도 60c는 MVAΔE5R로 감염된 WT 및 cGAS-/- BMDC에서의 백시니아 E3R 유전자 발현을 나타낸다. BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. RNA를 추출하였다. 실시간 정량적 PCR 분석을 수행하였다. 도 60d는 MVAΔE5R이 열-iMVA 또는 열-iMVAΔE5R과 비교하여 높은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도하고, 유도는 cGAS에 완전히 의존한다는 것을 나타낸다. WT 또는 cGAS-/- BMDC를 10의 MOI에서 MVA, MVAΔE5R, 동등한 MOI에서 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다. 상청액을 감염 후 8 및 16 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 61a 및 61b는 BMDC로부터의 MVAΔE5R-유도된 IFNB 유전자 발현 및 단백질 분비가 STING에 의존한다는 것을 나타낸다. 도 61a는 WT 또는 STINGGt/Gt 마우스로부터의 BMDC를 MVA, MVAΔE5R, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 세포를 감염 후 8 시간에 수집하고 RT-PCR 분석을 수행하였다. IFNB 유전자 발현의 배수 유도를 나타내었다. 도 61b는 골수 유래된 대식세포(BMDM)를 M-CSF(macrophage colony stimulating factor(대식세포 집락 자극 인자))의 존재 하에 WT 및 STINGGt/Gt 마우스로부터의 골수 세포를 배양함으로써 생성하였다는 것을 나타낸다. BMDM을 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다. 상청액을 감염 후 16 시간에 수집하고 IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 62a-62d는 MVAΔE5R-유도된 IFN-β 단백질 분비가 IRF3, IRF7 및 IFNAR을 요구한다는 것을 나타낸다. 도 62a는 WT 또는 IRF3-/- BMDC를 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 상청액을 감염 후 8 및 16 시간에 수집하였다. IFN-β 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 도 62b는 WT 또는 IRF3-/- BMDM을 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 상청액을 감염 후 8 및 16 시간에 수집하였다. IFN-β 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 도 62c는 WT 또는 IRF7-/- BMDC를 10의 MOI에서 MVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 상청액을 감염 후 21 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 도 62d는 WT, cGAS-/-, 또는 IFNAR-/- BMDC를 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-IMVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 상청액을 감염 후 16 시간에 수집하였다. IFN-β 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 63a-63c는 WT VACV-유도된 cGAS 분해가 프로테아좀-의존적 경로를 통해 매개된다는 것을 나타낸다. 도 63a는 뮤린 배아 섬유아세포를 사이클로헥시미드(CHX), 프로테아좀 억제제, MG132, 팬-카스파아제 억제제, Z-VAD, 또는 AKT1/2 억제제 VIII로 30 분 동안 전처치하였다는 것을 나타낸다. 그 다음에, MEF를 각각의 약물의 존재 하에 WT VACV로 감염시켰다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석을 항-cGAS 및 항-GAPDH 항체로 수행하였다. 도 63b는 MEF를 DMSO 또는 MG132로 처치하였다는 것을 나타낸다. 세포를 처치 후 2, 4, 및 6 시간에 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석을 항-cGAS 및 항-GAPDH 항체로 수행하였다. 도 63c는 BMDC의 WT VACV 감염이 cGAS 분해를 야기한 반면, VACVΔE5R은 그렇지 않았다는 것을 나타낸다. MG132의 존재 하에, WT VACV-유도된 cGAS 분해를 차단하였다. BMDC를 MG132의 존재 또는 부재 하에 10의 MOI에서 WT VACV 또는 VACV로 감염시켰다. 세포를 감염 후 2, 4, 및 6 시간에 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석을 항-cGAS 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 수행하였다.
도 64는 MVA에서 E5R 유전자가 BMDC에서 cGAS 분해를 매개하는데 중요하다는 것을 나타낸다. BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 2, 4, 6, 8, 및 12 시간에 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석을 항-cGAS 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 수행하였다.
도 65는 MVAΔE5R이 MVA와 비교하여 높은 수준의 인산화된 Stat2를 유도한다는 것을 나타낸다. BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 2, 4, 6, 8, 및 12 시간에 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석을 항-포스포-STAT2, 항-STAT2, 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 수행하였다.
도 66은 MVAΔE5R이 감염된 BMDC에서 높은 수준의 cGAMP 생산을 유도한다는 것을 나타낸다. 2.5 x 106 BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 2, 4, 6 및 8 시간에 수집하였다. 2 개의 유도성 리포터 구축물의 안정적인 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 유래된 투과성 분화 THP1-Dual™ 세포와 함께 세포 용해물을 배양함으로써 cGAMP 농도를 측정하였다. 상청액을 24 시간에 수집하고, (IRF 경로 활성화에 대한 지표로서) 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. cGAMP 수준을 cGAMP 표준과 비교함으로써 계산하였다.
도 67a 및 67b는 MVAΔE5R이 형질세포양 수지상 세포로부터 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 67a는 비장세포로부터 분류된 1.2 x 105 pDC(B220+PDCA-1+)를 MVA, 열-iMVA, 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 비-감염된 비장세포를 대조군으로서 포함시켰다. 상청액을 감염 후 18 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 도 67b는 Flt3L-BMDC로부터 분류된 4 x 105 pDC(B220+PDCA-1+)를 MVA, 열-iMVA, 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다는 것을 나타낸다. 비-감염된 분류된 pDC를 대조군으로서 포함시켰다. 상청액을 감염 후 18 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 68은 pDC로부터의 MVAΔE5R-유도된 IFN-β 분비가 cGAS에 의존한다는 것을 나타낸다. pDC를 WT, cGAS-/-, 또는 MyD88-/- 마우스로부터 얻은 Flt3L-배양된 BMDC(B220+PDCA-1+)로부터 분류하였다. 2 x 105 세포를 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. NT 대조군을 포함시켰다. 상청액을 감염 후 18 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 69는 MVAΔE5R 감염이 cGAS-의존적 경로를 통해 CD103+ DC로부터 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. CD103+ DC를 WT, cGAS-/-, 또는 MyD88-/- 마우스로부터 얻은 Flt3L-배양된 BMDC(CD11c+CD103+)로부터 분류하였다. 2 x 105 세포를 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. NT 대조군을 포함시켰다. 상청액을 감염 후 18 시간에 수집하였다. 상청액에서 IFN-β 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 70은 BMDC의 MVAΔE5R 감염이 MVA와 비교하여 낮은 수준의 세포 사멸을 야기한다는 것을 나타낸다. BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 16 시간에 수집하고 LIVE/DEAD 고정가능한 생존력 염료로 염색하고 유세포 분석을 실시하였다.
도 71a 및 71b는 MVAΔE5R 감염이 cGAS-의존적 방식으로 DC 성숙을 촉진한다는 것을 나타낸다. WT 및 cGAS-/- 마우스로부터의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA-OVA 또는 MVAΔE5R-OVA로 감염시켰다. 세포를 감염 후 16 시간에 수집하고 DC 성숙 마커에 대해 염색하였다: CD40(도 71a) 및 CD86(도 71b).
도 72a-72g는 BMDC의 MVAΔE5R 감염이 T 세포 활성화에 의해 측정된 바와 같이 항원 교차-제시를 촉진한다는 것을 나타낸다. BMDC를 3의 MOI에서 3 시간 동안 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시킨 다음에, 3 시간 동안 OVA와 함께 항온처리하였다. OVA를 세척한 다음에, 세포를 OT-I 세포(OVA257-264 SIINFEKL 펩티드를 인식함)와 함께 3 일 동안 항온처리하였다. OT-1 세포를 항-CD69 및 항-CD8 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 상청액을 수집하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 점 도표는 CD69를 발현하는 CD8+ 세포를 나타낸다.
도 73은 BMDC의 MVAΔE5R 감염이 활성화된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산에 의해 측정된 바와 같이 항원 교차-제시를 촉진한다는 것을 나타낸다. BMDC를 3의 MOI에서 3 시간 동안 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시킨 다음에, 3 시간 동안 OVA와 함께 항온처리하였다. OVA를 세척한 다음에, 세포를 OT-I 세포(OVA257-264 SIINFEKL 펩티드를 인식함)와 함께 3 일 동안 항온처리하였다. OT-1 세포를 항-CD69 및 항-CD8 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 상청액을 수집하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 도 73은 BMDC:T 세포 공동-배양의 상청액에서 IFN-γ 수준을 나타낸다.
도 74는 BMDC의 VACVΔE5R 감염이 활성화된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산에 의해 측정된 바와 같이 항원 교차-제시를 촉진한다는 것을 나타낸다. BMDC를 3의 MOI에서 3 시간 동안 MVA, MVAΔE5R, 또는 VACVΔE5R로 감염시키거나; BMDC를 3 시간 동안 cGAMP 또는 모의 대조군과 함께 항온처리하였다. 이어서, BMDC를 3 시간 동안 OVA와 함께 항온처리한 다음에, OVA를 세척하였다. 그 다음에, 세포를 OT-I 세포(OVA257-264 SIINFEKL 펩티드를 인식함)와 함께 3 일 동안 항온처리하였다. 상청액을 수집하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 75a-75c는 MVA로부터 E5R 유전자의 결실이 백신접종 효능을 개선한다는 것을 나타낸다. 도 75a는 백신접종 전략의 도식이다. 0 일차에, C57BL/6J 마우스를 피부 난절 또는 피내 주사를 통해 2 x 107 pfu의 MVA-OVA 또는 MVAΔE5R-OVA로 백신접종하였다. 1 주 후에 비장을 안락사시킨 마우스로부터 수집하고 12시간 동안 OVA257-264(SIINFEKL) 펩티드(10 ㎍/mL) 펄스된 BMDC와 공동배양하였다. CD8+ T 세포에서 세포내 IFN-γ 수준을 유세포 분석에 의해 측정하였다. (* p<0.05; ** p<0.01). 도 75b는 MVA-OVA 또는 MVAΔE5R-OVA를 이용한 피부 난절을 통한 백신접종 후 활성화된 CD8+ T 세포를 나타낸다. 도 75c는 MVA-OVA 또는 MVAΔE5R-OVA의 피내 주사를 통한 백신접종 후 활성화된 CD8+ T 세포를 나타낸다.
도 76a 및 75b는 MVAΔE5R 감염이 cGAS-의존적 방식으로 뮤린 원발성 섬유아세포로부터 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 피부 진피 섬유아세포를 암컷 WT 및 cGAS-/- C57BL/6J 마우스로부터 생성하였다. 세포를 MVA, MVAΔE5R, 열-iMVA 또는 열-iMVAΔE5R로 감염시켰다. 세포 및 상청액을 감염 후 16 시간에 수집하였다. 도 76a는 WT 및 cGAS-/- 세포에서 IFNB 유전자 발현의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 도 76b는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 감염된 WT 및 cGAS-/- 세포의 상청액에서 IFN-β 단백질 수준을 나타낸다.
도 77a-77d는 MVAΔE5R이 cGAS- 또는 IFNAR1-결여 피부 원발성 진피 섬유아세포에서 이의 DNA를 복제하는 능력을 얻는다는 것을 나타낸다. WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 마우스로부터의 피부 원발성 진피 섬유아세포를 3의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 1, 4, 10 및 24 시간에 수집하였다. 바이러스 DNA 복제 수를 정량적 PCR에 의해 확인하였다. 도 77a는 MVA-감염된 WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 피부 진피 섬유아세포에서의 DNA 복제 수를 나타낸다. 도 77b는 MVA로 감염 후 1 시간에 DNA 복제 수와 비교한 배수-변화를 나타낸다. 도 77c는 MVAΔE5R-감염된 WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 피부 진피 섬유아세포에서의 DNA 복제 수를 나타낸다. 도 77d는 MVAΔE5R로 감염 후 1 시간에 DNA 복제 수와 비교한 배수-변화를 나타낸다.
도 78a-78d는 MVAΔE5R이 cGAS-결여 피부 원발성 진피 섬유아세포에서 감염성 자손 바이러스를 생성하는 이의 능력을 얻는다는 것을 나타낸다. WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 마우스로부터의 피부 원발성 진피 섬유아세포를 0.05의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 1, 24 및 48 시간에 수집하였다. 바이러스 역가를 BHK21 세포에 대해 적정함으로써 확인하였다. 도 78a는 WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 피부 진피 섬유아세포에서 감염 후 시간에 걸친 MVA 역가를 나타낸다. 도 78은 MVA로 감염 후 1 시간에 바이러스 역가와 비교한 배수-변화를 나타낸다. 도 78c는 WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 피부 진피 섬유아세포에서 감염 후 시간에 걸친 MVAΔE5R 역가를 나타낸다. 도 78d는 MVAΔE5R로 감염 후 1 시간에 바이러스 역가와 비교한 배수-변화를 나타낸다.
도 79a 및 79b는 뮤린 흑색종 세포의 MVAΔE5R 감염이 STING-의존적 방식으로 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 79a는 WT B16-F10 뮤린 흑색종 세포 및 STING-/- B16-F10 세포에서 MVAΔE5R에 의한 IFNB 유도의 RT-PCR 결과를 나타낸다. WT 및 STING-/- B16-F10 세포를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 18 시간에 수집하였다. RNA를 추출하고 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 도 79b는 감염 후 18 시간에 수집된 MVA 또는 MVAΔE5R로 감염된 WT 및 STING-/- B16-F10 세포의 상청액에서 IFN-β 단백질 수준의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 80은 뮤린 흑색종 세포의 MVAΔE5R 감염이 면역원성 세포 사멸의 특징인 ATP 방출을 유도한다는 것을 나타낸다. B16-F10 세포를 10의 MOI에서 WT 백시니아, MVA 또는 MVAΔE5R로 감염시켰다. 상청액을 감염 후 48 시간에 수집하였다. ATP 수준을 ATPlite 1 단계 발광 ATP 검출 분석 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA)을 사용함으로써 확인하였다.
도 81은 MVA 게놈의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 hFlt3L 및 hOX40L을 발현하는 재조합 MVAΔE5R을 생성하는 도식을 나타낸다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L 및 hOX40L 둘 다를 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하기 위해 pUC57 벡터를 사용하였다. hFlt3L 및 hOX40L의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리하였다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 hFlt3L 및 hOX40L에 대한 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
도 82a 및 82b는 재조합 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L 바이러스가 PCR 분석에 의해 확인된 바와 같이 예상된 삽입을 갖는다는 것을 나타낸다. 선(lane) 1은 Fermentas 1kb + DNA 사다리를 나타낸다. 선 2는 F0/R5 프라이머 쌍을 사용한 1120 bp의 예측된 크기를 갖는 밴드를 나타낸다. 선 3은 F2/R2 프라이머 쌍을 사용한 1166 bp의 예측된 크기를 갖는 밴드를 나타낸다. 선 4는 F5/R0 프라이머 쌍을 사용한 1136 bp의 예측된 크기를 갖는 밴드를 나타낸다.
도 83a-83c는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L 바이러스가 감염된 세포의 표면 상에 hFlt3L 및 hOX40L 둘 다를 발현한다는 것을 나타낸다. 도 83a는 24 시간 동안 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 BHK21 세포의 Y 축 상의 hFlt3L 발현 및 X 축 상의 hOX40L 발현의 FACS 분석의 점 도표이다. 세포를 10의 MOI에서 감염시켰다. 모의 감염, 무 바이러스 대조군을 포함시켰다. 도 83b는 24 시간 동안 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 뮤린 B16-F10 흑색종의 Y 축 상의 hFlt3L 발현 및 X 축 상의 hOX40L 발현의 FACS 분석의 점 도표이다. 세포를 10의 MOI에서 감염시켰다. 모의 감염, 무 바이러스 대조군을 포함시켰다. 도 83c는 24 시간 동안 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 인간 흑색종 세포 SK-MEL28의 Y 축 상의 hFlt3L 발현 및 X 축 상의 hOX40L 발현의 FACS 분석의 점 도표이다. 세포를 10의 MOI에서 감염시켰다. 모의 감염, 무 바이러스 대조군을 포함시켰다.
도 84는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L-감염된 BHK21 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L의 발현의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. BHK21 세포를 모의 감염시키거나, MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염시켰다. 세포 용해물을 감염 후 24 시간에 수집하였다. 항-hFlt3L 및 항-hOX40L 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 85a 및 85b는 VACV-TK--항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하기 위한 도식을 나타낸다. 도 85a는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 항체의 중쇄 및 경쇄를 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 갖는 pCB 벡터의 개략도를 나타낸다. 9D9의 중쇄(muIgG2a) 및 경쇄의 코딩 서열을 리보솜 스키핑을 가능하게 하기 위해 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리하였다. 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 있는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 대장균(E. coli) 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)뿐 아니라, 백시니아 PsE/L 제어 하의 항-mu-CTLA-4 유전자를 함유하는 pCB 플라스미드. TK 유전자좌로부터 항-mu-CTLA-4를 발현하는 재조합 바이러스를 pCB 플라스미드 DNA와 바이러스 게놈 DNA 사이의 TK 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하였다. 도 85b는 단일 발현 카세트에서 융합 단백질로서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 둘 다를 발현하기 위해 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하는 개략도이다. 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L의 코딩 서열을 2A 펩타이드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리하였다. 양 측에 E4L 및 E6R 유전자가 있는 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 유전자를 함유하는 pUC57 플라스미드를 구축하였다. E5R 유전자좌로부터 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 pUC57 플라스미드와 바이러스 게놈 DNA 사이의 E4L 및 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하였다.
도 86a-86c는 재조합 백시니아 바이러스 VACV-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L을 검증하기 위한 PCR 분석의 도식 및 결과뿐 아니라, 재조합 바이러스로 감염된 세포에 의한 항-CTLA-4 항체의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 86a는 pUC57 발현 플라스미드의 삽입된 발현 카세트로부터 상이한 유전자 단편을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머의 개략도를 나타낸다. 프라이머 쌍 f1/r1을 사용하여, 전체 발현 카세트를 함유하는 2795 bp PCR 단편을 생성하였다. 이 프라이머 쌍을 또한 사용하여, 재조합 바이러스의 순도를 확인하였다. 프라이머 쌍 f0/r5를 사용하여, 발현 카세트가 바이러스 게놈에서 우측 위치 내로 삽입되었다는 것을 확인하였다. VACV-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L로부터의 프라이머 쌍 f1/r3 또는 fo/r2를 사용하여 인간 Flt3L 유전자를 증폭시켰다. 뮤린 OX40L 유전자를 프라이머 쌍 f4/r1을 사용하여 생성하였다. 최종적으로, pCB-R4 및 TK-F5 프라이머 쌍을 사용하여, VACV-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L 또는 MVA-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L 재조합 바이러스로부터의 TK 유전자좌에 삽입된 항-mu-CTLA-4 유전자를 생성하였다. 도 86b는 도 86a에 기재된 프라이머 쌍을 사용한 PCR 결과의 겔 이미지 및 프라이머 쌍으로 증폭된 DNA 단편의 예측된 크기를 나타내는 표를 나타낸다. 도 86c는 모의 감염되거나 10의 MOI에서 E3LΔ83N-TK--벡터, E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4, E3LΔ83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4-C7L--mOX40L, VACV, VACV-TK--항-muCTLA-4-C7L--mOX40L, 또는 VACV-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L로 감염된 인간 SK-MEL-28 흑색종 세포의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 세포 용해물을 감염 후 24 시간에 수집하고, 폴리펩티드를 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리하였다. HRP-연결된 항-마우스 IgG(중쇄 및 경쇄) 항체를 사용하여, 항-muCTLA-4 항체의 전장(FL), 중쇄(HC), 및 경쇄(LC)를 검출하였다.
도 87은 다수의 폭스바이러스 패밀리로부터의 E5 올소로그의 단백질 서열 정렬을 나타낸다.
도 88a는 백시니아 바이러스 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로부터의 E5의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 도 88b는 백시니아 바이러스 및 점액종 바이러스로부터의 E5의 단백질 서열 정렬을 나타낸다.
도 89a 및 89b는 점액종 바이러스 M31R이 cGAS 및 STING 유도된 IFN-β 경로를 억제한다는 것을 나타낸다. 도 89a는 HEK293T 세포를 플라스미드를 발현하는 E5R, M31R 또는 pcDNA 벡터 대조군과 함께 뮤린 cGAS, 인간 STING을 발현하는 플라스미드로 형질주입하였다는 것을 나타낸다. 24 시간 후, 루시퍼라아제 신호를 확인하였다. 도 89b는 HEK293T 세포를 플라스미드를 발현하는 E5R, M31R 또는 pcDNA 벡터 대조군과 함께 뮤린 STING을 발현하는 플라스미드로 형질주입하였다는 것을 나타낸다. 24 시간 후, 루시퍼라아제 신호를 확인하였다.
도 90a 및 90b는 백시니아 E5가 cGAS 유비퀴틴화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 90a는 HEK293T 세포를 Flag-cGAS 및 HA-유비퀴틴으로 형질주입하였다는 것을 나타낸다. 24 시간 후, 세포를 WT VACV 또는 VACVΔE5R로 감염시켰다. 세포 용해물을 6 시간 후에 수집하였다. cGAS를 항-Flag 항체로 면역 침전시키고 유비퀴틴화를 항-HA 항체에 의해 검출하였다. 도 90b는 전체 세포 용해물(WCL)에서 cGAS 및 β-액틴의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 91a-91c는 IT MVAΔE5R이 뮤린 B16-F10 흑색종 편측 종양 이식 모델에서 종양 성장일 지연시키고 생존을 연장시킨다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. 도 91a는 B16-F10 편측 종양 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식이다. 간단하게는, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 8 일에, PBS, 4 x 107 pfu의 MVA, MVAΔE5R 또는 열-iMVA를 매주 2 회 종양내로 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링하였다. 도 91b는 PBS, MVA, MVAΔE5R, 또는 열-iMVA 처치로 처치된 종양-보유 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선의 그래프이다. (n=5, *P < 0.05; **P < 0.01; 만텔-콕스 검정). 도 91c는 PBS, MVA, MVAΔE5R, 또는 열-iMVA로 처치된 마우스의 생존 중간값을 나타내는 표이다.
도 92a-92e는 BMDC의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40LΔE5R 감염이 MVAΔE5R과 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 야기한다는 것을 나타낸다. 도 92a-92c는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40LΔE5R 바이러스를 생성하는 개략도를 나타낸다. 제1 단계는 PsE/L 프로모터의 제어 하에 C7L 유전자를 hFlt3L로 치환하는, C8L 및 C6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통한 MVAΔC7L-hFlt3L의 생성을 포함한다(도 92a). 제2 단계는 PsE/L 프로모터의 제어 하에 TK 유전자를 mOX40L로 치환하는, TK 유전자좌에서 상동 재조합을 통한 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 생성을 포함한다(도 92b). 생성된 바이러스를 도 5a 및 5b에 기재하였다. 제3 단계는 P7.5 프로모터의 제어 하에서 E5R 유전자를 mCherry로 치환하는, E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40LΔE5R을 생성하는 것이다(도 92c). 도 92d는 MVAΔE5R, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40LΔE5R로 감염된 BMDC에서 IFNB 유전자 발현의 RT-PCR 결과를 나타낸다. WT 및 IFNAR-/- BMDC를 모의-감염시키거나 10의 MOI에서 MVAΔE5R, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40LΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 16 시간에 수집하고 RT-PCR을 수행하였다. 도 92e는 MVAΔE5R, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40LΔE5R로 감염된 BMDC의 상청액에서 IFN-β 단백질 수준의 ELISA 결과를 나타낸다. WT 및 IFNAR-/- BMDC를 모의-감염시키거나 10의 MOI에서 MVAΔE5R, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)mOX40LΔE5R로 감염시켰다. 상청액을 감염 후 16 시간에 수집하고 ELISA를 수행하여, IFN-β 단백질 수준을 측정하였다.
도 93a 및 93b는 MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-mOX40L 및 MVAΔC7L-OVA-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 나타낸다. 도 93a는 MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 나타낸다. 단일 발현 카세트에서 융합 단백질로서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 둘 다를 발현하기 위해 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하기 위해 pUC57 플라스미드를 구축한다. 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L의 코딩 서열을 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리하였다. E5R 유전자좌로부터의 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 pUC57 플라스미드와 MVAΔC7L 바이러스 게놈 사이의 E4L 및 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하였다. 도 93b는 MVAΔC7L-OVA-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 나타낸다. E5R 유전자좌로부터의 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 pUC57 플라스미드와 MVAΔC7L-OVA 바이러스 게놈 사이의 E4L 및 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 생성하였다.
도 94a 및 94b. 도 94a: 점액종 M62R, 점액종 M62R-HA, 점액종 M64R, 점액종 M64R-HA, 백시니아 C7L-발현 또는 대조군 플라스미드와 함께, ISRE-반딧불이 루시퍼라아제 리포터, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK로 형질주입된 HEK293T 세포의 이중-루시퍼라아제 분석. 형질주입 후 24 시간에, 세포를 수집 전에 다른 24 시간 동안 IFN-β로 처치하였다. 도 94b: 점액종 M62R, 점액종 M62R-HA, 점액종 M64R, 점액종 M64R-HA, 백시니아 C7L-발현, 또는 대조군 플라스미드와 함께, IFNB-반딧불이 루시퍼라아제 리포터, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK, 및 STING-발현 플라스미드로 형질주입된 HEK293T 세포의 이중-루시퍼라아제 분석. 세포를 형질주입 후 24 시간에 수집하였다.
도 95는 MVA 게놈의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 hFlt3L 및 mOX40L을 발현하는 재조합 MVAΔE5R을 생성하는 도식을 나타낸다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L 및 mOX40L 둘 다를 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하기 위해 pUC57 벡터를 사용하였다. hFlt3L 및 mOX40L의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리하였다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 hFlt3L 및 mOX40L에 대한 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
도 96a 및 96b는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 바이러스가 감염된 세포의 표면 상에 hFlt3L 및 mOX40L 둘 다를 발현한다는 것을 나타낸다. 도 96a는 BHK21 세포, 뮤린 흑색종 세포 B16-F10, 또는 인간 흑색종 세포 SK-MEL28의 Y 축 상의 hFlt3L 발현 및 X 축 상의 mOX40L 발현의 FACS 분석의 점 도표를 나타낸다. 세포를 24 시간 동안 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 감염시켰다. 무 바이러스 모의 감염 대조군을 포함시켰다. 도 96b는 감염된 BHK21, B16-F10, 및 MVA, MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 PBS로 감염된 SK-MEL28 세포 상의 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L의 중간 형광 강도(MFI)의 그래프를 나타낸다.
도 97-102는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 B16-F10 양측 종양 모델에서 MVA, MVAΔE5R. 또는 열-iMVA와 비교하여 주사 및 비-주사된 원거리 종양뿐 아니라, 비장에서 더욱 활성화된 종양-침윤성 이펙터 T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 97은 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 2 x 107 pfu의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, MVA, MVAΔE5R, 동등한 양의 열-iMVA, 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 3 일 간격으로 2 회 주사하였다. 비장을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고, ELISPOT 분석을 수행하여, 비장에서 종양-특이적 T 세포를 평가하였다. 주사된 비-주사된 종양 둘 다를 또한 단리시키고 종양 침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다.
도 98a-98b. 96-웰 플레이트에서 조사된 B16-F10 세포(150,000) 및 비장세포(1,000,000)를 공동-배양함으로써 ELISPOT 분석을 수행하였다. 도 98a는 좌측으로부터 우측으로 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지를 나타낸다. 도 98b는 1,000,000 정제된 CD8+ T 세포 당 IFN-γ+ 스폿의 그래프를 나타낸다. 각각의 막대는 개별 마우스(n=3-8)로부터의 비장 샘플을 나타낸다(*P < 0.05; **P < 0.01, t 검정).
도 99a-99c. 도 99a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 99b는 CD3+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 99c는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 100a-100c. 도 100a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 100b는 CD3+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (*P < 0.05; t 검정). 도 100c는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 101a-101c. 도 101a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 101b는 CD3+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (****P < 0.0001, t 검정). 도 101c는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9)(*P < 0.05; ****P < 0.0001, t 검정).
도 102a-102c. 도 102a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 102b는 CD3+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (**P < 0.01; t 검정). 도 102c는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9)(*P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001, t 검정).
도 103a-104c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ 조절 T 세포를 감소시켰으나, 비-주사된 종양에서는 그렇지 않았다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 103a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 103b는 CD4+ 세포 중 FoxP3+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 103c는 종양의 그램 당 FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (*P < 0.05, t 검정). 도 104a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 104b는 CD4+ 세포 중 FoxP3+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). 도 104c는 종양의 그램 당 FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9).
도 105a-109c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 주사된 종양에서 OX40+FoxP3+CD4+ 조절 T 세포를 우선적으로 감소시켰다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 105a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 OX40+FoxP3+CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 105b는 주사된 종양에서 CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 105c는 종양의 그램 당 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (*P < 0.05, t 검정).
도 106a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 OX40+FoxP3+CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 106b는 CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). 도 106c는 종양의 그램 당 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9).
도 107a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 OX40+FoxP3-CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 107b는 CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3- CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). 도 107c는 종양의 그램 당 OX40+FoxP3-CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9).
도 108은 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 비-주사된 종양에서 OX40+CD8+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다.
도 109a-109c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 MVAΔE5R과 비교하여, 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ 조절 T 세포의 감소를 더욱 야기한다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 109a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, MVAΔE5R, 또는 PBS로 처치 후 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 109b는 주사된 종양에서 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (*P < 0.05; **P < 0.01, t 검정). 도 109c는 종양의 그램 당 FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-9). (**P < 0.01, t 검정).
도 110-115c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 B16-F10 양측 뮤린 흑색종 모델에서 WT 마우스와 비교하여, OX40-/- 마우스에서 주사된 및 비-주사된 원거리 종양에서 더욱 활성화된 종양-침윤성 이펙터 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 생성하였다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 110은 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 10 일에, MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS의 종양내 주사(4 x 107 pfu)를 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 3 일 간격으로 2 회 수행하였다. 주사된 및 비-주사된 원거리 종양 둘 다를 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양 침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다.
도 111a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 111b는 CD3+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 111c는 종양의 그램 당 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 111d는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 111e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10).
도 112a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 112b는 CD3+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 112c는 종양의 그램 당 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 112d는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 112e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10).
도 113a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사가 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ T 세포를 감소시키는데 실패한다는 것을 나타낸다. MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표. 도 113b는 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10).
도 114a-115c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사가 WT 마우스로부터의 주사된 종양에서 OX40+FoxP3+CD4+ 및 OX40+FoxP3-CD4+ T 세포를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 114a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 114b는 CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 114c는 종양의 그램 당 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10).
도 115a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 주사된 종양에서 OX40+FoxP3-CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 115b는 CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3-CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10). 도 115c는 종양의 그램 당 OX40+FoxP3-CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-10).
도 116a-119c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 WT 마우스와 비교하여, OX40-/- 마우스로부터의 원거리 비-주사된 종양에서 종양-침윤성 이펙터 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증식 및 활성화를 더욱 야기한다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 116a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 116b는 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 116c는 종양의 그램 당 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 116d는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 116e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10).
도 117a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 비-주사된 종양에서 Ki67+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 117b는 CD8+ 세포 중 Ki67+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 117c는 종양의 그램 당 Ki67+CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10).
도 118a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 비-주사된 종양에서 그랜자임 B+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 118b는 CD45+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 118c는 종양의 그램 당 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 118d는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 118e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10).
도 119a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 WT 및 OX40-/- 마우스로부터의 비-주사된 종양에서 Ki67+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 119b는 CD4+ 세포 중 Ki67+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10). 도 119c는 종양의 그램 당 Ki67+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-10).
도 120-124b는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 림프 기관으로부터 T 세포를 모집하지 않고 항종양 효과를 유도할 수 있었다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 120은 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 9 일에, MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 PBS의 종양내 주사(4 x 107 pfu)를 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 9 및 12 일차에 2 회 수행하였다. 주사된 종양을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고 종양 침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다. 림프 기관으로부터 림프구가 떠나는 것을 차단하는 FTY720(25 ㎍)이 마우스에 복강내로 7, 9, 11, 및 13 일차에 주어졌다.
도 121(상부 패널)은 시간에 걸친 주사된 및 비-주사된 종양 둘 다의 종양 부피의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8). 도 121(하부 패널)은 1 차 주사 후 6 일차에 주사된 및 비-주사된 종양 둘 다의 종양 부피의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8).
도 122a-122d는 FTY720 또는 DMSO의 복강내 전달과 조합된 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 마우스로부터의 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 122b는 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8). 도 122c는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8). 도 122d는 CD8+ 세포 중 Ki67+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=8-8).
도 123a는 FTY720 또는 DMSO의 복강내 전달과 조합된 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 마우스로부터의 주사된 종양의 TDLN에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 123b는 CD3+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8). 도 123c는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8).
도 124a는 FTY720 또는 DMSO의 복강내 전달과 조합된 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 처치 후 마우스로부터의 주사된 종양의 TDLN에서 Ki67+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 124b는 CD8+ 세포 중 Ki67+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=7-8).
도 125-129c는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달이 뮤린 AT3 유방암 지방 패드 이식 모델에서 주사된 종양에서 종양 성장을 지연시키고, CD8+ T 세포를 활성화하고 FoxP3+CD4+ T 세포를 감소시킨다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다. 도 125는 뮤린 유방암 AT3 지방 패드 이식 모델에 대한 종양 이식 및 처치의 도식을 나타낸다. 간단하게는, AT3 세포(1 x 106)를 C57B/6J 마우스의 4번째 지방 패드 내로 이식하였다. 종양 이식 후 14 일에, MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 열-iMVA, 또는 PBS의 종양내 주사(6 x 107 pfu)를 3 일 간격으로 2 회 수행하였다. 주사된 종양을 FACS 분석을 위해 측정하고 수집하였다.
도 126a는 시간에 걸친 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 AT3 종양의 종양 부피의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 1 차 주사 후 6 일차에 주사된 종양의 종양 중량의 그래프. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 126b는 6 일차의 종양 중량을 나타낸다. *=p<0.05.
도 127a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 AT3 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 127b는 CD3+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 127c는 종양의 그램 당 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 127d는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 127e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5).
도 128a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 AT3 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 128b는 CD3+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 128c는 종양의 그램 당 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 128d는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 128e는 종양의 그램 당 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5).
도 129a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 열-iMVA, 또는 PBS로 처치 후 주사된 AT3 종양에서 FoxP3+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 129b는 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5). 도 129c는 종양의 그램 당 FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5).
도 130-131b는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1의 복강내 전달의 조합이 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 향상된 치료 효능을 야기한다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 130은 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 4 x 107 pfu의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 주 당 2 회 종양내로(IT) 주사하였다. 또한, 마우스 중 하나의 그룹은 IT MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L과 결합하여 항-PD-L1 항체(250 ㎍)를 1 주 2 회 받았다. 종양 부피 및 마우스 생존을 모니터링하였다.
도 131a는 PBS 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 종양내로, 또는 IT MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L + IP 항-PD-L1의 조합으로 처치된 마우스에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 다의 종양 부피를 나타낸다. 도 131b는 3 개 그룹의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 132a-134b는 BMDC의 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L 감염이 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도하고; 생체외(ex vivo)에서 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L을 이용한 인간 종양(유방외 파제트 병(extramammary Paget's disease))의 감염이 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 증가 및 FoxP3+CD4+ T 세포의 감소를 야기한다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 132a는 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 BMDC의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하였다. RNA를 추출하고 RT-PCR을 수행하였다. 도 132b는 10의 MOI에서 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 BMDC에서 IFN-β 단백질 수준을 나타낸다. 상청액을 감염 후 19 시간에 수집하였다. IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 133a는 2 일 동안 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 감염 후 인간 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 133b는 2 일 동안 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 감염 후 인간 종양에서 FoxP3+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다.
도 134a는 2 일 동안 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 감염 후 CD8+ 세포 중 그랜자임+CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=3). 도 134b는 2 일 동안 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로 감염 후 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=3).
도 135a-137b는 MVAΔE3LΔE5R이 MVAΔE5R 또는 MVAΔE3L과 비교하여, BMDC 및 B16-F10 흑색종 세포에서 높은 수준의 I 형 IFN을 유도한다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 135a-135c는 MVAΔE5R 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 게놈의 E2L 및 E4L 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 재조합 MVAΔE3LΔE5R 및 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 나타낸다. E2L 및 E4L 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 MVAΔE5R 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 게놈으로부터의 E3L 유전자의 결실을 야기한다.
도 136은 BMDC의 MVAΔE3LΔE5R 감염이 MVAΔE5R, MVA, 또는 열-iMVA와 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하였다는 것을 나타낸다. WT 또는 cGAS-/- 마우스로부터의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA, 열-iMVA, MVAΔE5R, 또는 MVAΔE3LΔE5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다.
도 137a-137b는 뮤린 B16-F10 흑색종 세포의 MVAΔE3LΔE5R 감염이 MVAΔE3L 또는 MVAΔE5R과 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 137a는 10의 MOI에서 MVAΔE3L, 또는 MVAΔE5R 또는 MVAΔE3LΔE5R로 감염된 WT 또는 MDA5-/-, 또는 STING-/-MDA5-/- B16-F10 세포를 이용한 정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다. 세포를 감염 후 16 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. 도 137b는 10의 MOI에서 MVAΔE3L, 또는 MVAΔE5R, 또는 MVAΔE3LΔE5R로 감염된 WT 또는 MDA5-/-, 또는 STING-/-MDA5-/- B16-F10 세포에서의 IFN-β 단백질 수준을 나타낸다. 상청액을 감염 후 24 시간에 수집하고 상청액에서 IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 138-139b는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L이 B16-F10 흑색종 세포에서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 트랜스유전자를 발현하였고 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달이 B16-F10 뮤린 흑색종 모델에서 강한 전신 항종양 T 세포 반응을 유도하였다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 138은 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 감염된 B16-F10 세포 상의 mOX40L 및 hFlt3L 발현을 나타내는 FACS 데이터를 나타낸다. B16-F10 세포를 10의 MOI에서 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 MVAΔE3LΔE5R로 감염시켰다. 세포를 1 시간 후에 세척하고 감염 후 24 시간에 수집하였다. 세포를 FACS를 위해 항-mOX40L 또는 항-hFlt3L 항체로 염색하였다.
도 139a-139b는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L과 비교하여, 비장에서 강한 항종양-특이적 T 세포를 생성하였다는 것을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 2 x 107 pfu의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 동등한 양의 열-iMVA, 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 3 일 간격으로 2 회 주사하였다. 비장을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고, ELISPOT 분석을 수행하여, 비장에서 종양-특이적 T 세포를 평가하였다. 96-웰 플레이트에서 조사된 B16-F10 세포(150,000) 및 비장세포(1,000,000)를 공동-배양함으로써 ELISPOT 분석을 수행하였다. 도 139a는 동일한 처치 그룹에서의 마우스로부터의 조합된 비장세포의 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지를 나타낸다. 도 139b는 1,000,000 비장세포 당 IFN-γ+ 스폿의 그래프를 나타낸다. 각각의 점은 개별 마우스(n=5-6)로부터의 비장세포 샘플을 나타낸다(*P < 0.05; **P < 0.01, t 검정).
도 140-141b는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달이 WT 및 β2M-/- B16-F10 종양 세포 둘 다의 성장을 지연시켰다는 것을 나타내는 데이터의 그래픽적 표현이다.
도 140은 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, WT 또는 b2M-/- B16-F10 종양 세포(2 x 105)(발명자의 실험실에서 CRISPR-cas9 기술에 의해 생성됨)를 C57B/6J 마우스의 우측 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 10 일에, 종양을 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 1 주 2 회 주사하였다. 종양 부피를 측정하고 마우스 생존을 모니터링하였다.
도 141a는 PBS 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 종양내로 처치된 마우스에서 주사된 WT 및 b2M-/- B16-F10 종양의 종양 부피를 나타낸다. 도 141b는 4 개 그룹의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 142-148은 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 AT3 양측 종양 이식 모델에서 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L과 비교하여, 주사된 종양에서 더윽 활성화된 종양-침윤성 이펙터 T 세포를 생성하고 대식세포 및 DC의 비율을 감소시켰다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다.
도 142는 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, 105 AT3 유방암 세포를 C57B/6J 마우스의 4번째 지방 패드 내로 이식하였다. 종양 이식 후 12 일에, 6 x 107 pfu의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 PBS를 양측 옆구리 상의 종양 내에 3 일 간격으로 2 회 종양내로(IT) 주사하였다. 주사된 종양을 단리시켰다. 종양 침윤성 림프구 및 골수 세포를 FACS에 의해 분석하였다.
도 143a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 143b는 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 143c는 CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 143d는 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 143e는 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 144a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 Ki67+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 144b는 CD8+ 세포 중 Ki67+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 144c는 Ki67+ CD8+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 145a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 145b는 CD3+ 세포 중 CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 145c는 CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 145d는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6)(**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 145e는 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 □T 세포이다. 데이터는 P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정이다.
도 146a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 FoxP3+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 146b는 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 146c는 FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다. 데이터는 P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정이다.
도 147a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 OX40+FoxP3+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 147b는 FoxP3+CD4+ 세포 중 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 147c는 OX40+FoxP3+CD4+ T 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 148a-148h는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사가 주사된 종양에서 대식세포 및 DC의 비율을 감소시킨다는 것을 나타내는 일련의 데이터이다. 도 148a는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L로 처치 후 주사된 종양에서 대식세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). 도 148b는 대식세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148c는 DC의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148d는 DC의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148e는 CD11b+DC의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148f는 CD11b+DC의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148g는 CD103+DC의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정). 도 148h는 CD103+DC의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=4-6). (**P < 0.01; ***P < 0.001, t 검정).
도 149-150은 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L과 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체의 종양내 주사의 조합이 MMTV-PyMT 유방암 모델에서 우수한 항-종양 효능을 가졌다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 149는 실험 도식을 나타낸다. 1 차 종양이 만질 수 있게 된 후, 4 x 107 pfu의 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS를 종양 내에 1 주 2 회 종양내로(IT) 주사하였다. 250 ㎍ 항-PD-L1 및 100 ㎍ 항-CTLA-4 항체 또는 이소타입 대조군 항체를 각각의 마우스에 1 주 2 회 복강내로 주사하였다. 종양 부피를 1 주 2 회 측정하였다. 도 150은 IT MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체로 처치 후 종양 성장 곡선의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=3-4).
도 151-152b는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L로부터의 C11R 유전자의 결실이 BMDC에서 IFN 생산을 증가시킨다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다.
도 151은 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔC11R을 생성하기 위한 상동 재조합의 개략도이다.
도 152a-152b는 BMDC의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔC11R 감염이 MVAΔE5R 또는 MVA와 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현(도 152a) 및 단백질 분비(도 152b)를 유도한다는 것을 나타낸다. WT 마우스로부터의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA, MVAΔE5R, 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔC11R로 감염시켰다. IFNB 유전자 발현을 평가하기 위해, 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. BMDC로부터의 IFN-b 단백질 분비를 시험하기 위해, 상청액을 감염 후 19 시간에 수집하였다. IFN-b 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 153-154c는 MVA 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40L로부터의 WR199 유전자의 결실이 BMDC에서 IFN 생산을 증가시킨다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다.
도 153은 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔWR199를 생성하기 위한 상동 재조합의 개략도이다. B17L 및 B19R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 2 개의 FRT 부위의 측면에 있는 mcherry에 대한 WR199의 결실 및 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
도 154a는 10의 MOI에서 WT 또는 cGAS-/- 마우스로부터의 PBS, MVA, MVAΔWR199, 또는 열-iMVA 감염된 BMDC에서의 IFNB 유전자 발현을 나타낸다. 도 154b-154c는 BMDC의 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔC11R 감염이 MVAΔE5R 또는 MVA와 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현(도 154b) 및 단백질 분비(도 154c)를 유도한다는 것을 나타낸다. WT 마우스로부터의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA, MVAΔE5R, 또는 MVAΔE5R-hFlt3L-mOX40ΔC11R로 감염시켰다. IFNB 유전자 발현을 평가하기 위해, 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. BMDC로부터의 IFN-β 단백질 분비를 시험하기 위해, 상청액을 감염 후 19 시간에 수집하였다. IFN-β 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 155는 백시니아 바이러스(WR) 게놈의 B1R 및 B3R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 재조합 VACVΔB2R 바이러스를 생성하는 도식을 나타낸다. B1R 및 B3R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 백시니아 바이러스(WR) 게놈으로부터의 B2R 유전자의 결실을 야기한다.
도 156a-156b는 VACVΔB2R이 비강내 감염 모델에서 고도로 약화되었다는 것을 나타낸다. 도 156a는 높은 용량의 VACVΔB2R(H, 2 x 107 pfu), 또는 낮은 용량의 VACVΔB2R(L, 2 x 106 pfu)로 비강내 감염 후 체중 감소를 나타낸다. 도 156b는 높은 용량의 VACVΔB2R(H, 2 x 107 pfu) 또는 낮은 용량의 VACVΔB2R(L, 2 x 106 pfu)을 이용한 비강내 감염된 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 157a-157b는 재조합 VACVΔE3L83NΔB2R, VACVΔE5RΔB2R, 및 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R 바이러스를 생성하는 개략도를 나타낸다. 도 157a는 VACVΔE3L83NΔB2R을 VACVΔE3L83N 게놈으로부터 B2R 유전자의 결실을 야기하는, 백시니아 VACVΔE3L83N 게놈의 B1R 및 B3R 유전자좌에서의 상동 재조합을 통해 생성하였다는 것을 나타낸다. 도 157b는 VACVΔE5RΔB2R 및 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R을 각각 백시니아 VACVΔE5R 또는 VACVΔE3L83NΔE5R 게놈의 B1R 및 B3R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하였다는 것을 나타낸다. B1R 및 B3R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 각각 VACVΔE5R 또는 VACVΔE3L83NΔE5R 게놈으로부터 B2R 유전자의 결실을 야기한다.
도 158은 VACVΔE3L83NΔE5R, VACVΔE5RΔB2R, 및 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R이 비강내 감염 모델에서 고도로 약화된다는 것을 나타낸다. WT 마우스를 2 x 107 pfu의 VACVΔB2R, VACVΔE5R, VACVΔE3L83NΔE5R, VACVΔE5RΔB2R, 또는 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R로 비강내로 감염시키고, 생존 및 체중 감소를 매일 모니터링하였다. 이 도면은 이들 5 개의 상이한 바이러스를 이용한 비강내 감염 후 체중 감소를 나타낸다.
도 159a-159b는 뮤린 BMDC의 VACVΔE5RΔB2R 및 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R 감염이 VACVΔB2R 또는 VACVΔE5R과 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-γ 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 159a는 10의 MOI에서 VACV, VACVΔ83N, VACVΔB2R, VACVΔE5R, VACVΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83NΔE5R, 또는 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R로 감염된 WT 및 cGAS 녹아웃(knockout) BMDC 세포에서의 IFNB 유전자 발현을 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. 도 159b는 10의 MOI에서 VACV, VACVΔ83N, VACVΔB2R, VACVΔE5R, VACVΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83NΔE5R, 또는 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R로 감염된 WT 및 cGAS 녹아웃 BMDC 세포에 의한 IFN-γ 단백질 분비를 나타낸다. 상청액을 감염 후 24 시간에 수집하고 상청액에서 IFN-γ 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 160은 뮤린 BMDC의 VACVΔE5RΔB2R 및 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R 감염이 VACVΔB2R 또는 VACVΔE5R과 비교하여, STING, IRF3 및 TBK1의 더 높은 수준의 인산화를 유도한다는 것을 나타낸다. WT BMDC 세포를 10의 MOI에서 VACV, VACVΔB2R, VACVΔE5R, VACVΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83NΔE5R, 또는 VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R로 감염시켰다. 세포 용해물을 상이한 시점에 수집하였다. STING, IRF3, 및 TBK1의 인산화를 각각 인산화된 STING, IRF3, 및 TBK1에 대한 항체에 의해 검출하였다.
도 161은 먼저 VACVΔE3L83N 게놈의 TK에서, 및 그 다음에 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 항-muCTLA-4 항체, 및 hFlt3L, mOX40L 및 mIL12 단백질을 발현하는 재조합 VACVΔE3L83NΔTKΔE5R 바이러스를 생성하는 단계적 전략의 도식을 나타낸다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L) 제어 하에 항-muCTLA-4 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위한 단일 발현 카세트를 삽입하기 위해 pCB 벡터를 사용하였다. TK-L 및 TK-R 부위에서 발생한 상동 재조합은 VACVΔE3L83N 게놈 상의 TK 유전자좌 내로의 항-muCTLA-4 항체의 발현 카세트의 삽입을 야기한다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L-mOX40L 융합 단백질 및 mIL-12 둘 다를 발현하도록 설계된 2 개의 발현 카세트를 삽입하기 위해 pUC57 벡터를 사용하였다. hFlt3L-mOX40L의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리하였다. mIL12의 p40 및 p30 서브유닛의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리하였다. p30 서브유닛의 C-말단을 기질 결합 서열로 태그하였다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합은 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4 게놈의 E5L 유전자좌 내로의 hFlt3L- mOX40L 및 mIL12에 대한 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
도 162는 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 게놈의 B1R 및 B3R 유전자좌에서 상동 재조합을 통한 B2R 유전자의 결실로 재조합 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스를 생성하는 도식을 나타낸다. B1R 및 B3R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 바이러스 게놈으로부터 B2R 유전자의 결실을 야기하여, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-ΔB2R 바이러스(OV-VACVΔE5RΔB2R)를 생성한다.
도 163은 WT VACV와 비교하여 BSC40 세포에서 재조합 바이러스 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 및 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-ΔB2R(OV-VACVΔE5RΔB2R)의 다단계 성장 곡선을 나타낸다. BSC40 세포를 0.01의 MOI에서 VACV, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12, 및 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-ΔB2R로 감염시켰다. 바이러스 샘플을 상이한 시점에 수집하고 바이러스 역가를 BSC40 세포를 사용하여 확인하였다.
도 164a-164b는 뮤린 BMDC의 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-ΔB2R(OV-VACVΔE5RΔB2R) 감염이 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R)와 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-γ 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. 도 164a는 10의 MOI에서 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-ΔB2R, 또는 열-iMVA로 감염된 WT BMDC 세포에서의 IFNB 유전자 발현을 나타낸다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. 도 164b는 도 164a와 동일한 감염에서 IFN-γ 단백질 분비를 나타낸다. 상청액을 감염 후 24 시간에 수집하고 상청액에서 IFN-γ 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다.
도 165a-165c는 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 감염된 B16-F10 세포 및 바이러스로 주사된 종양에서 트랜스유전자 항-muCTLA-4, mOX40L, 또는 인간 Flt3L의 발현을 나타낸다. 도 165a는 뮤린 항-CTLA-4 및 인간 Flt3L이 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R)-감염된 B16-F10 세포에서 발현된다는 것을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다. FL: 항-muCTLA-4의 전장; HC: 항-muCTLA-4의 중쇄; LC: 항-muCTLA-4의 경쇄. 도 165b는 뮤린 흑색종 세포 B16-F10 상의 mOX40 발현의 FACS 분석의 점 도표를 나타낸다. 세포를 24 시간 동안 10의 MOI에서 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(GFP를 발현함)로 감염시켰다. 바이러스 모의 감염 대조군을 포함시키지 않았다. 세포를 항-mOX40L 항체로 염색하였다. 도 165c는 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 바이러스의 종양내 주사 후 B16-F10 흑색종 종양에서의 mIL-12 발현을 나타낸다. 피내로 이식된 B16-F10 흑색종 종양을 100 μL의 PBS 중 4 x 107 pfu의 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R)로 주사하고, 종양을 처치 후 48 시간에 수집하였다. 종양 샘플을 용해시키고 뮤린 IL-12의 발현을 항-p40 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 시험하였다.
도 166a-166d. 도 166a-166c는 3 개의 상이한 뮤린 암 세포주의 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 바이러스 감염 후 뮤린 IL-12의 발현 및 분비를 나타낸다. 종양 세포를 VACV, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12로 감염시키거나, 모의 감염시켰다. 상청액을 바이러스 감염 후 24 및 48 시간에 수집하고 세포 배양 상청액에서 IL-12의 농도를 ELISA에 의해 확인하였다. 도 166a는 OV-VACVΔE5R-감염된 B16-F10 흑색종 세포에서 mIL-12 수준을 나타낸다. 도 166b는 OV-VACVΔE5R-감염된 4T1 유방암 세포에서 mIL-12 수준을 나타낸다. 도 166c는 OV-VACVΔE5R-감염된 MC38 결장암 세포에서 mIL-12 수준을 나타낸다. 도 166d는 OV-VACVΔE5R로 처치된 마우스에서 혈청 mIL-12 수준을 나타낸다. 바이러스의 종양내 감염 후 48 시간 및 72 시간에, 마우스를 안락사시키고 혈액/혈청을 ELISA에 의한 사이토카인 측정을 위해 수집하였다.
도 167a-167b는 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 단독 또는 항-PD-L1 항체와의 조합의 종양내 전달의 항종양 효능을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 4 x 107 pfu의 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R), 열-iMVA, 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 주 당 2 회 주사하였다. 또한, 마우스 중 하나의 그룹은 IT VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R)와 결합하여 항-PD-L1 항체(250 ㎍)를 1 주 2 회 받았다. 종양 부피 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 도 167a는 PBS 또는 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R), 열-iMVA로 종양내로, 또는 IT VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 (OV-VACVΔE5R) + IP 항-PD-L1의 조합으로 처치된 마우스에서 주사된 및 비-주사된 종양 둘 다의 종양 부피를 나타낸다. 도 167b는 4 개 그룹의 카플란 마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 168a-168b는 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12ΔB2R(OV-VACVΔE5RΔB2R)의 종양내 주사가 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACVΔE5R) 또는 열-iMVA와 비교하여 비장에서 강한 항종양-특이적 T 세포를 생성하였다는 것을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 4 x 107 pfu의 OV-VACVΔE5RΔB2R, OV-VACVΔE5R, 동등한 양의 열-iMVA, 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 3 일 간격으로 2 회 주사하였다. 비장을 2 차 주사 후 2 일에 수집하고, ELISPOT 분석을 수행하여, 비장에서 종양-특이적 T 세포를 평가하였다. 96-웰 플레이트에서 조사된 B16-F10 세포(150,000) 및 비장세포(1,000,000)를 공동-배양함으로써 ELISPOT 분석을 수행하였다. 도 168a: 1,000,000 비장세포 당 IFN-γ+ 스폿의 그래프. 각각의 점은 개별 마우스(n=4)로부터의 비장세포를 나타낸다(*P < 0.05; **P < 0.01, ****P < 0.0001, t 검정). 도 168b: 동일한 처치 그룹에서 마우스로부터의 조합된 비장세포의 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지.
도 169는 먼저 VACVΔE3L83N 게놈의 TK에서, 및 그 다음에 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 항-huCTLA-4 항체, 및 hFlt3L, hOX40L 및 hIL12 단백질을 발현하는 재조합 VACVΔE3L83NΔTKΔE5R 바이러스를 생성하기 위한 단계적 전략의 도식이다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L) 제어 하에 항-huCTLA-4 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위한 단일 발현 카세트를 삽입하기 위해 pCB 벡터를 사용하였다. TK-L 및 TK-R 부위에서 발생한 상동 재조합은 VACVΔE3L83N 게놈의 TK 유전자좌 내로의 항-huCTLA-4 항체의 발현 카세트의 삽입을 야기하며, 이는 N-말단 83 아미노산을 코딩하는 E3L 유전자의 DNA 단편을 결실시킴으로써 생성되었다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L-hOX40L 융합 단백질 및 mIL-12 둘 다를 발현하도록 설계된 2 개의 발현 카세트를 삽입하기 위해 pUC57 벡터를 사용하였다. hFlt3L-mOX40L의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리하였다. hIL12의 p40 및 p30 서브유닛의 코딩 서열을 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리하였다. p30 서브유닛의 C-말단을 기질 결합 서열로 태그하였다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합은 VACVΔE3L83N-ΔTK-항-muCTLA-4 게놈의 E5L 유전자좌 내로의 hFlt3L- hOX40L 및 hIL12에 대한 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
도 170은 myxomaΔM127-mcherry 게놈의 M062R 및 M064R 유전자좌에서 상동 재조합을 통한 M063R 유전자의 결실로 재조합 점액종 바이러스(라우산(Lausanne) 균주)를 생성하는 것뿐 아니라, myxomaΔM127-mcherry 게놈의 M063R 및 M065R 유전자좌에서 상동 재조합을 통한 M064R 유전자의 결실로 재조합 점액종 바이러스(라우산 균주)를 생성하는 도식을 나타낸다. M062R 및 M064R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 바이러스 게놈으로부터 M063R 유전자의 결실을 야기하여, MyxomaΔM063R 바이러스를 생성한다. M063R 및 M065R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 바이러스 게놈으로부터 M064R 유전자의 결실을 야기하여, MyxomaΔM064R 바이러스를 생성한다.
도 171a-171b는 뮤린 BMDC의 MyxomaΔM064R 및 MyxomaΔM063R 감염이 M0127 유전자의 결실을 또한 함유하는 mcherry를 발현하는 모 점액종 바이러스(Myxoma-mcherry)와 비교하여 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-Β 단백질 분비를 유도한다는 것을 나타낸다. BMDC 세포를 10의 MOI에서 Myxoma-mcherry, MyxomaΔM063R, MyxomaΔM064R, 또는 MVA로 감염시켰다. 세포를 감염 후 6 시간에 수집하고 RNA를 추출하였다. 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여, IFNB 유전자의 발현을 시험하였다. 도 171a는 감염된 BMDC에서 IFNB 유전자 발현의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 상청액을 감염 후 24 시간에 수집하고 상청액에서 IFN-Β 단백질 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 도 171b는 감염된 BMDC의 상청액에서 IFN-Β 단백질 수준의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 172-174b는 myxomaΔM064R 또는 myxoma-mcherry의 종양내 주사가 B16-F10 흑색종 모델에서 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 야기한다는 것을 나타내는 데이터의 일련의 그래픽적 표현이다. 도 172는 실험 도식을 나타낸다. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 후 7 일에, 2 x 107 pfu의 Myxoma-mCherry, MyxomaΔM064R, MVAΔE5R 또는 PBS를 우측 옆구리 상의 대규모 종양 내에 종양내로(IT) 주사하였다. 주사 후 2 일에, 주사된 종양을 단리시키고 종양 침윤성 림프구를 FACS에 의해 분석하였다. 도 172는 myxomaΔ0M64R 또는 myxoma-mcherry의 종양내 주사가 B16-F10 흑색종 모델에서 이펙터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 야기한다는 것을 나타낸다.
도 173a는 Myxoma-mCherry, MyxomaΔM064R, MVAΔE5R 또는 PBS 처치를 이용한 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 173b는 주사된 종양에서 CD45+ 세포의 절대 수의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-8). 도 173c는 CD8+ T 세포 중 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-8)(*P < 0.05, t 검정).
도 174a는 Myxoma-mCherry, MyxomaΔM064R, MVAΔE5R 또는 PBS 처치를 이용한 주사된 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 나타낸다. 도 174b는 CD4+ 세포 중 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율의 그래프를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM이다(n=5-8)(**P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001, t 검정).
상세한 설명
본 기술의 특정 양태, 방식, 실시양태, 변형, 및 특징은 본 기술의 실질적 이해를 제공하기 위해 다양한 상세 수준으로 하기에 기재된다는 것을 이해해야 한다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 특정 용어의 정의가 하기에 제공된다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 기술이 속하는 업계의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나", "한", 및 "그"는 내용이 달리 명확하게 지시되지 않는 경우, 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 언급은 2 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 측정에서 발생할 수 있고 통상의 기술자에게 명확할 실험 오차의 범위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아쥬반트"는 종양 항원을 포함한 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 향상시키거나, 증가시키거나, 강화시키는 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 약제 또는 약물의 "투여"는 대상체에 화합물을 도입하거나 전달하여, 이의 의도된 기능을 수행하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는, 비제한적으로, 경구, 비강내, 비경구적(정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 또는 피하), 직장, 척추강내, 종양내, 또는 국부를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)이 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 다른 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 종양 항원-함유 전세포 백신에서와 같이 전체 세포 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 암-관련 항원 또는 신생항원을 포함하고 종양 또는 비-종양 암에 의해 발현된 단백질 또는 다른 분자, 예컨대 암 세포 내에 존재하지만 비-암 세포 내에 부재하는 분자, 및 비-암 세포와 비교하여 암 세포에서 상향-조절되는 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 바이러스와 결합되어 사용된 "약화된"은 비-약화된 대응물과 비교하여 감소된 독력 또는 병원성을 갖지만, 여전히 생존가능하거나 살아있는 바이러스를 지칭한다. 통상적으로, 약화는 감염원, 예컨대 바이러스가 비-약화된 바이러스와 비교하여 감염된 대상체에 대해 덜 유해하거나 독성이 되게 한다. 이는 사멸되거나 완전히 불활성화된 바이러스와 대조된다.
본원에 사용된 바와 같이, "합동 투여(conjoint administration)"는 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00010
)와 조합된 제2 치료 양상의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 면역 체크포인트 차단제, 면역조절제, 및/또는 항암 약물은 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00011
)와 인접한 시간적 근접성으로 투여된다. 예를 들어, PD-1/PD-L1 억제제 및/또는 CTLA-4 억제제(더욱 구체적인 실시양태에서, 항체)는 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00012
)와 동시에(즉, 일제히)(
Figure pct00013
이 상기 기술된 바와 같이 종양내로 또는 전신으로 투여될 때, 정맥내 또는 종양내 주사에 의함) 또는
Figure pct00014
투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00015
투여 및 면역 체크포인트 차단제, 면역조절제, 및/또는 항암 약물이 약 1 내지 약 7 일 간격 또는 최대 3 주 간격으로 투여되는 경우, 이는 본원에 기술된 바와 같이 여전히 "인접한 시간적 근접성" 내에 있을 것이므로, 이러한 투여는 "합동"으로서 적격할 것이다.
용어 "상응하는 야생형 균주" 또는 "상응하는 야생형 바이러스"는 본원에서 조작된 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스가 유래된 야생형 MVA, 백시니아 바이러스(VACV), 또는 점액종 바이러스(MYXV) 균주를 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 야생형 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스는 특정 관심 유전자를 파괴하거나 결실(녹 아웃)시키고/시키거나 이종 핵산을 발현하도록 조작된 균주 또는 바이러스이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 야생형 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스는 C7 유전자를 파괴하거나 결실(녹 아웃)시키고 OX40L을 발현하도록 조작된 균주 또는 바이러스이다. 다른 실시양태에서, 야생형 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스는 E5R(또는 M31R) 유전자를 파괴하거나 결실(녹 아웃)시키도록 조작된 균주 또는 바이러스이다. 조작된 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스는 C7 유전자를 파괴하거나 결실(녹 아웃)시키고 OX40L을 발현하도록 단독으로 변형되거나 본원에 기재된 바와 같은 추가 변형(예를 들어, 추가 면역조절 단백질을 발현하고/하거나 추가 유전자 결실을 포함하도록 조작됨)과 조합되어 변형되었을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 조작된 MVA, 백시니아, 또는 점액종 균주 또는 바이러스는 E5R(또는 M31R) 유전자를 파괴하거나 결실(녹 아웃)시키도록 단독으로 변형되거나 본원에 기재된 바와 같은 추가 변형(예를 들어, 추가 면역조절 단백질을 발현하고/하거나 추가 유전자 결실을 포함하도록 조작됨)과 조합되어 변형되었을 수 있다. 용어 "상응하는 MVAΔE3L 균주" 또는 "상응하는 MVAΔE3L 바이러스"는 본원에서 E3L 결실 단독을 갖는 MVA 균주 또는 바이러스(즉, 다른 유전자 결실 또는 첨가를 포함하지 않는 MVAΔE3L 균주 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "상응하는 MVAΔC7L 균주" 또는 "상응하는 MVAΔC7L 바이러스"는 본원에서 C7L 결실 단독을 갖는 MVA 균주 또는 바이러스(즉, 다른 유전자 결실 또는 첨가를 포함하지 않는 MVAΔC7L 균주 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "상응하는 MVAΔE5R 균주" 또는 "상응하는 MVAΔE5R 바이러스"는 본원에서 E5R 결실 단독을 갖는 MVA 균주 또는 바이러스(즉, 다른 유전자 결실 또는 첨가를 포함하지 않는 MVAΔE5R 균주 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "상응하는 VACVΔC7L 균주" 또는 "상응하는 VACVΔC7L 바이러스"는 본원에서 C7L 결실 단독을 갖는 백시니아 균주 또는 바이러스(즉, 다른 유전자 결실 또는 첨가를 포함하지 않는 VACVΔC7L 균주 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "상응하는 VACVΔE5R 균주" 또는 "상응하는 VACVΔE5R 바이러스"는 본원에서 E5R 결실 단독을 갖는 백시니아 균주 또는 바이러스(즉, 다른 유전자 결실 또는 첨가를 포함하지 않는 VACVΔE5R 균주 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전달하는" 및 "접촉하는"은 종양에 대한 국소 투여(종양내)에 의하든지 또는 예를 들어, 정맥내 투여에 의하든지, 본 발명의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00016
)를 종양 미세환경 내에 두는 것을 지칭한다. 상기 용어는 종양 그 자체에 도달하는 조작된 바이러스(예를 들어,
Figure pct00017
)에 초점을 맞춘다. 일부 실시양태에서, "전달하는"은 투여하는 것과 동의어이지만, 이는 염두한 특정 투여 현장, 예를 들어, 종양내에 대해 사용된다.
용어 "파괴" 및 "돌연변이"는 본원에서 유전자 물질에서 검출 가능하거나 상속 가능한 변화를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 돌연변이는 삽입, 결실, 치환(예를 들어, 전이, 전환), 전위, 도치, 녹아웃, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드(예를 들어, 점 돌연변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성)만을 포함하거나 다중 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 침묵적이며, 즉 돌연변이의 표현형 효과는 검출되지 않는다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 표현형 변화를 야기하며, 예를 들어 코딩된 생산물의 발현 수준이 변경되거나, 코딩된 생산물 자체가 변경된다. 일부 실시양태에서, 파괴 또는 돌연변이는 야생형 균주와 비교하여 유전자 생산물(예를 들어, 단백질 또는 RNA)의 발현의 감소된 수준을 갖는 파괴된 유전자를 야기할 수 있다. 다른 실시양태에서, 파괴 또는 돌연변이는 야생형 균주로부터의 발현된 단백질의 활성과 비교하여 낮은 활성을 갖는 발현된 단백질을 야기할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 1 회 이상의 투여량으로 일정 기간 동안 투여될 때, 질환을 완화시키거나, 치유하거나, 증상완화시키는데 소망하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 약제의 충분한 양을 지칭한다. 본 발명에서, 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00018
)의 유효량은 (적합한 기간 동안 적합한 빈도로 투여될 때) 암 세포의 수를 감소시키거나; 종양 크기를 감소시키거나 종양을 근절시키거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제하고/하거나(즉, 늦추거나 정지시키고/시키거나); 전이 성장을 억제하고/하거나(즉, 늦추거나 정지시키고/시키거나); 종양 성장을 억제하고/하거나(안정화시키거나 저지하고/하거나); 종양을 치료하게 하고/하거나; 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 촉진하는 양을 포함한다. 임의의 개별 사례에서 적절한 치료적 양은 본 발명을 고려하여 일상적 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다. 이러한 확인은 시험관내에서(in vitro) 효과적인 것으로 밝혀진 양 및 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 양으로 개시할 수 있다. 치료적 유효량은 초기에 배양액에서 세포에 이득을 부여하는 것으로 밝혀진 농도 또는 농도들을 기초로 하여 확인될 것이다. 유효량은 세포 배양액 내에서의 데이터로부터 추정될 수 있고 본원에 상세화된 바와 같은 인자를 기초로 하여 상향 또는 하향 조정될 수 있다. 바이러스 구축물의 유효량은 일반적으로 약 105 내지 약 1010 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내에 있으나, 더 낮거나 높은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 106-109 pfu이다. 일부 실시양태에서, 단위 투여량은 1 내지 10 mL 범위 내의 부피로 투여된다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가는 사용되는 구체적인 pfu 적정 방법에 따라 상이할 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 개 바이러스 입자와 동등하다. 바이러스를 보유한 치료적 유효량의 hFlt3L 트랜스유전자의 치료적 유효량은 처방된 기간 동안 처방된 투여 빈도로 하나 이상의 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 바이러스를 보유한 hFlt3L의 치료적 유효량은 인자, 예컨대 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 일반 조건, 및 특정 암에 대해 특정 대상체에서 소망하는 면역학적 반응을 유도하는 바이러스 구축물의 효능에 따라 달라질 수 있다.
특히, 본원에 개시된 바이러스-계 면역자극제에 대해, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 종양 세포 성장을 감소시키거나, 억제하거나, 폐지시켜, 종양을 감소시키거나 근절하기에 충분하거나, 시험관내에서, 생체외에서, 또는 대상체에서 전이성 확산을 억제하거나, 감소시키거나, 폐지시키거나 결국 사례가 있을 수 있는 전이성 확산 감소, 억제, 및/또는 폐지 중 하나 이상을 야기할 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 촉진하기에 충분한 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00019
)를 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 종양 세포 성장의 감소, 억제, 또는 근절은 괴사, 아폽토시스, 또는 면역 반응, 또는 상술한 것 중 2 이상의 조합의 결과일 수 있다(그러나, 아폽토시스의 침강은 예를 들어, 종양세포붕괴성 바이러스로 관찰된 바와 동일한 인자로 인한 것이 아닐 수 있음). 치료적 유효량인 양은 조성물에서 사용된 특정 바이러스, 치료되는 대상체의 연령 및 조건, 종양 형성의 정도, 다른 치료 양상의 존재 또는 부재 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유사하게는, 투여될 조성물의 투여량 및 이의 투여 빈도는 활성 성분의 효능, 일단 투여될 때 이의 활성의 기간, 투여의 경로, 대상체의 크기, 연령, 성별, 및 신체적 조건, 역반응의 위험 및 전문의의 판단과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 조성물은 주사액과 같은 다양한 투여량 형태로 투여된다.
특히, 면역 체크포인트 억제제와의 병용 요법에 대해, 면역 체크포인트 차단제에 대한 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 종양 미세환경에서 면역 억제를 역전시키거나 감소시키고 치료되는 대상체에서 숙주 면역을 활성화시키거나 향상시키기에 충분한 면역 체크포인트 차단제의 양을 의미한다. 면역 체크포인트 차단제는, 비제한적으로, CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원 4)와 같은 CD28 억제제에 대한 억제성 항체(예를 들어, 이필리무맙), 항-PD-1(프로그램된 사멸 1) 억제성 항체(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙), 및 항-PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1) 억제성 항체(MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180)뿐 아니라, LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-3), B7-H3, TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체), AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, 또는 PDR001, 및 이의 조합에 대한 억제성 항체를 포함한다. 상술한 것의 투여량 범위는 몇몇 투여 임상 시험이 완료되어, 다른 약제에 대한 추정이 가능하게 하였기 때문에, 알려져 있거나 이미 통상의 기술 내에 있다.
일부 실시양태에서, 종양은 특정 체크포인트를 발현하지만, 본 기술의 맥락에서, 이는 면역 체크포인트 차단제가 종양 세포, 기질 세포, 및 종양-침윤성 면역 세포에 의해 유도되는, 종양 내에서 면역 억제 메커니즘을 더욱 일반적으로 차단하기 때문에 반드시 필요한 것은 아니다.
예를 들어, CTLA-4 억제제 이필리무맙은 흑색종에서 수술 후 아쥬반트 요법으로서 투여될 때, 총 4 회 용량에 대해 3 주마다 3 mg/kg의 총 주입량에 대해 90 분에 걸쳐 1-2 mg/mL로 투여된다. 이 요법은 보통 중증이며, 또한 생명을 위협하는 면역-매개된 역반응을 수반하며, 이는 허용량뿐 아니라, 투여될 수 있는 누적량을 제한한다. 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00020
)와 합동으로 투여될 때, 이필리무맙의 용량 및/또는 누적량을 감소시키는 것이 가능할 것으로 예상된다. 특히, 하기 기재된 실험 결과를 고려하면, 상술한 MVA 바이러스 하나 또는 둘 다와 합동으로 종양에 직접 투여되는 경우, CTLA-4 억제제의 용량을 추가로 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 이필리무맙에 대해 상기 제공된 양은 합동 투여에서 환자에게 주어질 특정 투여량 및 누적량을 결정하기 위한 출발점일 수 있다.
다른 예로서, 펨브롤리주맙은 25 mg/mL로 희석된 흑색종에서 아쥬반트 요법으로서의 투여를 위해 처방된다. 이는 3 주마다 30 분에 걸쳐 2 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 이는 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00021
)의 합동 투여에서 투여량 및 투여를 결정하기 위한 출발점일 수 있다.
니볼루맙이 또한 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00022
)와 조합되어 투여되는 체크포인트 억제제의 투여량 및 투여 요법을 결정하는데 출발점으로서 제공될 수 있다. 니볼루맙은 2 주마다 30 분에 걸쳐 정맥내 주입으로서 3 mg/kg의 투여로 처방된다.
면역 제극제, 예컨대 작용제 항체가 또한 암에 대한 면역요법으로서 탐구되어 왔다. 예를 들어, 항-ICOS 항체는 ICOS의 세포외 도메인에 결합하여, ICOS 시그널링의 활성화 및 T-세포 활성화를 야기한다. 항-OX40 항체는 OX40에 결합하고 T-세포 수용체 시그널링을 강화하여, T-세포 활성화, 증식 및 생존을 야기할 수 있다. 다른 예는 4-1BB(CD137), GITR에 대한 작용제 항체를 포함한다.
면역 자극 작용제 항체는 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00023
)의 종양내 주사와 조합하여 전신으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 면역 자극 작용제 항체는 동시에(즉, 일제히) 또는 순차적으로 종양내 전달을 통해 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00024
)와 합동하여 사용될 수 있다.
용어 "면역조절 약물"은 본원에서 핑골리모드(FTY720)를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "조작된" 또는 "유전적으로 조작된"은 본원에서 예를 들어, 게놈의 파괴에 의해 유전적으로 변경되거나, 변형되거나, 변화되도록 처리된 유기체를 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "조작된 백시니아 바이러스 균주", "조작된 변형된 백시니아 앙카라 바이러스", 또는 "조작된 점액종 바이러스"는 유전적으로 변경되거나, 변형되거나, 변화되도록 처리된 백시니아, 변형된 백시니아 앙카라, 또는 점액종 균주를 지칭한다. 본 맥락에서, "조작된" 또는 "유전적으로 조작된"은 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 변형된 백시니아 앙카라 바이러스, 및 재조합 점액종 바이러스를 포함한다.
용어 "유전자 카세트"는 본원에서 DNA 서열의 하나 이상의 선택된 제한 부위 사이에 삽입될 수 있는 하나 이상의 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L, 선택 가능한 마커, 또는 이의 조합)를 코딩하고 발현할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 카세트의 삽입은 유전자 파괴를 야기한다. 일부 실시양태에서, 유전자의 파괴는 유전자의 적어도 일부를 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L, 선택 가능한 마커, 또는 이의 조합)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 카세트로 치환하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종 핵산"은 바이러스 내로 도입되고, 도입된 바이러스에서 자연적으로 발견되는 서열의 복제물이 아닌 핵산, DNA, 또는 RNA를 지칭한다. 이러한 이종 핵산은 도입된 바이러스에서 자연적으로 발견되는 서열의 복제물인 세그먼트를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 유전자가 기재된 어디서든, 유전자는 인간 또는 뮤린일 수 있어, 인간(h 또는 hu) 또는 뮤린(m 또는 mu)의 표시는 상호교환적으로 사용될 수 있고 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, mIL-12가 기재되는 경우, hIL-12는 기재된 구축물에서 mIL-12로 치환될 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다.
본원에 사용된 바와 같이, "IL-15/IL-15Rα"는 Van den Bergh et al. (Pharmacology & Therapeutics 170:73-79 (2017); Kowalsky et al. (Molecular Therapy 26(10):2476-2486 (2018); Stoklasek et al. (J. Immunol. 177:6072-6080); Duboi et al. (J. Immunol. 180:2099-2106 (2008); Epardaud et al, (Cancer Res. 68:2972-2983 (2008); 및 Dubois et al. (Immunity 17:537-547 (2002)에 기재된 바와 같은 막 결합된 hIL-15/IL-15Rα 경유제시(transpresentation) 구축물 및 융합 단백질을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역 체크포인트 억제제" 또는 "면역 체크포인트 차단제" 또는 "면역 체크포인트 차단 억제제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질의 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나, 억제하거나, 간섭하거나, 조절하는 분자를 지칭한다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 체크포인트 단백질은, 비제한적으로, CD28 수용체 패밀리 멤버, CTLA-4 및 이의 리간드 CD80 및 CD86; PD-1 및 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2; LAG3, B7-H3, B7-H4, TIM3, ICOS, II DLBCL, BTLA 또는 상술한 것 중 2 이상의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 면역 체크포인트 차단제의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원 4)와 같은 CD28 억제제에 대한 억제성 항체(예를 들어, 이필리무맙), 항-PD-1(프로그램된 사멸 1) 억제성 항체(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙), 및 항-PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1) 억제성 항체(MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180)뿐 아니라, LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-3), B7-H3, TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체), AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, 또는 BTLA, PDR001, 및 이의 조합에 대한 억제성 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역 반응"은 암성 세포, 전이성 종양 세포 등에 대한 선택적 손상, 이의 파괴, 또는 이의 인체로부터의 제거를 야기하는 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인, 및 보체를 포함함) 중 하나 이상의 작용을 지칭한다. 면역 반응은 세포 반응, 예컨대 세포의 변경(조절, 예를 들어 상당한 향상, 자극, 활성화, 손상, 또는 억제)인 T-세포 반응, 즉 T-세포 기능을 포함할 수 있다. T-세포 반응은 특정 유형의 T-세포, 또는 T-세포의 서브세트, 예를 들어 이펙터 CD4+, CD4+ 헬퍼, 이펙터 CD8+, CD8+세포독성, 또는 천연 킬러(NK) 세포의 생성, 증식 또는 확장, 자극을 포함할 수 있다. 이러한 T-세포 서브세트는 하나 이상의 세포 수용체 또는 세포 표면 분자(예를 들어, CD 또는 분화 분자의 군집)를 검출함으로써 확인될 수 있다. T-세포 반응은 또한 다른 세포의 분화 또는 증식에 영향을 주는 가용성 매개체(예를 들어, 사이토카인, 림포카인, 사이토카인 결합 단백질, 또는 인터류킨)와 같은 세포 인자의 변경된 발현(통계적으로 상당한 증가 또는 감소)을 포함할 수 있다. 예를 들어, I 형 인터페론(IFN-α/β)은 선천성 면역의 중요한 조절제이다(Huber et al., Immunology 132(4):466-474 (2011)). 동물 및 인간 연구는 항원 인식 및 항-종양 면역 반응의 초기 단계 동안 CD4+ 및 CD8+ T-세포 둘 다의 운명에 직접 영향을 주는데 있어서 IFN-α/β에 대한 역할을 나타냈다.I 형 IFN은 수지상 세포, 및 결국 선천성 면역계의 보초의 활성화에 대한 반응에서 유도된다.
용어 "면역원성 조성물"은 본원에서 조성물에 노출된 포유동물에서 면역 반응을 유도할 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은
Figure pct00025
, 항원, 상술한 조작된 바이러스 중 임의의 하나 이상을 포함하는 아쥬반트, 및/또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L, MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L, MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L, 및/또는 열-iMVAΔE5R을 포함하는 아쥬반트 단독 또는 면역 체크포인트 차단 억제제와의 조합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 조성물은 백신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 종양 항원-함유 전세포 백신(예를 들어, 조사된 전세포 백신)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불활성화된 MVA"는 감염성, 비복제성이고, 감염된 DC 세포에서 I 형 IFN을 억제하지 않는 열-불활성화된 MVA(열-iMVA) 및/또는 UV-불활성화된 MVA를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불활성화된 백시니아 바이러스"는 열-불활성화된 백시니아 바이러스 및/또는 UV-불활성화된 백시니아 바이러스를 포함한다. 열 및 UV 방사선의 조합에 의해 불활성화된 MVA 또는 백시니아 바이러스가 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "열-불활성화된 MVA"(열-iMVA) 및 "열-불활성화된 백시니아 바이러스"는 각각 이의 면역원성 또는 표적 세포(종양 세포)에 들어가는 이의 능력을 파괴하지 않지만, 바이러스의 잔류 복제 능력을 제거할 뿐 아니라, 숙주의 면역 반응을 억제하는 인자를 억제하는 조건 하에서 열 처치에 노출된 MVA 및 백시니아 바이러스를 지칭한다. 이러한 조건의 예는 약 1 시간의 기간 동안 약 50 내지 약 60℃ 범의 내의 온도에 대한 노출이다. 다른 시간 및 온도는 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "UV-불활성화된 MVA" 및 "UV-불활성화된 백시니아 바이러스"는 각각 이의 면역원성 또는 표적 세포(종양 세포)에 들어가는 이의 능력을 파괴하지 않지만, 바이러스의 잔류 복제 능력을 제거하는 조건 하에서 UV에 대한 노출에 의해 불활성화된 MVA 및 백시니아 바이러스를 지칭한다. 본 방법에 유용할 수 있는 이러한 조건의 예는 예를 들어, 약 30 분 내지 약 1 시간의 기간 동안 365 nm UV 전구를 사용한 UV에 대한 노출이다. UV 파장 및 노출의 이들 조건의 다른 제한은 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다.
"녹 아웃", "녹 아웃된 유전자", 또는 "유전자 결실"은 삭제 돌연변이(예를 들어, 유전자에 의해 코딩된 야생형 생산물이 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성임)를 포함하는 유전자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 녹 아웃된 유전자는 이종 서열(예를 들어, 이종 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트) 또는 유전자 자체의 유전적으로 조작된 비-기능성 서열을 포함하며, 이는 유전자가 비-기능성이 되게 한다. 다른 실시양태에서, 녹 아웃된 유전자는 야생형 유전자의 일부가 결여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 60%의 야생형 유전자 서열이 결실된다. 다른 실시양태에서, 녹 아웃된 유전자는 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%의 야생형 유전자 서열이 결여된다. 다른 실시양태에서, 녹 아웃된 유전자는 최대 100%의 야생형 유전자 서열를 포함할 수 있지만(예를 들어, 야생형 유전자 서열의 일부 부분이 결실될 수 있음), 이에 삽입된 하나 이상의 이종 및/또는 비-기능성 핵산 서열을 또한 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "전이"는 원발성 부위로부터 신체 내의 이웃한 조직 또는 원거리 위치로의 암의 확산을 지칭한다. 암 세포(암 줄기 세포를 포함함)는 원발성 종양으로부터 탈피하고, 림프구 및 혈관에 침투하고, 혈류를 통해 순환하고, 신체 내 어디에서든 정상 조직에서 성장할 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 분리되고, 혈류 또는 림프관을 통해 이동하고, 원거리 부위에서 정지하는 종양 세포(또는 암 줄기 세포)에 달린 순차적 과정이다. 다른 부위에서 암 세포가 혈관 또는 림프관 벽을 통해 재-침투하게 되면, 증식을 계속하고, 결국 새로운 종양(전이성 종양)을 형성한다. 일부 실시양태에서, 이 새로운 종양은 전이성(또는 이차) 종양으로서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, "MVA"는 "변형된 백시니아 앙카라"를 의미하고 앙카라 균주로부터 유래되고 백신 및 백신 아쥬반트로서 사용하기 위해 개발된 백시니아의 고도로 약화된 균주를 지칭한다. 본래의 MVA는 닭 배아 세포를 통한 연속 계대에 의해 야생형 앙카라 균주로부터 단리되었다. 처리되어, 이는 영장류(인간을 포함함) 세포에서 효율적으로 복제하는 이의 능력을 포함하여 야생형 백시니아의 게놈의 약 15%를 소실하였다. (Mayr et al., Zentralbl Bakteriol B 167:375-390 (1978)). MVA는 감염성 질환 또는 종양에 대한 유전자 또는 백신접종 전달을 위한 재조합 벡터로서 개발을 위해 적절한 후보로 고려된다. (Verheust et al., Vaccine 30(16):2623-2632 (2012)). MVA는 178 kb 길이의 게놈 및 Antoine et al., Virol. 244(2): 365-396 (1998)에 처음 개시된 서열을 갖는다. 서열은 또한 GenBank 수탁번호 U94848.1(서열번호 1)에 개시되어 있다. 임상 등급 MVA는 Bavarian Nordic A/S Kvistgaard, Denmark로부터 상업적으로 및 공개적으로 이용 가능하다. 또한, MVA는 ATCC, Rockville, MD, 및 CMCN(Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes) Paris, France로부터 이용 가능하다.
용어 "MVAΔC7L"은 C7 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔC7L"은 기능성 C7L 유전자가 결여되고 감염성이지만, 비-복제성이고 숙주의 면역계를 회피하는 이의 능력이 추가로 손상된 MVA의 결실 돌연변이체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔC7L"은 기능성 C7 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔC7L 돌연변이체는 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔC7L"은 MVA 게놈에서 C7의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MVAΔC7L-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)("MVAΔC7L-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 MVA 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MVAΔC7L 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 MVA 게놈의 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MVAΔC7L-OX40L-TK(-)"; "MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MVAΔC7L은 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 MVA 바이러스("MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 추가 이종 유전자, 예컨대 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L(여기서, "h" 또는 "hu"는 인간 단백질을 표시함) 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40은 E5R의 결실을 포함하고, E5R 유전자가 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 선택 가능한 마커(예를 들어, mCherry)로 치환되도록 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, MVAΔC7L은 E5R 유전자좌와 같이 다른 유전자좌 내부로부터 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔC7L은 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFtl3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 추가 이종 유전자 및/또는 바이러스의 명칭에 구체적으로 언급된 것 이외의 바이러스 유전자 돌연변이를 함유하지 않는다.
용어 "MVAΔE3L"은 기능성 E3L 유전자가 결여되고 감염성이지만, 비-복제성이고 숙주의 면역계를 회피하는 이의 능력이 추가로 손상된 MVA의 결실 돌연변이체를 의미한다. 이는 종양 또는 바이러스 항원을 전달하기 위한 백신 벡터로서 사용되어 왔다. 돌연변이체 MVA E3L 녹아웃 및 이의 제조는 예를 들어, 미국 특허 제7,049,145호에 기재되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔE3L"은 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 변형된 재조합 MVA("MVAΔE3L-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE3L 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MVAΔE3L-OX40L-TK(-)"; "MVAΔE3L-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 추가 이종 유전자, 예컨대 임의의 하나 이상의 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 추가로 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 언급된 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "MVAΔE5R"은 E5R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔE5R"은 기능성 E5R 유전자가 결여되고 감염성이지만, 비-복제성이고 숙주의 면역계를 회피하는 이의 능력이 추가로 손상된 MVA의 결실 돌연변이체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔE5R"은 기능성 E5 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔE5R 돌연변이체는 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔE5R"은 MVA 게놈에서 E5R 의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 38,432 내지 39,385)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MVAΔE5R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)("MVAΔE5R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 MVA 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R은 E5R 유전자좌가 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된 재조합 MVA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔE5R은 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFtl3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MVA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 MVA 게놈의 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MVAΔE5R-OX40L-TK(-)"; "MVAΔE5R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MVAΔE5R은 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 MVA 바이러스("MVAΔE5R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 MVAΔE5R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L(여기서, "h" 또는 "hu"는 인간 단백질을 표시함) 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 MVAΔE5R 바이러스는 추가 이종 유전자 및/또는 바이러스의 명칭에 구체적으로 언급된 것 이외의 바이러스 유전자 돌연변이를 함유하지 않는다.
용어 "MVAΔWR199"는 본원에서 WR199 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔWR199"는 기능성 WR199 유전자가 결여되고 감염성이지만, 비-복제성이고 숙주의 면역계를 회피하는 이의 능력이 추가로 손상된 MVA의 결실 돌연변이체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔWR199"는 기능성 E5 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔWR199 돌연변이체는 WR199 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MVAΔWR199"는 MVA 게놈에서 WR199 의 위치(예를 들어, GenBank 수탁번호 AY603355에 기재된 서열의 위치 158,399 내지 160,143)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MVAΔWR199-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)("MVAΔWR199-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 MVA 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVAΔWR199는 WR199 유전자좌가 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된 재조합 MVA를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔWR199는 WR199 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFtl3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MVAΔWR199-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MVA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MVAΔWR199 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 MVA 게놈의 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MVAΔWR199-OX40L-TK(-)"; "MVAΔWR199-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MVAΔWR199는 WR199 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 MVA 바이러스("MVAΔWR199-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 MVAΔWR199 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L(여기서, "h" 또는 "hu"는 인간 단백질을 표시함) 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; 및/또는 N2L 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 MVAΔWR199 바이러스는 추가 이종 유전자 및/또는 바이러스의 명칭에 구체적으로 언급된 것 이외의 바이러스 유전자 돌연변이를 함유하지 않는다.
용어 "VACVΔC7L"은 본원에서 C7 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 백시니아 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔC7L"은 기능성 C7L 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve)(WR) 균주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ΔC7L 돌연변이체는 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔC7L"은 VACV 게놈에서 C7L의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 15,716 내지 16,168)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("VACVΔC7L-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("VACVΔC7L-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 백시니아 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, VACVΔC7L 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("VACVΔC7L-OX40L-TK(-)"; "VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, VACVΔC7L은 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 백시니아 바이러스("VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 추가 이종 유전자, 예컨대 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 기술의 개시내용은 재조합 VACVΔ E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-ΔC7L-OX40L 바이러스를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "VACVΔE5R"은 본원에서 E5R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 백시니아 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔE5R"은 기능성 E5 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(WR) 균주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ΔE5R 돌연변이체는 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔE5R"은 VACV 게놈에서 E5R의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 49,236 내지 50,261)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("VACVΔE5R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("VACVΔE5R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 백시니아 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("VACVΔE5R-OX40L-TK(-)"; "VACVΔE5R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, VACVΔE5R은 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 백시니아 바이러스("VACVΔE5R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 VACVΔE5R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 기술의 개시내용은 재조합 VACVΔE3L-hFlt3L-항-CTLA-4-OX40L-ΔE5R 바이러스를 제공한다. 다른 예로서, 일부 실시양태에서, 백시니아 게놈의 TK 유전자좌는 항-CTLA-4와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 발현하도록 상동 재조합을 통해 변형되며, 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, VACV-TK(-)-항-CTLA-4를 생산한다. 일부 실시양태에서, VACV-TK(-)-항-CTLA-4 게놈은 E5R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환된 E5R의 결실을 포함하고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, VACV-TK--항-CTLA-4-E5R--hFlt3L-OX40L(또는 VACVΔE5R-TK(-)-항-CTLA-4-hFlt3L-OX40L)과 같은 재조합 바이러스를 형성하도록 추가로 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 VACVΔE5R 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "VACVΔB2R"은 본원에서 B2R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 백시니아 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔB2R"은 기능성 B2 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(WR) 균주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, ΔB2R 돌연변이체는 B2R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "VACVΔB2R"은 VACV 게놈에서 B2R의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 164,856 내지 165,530)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("VACVΔB2R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("VACVΔB2R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 백시니아 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 백시니아 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("VACVΔB2R-OX40L-TK(-)"; "VACVΔB2R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, VACVΔB2R은 B2R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 백시니아 바이러스("VACVΔB2R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 VACVΔB2R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 예로서, 일부 실시양태에서, 백시니아 게놈의 TK 유전자좌는 항-CTLA-4와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 발현하도록 상동 재조합을 통해 변형되며, 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, VACV-TK(-)-항-CTLA-4를 생산한다. 일부 실시양태에서, VACV-TK(-)-항-CTLA-4 게놈은 B2R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환된 B2R의 결실을 포함하고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되도록 추가로 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 VACVΔB2R 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "MYXVΔM31R"은 본원에서 M31R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 점액종 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 점액종 바이러스 M31R은 백시니아 바이러스 E5R의 올소로그이다. 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM31R"은 기능성 M31R 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스(MYXV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔM31R 돌연변이체는 M31R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM31R"은 MYXV 게놈에서 M31R의 위치(예를 들어, MYXV 게놈의 위치 30,138 내지 31,319)에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MYXVΔM31R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("MYXVΔM31R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 점액종 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R은 M31R 유전자좌가 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된 재조합 MYXV를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R은 M31R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MYXVΔM31R-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MYXV를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 점액종 게놈의 위치 57,797 내지 58,333) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MYXVΔM31R-OX40L-TK(-)"; "MYXVΔM31R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R은 M31R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 점액종 바이러스("MYXVΔM31R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 MYXVΔM31R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실의 점액종 올소로그 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 MYXVΔM31R 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "MYXVΔM63R"은 본원에서 M63R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 점액종 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM63R"은 기능성 M63R 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스(MYXV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔM63R 돌연변이체는 M63R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM63R"은 MYXV 게놈에서 M63R의 위치에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MYXVΔM63R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("MYXVΔM63R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 점액종 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R은 M63R 유전자좌가 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된 재조합 MYXV를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R은 M63R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MYXVΔM63R-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MYXV를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 점액종 게놈의 위치 57,797 내지 58,333) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MYXVΔM63R-OX40L-TK(-)"; "MYXVΔM63R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R은 M63R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 점액종 바이러스("MYXVΔM63R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 MYXVΔM63R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실의 점액종 올소로그 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R은 추가 점액족 유전자 결실(예를 들어, ΔM31R, ΔM62R, 및/또는 ΔM64R)을 포함하도록 추가로 조작된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 MYXVΔM63R 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
용어 "MYXVΔM64R"은 본원에서 M64R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성인(예를 들어, 삭제-돌연변이인) 바이러스를 포함하는 점액종 돌연변이체 바이러스 또는 백신을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM64R"은 기능성 M64R 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스(MYXV)를 포함한다. 일부 실시양태에서, ΔM64R 돌연변이체는 M64R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, "MYXVΔM64R"은 MYXV 게놈에서 M64R의 위치에 상응하는 핵산 서열이 인간 OX40L("MYXVΔM64R-OX40L") 또는 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L) 유전자("MYXVΔM64R-hFlt3L")와 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된 재조합 점액종 바이러스 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM64R은 M64R 유전자좌가 하나 이상의 이종 유전자를 발현하도록 변형된 재조합 MYXV를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MYXVΔM64R은 M64R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, "MYXVΔM64R-hFlt3L-OX40L"과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MYXV를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM64R 바이러스는 기능성 티미딘 키나아제(TK) 단백질을 발현하지 않는 재조합 점액종 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 TK 유전자좌(예를 들어, 점액종 게놈의 위치 57,797 내지 58,333) 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앤다("MYXVΔM64R-OX40L-TK(-)"; "MYXVΔM64R-hFlt3L-TK(-)"). 일부 실시양태에서, MYXVΔM64R은 M64R 유전자 서열 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L)로 치환되고 제2 관심 유전자(예를 들어, OX40L)가 TK 유전자좌 내로 삽입되는 재조합 점액종 바이러스("MYXVΔM64R-hFlt3L-TK(-)-OX40L")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 MYXVΔM64R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 백시니아 바이러스 결실의 점액종 올소로그 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7L(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM64R은 추가 점액종 유전자 결실(예를 들어, ΔM31R, ΔM62R, 및/또는 ΔM63R)을 포함하도록 추가로 조작된다. 다른 실시양태에서, 본 기술의 MYXVΔM64R 바이러스는 임의의 추가 이종 유전자를 발현하지 않고/않거나 바이러스의 명칭에 구체적으로 나타낸 것 이외의 임의의 추가 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양세포붕괴성 바이러스"는 암 세포를 우선적으로 감염시키고, 이러한 세포에서 복제되고, 이의 복제 과정을 통해 암 세포의 용해를 유도하는 바이러스를 지칭한다. 자연 발생 종양세포붕괴성 바이러스의 비제한적인 예는 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스뿐 아니라, 종양선택적이되도록 조작된 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스 및 단순 포진 바이러스를 포함한다(예를 들어, Nemunaitis, J. Invest. New Drugs 17(4):375-86 (1999); Kirn, DH et al., Nat. Rev. Cancer 9(1):64-71(2009); Kirn et al., Nat. Med. 7:781 (2001); Coffey et al., Science 282:1332 (1998) 참고). 백시니아 바이러스는 많은 유형의 세포를 감염시키지만, 종양 세포가 복제를 선호하는 대사를 갖고, 복제를 또한 선호하는 특정 경로의 활성화를 나타내고 바이러스 복제를 또한 선호하는 선천성 면역계를 회피하는 환경을 생성한다는 사실로 인해 종양 세포에서 우선적으로 복제된다.
본원에 사용된 바와 같이, "비경구적"은 치료 물질 또는 조성물의 투여의 맥락에서 사용될 때, 소화관을 통한 투여 이외의 임의의 투여 경로를 포함한다. 본원에 개시된 방법과 특히 관련된 것은 정맥내(예를 들어, 간 전달을 위해 간문맥을 통하는 것을 포함함), 종양내, 또는 척추강내 투여이다.
용어 "약학적 허용 부형제", "약학적 허용 희석제", "약학적 허용 담체", 또는 "약학적 허용 아쥬반트"는 일반적으로 안전하고, 비-독성이고 생물학적으로 달리 비바람직하지 않고, 약학적 용도에 허용가능한 부형제, 희석제, 담체, 및 아쥬반트를 포함하는 약학 조성물을 제조하는데 유용한 부형제, 희석제, 담체, 및/또는 아쥬반트를 지칭한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 "약학적 허용 부형제, 희석제, 담체 및/또는 아쥬반트"는 하나 이상의 이러한 부형제, 희석제, 담체, 및 아쥬반트를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 장애 또는 병태의 "예방", "예방하다", 또는 "예방하는"은 통계적 샘플에서 미처치된 대조군 샘플에 비해 처치된 샘플에서 장애 또는 병태의 발생을 감소시키거나, 미처치된 대조군 샘플에 비해 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 개시를 지연시키는 하나 이상의 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 예를 들어, 바이러스, 또는 세포, 또는 핵산, 또는 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 바이러스, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었다는 것, 또는 물질이 이렇게 변형된 바이러스 또는 세포로부터 유래된다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 바이러스 또는 세포는 바이러스 또는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 이와 달리 비정상적으로 발현되거나, 부족하게 발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, "고형 종양"은 림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종과 같은 혈액암을 제외한 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 고형 종양의 예는, 비제한적으로, 연조직 육종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골원성육종, 골원성육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor) 및 다른 골 종양(예를 들어, 골육종, 악성 섬유 조직구증), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 뇌/CNS 종양(예를 들어, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 유아기 종양, 예컨대 비정형 기형/횡문근 종양, 생식세포 종양, 배아 종양, 뇌실막세포종) 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법이 유용할 가장 일반적인 고형 종양 중 일부는 두경부암, 직장 선암종, 신경교종, 수모세포종, 요로상피세포암종, 췌장 선암종, 자궁(예를 들어, 자궁내막암, 난관암) 난소암, 자궁경부암 전립선 선암종, 비소세포 폐암(편평세포 및 선암종), 소세포 폐암, 흑색종, 유방 암종, 방광암, 젖관 제자리암, 신세포 암종, 및 간세포 암종, 부신 종양(예를 들어, 부신겉질샘암종), 식도, 눈(예를 들어, 흑색종, 망막모세포종), 쓸개, 위장, 빌름스 종양, 심장, 두경부, 후두 및 하인두, 구강(예를 들어, 입술, 입, 침샘), 비인두, 신경모세포종, 복막, 뇌하수체, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 소장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 부갑상선, 질 종양, 및 상술한 것 중 임의의 것의 전이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체", "개체", 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 개별 유기체, 척추동물, 포유동물, 또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, "대상체"는 암으로 피해 입을 수 있고 피해를 입었을 때, 치료를 필요로 하는 임의의 동물(포유동물, 인간, 또는 다른) 환자를 의미한다. 일부 실시양태에서, "대상체"는 인간을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "상승작용 치료 효과"는 일부 실시양태에서, 적어도 2 개의 조합에 의해 생산된 부가 초과 치료 효과를 나타내며, 이는 약제의 개별 투여로부터의 결과를 초과한다. 일부 실시양태에서, "상승작용 치료 효과"는 약제의 개별 투여에 비해 적어도 2 개의 약제의 조합에 의해 생산된 향상된 치료 효과를 나타낸다. 예를 들어, 더 낮은 용량의 하나 이상의 약제가 질환 또는 장애를 치료하는데 사용되어, 증가된 치료 효능 및 감소된 부작용을 야기할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는", "치료하다", "치료되는", 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 인간에서 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포괄하며, (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 이의 발달을 저지하는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 야기하는 것; (iii) 장애의 진행을 늦추는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제하거나, 완화시키거나, 늦추는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 질환과 연관된 증상이 예를 들어 완화되거나, 감소되거나, 치유되거나, 관해의 상태에 놓이게 되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "억제하는"은 종양의 성장을 감소시키거나 늦추는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 종양 성장의 억제는 예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제는 완전할 수 있다.
또한, 기재된 바와 같은 의학적 질환 또는 병태의 치료 또는 예방의 다양한 방식이 "실질적"을 의미하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 하며, 이는 총, 총 미만의 치료 또는 예방을 포함하고, 일부 생물학적 또는 의학적 관련 결과가 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양 면역"은 종양이 면역계에 의해 인식 및 클리어런스(clearance)를 회피하는 하나 이상의 과정을 지칭한다. 따라서, 치료 개념으로서, 종양 면역은 이러한 회피가 약화되거나 제거되고, 종양이 면역계에 의해 인식되고 공격될 때(후자는 본원에서 "항-종양 면역"으로 지칭됨), "치료된다". 종양 인식의 예는 종양 결합이고, 종양 공격의 예는 (수, 크기, 또는 둘 다에서의) 종양 감소 및 종양 클리어런스이다.
본원에 사용된 바와 같이, "T-세포"는 다양한 세포-매개된 후천성 면역 반응에 참가하는 흉선 유래된 림프구를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "이펙터 T-세포"는 헬퍼, 킬러, 및 조절 T-세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "헬퍼 T-세포"는 CD4+ T-세포를 지칭하고; 헬퍼 T-세포는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원을 인식한다. 상이한 사이토카인을 생산하는 적어도 2 개 유형의 헬퍼 T-세포, Th1 및 Th2가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포독성 T-세포"는 보통 이의 표면 상에 CD8 분자 마커(CD8+)를 보유하고 이의 표면 상의 특정 항원성 분자를 갖는 표적 T-세포를 파괴함으로써 세포-매개된 면역에서 기능하는 T-세포를 지칭한다. 세포독성 T-세포는 또한 퍼포린-형성된 공극을 통해 표적 T-세포에 들어가고 아폽토시스(세포 사멸)를 유도할 수 있는 그랜자임, 세린 프로테아제를 방출한다. 그랜자임은 세포독성 표현형의 마커로서 제공된다. 세포독성 T-세포에 대한 다른 명칭은 CTL, 세포용해 T-세포, 세포용해 T 림프구, 킬러 T-세포, 또는 킬러 T 림프구를 포함한다. 세포독성 T-세포의 표적은 바이러스-감염된 세포, 세균 또는 원생동물 기생충으로 감염된 세포, 또는 암 세포를 포함할 수 있다. 대부분의 세포독성 T-세포는 이의 세포 표면 상에 존재하는 단백질 CD8을 갖는다. CD8은 클래스 I MHC 분자의 부분에 끌린다. 통상적으로, 세포독성 T-세포는 CD8+ 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양-침윤성 림프구"는 순환(혈액 또는 림프액)에 체류하거나 이와 달리 남아있었으며 종양 내로 이동한, 암(예컨대, 흑색종)으로 피해를 입은 대상체의 백혈구를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는 임의의 유전적 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함하며, 이는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제 능력이 있고, 세포 사이에서 유전자 서열을 이동시킬 수 있다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐 아니라, 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 세그먼트가 프로모터의 전사 제어 하에서 위치하고 있는 벡터인 것으로 고려된다. "프로모터"는 세포의 합성 장치, 또는 도입된 합성 장치에 의해 인식되는, 특정 유전자의 전사를 개시하는 데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어 하에", 또는 "전사 제어 하에"는, RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위한 핵산에 대해, 프로모터가 올바른 위치 및 방향으로 있다는 것을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 발현 구축물"은 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전적 구축물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 발현은 예를 들어, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 생산물 또는 전사된 유전자로부터의 억제성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다. 본 기술에 따른 pCB-OX40L-gpt 벡터의 비-제한적인 예는 서열번호 3에 기재되어 있다. 본 기술에 따른 pUC57-hFlt3L-GFP 벡터의 비-제한적인 예는 서열번호 4에 기재되어 있다. pUC57-delC7-hOX40L-mCherry 벡터의 비-제한적인 예는 서열번호 5에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "병독성"은 질환을 야기하는 병원체의 상대적 능력을 지칭한다. 용어 "약화된 병독성" 또는 "감소된 병독성"은 본원에서 질환을 야기하는 병원체의 감소된 상대적 능력을 지칭하기 위해 사용된다.
II. 면역계 및 암
악성 종양은 본래 종래의 치료법에 저항성이 있고, 상당한 치료적 도전을 제시한다. 면역요법은 발전하고 있는 연구 분야이고, 특정 유형의 암의 치료를 위한 추가적인 옵션이다. 면역요법 접근법은 면역계가 종양 세포를 확인하고, 파괴를 위해 이를 표적화하도록 자극될 수 있다는 근거에 기반한다.
많은 연구는 암 진행에서 면역계 구성요소의 차별적 존재의 중요성을 지지한다(Jochems et al., Exp. Biol. Med. 236(5):567-579 (2011)). 임상 데이터는 고밀도의 종양-침윤성 림프구가 개선된 임상 결과와 연결되어 있다는 것을 제시한다(Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev. 30:5-12, (2011)). 강력한 림프구 침윤과 환자 생존 사이의 연관성은 흑색종, 난소, 두경부, 유방, 요로상피, 대장, 폐, 간세포, 담낭, 및 식도암을 포함한 다양한 유형의 암에서 보고되었다(Angell et al., Current Opinion in Immunology 25:1-7, (2013)). 종양 면역 침윤은 대식세포, 수지상 세포(DC), 단핵구, 호중구, 천연 킬러(NK) 세포, 나이브 및 기억 림프구, B 세포 및 이펙터 T-세포(T 림프구)를 포함하며, 종양 세포에 의해 발현된 항원의 인식 및 이어지는 세포독성 T-세포에 의한 종양 세포의 파괴를 일차로 담당한다.
암 세포에 의한 항원의 제시 및 잠재적으로 종양 세포에 대해 반응할 수 있는 면역 세포의 존재에도 불구하고, 많은 경우에, 면역계는 활성화되지 않거나 적극적으로 억제된다. 이 현상의 핵심은 면역계의 세포가 면역계의 다른 세포를 억제하도록 강제함으로써, 면역 반응으로부터 자신을 보호하는 종양의 능력이다. 종양은 다수의 면역조절 메커니즘을 개발하여, 항종양 면역 반응을 회피한다. 예를 들어, 종양 세포는 면역 억제성 사이토카인(예컨대, TGF-β)을 분비하거나 면역 세포, 예컨대 CD4+ T 조절 세포 및 대식세포를 종양 부위로 유도하여, 이들 사이토카인을 분비하도록 한다. 종양은 또한 CD4+ T-세포가 조절 표현형을 발현하도록 치우치게 하는 능력을 갖는다. 전체적인 결과는 손상된 T-세포 반응 및 손상된 아폽토시스의 유도 또는 감소된 CD8+ 세포독성 T-세포의 항-종양 면역 능력이다. 또한, 종양 세포의 표면 상의 MHC 클래스 I의 종양-연관 변경된 발현은 면역반응에 대해 이들을 "비가시성"으로 만든다(Garrido et al. Cancer Immunol. Immunother. 59(10):1601-1606 (2010)). 항원-제시 기능 및 수지상 세포(DC)의 억제는 또한 항-종양 면역의 회피에도 기여한다(Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6):1853-1863 (2004)).
또한, 종양 미세환경의 국소적인 면역억제 특성은, 면역 편집과 마찬가지로, 표적 항원을 발현하지 않는 암 세포 하위집단의 도피를 야기할 수 있다. 따라서, 면역계의 항-종양 활성의 보존 및/또는 복원을 촉진할 접근법을 찾아내는 것은 상당한 치료적 이득일 것이다.
면역 체크포인트는 항-종양 면역의 종양-매개된 하향조절의 원인임을 시사하며, 치료적 표적으로서 사용되었다. T-세포 기능이상은 억제성 수용체, CTLA-4 및 프로그램된 사멸 1 폴리펩티드(PD-1), CD28 수용체 패밀리의 멤버의 유도된 발현과 동시에 발생한다는 것이 밝혀졌다. PD-1은 CD28 수용체 패밀리의 억제성 멤버이고, 이는 PD-1과 함께, CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 포함한다. 그러나, 흑색종의 치료에서 면역요법의 사용에 관한 가능성은 임상적 사용 및 심지어 항-CTLA-4(이필리무맙) 및 항-PD-1 약물(예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙)의 규제 승인에 의해 강조된 한편, 이들 면역요법에 대한 환자의 반응은 제한적이었다. T-세포에서 이들 억제성 신호(예로서, CTLA-4, PD-1 및 PD-1의 리간드인 PD-L1)의 차단에 초점을 맞춘 임상 시험은 T-세포 억제를 되돌리는 것이 성공적인 면역요법을 위해 중요하다는 것을 나타내었다(Sharma et al., Science 348(6230):56-61 (2015); Topalian et al., Curr. Opin. Immunol. 24(2):202-217 (2012)). 이들 관찰은 암에 대해 면역계를 이용하는 새로운 치료적 접근의 개발에 대한 필요성을 강조한다.
III. 폭스바이러스: 백시니아 바이러스(VACV), 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스, 및 점액종 바이러스(MYXV)
폭스바이러스, 예컨대 조작된 백시니아 바이러스는 전이성 암에 대한 종양세포붕괴성 요법으로서 선두에 있다(Kirn et al., Nature Review Cancer 9:64-71 (2009)). 폭스바이러스 패밀리의 멤버인 백시니아 바이러스(VACV)는 큰 DNA 바이러스이며, 이는 빠른 수명 주기 및 원거리 조직으로의 효율적인 혈행 확산을 갖는다. 폭스바이러스는 암 세포에서 복수의 트랜스유전자를 발현하여, 치료 효능을 향상시키기 위한 벡터로서 적절하다(Breitbach et al., Current pharmaceutical biotechnology 13:1768-1772 (2012)). 전임상 연구 및 임상 시험은 종래의 요법에 대해 불응성인 진행된 암의 치료를 위해 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스 및 다른 폭스바이러스를 사용하는 것의 효능을 나타내었다(Park et al., Lacent Oncol. 9:533-542 (2008); Kirn et al., PLoS Med 4:e353 (2007); Thorne et al., J. Clin. Invest. 117:3350-3358 (2007)). 폭스바이러스-기반 종양세포붕괴성 요법은 세포 용해, 아폽토시스, 및 괴사의 조합을 통해 암 세포를 사멸시키는 이점을 갖는다. 또한, 이는 종양으로 면역 세포의 모집을 용이하게 하는 선천성 면역 감지 경로 및 항-종양 후천성 면역 반응의 발달을 촉발시킨다. 임상 시험에서의 최근 종양세포붕괴성 백시니아 균주(예를 들어, JX-594)는 복제가능한 균주이다. 이들은 티미딘 키나아제의 결실을 갖는 야생형 백시니아를 사용하여, 종양 선택성을 향상시키고, 트랜스유전자, 예컨대 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)의 발현으로 면역 반응을 자극한다(Breitbach et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 13:1768-1772 (2012)). 그러나, 많은 연구는 야생형 백시니아가 항원 제시 세포(APC)에 대해 면역 억제 효과를 갖고(Engelmayer et al., J. Immunol. 163:6762-6768 (1999); Jenne et al., 유전자 Therapy 7:1575-1583 (2000); P. Li et al., J. Immunol. 175:6481-6488 (2005); Deng et al., J. Virol. 80:9977-9987 (2006)), 따라서 종양 자체의 면역억제 및 면역회피 효과에 부가한다는 것을 나타내었다.
백시니아 바이러스(웨스턴 리저브; WR) 게놈 서열이 서열번호 2에 기재되어 있으며, GenBank 수탁번호 AY243312.1에 의해 주어진다.
변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스는 또한 폭스바이러스 패밀리의 멤버이다. MVA는 백시니아 바이러스(CVA)의 앙카라 균주의 닭 배아 섬유아세포(CEF) 상에서 대략 570 회 연속 계대에 의해 생성되었다(Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975)). 이들 장기 계대의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스는 광범위한 게놈 결실을 함유하고 숙주 세포가 조류 세포로 고도로 제한된다(Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-1038 (1991)). 생성된 MVA가 상당히 비병독성인 다양한 동물 모델이 나타나 있다(Mayr et al., Dev. Biol. Stand. 41:225-34 (1978)).
MVA의 안전성 및 면역원성은 특히, 인간 두창 질환에 대해 임상 시험에서 광범위하게 시험되고 문서화되었다. 이들 연구는 120,000 명 초과의 개인을 포함하였으며 인간에서 우수한 효능 및 안전성을 나타내었다. 또한, 다른 백시니아 기반 백신과 비교하여, MVA는 병독성(감염성)을 약화시킨 한편, 이는 양호한 특정 면역 반응을 촉발시켰다. 따라서, MVA는 특정 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는 안전한 백신 벡터로서 확립되었다.
상술한 특징으로 인해, MVA는 재조합 유전자 발현 및 백신으로 사용되는 조작된 MVA 벡터의 개발을 위한 매력적인 후보가 되었다. 백신 벡터로서, MVA는 HIV, 결핵 및 말라리아뿐 아니라, 암을 포함한 많은 병리학적 병태에 대해 조사되었다(Sutter et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 3:263-271(2003); Gomez et al., Curr. Gene Ther. 8:97-120 (2008)).
인간 단핵구-유래된 수지상 세포(DC)의 MVA 감염은 공동-자극 분자의 상향조절 및 전염증성 사이토카인의 분비가 특징인 DC 활성화를 야기하는 것으로 나타났다(Drillien et al., J. Gen. Virol. 85:2167-2175 (2004)). 이에 대해, MVA는 DC를 활성화시키는데 실패한 표준 야생형 백시니아 바이러스(WT-VAC)와 상이하다. 수지상 세포는 종래의 수지상 세포(cDC) 및 형질세포양 수지상 세포(pDC)의 2 개의 주요 하위유형으로 분류될 수 있다. 전자, 특히 CD103+/CD8α+ 하위유형은 특히 T-세포에 대한 교차-제시 항원으로 채택되고; 후자는 I 형 IFN의 강한 생산자이다.
인간 세포의 바이러스 감염은 I 형 인터페론, 특히 인터페론-알파(α)에 의해 매개된 선천성 면역 반응(방어의 제1 선)의 활성화를 야기한다. 이는 보통 활성화된 T-세포(CTL 및 헬퍼 둘 다)의 모집 및 증식 및 결국 항체 생산으로 면역학적 "캐스케이드"의 활성화를 야기한다. 그러나, 바이러스는 숙주의 면역 반응을 약화시키는 인자를 발현한다. MVA는 WT-VAC에 비해 양호한 면역원이고 포유동물 세포에서 열악하게 복제된다(예를 들어, Brandler et al., J. Virol. 84:5314-5328 (2010) 참고).
그러나, MVA는 완전히 비-복제성은 아니며 일부 잔류 면역억제 활성을 함유한다. 그럼에도 불구하고, MVA는 치료된 대상체의 생존을 연장시키는 것으로 나타났다.
MVA 게놈 서열은 서열번호 1에 기재되어 있으며 GenBank 수탁번호 U94848.1에 의해 주어진다.
점액종 바이러스(MYXV)는 폭스비리대(Poxviridae) 패밀리 내의 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus) 속의 원형적 멤버이다. MYXV 라우산 균주 게놈(예를 들어, GenBank 수탁번호 AF170726.2로 주어짐)은 크기가 161.8 kbp이고, 약 171 개 유전자를 코딩한다. 게놈의 중심 영역은 모든 폭스바이러스에서 고도로 보존되는 100 개 미만의 유전자를 코딩하는 한편, 말단 게놈 영역은 면역조절성을 코딩하는 더욱 고유한 유전자 및 숙주 면역계 및 다른 항-바이러스 반응을 전복시키는데 관여하는 숙주-상호작용 인자가 풍부화된다. 점액종 바이러스는 매우 제한된 숙주 범위를 나타내고 유럽 토끼에 대해 병원성일 뿐이다. 자연에서 이의 좁은 숙주 범위에도 불구하고, MYXV는 다양한 클래스의 인간 암 세포를 생산적으로 감염시키는 것으로 나타났다. 종양세포붕괴성 약제로서 MYXV의 매력적인 특징은 다양한 인간 암 세포를 생산적으로 감염시키는 이의 능력 및 마우스 및 인간을 포함한 시험된 모든 비-토끼 숙주에서 이의 일관된 안전성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스는 균주 라우산으로부터 유래된다.
V. 백시니아 바이러스 C7 단백질 및 C7의 결실을 포함하는 MVA 또는 백시니아 바이러스(MVAΔC7L, VACVΔC7L), 또는 점액종 C7 올소로그의 결실을 포함하는 점액종 바이러스
백시니아 바이러스 C7 단백질은 포유동물 세포에서 백시니아 바이러스 수명 주기에 대한 중요한 숙주 범위 인자이다. C7L 동족체는 포유동물 숙주를 감염시키는 거의 모든 폭스바이러스에 존재한다. 숙주 범위 유전자 C7L 및 K1L 둘 다의 결실은 바이러스가 인간 세포에서 복제 불가능하게 한다(Perkus et al., Virology, 1990). K1L 및 C7L 둘 다의 돌연변이체 바이러스 결여는 SAMD9가 녹-아웃될 때, 인간 HeLa 세포에서 복제되는 이의 능력을 얻는다(Sivan et al., MBio, 2015). K1 및 C7 둘 다는 SAMD9와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다(Sivan et al., MBio, 2015). IRF1의 과잉발현은 C7L 및 K1L 이중 결실된 백시니아 바이러스의 숙주 제한을 야기한다(Meng et al., Journal of Virology, 2012). C7 및 K1 둘 다는 시험관내에서 SAMD9과 상호작용한다(Sivan et al., MBio. 2015). C7이 IFN 생산 또는 시그널링을 직접 조절하는지 여부는 알려지지 않았다. I 형 IFN은 바이러스 감염의 숙주 방어에서 중요한 역할을 하며, 아직 IFN 경로의 면역 조절에서 C7의 역할은 불명확하다.
이론에 구애됨 없이, 백시니아 C7은 I 형 IFN 유도 및 IFN 시그널링의 억제제인 것으로 여겨진다. TANK 결합 키나아제 1(TBK1)은 핵산을 포함한 다양한 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)에 대한 선천성 면역 반응의 유도에서 중요한 역할을 하는 세린/트레오닌 키나아제이다. 한편으로, RIG-I-유사 수용체, 예컨대 각각 5' 트리포스페이트 RNA 및 dsRNA를 검출하는 RIG-I 및 MDA5는 미토콘드리아 단백질 IPS-1 또는 MAVS와 상호작용하여, TBK1의 활성화 및 인산화를 야기한다. 엔도솜 dsRNA는 Toll-유사 수용체 3(TLR3)에 결합하며, 이는 TRIF 및 TRAF3의 모집 및 TBK1의 활성화를 야기한다. 반면에, 세포질 DNA는 세포질 DNA 센서 사이클릭 GMP-AMP 합성효소(cGAS)에 의해 검출될 수 있고, 이는 사이클릭 GMP-AMP(cGAMP)의 생산을 야기한다. cGAMP는 결국 소포체(ER)-국부 어댑터 STING에 결합하여, TBK1의 모집 및 활성화를 야기한다. TBK1은 전사 인자 IRF3를 인산화하고, 이는 핵으로 이동하여, IFNB 유전자 발현을 활성화시킨다. 이론에 구애됨 없이, C7은 RNA 바이러스, DNA 바이러스, 폴리 (I:C), 면역자극 DNA(ISD)를 포함하여 다양한 자극에 의해 IFNB 유도를 억제하는 것으로 여겨진다. C7은 TBK1/IRF3 복합체의 수준에서 이의 억제성 효과를 가할 수 있다. 일단 분비되면, I 형 IFN은 IFNAR에 결합하고, 이는 JAK/STAT 시그널링 경로의 활성화를 야기한다. 인산화된 STAT1 및 STAT2는 핵으로 이동하며, 여기서 IRF9와 함께 이들은 IFN-자극된 유전자(ISG)의 발현을 활성화시킨다. 이론에 구애됨 없이, IFNB 유도를 억제하는 이의 능력과 함께, C7은 또한 STAT2의 이의 상호작용을 통한 IFNAR 시그널링을 차단하여, IFN-β-유도된 STAT2 인산화를 예방할 수 있는 것으로 여겨진다. 이론에 구애됨 없이, 백시니아 C7은 I 형 IFN 생산 및 시그널링의 이중 억제성 역할을 갖는 것으로 여겨진다. 이전의 연구는 WT 백시니아로부터 C7L의 결실(VACVΔC7L)이 바이러스의 약화를 야기하고 MVA로부터 C7L의 결실(MVAΔC7L)이 MVA와 비교하여 향상된 면역자극 기능을 야기한다는 것을 나타내었다.
전위성 C7은 STING, TBK1, 또는 IRF3-유도된 IFNB 및 ISRE(인터페론 자극 반응 요소) 프로모터 활성화를 차단하는 것으로 나타났다. C7을 과잉발현하는 뮤린 또는 인간 대식세포 세포주는 DNA 또는 RNA 자극, 또는 DNA 또는 RNA 바이러스의 감염에 대해 둔화된 선천성 면역 반응을 갖는 것으로 나타났다. 또한, C7의 과잉발현은 IFN-β 처치에 의해 유도된 ISG 유전자 발현을 약화시키는 것으로 나타났다. cDC의 C7L의 결실을 갖는 MVA(MVAΔC7L) 감염은 MVA에 비해 높은 수준의 I 형 IFN을 유도하는 것으로 나타났다. C7은 Stat2 인산화 예방을 통한 IFN-β-유도된 야누스(Janus) 키나아제/신호 변환제 및 전사의 활성화제(JAK/STAT) 시그널링 경로를 차단하는 것으로 나타났다. C7은 공동-면역침강 연구에 의해 나타난 바와 같이 Stat2와 직접 상호작용하는 것으로 나타났다.
GenBank 수탁번호 AAB96405.1(서열번호 6)로 주어진 예시적 전장 백시니아 바이러스 C7 숙주 범위 단백질이 하기에 제공된다.
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점액종 바이러스는 3 개의 C7 올소로그인 M62, M63, M64를 갖는다. 점액종 M64는 백시니아 C7과 유사한 구조 특징을 공유함에도 불구하고, 23% 서열 동일성만을 갖는다. 점액종 M62는 인간 세포에서 VACVΔK1LΔC7L의 복제 결여를 구제할 수 있다. 점액종 M63 결실은 토끼 세포에서 비-복제성인 재조합 바이러스를 야기한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 기술은 조작된 점액종 바이러스, 예컨대 MYXVΔM64R 또는 MYXVΔM64R-hFlt3L-mOX40L을 제공한다.
VI. OX40 리간드(OX40L)
OX40 리간드(OX40L) 및 이의 결합 파트너인 종양 괴사 인자 수용체 OX40은 TNFR/TNF 슈퍼패밀리의 멤버이며 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포뿐 아니라, 다수의 다른 림프구 및 비-림프구 세포 상에서 발현된다. OX40L-OX40 상호작용은 OX40을 발현하는 T-세포에 대한 생존 및 활성화 신호를 제공한다. OX40은 Treg의 분화 및 활성을 추가로 억제하여, 이 과정을 추가로 증폭시킨다. OX40 및 OX40L은 또한 T-세포, 항원-제시 세포, NK 세포, 및 NKT 세포로부터의 사이토카인 생산을 조절하고, 사이토카인 수용체 시그널링을 조절한다. 본 기술의 MVAΔE3L-OX40L, MVAΔC7L-OX40L, MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L, MVAΔE5R, VACVΔC7L-OX40L, VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L, VACVΔE5R, 및 MYXVΔM31R 재조합 바이러스의 OX40L은 huOX40L 또는 muOX40L일 수 있다.
예시적 인간 OX40L(huOX40L) 핵산(서열번호 7) 및 폴리펩티드 서열(서열번호 8)이 하기에 제공된다.
Figure pct00027
예시적 뮤린 OX40L(muOX40L) 핵산(서열번호 9) 및 폴리펩티드 서열(서열번호 10)이 하기에 제공된다.
Figure pct00028
VII. 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)
골수 세포의 증식을 자극하는 I 형 막관통 단백질인 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)는 1994년에 클로닝되었다(Lyman et al., 1994). hFlt3L의 용도는 뿐만 아니라, 골수 이식 준비 과정에서의 줄기 세포 가동화, 암 면역요법, 예컨대 수지상 세포의 확장뿐 아니라, 백신 아쥬반트를 포함한 다양한 전임상 및 임상 환경에서 탐구되었다. 재조합 인간 Flt3L(rhuFlt3L)은 500 명 초과의 인간 대상체에서 시험되었고 생물활성이고, 안전하고, 내성이 있다. CD8α+/CD103+ DC 및 pDC를 포함한 DC 서브세트의 개발에서 성장 인자 Flt3L의 중요한 역할을 이해하는데 많은 진전이 있었다.
CD103+/CD8α+ DC는 종양 항원-특이적 CD8+ T-세포의 자발적 교차-프라이밍을 위해 필요하다. CD103+ DC는 종양 내부에서 드물게 존재하고 이들은 종양 항원에 대해 풍부한 종양-연관 대식세포와 경쟁한다는 것이 보고되었다. CD103+ DC는 나이브뿐 아니라, 활성화된 CD8+ T-세포를 고유하게 자극할수 있을 뿐 아니라, 입양 T-세포 요법의 성공을 위해 중요하다(Broz, et al. Cancer Cell, 26(5):638-52 (2014)). Spranger et al.은 종양발생 시그널링 경로 WNT/β-카테닌의 활성화가 종양 내에서 CD103+ DC 및 항-종양 T-세포의 감소를 야기한다는 것을 보고하였다(Spranger et al., 2015). Flt3L-배양된 골수 유래된 수지상 세포(BMDC)의 종양내 전달은 항-CTLA-4 및 항-PD-L1 면역요법의 조합에 대한 반응성을 야기한다(Spranger et al., 2015). CD103+ DC에 대한 성장 인자인 Flt3L의 전신 투여, 및 폴리 I:C(TLR3 작용제)의 종양내 주사는 종양 내에서 CD103+ DC 집단을 확장시키고 활성화시켰으며 뮤린 흑색종 및 MC38 결장암 모델에서 면역요법에 대한 저항성을 극복하거나 반응성을 향상시켰다.
다양한 고형 종양에서 종양 신생항원의 최근 발견은 고형 종양이 보통 인간 사이에 상이한 고유한 신생항원을 보유한다는 것을 나타낸다(Castle et al., Cancer Res 72:1081-1091 (2012); Schumacher et al., Science 348:69-74 (2015)). 본원에 개시된 유전적으로 조작된 또는 재조합 바이러스는 종양 항원을 발현함으로써 이의 활성을 가하지 않는다. 본 발명의 유전적으로 조작된 또는 재조합 MVA 바이러스의 종양내 전달은 종양 내에서 종양 신생항원의 효율적인 교차-제시 및 항-종양 후천성 면역의 생성(또한 전신으로 확장시킴)을 허용하므로, 종양에 대한 면역 반응을 개시하는데 종양 세포에 의해 발현된 종양 분화 항원 및 신생항원을 이용하는 "제자리 암 백신접종"을 야기한다.
종양 내에서 체세포 돌연변이에 의해 생성된 신생항원의 존재에도 불구하고, 종양 항원-특이적 T-세포의 기능은 보통 다중 억제성 메커니즘에 의해 억제된다(Mellman et al., Nature 480, 480-489 (2011)). 예를 들어, 활성화된 T-세포 상의 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA-4)의 상향-조절은 수지상 세포(DC) 상의 CD80(B71)/CD86(B7.2)과 상호작용하기 위해 T-세포 공동-자극제 CD28과 경쟁하므로, T-세포 활성화 및 증식을 억제할 수 있다. CTLA-4는 또한 조절 T(Treg) 세포 상에서 발현되고 Treg의 억제성 기능을 매개하는데 중요한 역할을 한다(Wing et al., Science 322:271-275 (2008); Peggs, et al., J. Exp. Med. 206:1717-1725 (2009)). 또한, 종양 세포 상의 PD-L/PD-L2의 발현은 CD28 패밀리의 억제성 수용체인 PD-1의 활성화를 야기하여, T-세포 고갈을 야기할 수 있다. CTLA-4 및 프로그램된 사멸 1 폴리펩티드(PD-1)와 같이, 억제성 수용체에 대한 항체를 이용하는 면역요법은 동물 연구에서 주목할만한 전임상 활성 및 전이성 암을 갖는 환자에서 임상 반응을 나타내었으며, 전이성 흑색종, 비소세포 폐암뿐 아니라, 신세포 암종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다(Leach et al., Science 271:1734-1746 (1996); Hodi et al., NEJM 363:711-723 (2010); Robert et al., NEJM 364:2517-2526 (2011); Topalian et al., Cancer Cell 27:450-461 (2012); Sharma et al., Science 348(6230):56-61 (2015)).
VIII. ΔE3L 및 E3LΔ83N
폭스바이러스는 이들 경로의 세포외 및 세포내 구성요소를 제지하는 단백질을 코딩함으로써 다중 선천성 면역 시그널링 경로를 회피하고 길항하는데 이례적으로 능숙하다(Seet et al. Annu. Rev. Immunol. 21:377-423 (2003)). 세포내 선천성 면역 시그널링의 폭스바이러스 길항제 중 가장 주된 것은 백시니아 바이러스 듀엘(duel) Z-DNA 및 dsRNA-결합 단백질 E3이고, 이는 백시니아 바이러스 감염에 의해 달리 활성화될 PKR 및 NF-κB 경로를 억제할 수 있다(Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4825-4829 (1992); Deng et al., J. Virol. 80:9977-9987 (2006)). E3L 유전자가 결여된 돌연변이 백시니아 바이러스(ΔE3L)는 제한된 숙주 범위를 가지며, IFN에 대해 고도로 민감하고, 치명적 폭스바이러스 감염 동물 모델에서 크게 감소된 병독성을 갖는다(Beattie et al., Virus Genes 1289-94 (1996); Brandt et al., Virology 333263-270 (2004)). 최근 연구는 ΔE3L 바이러스를 이용한 배양된 세포주의 감염이 전염증성 반응을 유도하는 것을 나타내었으며, 이는 야생형 백시니아 바이러스로의 감염 동안 차단된다(Deng et al., J. Virol. 80:9977-9987 (2006); Langland et al. J. Virol. 80:10083-10095). 야생형 백시니아 바이러스를 이용한 마우스 표피 수지상 세포주의 감염은 TLR 작용제인 리포폴리사카라이드(LPS) 및 폴리(I:C)에 대한 전염증성 반응을 약화시키고, 이 효과는 E3L 결실에 의해 감소되었다. 또한, E3L 바이러스를 이용한 수지상 세포의 감염은 외인성 작용제의 부재 하에 NF-κB 활성화를 촉발시켰다(Deng et al., J. Virol. 80:9977-9987 (2006)). 뮤린 각질세포의 야생형 백시니아 바이러스 감염은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 생산을 유도하지 않는 반면, ΔE3L 바이러스를 이용한 감염은 뮤린 각질세포에서 IFN-β, IL-6, CCL4 및 CCL5의 생산을 유도하고, 이는 미토콘드리아 항바이러스 시그널링 단백질(MAVS; 세포질 RNA 센서 RIG-I 및 MDA5를 위한 어댑터) 및 전사 인자 IRF3에 의해 매개되는 세포질 dsRNA-감지 경로에 의존적이다(Deng et al., J. Virol. 82(21):10735-10746 (2008)).
비강내 감염 모델에서 Z-DNA-결합 도메인의 결실을 갖는 E3LΔ83N 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스에 비해 1,000-배 더 약화된다(Brandt et al., 2001). 두개강내 접종 모델에서 E3LΔ83N은 또한 야생형 백시니아와 비교하여, 감소된 신경독성을 갖는다(Brandt et al., 2005). 감소된 Z-DNA-결합을 야기하는 E3의 Z-DNA 결합 도메인 내 돌연변이(Y48A)는 감소된 신경독성을 야기한다(Kim et al., 2003). E3의 N-말단 Z-DNA 결합 도메인은 바이러스 발병에 중요하지만, 그것이 어떻게 백시니아 바이러스의 숙주 선천성 면역 감지에 영향을 미치는지는 잘 이해되고 있지 않다. 뮤린 형질세포양 수지상 세포의 야생형 백시니아는 아닌 점액종 바이러스의 감염은 TLR9/MyD88/IRF5/IRF-의존적 경로를 통해, I 형 IFN 생산을 유도한다(Dai et al., 2011). 점액종 바이러스 E3 올소로그 M029는 E3의 dsRNA-결합 도메인을 함유하지만, E3의 Z-DNA 결합 도메인은 결여되어 있다. E3의 Z-DNA-결합 도메인(Z-DNA-결합 활성 그 자체는 아닌 것으로 추정됨)은 뮤린 및 인간 pDC에서 폭스바이러스 감지를 억제하는데 중요한 역할을 한다(Dai et al., 2011; Cao et al., 2012).
E3L의 결실은 허용 RK13 세포에서 IFN 억제에 대해 백시니아 바이러스 복제를 민감화시키고 숙주 범위 표현형을 야기하며, 이에 의해 ΔE3L는 HeLa 또는 BSC40 세포에서 복제될 수 없다(Chang et al., 1995). E3의 C-말단 dsRNA-결합 도메인은 숙주 범위 효과를 담당하는 반면, N-말단 Z-DNA-결합 도메인의 결실을 갖는 E3LΔ83N 바이러스는 HeLa 및 BSC40 세포에서 복제 능력이 있다(Brandt et al., 2001).
티미딘 키나아제의 결실을 갖는 백시니아 바이러스(웨스턴 리저브 균주; WR)는 비-분열 세포에서 고도로 약화되지만, 형질전환된 세포에서는 복제성이다(Buller et al., 1988). TK-결실된 백시니아 바이러스는 생체내에서(in vivo) 종양 세포에서 선택적으로 복제된다(Puhlmann et al., 2000). Thorne et al.은 다른 백시니아 균주와 비교하여, WR 균주가 종양 세포주에서 정상 세포에 비해 최고 파열(burst) 비를 갖는다는 것을 나타내었다(Thorne et al., 2007).
IX. 백시니아 바이러스 E5는 세포질 DNA 센서 cGAS의 우성 억제제이다.
세포질 DNA 센서 cGAS는 바이러스 핵산을 검출하는데 중요한 역할을 하며, 이는 I 형 IFN 생산을 야기한다. 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), 고도로 약화된 백시니아 균주를 이용한 종래의 수지상 세포의 감염은 cGAS/STING-의존적 메커니즘을 통해 IFN 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, MVA 감염은 cGAS 분해를 촉발시킨다. 백시니아 바이러스(VACV)는 세포질 DNA 바이러스이며, 이는 200 개 초과의 유전자를 코딩한다. 실험 실시예 섹션에 기재된 바와 같이, 70 개 백시니아 바이러스 초기 유전자가 이중 루시퍼라아제 시스템을 사용한 HEK293 T 세포에서 cGAS/STING 경로의 억제를 위해 시크리닝되었다. 백시니아 E5R은 cGAS의 우성 억제제이고 cGAS 분해를 매개하는 핵심 단백질이라는 것이 밝혀졌다. MVAΔE5R은 골수 유래된 수지상 세포(BMDC), 골수-유래된 대식세포(BMDM), 및 피부 원발성 섬유아세포를 포함한 다중 세포 유형에서 MVA에 비해 매우 높은 수준의 I 형 IFN을 유도한다(도 57c 및 57d; 76a 및 76b). MVAΔE5R-매개된 I 형 IFN 생산은 cGAS에 의존적이다(도 58a-58c). 또한, MVAΔE5R은 cGAS-/- 피부 섬유아세포에서 복제 능력을 얻는다(도 77c 및 77d). 백신 벡터로서, MVAΔE5R-OVA를 이용한 피부 난절 또는 피내 백신접종은 생체내에서 MVA-OVA에 비해 더욱 높은 OVA-특이적 CD8+ T 세포 반응을 야기한다(도 75b 및 75c). MVAΔE5R의 종양내 주사는 MVA와 비교하여 더 강한 항-종양 면역 반응 및 양호한 생존을 야기한다(도 91a-91c). 마지막으로, 비강내 감염 모델에서, VACVΔE5R은 WT VACV와 비교하여, 적어도 1000-배 약화된다(도 55b). 함께 고려하면, 이들 결과는 E5가 세포질 DNA 센서 cGAS를 표적화하는 핵심 바이러스 병독성 인자이고, 이에 의해 I 형 IFN 생산을 억제한다는 강한 증거를 제공한다. 본 기술의 발명자들은 우선 면역 회피에서 E5R의 역할을 기재할 것이다.
GenBank 수탁번호 AAB59825.1(서열번호 20)에 의해 주어진 예시적 전장 백시니아 바이러스 E5R 숙주 범위 단백질이 하기에 제공된다.
Figure pct00029
백시니아 바이러스 E5R의 점액종 올소로그는 M31R이다. GenBank 수탁번호 AAF14919.1(서열번호 21)에 의해 주어진 예시적 전장 점액종 바이러스 M31R 단백질이 하기에 제공된다.
Figure pct00030
X. 본 기술의 조작된 폭스바이러스 균주
MVAΔC7L
본 기술의 개시내용은 C7L 돌연변이체 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(즉, MVAΔC7L; C7L 결실을 포함하는 MVA 바이러스; 돌연변이체 C7L 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MVA), 또는 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, MVA 바이러스의 C7 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 C7 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) C7 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔC7L 돌연변이체는 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVA 게놈에서 C7의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, MVAΔC7L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔC7L-hFlt3L을 야기한다. (예를 들어, 도 5a 참고).
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, MVAΔC7L은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, MVA 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093)는 상동 재조합을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 유전자 녹아웃을 야기한다. 생성된 MVAΔC7L-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다(예를 들어, 도 5b 참고). 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L 또는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔC7L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 C7 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 C7 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) C7 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 C7 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔC7L은 E5R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MVA 바이러스를 포함한다(예를 들어, 도 93a 참고). 다른 예로서, 일부 실시양태에서, 본 기술은 3 개의 별개 변형을 제작함으로써 형성된 재조합 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40LΔE5R 바이러스를 제공한다. 제1 변형은 C7L 유전자를 C8L 및 C6R 유전자좌에서의 상동 재조합을 통해 hFlt3L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열로 치환하는 것을 포함하며, 이에 의해 MVAΔC7L-hFlt3L을 형성한다. 제2 변형 동안, TK 유전자좌에서의 상동 재조합을 통해, TK 유전자는 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되며, 이에 의해 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 형성한다. 제3 변형 동안, E4L 및 E6R 유전자좌에서의 상동 재조합을 통해, E5R 유전자는 mCherry와 같은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되며, 이에 의해 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40LΔE5R을 형성한다(예를 들어, 도 92a 참고).
일부 실시양태에서, 상기 기재된 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 추가 이종 유전자, 예컨대 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L, N2L, 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, MVA는, 비제한적으로, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 기술은 E5R 유전자좌 내부로부터 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15, 및/또는 IL-21을 발현하는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L 또는 OX40L 및 hFlt3L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 C7L 또는 C7L 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다(도 5a-5b). 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 OX40L 발현 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 3 및 5(표 1)에 나타나 있다. 본 기술에 따른 hFlt3L 발현 구축물의 비-제한적인 예가 서열번호 4(표 1)에 나타나 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
GenBank 수탁번호 U94848.1로 주어진 MVA 바이러스 게놈 서열(서열번호 1)이 도 22에 제공된다. 일부 실시양태에서, OX40L을 발현하는 조작된 MVAΔC7L 바이러스는 서열번호 3 및 5에 의해 예시된 것과 같은 발현 구축물을 TK 유전자좌의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내로 삽입함으로써 생성된다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 조작된 MVAΔC7L-OX40L은 서열번호 4에 의해 예시된 것과 같은 발현 구축물을 C7 유전자좌(예를 들어, 서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내로 삽입함으로써 hFlt3L을 발현하도록 추가로 변형된다.
MVAΔE3L
본 기술의 개시내용은 E3L 돌연변이체 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(즉, MVAΔE3L; E3L 결실을 포함하는 MVA 바이러스; 돌연변이체 E3L 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MVA), 또는 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된 바이러스(MVAΔE3L-OX40L)를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, MVA 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 녹아웃을 야기한다. 생성된 MVAΔE3L-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔE3L 게놈에서 TK의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 75,798 내지 75,868)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, MVAΔE3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함한다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자(예를 들어, OX40L)는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, MVA는, 비제한적으로, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 다른 이종 유전자, 예컨대 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 C7; E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 E3L 또는 E3L 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
일부 실시양태에서, MVAΔE3L은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 E3 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 E3 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) E3 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔE3L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 E3 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다(예를 들어, 도 1 참고). 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 OX40L 발현 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 상기 표 1에 나타나 있다.
MVAΔE5R
본 기술의 개시내용은 E5R 돌연변이체 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(즉, MVAΔE5R; E5R 결실을 포함하는 MVA 바이러스; 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MVA), 또는 상기 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, MVA 바이러스의 E5R 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 E5R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) E5R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔE5R 돌연변이체는 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVA 게놈에서 E5R의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 38,432 내지 39,385)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, MVAΔE5R-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔE5R-hFlt3L을 야기한다.
일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG), 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 이종 유전자를 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 또는 돌연변이 C7(ΔC7); E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R(ΔE5R); K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는
Figure pct00039
로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MVA 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 녹아웃을 야기한다. 생성된 MVAΔE5R-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 게놈에서 TK의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 75,798 내지 75,868)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, MVAΔE5R-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함한다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자(예를 들어, OX40L)는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, MVA는, 비제한적으로, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L, hFlt3L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 E3L 또는 E3L 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
일부 실시양태에서, MVAΔE5R은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 E5R 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 E5R 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) E5R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MVAΔE5R-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 E5R 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MVAΔE5R은 E5R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환되고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되며, 이에 의해 MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L과 같은 재조합 바이러스를 형성하는 재조합 MVA를 포함한다(예를 들어, 도 81 참고).
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 발현 및 결실 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 (표 2)에 나타나 있다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
일부 실시양태에서, 조작된 MVAΔE5R 바이러스는 서열번호 22-24 및 32(표 2)에 예시된 것과 같은 발현 구축물을 E5R 유전자좌의 위치(예를 들어, 서열번호 1의 위치 38,432 내지 39,385; 또는 GenBank 수탁번호 AY603355에 기재된 서열의 위치 38,389 내지 39,389)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내로 삽입함으로써 생성된다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는 서열번호 31에 의해 예시된 것과 같은 발현 구축물을 E3L 유전자좌(예를 들어, GenBank 수탁번호 AY603355에 기재된 서열의 위치 36,931 내지 37,497)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내로 삽입함으로써 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, MVAΔE5R 바이러스는 서열번호 33에 의해 예시된 것과 같은 발현 구축물을 C11R 유전자좌(예를 들어, GenBank 수탁번호 AY603355에 기재된 서열의 위치 4,160-4,785)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내로 삽입함으로써 추가로 조작된다.
본 기술에 따른 MVAΔK7R 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 25(표 3)에 나타나 있다.
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
VACVΔC7L
본 기술의 개시내용은 C7L 돌연변이체 백시니아 바이러스(즉, VACVΔC7L; C7L 결실을 포함하는 VACV; 돌연변이체 C7L 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV), 또는 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다(VACVΔC7L-OX40L). 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 C7 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 C7 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) C7 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔC7L 돌연변이체는 C7L 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, VACV 게놈에서 C7의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 15,716 내지 16,168)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, VACVΔC7L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔC7L-hFlt3L을 야기한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VACVΔC7L은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032)는 상동 재조합을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 유전자 녹아웃을 야기한다. 생성된 VACVΔC7L-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔC7L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 C7 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 C7 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) C7 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 C7 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, VACVΔC7L-항-CTLA-4-hFlt3L-TK(-) 바이러스는 OX40L을 발현하도록 추가로 변형되어, VACVΔC7L-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, VACVΔC7L-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스는 hIL-12를 발현하도록 추가로 변형되어, VACVΔC7L-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12를 야기한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 상세내용은 VACVΔC7L-TK(-)-항-CTLA-4-OX40L 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 상세내용은 VACVΔC7L-E3LΔ83N-TK(-)-hFlt3L-항-CTLA-4-OX40L 바이러스를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스는 적어도 하나의 추가 이종 유전자, 예컨대 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L 또는 OX40L 및 hFlt3L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 C7L 또는 C7L 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, VACV는, 비제한적으로, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
VACVΔE5R
본 기술의 개시내용은 E5R 돌연변이체 백시니아 바이러스(즉, VACVΔE5R; E5R 결실을 포함하는 VACV; 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV), 또는 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다(VACVΔE5R-OX40L). 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 E5R 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 E5R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) E5R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔE5R 돌연변이체는 E5R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, VACV 게놈에서 E5R의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 49,236 내지 50,261)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, VACVΔE5R-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔE5R-hFlt3L을 야기한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VACVΔE5R은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032)는 상동 재조합을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 유전자 녹아웃을 야기한다. 생성된 VACVΔE5R-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔE5R-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 E5R 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 E5R 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) E5R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔE5R-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 E5R 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R-항-CTLA-4-hFlt3L-TK(-) 바이러스는 OX40L을 코딩하도록 추가로 변형되어, VACVΔE5R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스는 hIL-12를 발현하도록 추가로 변형되어, VACVΔE5R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12를 야기한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE5R은 IL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 단독(VACVΔE5R-IL-15/IL-15Rα) 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 변형과의 조합을 포함하도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, VACVΔE5R-IL-15/IL-15Rα는 OX40L을 코딩하는 핵산을 포함하도록 추가로 조작된다(VACVΔE5R-IL-15/IL-15Rα-OX40L).
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 백시니아 게놈의 TK 유전자좌는 항-CTLA-4와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 발현하도록 상동 재조합을 통해 변형되며, 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되어, VACV-TK(-)-항-CTLA-4를 생산한다. 일부 실시양태에서, VACV-TK(-)-항-CTLA-4 게놈은 E5R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환된 E5R의 결실을 포함하고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되도록 추가로 변형되어, VACV-TK--항-CTLA-4-E5R--hFlt3L-OX40L(또는 VACVΔE5R-TK(-)-항-CTLA-4-hFlt3L-OX40L)과 같은 재조합 바이러스를 형성한다(예를 들어, 도 85a 참고).
일부 실시양태에서, 상기 기재된 유전적으로 조작된 또는 재조합 VACVΔE5R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L 또는 OX40L 및 hFlt3L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 E5R 또는 E5R 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, VACV는, 비제한적으로, C7, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 E5R 또는 E5R 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 VACVΔE5R 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 26-28(표 4)에 나타나 있다.
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
일부 실시양태에서, 조작된 VACVΔE5R 바이러스는 서열번호 26-28(표 4)에 예시된 것과 같은 발현 구축물을 E5R 유전자좌의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 49,236 내지 50,261)에 상응하는 VACV 게놈 영역 내로 삽입함으로써 생성된다.
예를 들어, pCB 플라스미드-계 벡터를 사용한 VACV의 TK 유전자좌 내로의 삽입을 위한 항-CTLA-4 항체 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 29(표 5)에 나타나 있다.
Figure pct00068
Figure pct00069
예를 들어, VACV-E3LΔ83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-hIL-12 구축물이 조작되는, 본 기술에 따라 예를 들어, pUC57 벡터를 사용한 예를 들어, E5R 유전자좌 내로의 삽입을 위한 IL-12 발현 구축물의 비-제한적인 예가 서열번호 35-38(표 5a)에 나타나 있다(또한, 도 169 참고).
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 VACV 바이러스는 TK 유전자좌의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032)에 상응하는 VACV 게놈 영역 내에 삽입된 서열번호 29(표 5)에 의해 예시된 것과 같은 발현 구축물을 포함한다.
VACVΔB2R
VACV B2R 유전자는 숙주 cGAS-STING 선천성 면역의 바이러스 회피에서 역할을 하는 폭신(poxin), 뉴클레아제를 코딩한다. 본 기술의 개시내용은 B2R 돌연변이체 백시니아 바이러스(즉, VACVΔB2R; B2R 결실을 포함하는 VACV; 돌연변이체 B2R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV), 또는 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된 바이러스(VACVΔB2R-OX40L)를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 B2R 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 B2R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) B2R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔB2R 돌연변이체는 B2R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, VACV 게놈에서 B2R의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 164,856 내지 165,530)에 상응하는 핵산 서열은 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 형광 단백질(예를 들어, gpt, GFP, mCherry)이다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R 바이러스는 기능성 B2R 단백질을 발현하지 않는 재조합 VACV를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L)는 VACV 게놈의 B2R 유전자좌 내로 삽입되고, B2R 유전자를 분열시키고 이를 없앤다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VACVΔB2R은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032)는 상동 재조합을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 유전자 녹아웃을 야기한다. 생성된 VACVΔB2R-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔB2R-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 B2R 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 B2R 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) B2R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, VACVΔB2R-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 B2R 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R-항-CTLA-4-hFlt3L-TK(-) 바이러스는 OX40L을 코딩하도록 추가로 변형되어, VACVΔB2R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, VACVΔB2R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스는 hIL-12를 발현하도록 추가로 변형되어, VACVΔB2R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12를 야기한다. 일부 실시양태에서, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-hIL-12 게놈은 B2R 결실을 포함하도록 변형된다(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12-ΔB2R)(예를 들어, 도 168 참고).
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 유전적으로 조작된 또는 재조합 VACVΔB2R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7(ΔC7L); B19R(B18R; ΔWR200); E5R (ΔE5R); K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 조작된 또는 재조합 VACVΔB2R 바이러스는 VACVΔB2R-ΔE5R, VACVΔB2R-ΔE5R-E3LΔ83N, 및 VACVΔB2R-E3LΔ83N으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자는 B2R 유전자좌 내로 삽입되고, B2R 유전자를 분열시키고 이를 없애거나 이를 치환할 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, VACV는, 비제한적으로, C7, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 VACVΔB2R 결실 구축물의 비-제한적인 예가 서열번호 30(표 7)에 나타나 있다.
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
일부 실시양태에서, 조작된 VACVΔB2R 바이러스는 서열번호 30(표 7)에 예시된 것과 같은 발현 구축물을 B2R 유전자좌의 위치(예를 들어, 서열번호 2의 위치 164,856 내지 165,530)에 상응하는 VACV 게놈 영역 내로 삽입함으로써 생성된다.
MVAΔWR199
본 기술에 따른 MVAΔWR199 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 34(표 8)에 나타나 있다. 일부 실시양태에서, ΔWR199 돌연변이체를 포함하는 MVA는 서열번호 34에 의해 예시된 것과 같은, 예를 들어 WR199 녹아웃 플라스미드를 갖는 발현 구축물을 WR199 유전자좌의 위치(예를 들어, GenBank 수탁번호 AY603355에 기재된 서열의 위치 158,399 내지 160,143)에 상응하는 MVA 게놈 영역 내에 삽입함으로써 생성된다(예를 들어, 도 153 참고).
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
MYXVΔM31R
점액종 M31R은 VACV E5R에 대한 올소로그이다(도 88b 참고). 본 기술의 개시내용은 M31R 돌연변이체 점액종 바이러스(즉, MYXVΔM31R; M31R 결실을 포함하는 MYXV; 돌연변이체 M31R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV), 또는 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R 바이러스는 암 면역치료제로서의 용도를 위해 OX40L과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된다(MYXVΔM31R-OX40L). 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스는 균주 라우산(예를 들어, GenBank 수탁번호 AF170726.2에 의해 주어짐)으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스의 M31R 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 M31R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) M31R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔM31R 돌연변이체는 M31R 유전자 서열 전부 또는 대부분을 대신해서 이종 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MYXV 게놈에서 M31R의 위치(예를 들어, 점액종 게놈의 위치 30,138 내지 31,319)에 상응하는 핵산 서열은 인간 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되어, MYXVΔM31R-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L을 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MYXVΔM31R-hFlt3L을 야기한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R은 OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스의 티미딘 키나아제(TK) 유전자(예를 들어, 점액종 게놈의 위치 57,797 내지 58,333)는 상동 재조합을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 TK 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) TK 유전자 녹아웃을 야기한다. 생성된 MYXVΔM31R-TK(-) 바이러스는 양측에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L 및 TK-R)이 측면에 있는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하도록 추가로 조작된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 점액종 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 OX40L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MYXVΔM31R-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, 재조합 바이러스는 상동 재조합 기술을 통해 M31R 유전자좌에서 추가로 변형되어, 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하며, 이는 M31R 유전자가 발현되지 않거나 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) M31R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 hFlt3L과 같은 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 단일 개방형 해독틀을 포함하여, MYXVΔM31R-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, OX40L을 코딩하는 발현 카세트는 M31R 유전자좌 내로 삽입되는 한편, hFlt3L을 코딩하는 발현 카세트는 TK 유전자좌 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R-항-CTLA-4-hFlt3L-TK(-) 바이러스는 OX40L을 코딩하도록 추가로 변형되어, MYXVΔM31R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L을 야기한다. 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스는 hIL-12를 발현하도록 추가로 변형되어, MYXVΔM31R-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12를 야기한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 유전적으로 조작된 또는 재조합 MYXVΔM31R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것(예를 들어, OX40L 또는 OX40L 및 hFlt3L) 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 M31R 또는 M31R 및 TK 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
상기 기재된 특정 실시양태에서, 트랜스유전자는 TK 유전자좌 내로 삽입되고, TK 유전자를 분열시키고 이를 없앨 수 있으나, 다른 적합한 통합 유전자좌가 선택될 수 있다. 예를 들어, MYXV는, 비제한적으로, C7, C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199를 포함한 몇몇 면역 조절 유전자를 코딩한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이들 유전자는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이종 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 프로테아제 절단 부위(예를 들어, 퓨린 절단 부위) 및 2A 펩티드(Pep2A) 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 분리된, 2 이상의 특정 관심 유전자를 코딩하는 2 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MYXVΔM31R은 M31R 유전자 서열의 전부 또는 대부분이 제1 특정 관심 유전자(예를 들어, hFlt3L) 및 제2 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L)로 치환된 재조합 MYXV를 포함하고, 제1 및 제2 특정 관심 유전자의 코딩 서열이 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되며, 이에 의해 MYXVΔM31R-hFlt3L-OX40L과 같은 재조합 바이러스를 형성한다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
MYXVΔM63R 및 MYXVΔM64R
본 기술의 개시내용은 M63R 돌연변이체 점액종 바이러스(즉, MYXVΔM63R; M63R 결실을 포함하는 MYXV; 돌연변이체 M63R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV), 및 M64R 돌연변이체 점액종 바이러스(즉, MYXVΔM64R; M64R 결실을 포함하는 MYXV; 돌연변이체 M64R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV), 또는 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물, 및 암 면역치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, M63R 또는 M64R 돌연변이체는 MYXVΔM127 mCherry 게놈 내로 삽입된다(예를 들어, 도 170 참고). 일부 실시양태에서, MYXVΔM63R 또는 MYXVΔM64R 바이러스는 암 면역치료제로서의 용도를 위해 본원에 개시된 것과 같은 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스는 균주 라우산(예를 들어, GenBank 수탁번호 AF170726.2에 의해 주어짐)으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 점액종 바이러스의 M63R 또는 M64R 유전자는 상동 재조합 기술을 통해 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 이종 핵산 서열을 포함하는 파괴를 함유하도록 조작되며, 이는 M63R 또는 M64R 유전자가 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 만큼 낮은 수준에서 발현되거나, 발현된 단백질이 비-기능성이도록(예를 들어, 삭제-돌연변이임) M63R 또는 M64R 녹아웃을 야기한다. 일부 실시양태에서, ΔM63R 또는 ΔM64R 돌연변이체는 이종 핵산 서열(예를 들어, 특정 관심 유전자(SG)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 유전적으로 조작된 또는 재조합 MYXVΔM63R 또는 MYXVΔM64R 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자, 예컨대 hOX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 임의의 하나 이상을 발현하고/하거나 적어도 하나의 다른 바이러스 유전자 돌연변이 또는 결실, 예컨대 다음 결실 E3L(ΔE3L); E3LΔ83N; C7(ΔC7L); B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200); E5R; K7R; C12L(IL18BP); B8R; B14R; N1L; C11R; K1L; M1L; N2L; 및/또는 WR199 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 변형된다. 다른 실시양태에서, 본원의 바이러스의 명칭에 제공된 것 이외의 추가 이종 유전자는 첨가되지 않고/않거나 M63R 또는 M64R 이외의 추가 바이러스 유전자는 파괴되거나 결실되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 선택 가능한 마커의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 추가 발현 카세트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 적색 형광 단백질을 코딩하는 mCherry 유전자이다.
본 기술에 따른 MVAΔ63R 및 MVAΔ64R 구축물 개방형 해독틀의 비-제한적인 예가 서열번호 39 및 40(표 9)에 나타나 있다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
XI. 흑색종
가장 치명적인 암 중 하나인 흑색종은 미국 및 전세계에서 가장 빠르게 증가하고 있는 암이다. 대부분의 경우, 진행된 흑색종은 화학요법 및 방사선을 포함한 종래의 요법에 저항성이다. 그 결과, 전이성 흑색종을 앓는 사람은 매우 나쁜 예후를 갖고, 기대 수명은 오직 6 내지 10 개월이다. 흑색종의 약 50%는 BRAF(핵심 종양-촉진 유전자)에서 돌연변이를 갖는다는 발견은 이 질환의 표적화된 요법을 위한 문을 열었다. BRAF 억제제를 이용한 초기 임상 시험은 BRAF 돌연변이를 갖는 흑색종을 앓는 환자에서 현저하지만, 불운하게도 지속되지 않는 반응을 나타내었다. 따라서, 이들 환자들뿐 아니라, BRAF 돌연변이가 없는 흑색종을 앓는 다른 환자들을 위한 대안적인 치료 전략이 시급히 필요하다.
인간 병리 데이터는 흑색종 병변 내 T-세포 침윤의 존재가 환자의 더 오랜 생존과 양의 상관관계를 갖는다는 것을 나타낸다(Oble et al., Cancer Immun. 9:3 (2009)). 흑색종에 대한 보호에서 면역계의 중요성은 면역요법, 예컨대 면역 활성제인 IFN-α2b 및 IL-2의 부분적인 성공뿐만 아니라(Lacy et al., Expert Rev. Dermatol. 7(1):51-68 (2012)), 항-CTLA-4 및 항-PD-1/PD-L1 약제 단독 또는 병용 요법을 포함한 면역 체크포인트 요법에 대한 전이성 흑색종을 앓는 환자의 전례 없는 임상 반응에 의해 추가로 지지된다(Sharma & Allison, Science 348(6230)"56-61 (2015); Hodi et al., NEJM 363(8):711-723 (2010); Wolchok et al., Lancet Oncol. 11(6) :155-164 (2010); Topalian et al., NEJM 366(26) :2443-2454 (2012); Wolchok et al., NEJM 369(2): 122-133 (2013); Hamid et al., NEJM 369(2) :134-144 (2013); Tumeh et al., Nature 515(7528) :568-571 (2014)). 그러나, 많은 환자들은 면역 체크포인트 차단 요법 단독에 반응하는 데 실패한다.
XII. 종양 면역에서 I 형 IFN 및 세포질 DNA-감지 경로
I 형 IFN은 숙주 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다(Fuertes et al., Trends Immunol. 34:67-73 (2013)). IFNAR1-결여 마우스는 종양 세포의 이식 후 종양을 발생시키는데 더욱 민감하고; 자발적 종양-특이적 T-세포 프라이밍은 또한 IFNAR1-결여 마우스에서 결함이 있다(Diamond et al., J. Exp. Med. 208:1989-2003 (2011); Fuertes et al., J. Exp. Med. 208:2005-2016 (2011)). 더욱 최근 연구는 세포질 DNA-감지 경로가 종양-유래된 DNA의 선천성 면역 감지에서 중요하며, 이는 항종양 CD8+ T-세포 면역의 발달을 야기한다는 것을 나타내었다(Woo et al., Immunity 41:830-842 (2014)). 이 경로는 또한 방사선-유도된 항종양 면역에서 역할을 한다(Deng et al., Immunity 4: 843-852 (2014)). 자발적 항-종양 T-세포 반응은 암을 앓는 환자에서 검출될 수 있으나, 암은 결국 대부분의 환자에서 항종양 면역을 극복한다. 종양 면역 억제 미세환경을 변경하기 위한 새로운 전략이 암 요법을 위해 유익할 것이다.
XIII. 면역 반응
특정 면역계 활성(예컨대, 항체 및/또는 사이토카인 생산, 또는 세포 매개된 면역의 활성화)의 상향-조절에 의한 면역 반응의 유도와 함께, 면역 반응은 또한 검출가능한 면역의 억제, 약화, 또는 임의의 다른 하향-조절을 포함하여, 항상성을 재수립하고 숙주 자신의 기관 및 조직에 대한 과잉 손상을 예방할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 유도되는 면역 반응은 이펙터 T-세포(예를 들어, 헬퍼, 킬러, 조절 T-세포)를 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 유도되는 면역 반응은 종양 세포의 사멸, 또는 증식 능력의 손실을 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 이펙터 CD8+(항종양 세포독성 CD8+) T-세포 또는 활성화된 T 헬퍼(TH) 세포(예를 들어, 이펙터 CD4 + T-세포), 또는 둘 다를 생성한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의한 면역 반응의 유도는 다양한 잘 알려진 면역학적 파라미터 중 임의의 것을 검출함으로써 확인될 수 있다(Takaoka et al., Cancer Sci. 94:405-11 (2003); Nagorsen et al., Crit. Rev. Immunol. 22:449-62 (2002)). 따라서, 면역 반응의 유도는 면역학적 분석을 포함한 다수의 잘 알려진 분석 중 임의의 것에 의해 수립될 수 있다. 이러한 분석은, 비제한적으로, 가용성 면역글로불린 또는 항체; 가용성 매개체, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등뿐 아니라, 다른 가용성 소형 펩티드, 탄수화물, 뉴클레오티드 및/또는 지질 매개체; 면역계의 세포의 변경된 기능적 또는 구조적 특성에 의해 확인된 바와 같은 세포 활성화 상태 변화, 예를 들어 세포 증식, 변경된 운동성, 변경된 세포내 양이온 구배 또는 농도(예컨대, 칼슘); 세포 폴리펩티드의 인산화 또는 탈인산화; 전문화된 활성, 예컨대 특이적 유전자 발현 또는 세포용해 거동; 변경된 표면 항원 발현 프로파일, 또는 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)의 개시를 포함한 면역계의 세포에 의한 세포 분화; 또는 면역 반응의 존재가 검출될 수 있는 임의의 다른 기준의 생체내, 생체외, 또는 시험관내 확인을 포함한다. 예를 들어, 면역 세포 유형을 구별하는 세포 표면 마커는 CD4+, CD8+, 또는 NK 세포에 결합하는 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. 검출될 수 있는 다른 마커 및 세포 구성요소는, 비제한적으로, 인터페론 γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF), IFN-α, IFN-β(IFNB), IL-6, 및 CCL5를 포함한다. 면역 반응을 검출하기 위한 일반적인 방법은, 비제한적으로, 유세포 분석, ELISA, 면역조직화학을 포함한다. 이들 및 유사한 분석을 수행하기 위한 절차는 광범위하게 알려져 있으며, 예를 들어 Letkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998)에서 찾아볼 수 있다.
XIV. 본 기술의 약학 조성물 및 제제
본원은 예를 들어, 물, 식염수, Tris 버퍼, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유한 용매 또는 분산매일 수 있는 담체 또는 희석제를 함유할 수 있는
Figure pct00085
를 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제 및 보존제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 유효할 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨, 및 완충제가 포함된다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 약제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 또는 담체 분자의 사용에 의해 야기될 수 있다. 다른 부형제는 습윤제 또는 유화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 주사용 제제에 적합한 부형제는 통상의 기술자에게 분명한 것으로서 포함될 수 있다.
Figure pct00086
를 포함하는 약학 조성물 및 제제는 종래의 혼합, 용해, 과립화, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정의 수단에 의해 제조될 수 있다. 약학적 바이러스 조성물은 시험관내, 생체내, 또는 생체외 용도에 적합한 바이러스 제제의 제형화를 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하는 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 추가 생물학적 활성제와 조합될 수 있고 약학적 허용 담체, 희석제 또는 부형제로 제형화되어, 비경구적 또는 종양내 투여에 적합한 본 발명의 약학적(생물학적을 포함함) 또는 수의학적 조성물을 생성할 수 있다.
통상의 기술자에 의해 인식되는 많은 유형의 제형이 가능하다. 당업계에 인식된 바와 같이, 선택된 특정 유형은 선택된 투여 경로에 의존적이다. 예를 들어, 전신 제형은 일반적으로 종양내 전달을 위해 설계된 것뿐 아니라, 주사, 예를 들어 정맥내에 의한 투여를 위해 설계될 것이다. 일부 실시양태에서, 전신 또는 종양내 제형은 살균성이다.
살균 주사액은
Figure pct00087
를 요구되는 바와 같이 본원에 열거된 다양한 다른 성분을 갖는 요구되는 양의 적절한 용매 중에 포함시킨 후, 적합한 살균 수단에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산매 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내에 다양한 살균된 활성 성분을 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이는 바이러스 + 이의 사전 살균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 소망하는 성분의 분말을 산출한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의
Figure pct00088
조성물은 수용액, 또는 생리학적으로 양립 가능한 용액 또는 버퍼, 예컨대 행크액(Hanks's solution), 링거액(Ringer's solution), 만니톨 용액 또는 생리 식염수 버퍼에서 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서,
Figure pct00089
조성물 중 임의의 것은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제, 침투제 또는 분산제, 버퍼, 동결건조보호제 또는 보존제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80, 1-도데실헥사하이드로-2H-아제핀-2-온(라우로카프란), 올레산, 소듐 시트레이트, Tris HCl, 덱스트로오스, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르비탄 모노라우레이트(Tween®-20), 이소프로필 미리스테이트, 벤질 알코올, 이소프로필 알코올, 에탄올 수크로오스, 트레할로오스를 함유할 수 있으며 당업계에 일반적으로 알려진 다른 것들이 본 발명의 임의의 조성물에 사용될 수 있다. (Pramanick et al., Pharma Times 45(3):65-76 (2013)).
본 발명의 생물학적 또는 약학 조성물은 그 내부에 함유된 바이러스가 대상체에 대한 조성물의 투여시 종양 세포를 감염시키기 위해 이용 가능하게 되도록 제형화될 수 있다. 투여 후 혈청, 종양, 및 소망하는 경우, 다른 조직에서 바이러스의 수준은 다양한 잘-수립된 기술, 예컨대 항체-기반 분석(예를 들어, ELISA, 면역조직화학 등)에 의해 모니터링될 수 있다.
본 기술의 조작된 폭스바이러스는 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.7로 제형화된 3.5 x107 pfu/mL의 역가로 -80℃에서 저장될 수 있다. 백신 주사의 제조를 위해, 예를 들어 102-108 또는 102-109 바이러스 입자가 앰플, 바람직하게는 유리 앰플에서 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에 100 mL의 포스페이트-완충 식염수(PBS)에서 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 주사용 제제는 제형 중 조작된 폭스바이러스의 단계적 동결-건조에 의해 생산될 수 있다. 이 제형은 추가 첨가제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스, 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 다른 첨가제, 예컨대 항산화제 또는 불활성 가스, 안정제, 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)을 함유할 수 있다. 그 다음에, 유리 앰플은 실링되고 4℃ 내지 실온에서 수개월 동안 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 앰플은 -20℃ 미만의 온도에서 저장된다.
요법을 위해, 동결건조물은 수용액, 예컨대 생리 식염수 또는 Tris 버퍼 중에 용해되고, 전신으로 또는 종양내로 투여될 수 있다. 투여의 방식, 투여량, 및 투여의 횟수는 통상의 기술자에 의해 최적화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 추가 아쥬반트를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "아쥬반트"는 종양 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 향상시키거나, 증가시키거나, 강화시키는 물질을 지칭한다. 통상적인 아쥬반트는 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, Quil A, 세균 세포벽 펩티도글리칸, 바이러스-유사 입자, 폴리사카라이드, 톨-유사 수용체, 나노-비드 등일 수 있다. (Aguilar et al., Vaccine 25:3752-3762 (2007)).
XV. 본 기술의 치료 방법
일 양태에서, 본 발명은 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 E3L의 결실을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스(MVAΔE3L)(MVAΔE3L-OX40L); OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 C7L의 결실을 포함하는 재조합 MVA 바이러스(MVAΔC7L)(MVAΔC7L-OX40L); OX40L 및 hFlt3L을 발현하도록 조작된 재조합 MVAΔC7L(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L); C7L의 결실, E5R의 결실을 포함하고 hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔC7LΔE5R-hFlt3L-OX40L); E5R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE5R); E5R의 결실을 포함하고 hFlt3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MVA(MVAΔE5R-hFlt3L-OX40L); OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 C7L의 결실을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACVΔC7L)(VACVΔC7L-OX40L); OX40L 및 hFlt3L 둘 다를 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 VACVΔC7L(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L); E5R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 VACV(VACVΔE5R); E5R의 결실, 티미딘 키나아제(TK)의 결실을 포함하고, 항-CTLA-4, hFlt3L, 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 VACV(VACV-TK--항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L); M31R의 결실을 포함하도록 유전적으로 조작된 MYXV(MYXVΔM31R); M31R의 결실을 포함하고 hFl3L 및 OX40L을 발현하도록 유전적으로 조작된 재조합 MYXV(MYXVΔM31R-hFlt3L-OX40L); 및/또는
Figure pct00090
, 또는 이의 조합으로부터 선택된 추가 조작된 폭스바이러스의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고향 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료는 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진은 상응하는 MVA, MVAΔE3L, MVAΔC7L, VACV, VACVΔC7L, 또는 MYXV 균주로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및 상응하는 MVA, MVAΔE3L, MVAΔC7L, VACV, VACVΔC7L, 또는 MYXV 균주와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00091
를 포함하는 본 기술의 조성물은 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시(즉, 일제) 또는 순차 조합에 의해 대상체에 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암, 예컨대 흑색종, 결장 암종, 유방암, 전립선암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골원성육종, 골원성육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양 및 다른 골 종양(예를 들어, 골육종, 악성 섬유 조직구증), 평활근육종, 횡문근육종, 췌장암, 난소암, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 뇌/CNS 종양(예를 들어, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 유아기 종양, 예컨대 비정형 기형/횡문근 종양, 생식세포 종양, 배아 종양, 뇌실막세포종) 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경집종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 직장 선암종, 신경교종, 요로상피세포암종, 자궁(예를 들어, 자궁내막암, 난관암) 비소세포 폐암(편평세포 및 선암종), 젖관 제자리암, 및 간세포 암종, 부신 종양(예를 들어, 부신겉질샘암종), 식도암, 눈암(예를 들어, 흑색종, 망막모세포종), 담낭암, 위장암, 심장암, 후두 및 하인두암, 구강암(예를 들어, 입술, 입, 침샘), 비인두암, 신경모세포종, 복막암, 뇌하수체암, 카포시 육종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 부갑상선암, 질 종양, 및 상술한 것 중 임의의 것의 전이로 진단된다.
XVI. 다른 활성제와의 병용 요법
일부 실시양태에서, 본 기술의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00092
)는 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및 (iii) 면역조절 약물(즉, 핑골리모드(FTY720))의 임의의 조합과 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 폭스바이러스(예를 들어,
Figure pct00093
)와 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및 (iii) 면역조절 약물(즉, 핑골리모드(FTY720)) 중 임의의 하나 이상의 조합된 투여는 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
A. 면역 체크포인트 차단제 및 면역계 자극제
일부 실시양태에서,
Figure pct00094
는 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제와 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 PD-1(프로그램된 사멸 1), PD-L1(프로그램된 사멸 리간드 1), 또는 CTLA-4(세포독성 T 림프구 항원 4)(예를 들어, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, 또는 항-huCTLA-4 항체) 중 임의의 하나 이상을 표적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제는 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIM3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-3), B7-H3, B7-H4, TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체), AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS(유도성 T-세포 공동자극제), DLBCL(미만성 거대 B-세포 림프종) 억제제, BTLA(B 및 T 림프구 약화제), PDR001, 및 이의 임의의 조합에 대한 억제성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상술한 것의 투여량 범위는 몇몇 투여 임상 시험이 완료되어, 다른 약제에 대한 추정이 가능하게 하였기 때문에, 당업계에 알려져 있거나 이미 통상의 기술 내에 있다.
제한의 방식이 아닌, 예로서, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역계 자극제는 천연 킬러 세포(NK) 자극제, 항원 제시 세포(APC) 자극제, 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 및 톨-유사 수용체 자극제 중으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, NK 자극제는, 비제한적으로, IL-2, IL-15, IL-15/IL-15RA 복합체, IL-18, 및 IL-12를 포함한다. 일부 실시양태에서, NK 자극제는 다음 수용체 NKG2, KIR2DL1/S1, KRI2DL5A, NKG2D, NKp46, NKp44, 또는 NKp30 중 적어도 하나를 자극하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, APC 자극제는, 비제한적으로, CD28, ICOS, CD40, CD30, CD27, OX-40, 및 4-1BB를 포함한다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00095
및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제의 조합은 상승작용 효과를 야기한다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00096
및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제의 조합은 향상된 항-종양 효과를 야기한다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00097
및 항-PD-L1의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00098
및 항-PD-1의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00099
및 항-CTLA-4의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00100
와 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제의 조합은 섹션 XVI B 및 C에서 하기 기재된 하나 이상의 항암 약물 및/또는 면역조절 약물과 추가로 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00101
와 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제 및 섹션 XVI B 및 C에서 하기 기재된 하나 이상의 항암 약물 및/또는 면역조절 약물의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
항-OX40 항체 후 면역 체크포인트 억제제, 항-PD-1 항체의 순차적(즉, 연속) 투여는 조합의 치료 효능을 개선하여, 종양 진행 지연 및, 일부 경우에, 완전 종양 관해를 야기한다는 것이 보고되었다. (예를 들어, Shrimali et al., Cancer Immunol. Res.5(9): OF1-OF12 (2017); Messenheimer et al., Clin. Cancer Res. 23(20):6165-6177 (2017) 참고). 그러나, 동일한 연구는 항-OX40 항체 및 항-PD-1 항체의 동시(즉, 일제) 투여는 마우스에서 OX40 항체의 항-종양 효과를 무효화하고 좋지 않은 치료 결과를 야기한다는 것을 나타낸다. (Shrimali et al., (2017); Messenheimer et al., (2017) 참고). 반대로, 도 11B-11G에 나타낸 바와 같이, 본 기술의 OX40L 트랜스유전자를 발현하는 바이러스(예를 들어, MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L) 및 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L + 항-PD-L1 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L + 항-CTLA-4 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L + 항-PD-1(나타내지 않음))의 조합된 동시(즉, 일제) 투여는 마우스 흑색종 모델에서 대조군과 비교하여 놀랍게도 예상외로 주사된 및 비-주사된 종양 둘 다에서의 항-종양 효과 향상 및 생존 증가를 야기한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 OX40L 트랜스유전자를 발현하는 바이러스, 예를 들어
Figure pct00102
및/또는 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합은 면역 체크포인트 억제제 및 항-OX40 작용제 항체의 조합과 비교하여 놀라운 예상외의 향상된 항-종양 효과를 야기한다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00103
및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합은 면역 체크포인트 억제제 및 항-OX40 작용제 항체의 조합과 비교하여 고형 종양의 치료에 대해 놀라운 예상외의 상승작용 효과를 야기한다.
B. 항암 약물
수용체 티로신 키나아제, 예컨대 EGFR 및 HER2는 Ras-Raf-Mek-Erk(Ras-MAPK) 경로를 통한 종양 세포 증식 및 생존 촉진에 연관되어 왔다. Raf 및 Mek는 또한 상류 수용체 티로신 키나아제로부터 또는 Ras-MAPK 시그널링을 구동하는 RAS 또는 RAF에서의 기능 증가(gain-of-function) 돌연변이로부터 발생한 진행 중인 신호를 억제하기 위한 표적이다. 흑색종을 포함한 암에서의 핵심 활성화 돌연변이의 확인은 MAPK-경로에 따른 표적화된 요법의 발달을 야기하였다. 예를 들어, BRAF에서의 활성화 돌연변이는 절반을 초과하는 흑색종 암에서 발생하며, 이들 대부분은 MAPK 시그널링 경로를 본질적으로 활성화하는 BRAFV600E 돌연변이를 포함한다. 이는 결국 침습성을 포함한 전이 거동 증가를 야기하는 한편, 아폽토시스 감소(즉, 암 세포 생존 증가)를 야기한다. 몇몇 항암 약물은 이 경로로부터의 병원성 시그널링을 완화시키기 위해 개발되었다. 이 경로를 표적화하는 집중된 요법은 EGFR, HER2, BRAF, RAF, 및 MEK의 억제제를 포함한다.
체크포인트 억제제(PD-1/PD-L1, CTLA-4) 및 MAPK-경로 표적화된 요법의 조합으로 구성된 면역요법은 예를 들어, BRAF-양성 진행된 흑색종에서 유망한 결과를 나타내었다. MAPK 경로 활성화는 면역 도피에 기여하는 한편, MAPK 경로 억제는 면역억제 인자의 폐기뿐 아니라, 특정 다른 면역조절 단백질, 예컨대 PD-L1의 조절장애를 통한 더욱 바람직한 면역 환경에 기여한다는 것이 보고되었다. 또한, MAPK 경로 억제와의 이중 조합에서 종양세포붕괴성 헤르페스 바이러스(T-Vec)는 전임상 모델에서 단일 약제 단독과 비교하여 암 세포 사멸을 증가시키는 것으로 나타난 한편, MAPK-억제제, T-Vec, 및 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD-L1 항체)의 삼중 조합은 상승작용 면역자극 효과를 나타내었다. MAPK 경로 억제를 이용한 강력한 면역 반응은 CD8 T-세포 인플럭스(influx)의 활성화 증가 및 분비된 IFN 및 TNF-α의 수준 증가와 강하게 연관되었다.
본원에 나타낸 바와 같이, MVAΔE5R, VACVΔE5R, 및 MYXVΔM31R과 같이 E5R(또는 이의 올소로그)의 결실을 포함하는 본 기술의 재조합 바이러스 구축물은 상응하는 야생형 바이러스와 비교하여 IFN 유전자 발현 수준을 1000-배 초과하여 상당히 증가시킨다(도 60a 참고).
일부 실시양태에서,
Figure pct00104
는 Mek 억제제(예를 들어, U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(예를 들어, 라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(예를 들어, 라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(예를 들어, 소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(예를 들어, 다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(예를 들어, 베바시주맙)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항암 약물과 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00105
와 하나 이상의 항암 약물의 조합은 섹션 XVI A에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제와 추가로 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00106
와 하나 이상의 항암 약물 및 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00107
와 하나 이상의 항암 약물의 조합은 섹션 XVI A에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제, 및/또는 섹션 XVI C에 기재된 면역조절 약물과 추가로 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00108
와 하나 이상의 항암 약물, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 또는 면역계 자극제 및/또는 면역조절 약물의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
C. 면역조절 약물
핑골리모드 (FTY720)는 다발성 경화증을 치료하기 위해 사용되는 경구 활성 면역조절 약물이다. 핑골리모드는 림프절로부터 림프구가 떠나는 것을 차단하는 스핑고신-1-포스페이트 수용체 조절제로서 작용한다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00109
는 FTY720과 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다.
일부 실시양태에서,
Figure pct00110
와 FTY720의 조합은 섹션 XVI A에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제 및/또는 섹션 XVI B에 기재된 항암 약물과 추가로 조합되거나 이와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 일제히) 투여된다. 일부 실시양태에서,
Figure pct00111
와 FTY720, 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제, 및/또는 면역계 자극제, 및/또는 항암 약물의 조합은 고형 종양의 치료에 대해 상승작용 효과를 야기한다.
XVII 조작된
Figure pct00112
를 포함하는 키트
본 발명은 치료될 대상체에 대한 조작된 폭스바이러스의 투여를 위한 설명서와 함께 본원에 기재된 조작된 폭스바이러스, 예를 들어
Figure pct00113
중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 조작된 바이러스, 예를 들어
Figure pct00114
조성물과의 합동 투여를 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제를 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 조작된 폭스바이러스, 예를 들어
Figure pct00115
조성물과의 합동 투여를 위한 하나 이상의 항암 약물을 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 조작된 폭스바이러스, 예를 들어
Figure pct00116
조성물과의 합동 투여를 위한 면역조절 약물을 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 조작된 폭스바이러스, 예를 들어
Figure pct00117
조성물과의 합동 투여를 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제, 및 하나 이상의 항암 약물을 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 또한 조작된 폭스바이러스, 예를 들어
Figure pct00118
조성물과의 합동 투여를 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제, 하나 이상의 항암 약물, 및 면역조절 약물의 임의의 조합을 포함하는 추가 조성물을 포함할 수 있다.
XVIII.
Figure pct00119
의 유효량 및 투여량
일반적으로, 대상체는 약 106 내지 약 1010 플라크 형성 단위(pfu)의 범위 내의
Figure pct00120
의 투여량을 투여받지만, 더 낮거나 높은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 102 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 103 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 104 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 105 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 106 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 107 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 108 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 109 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 107 내지 약 109 pfu이다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가는 사용되는 구체적인 pfu 적정 방법에 따라 상이할 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 개 바이러스 입자와 동등하고 0.69 pfu는 약 1 TCID50이다.
Figure pct00121
의 치료적 유효량은 처방된 기간 동안 처방된 투여 빈도로 하나 이상의 분할된 용량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 통상의 기술자에게 명확한 바와 같이, 본 발명에 따른
Figure pct00122
의 치료적 유효량은 인자, 예컨대 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 일반 건강, 및 특정 대상체에서 소망하는 면역학적 반응(요법에 대한 대상체의 반응)을 유도하는
Figure pct00123
의 능력에 따라 달라질 수 있다. 대상체에 대한
Figure pct00124
의 전달에서, 투여량은 또한 일반 의학적 병태, 이전의 병력, 질환 유형 및 진행, 종양 부담, 종양에서 종양 침윤성 면역 세포의 존재 또는 부재 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. "본원에 사용된 바와 같은 투여량 단위 형태"는 치료되는 포유동물 대상체에 대한 통합된 투여량으로서 맞추어진 물리적 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약학적 또는 수의학적 허용 담체와 공동으로 소망하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 사전결정된 양을 함유한다.
XIX.
Figure pct00125
의 투여 및 치료 요법
약학 조성물은 통상적으로 이의 의도된 투여 경로와 양립되도록 제형화된다.
Figure pct00126
의 투여는 하나 초과의 경로를 사용하여 달성될 수 있다. 투여 경로의 예는, 비제한적으로, 비경구적(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 피하), 종양내, 척추강내, 비강내, 전신, 경피, 이온영동, 피내, 안구내, 또는 국부 투여를 포함한다. 일 실시양태에서,
Figure pct00127
는 예를 들어, 종양내 주사에 의해 종양 내에 직접 투여되고, 직접 국소 반응이 바람직하다. 또한,
Figure pct00128
의 투여 경로는 예를 들어, 종양내 주사를 사용한 1 차 투여, 및 정맥내 주사를 통한 후속 투여, 또는 이의 임의의 조합으로 달라질 수 있다.
Figure pct00129
주사의 치료적 유효량은 처방된 기간 동안 처방된 투여 빈도로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서,
Figure pct00130
는 다른 치료법과 결합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 재조합 폭스바이러스는 큰 부피의 원발성 종양으로 감염된 대상체를 위해 네오아쥬반트(수술전) 또는 아쥬반트(수술후) 환경에서 투여될 수 있다. 이러한 최적화된 치료 요법은 종양에 대해 면역 반응을 유도하고 일차 요법, 예컨대 수술 전 또는 후에 대상체에서 종양 부담을 감소시킬 것이라는 것이 예상된다. 또한,
Figure pct00131
는 다른 치료법, 예컨대 화학요법 또는 방사선과 결합하여 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서,
Figure pct00132
는 매주 또는 매달 적어도 1 회 투여되지만, 필요한 경우, 더욱 자주, 예컨대 수주, 수개월, 수년 동안, 또는 이득이 지속되는 한 오래 무기한으로 매주 2 회 투여될 수 있다. 더욱 빈번한 투여는 용인된 경우 및 이들이 지속되거나 증가된 이득을 야기하는 경우 고려된다. 본 방법의 이득은, 비제한적으로, 암 세포의 수의 감소, 종양 크기의 감소, 종양의 근절, 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제, 전이 성장의 억제 또는 안정화 또는 근절, 종양 성장의 억제 또는 안정화, 및 삶의 질의 안정화 또는 개선을 포함한다. 또한, 이득은 종양에 대한 면역 반응의 유도, 이펙터 CD4 + T-세포의 활성화, 이펙터 CD8+ T-세포의 증가, 또는 조절 CD4+ 세포의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종의 맥락에서, 이득은 흑색종의 초기 진단의 1, 2, 3, 4, 5 년 이상 이내의 재발 또는 전이의 결여일 수 있다. 유사한 평가가 결장암 및 다른 고형 종양에 대해 이루어질 수 있다.
특정 다른 실시양태에서, 종양 덩어리 또는 종양 세포는
Figure pct00133
로 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 치료된다.
XX. 벡터
일부 실시양태에서, pCB 플라스미드-계 벡터는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 특정 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L(뮤린 또는 인간)을 삽입하기 위해 사용된다. 벡터를 구축하기 위한 방법론이 기재되어 왔다(M. Puhlmann, C. K. Brown, M. Gnant, J. Huang, S. K. Libutti, H. R. Alexander, D. L. Bartlett, Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: Biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant Cancer Gene Therapy 7(1):66-73 (2000) 참조). 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하의 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt) 유전자는 선택 가능한 마커로서 사용된다. 예시적 pCB-mOX40L-gpt 벡터 핵산 서열이 서열번호 3에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, pUC57 플라스미드-계 벡터는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 특정 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L(뮤린 또는 인간)을 삽입하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, pMA 플라스미드-계 벡터는 백시니아 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)의 제어 하에 특정 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L(뮤린 또는 인간)을 삽입하기 위해 사용된다. 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하의 mCherry 유전자는 선택 가능한 마커로서 사용된다. 예시적 pUC57-hOX40L-mCherry 벡터 핵산 서열이 서열번호 5에 기재되어 있다. 본 기술의 추가 예시적 벡터 핵산 서열이 표 2-5에 나타나 있다.
일부 실시양태에서, 이들 발현 카세트는 각각의 측면에 TK 유전자의 부분 서열(TK-L, TK-R)이 측면에 있다. 플라스미드 DNA 및 MVAΔE3L, MVAΔC7L, MVAΔE5R, VACVΔC7L, VACVΔE5R, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA의 TK 유전자좌에서 발생하는 상동 재조합은 MVAΔE3L, MVAΔC7L, MVAΔE5R, VACVΔC7L, VACVΔE5R, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA TK 유전자좌 내로의 OX40L 및 선택 가능한 마커 발현 카세트의 삽입을 야기하여, MVAΔE3L-TK(-)-OX40L, MVAΔC7L-TK(-)-OX40L, MVAΔE5R-TK(-)-OX40L, VACVΔC7L-TK(-)-OX40L, VACVΔE5R-TK(-)-OX40L, 또는 MYXVΔM31R-TK(-)-OX40L을 생성한다. 추가로 또는 대안적으로, 바이러스 내의 TK 유전자좌 이외의 적합한 유전자좌가 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA 및 MVA, MVAΔE3L, MVAΔC7L, MVAΔE5R, VACV, VACVΔC7L, VACVΔE5R, MYXV, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA의 적합한 바이러스 유전자좌에서 발생하는 상동 재조합은 MVA, MVAΔE3L, MVAΔC7L, MVAΔE5R, VACVΔC7L, VACVΔE5R, MYXV, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA 바이러스 유전자좌 내로의 하나 이상의 특정 관심 유전자(예를 들어, OX40L, hFlt3L, 항-CTLA-4 등) 및/또는 선택 가능한 마커 발현 카세트의 삽입을 야기하여, 본원에 기재된 것과 같은 재조합 폭스바이러스를 생성한다.
일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 18,407 내지 18,859는 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 75,560 내지 76,093은 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, VACV 게놈 서열(서열번호 2)의 위치 15,716 내지 16,168은 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 75,798 내지 75,868은 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, VACV 게놈 서열(서열번호 2)의 위치 80,962 내지 81,032는 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 재조합 바이러스는 선택에 의해 풍부화되고 적절한 재조합 바이러스가 얻어질 때까지 4-5 라운드 동안 플라크-정제된다.
유사하게는, 일부 실시양태에서, pUC57 플라스미드-계 벡터는 특정 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L을 MVA 또는 VACV 바이러스 게놈 백본 내에 삽입하기 위해 사용된다. GFP는 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있다. 예시적 pUC57-hFlt3L-GFP 벡터 핵산 서열이 서열번호 4에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 이들 발현 카세트는 각각의 측면에서 C7 유전자의 부분 서열이 측면에 있다. 추가로 또는 대안적으로, 바이러스 내의 C7 유전자좌 이외의 적합한 유전자좌가 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA 및 MVAΔE3L, MVAΔE5R, MVA, VACV, VACVΔC7L, VACVΔE5R, MYXV, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA의 C7 유전자좌에서 발생하는 상동 재조합은 MVAΔE3L, MVAΔE5R, MVA, VACV, VACVΔC7L, VACVΔE5R, MYXV, 또는 MYXVΔM31R 게놈 DNA C7 유전자좌 내로의 hFlt3L 및 선택 가능한 마커 발현 카세트의 삽입을 야기한다.
일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 18,407 내지 18,859는 선택 가능한 마커, 예컨대 GFP, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 75,560 내지 76,093은 선택 가능한 마커, 예컨대 gpt 또는 mCherry, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, VACV 게놈 서열(서열번호 2)의 위치 15,716 내지 16,168은 선택 가능한 마커, 예컨대 GFP, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 일부 실시양태에서, VACV 게놈 서열(서열번호 2)의 위치 80,962 내지 81,032는 선택 가능한 마커, 예컨대 GFP, 및 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 재조합 바이러스는 선택에 의해 풍부화되고 적절한 재조합 바이러스가 얻어질 때까지 4-5 라운드 동안 플라크-정제된다.
일부 실시양태에서, MVA 게놈 서열(서열번호 1)의 위치 38,432 내지 39,385는 선택 가능한 마커, 예컨대 mCherry, 및/또는 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L 및/또는 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 재조합 바이러스는 선택에 의해 풍부화되고 적절한 재조합 바이러스가 얻어질 때까지 4-5 라운드 동안 플라크-정제된다.
일부 실시양태에서, VACV 게놈 서열(서열번호 2)의 위치 49,236 내지 50,261은 선택 가능한 마커, 예컨대 mCherry, 및/또는 관심 유전자(SG), 예컨대 hFlt3L 및/또는 OX40L을 코딩하는 하나 이상의 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환된다. 재조합 바이러스는 선택에 의해 풍부화되고 적절한 재조합 바이러스가 얻어질 때까지 4-5 라운드 동안 플라크-정제된다.
일부 실시양태에서, pCB-OX40L-gpt 벡터 또는 pUC57-OX40L-mCherry 벡터 또는 pUC57-OX40L-mCherry 벡터 및 pUC57-hFlt3L-GFP 벡터 둘 다는 OX40L을 TK 유전자좌 내로 및 hFlt3L을 C7 유전자좌 내로 삽입하여, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 생성하기 위해 사용된다.
MVA, VACV, 또는 MYXV 게놈 내로의 통합에 적합한 임의의 다른 발현 벡터뿐 아니라, 대안적 프로모터, 조절 요소, 선택 가능한 마커, 절단 부위, 및/또는 MVA, VACV, 또는 MYXV의 비필수 삽입 영역이 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 리포터 단백질이며, 리포터 단백질은 생물발광 단백질, 형광 단백질, 또는 화학발광 단백질이다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP)이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)이다. 일부 실시양태에서, 선택 가능한 마커는 mCherry 유전자이다. MVA, VAVC, 및 MYXV는 C11, K3, F1, F2, F4, F6, F8, F9, F11, F14.5, J2, A46, E3L, B18R(WR200), E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, C16, M1L, N2L, 및 WR199(또는 이의 올소로그)를 포함하여 선형 게놈의 단부에서 많은 면역 조절 유전자를 코딩한다. 이들 유전자(또는 이의 올소로그)는 결실되어, 바이러스의 면역 활성화 특성을 잠재적으로 향상시키고, 트랜스유전자의 삽입을 허용할 수 있다.
XXI. 암을 치료하기 위한 대상체에 대한 아쥬반트로서 본 기술의 조작된 폭스바이러스 균주의 전달
A. 조성물
면역-활성화 암 백신 아쥬반트
암 신생항원의 최근 발견은 백신접종 효과를 향상시키기 위한 암 백신접종 및 암 백신접종과 면역 체크포인트 차단제의 조합에 재개된 관심을 생성하였다. 항종양 면역 반응을 최대화할 수 있는 효과적인 백신 아쥬반트를 개발하는 것은 암 백신의 성공을 위해 중요하다.
암 백신은 암 항원 및 면역 아쥬반트를 포함한다. 암 항원은 일반적으로 종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우에 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 및 바이러스 항원을 포함한다. 암 항원은 조사된 종양 세포, 종양 세포 용해물 또는 펩티드가 로딩된 수지상 세포(DC), 항원을 코딩하는 DNA 또는 RNA뿐 아니라, 암 항원(들)을 코딩하는 트랜스유전자(들)를 갖는 종양세포붕괴성 바이러스의 형태로 제공될 수 있다. 수지상 세포(DC)는 천연 T-세포를 프라이밍하여, 항원-특이적 T-세포 반응을 생성하기 위해 중요한 전문적 항원-제시 세포이다. 면역 아쥬반트는 DC 및/또는 DC 성숙 및 활성화에 의해 항원 섭취를 촉진하는 약제이다. 톨-유사 수용체(TLR) 작용제, 폴리 (I:C)(TLR3 작용제), CpG(TLR9 작용제), 이미퀴모드(TLR7 작용제)뿐 아니라, STING 작용제를 포함한 몇몇 면역 아쥬반트는 전임상 모델 및 임상 환경에서 백신 효능을 개선하는 것으로 나타났다.
아쥬반트 요법으로서 본 기술의 조작된 폭스바이러스 균주
본 기술의 개시내용은 백신 아쥬반트로서 본원에 기재된 조작된 폭스바이러스 균주(예를 들어,
Figure pct00134
)의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 개시내용은 백신 아쥬반트로서 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 개시내용은 백신 아쥬반트로서 열-불활성화된 백시니아(열-iMVA, 열-iMVAΔE5R)와 조합된 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L의 용도에 관한 것이다. 열-iMVA는 cGAS/STING-의존적 경로를 통해 종래의 DC(cDC)에서 I 형 IFN을 유도하고 또한 TLR7/MyD88-의존적 메커니즘을 통해 형질세포양 DC(pDC)에서 I 형 IFN을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 열-iMVA의 종양내 주사는 주사된 종양을 근절하고 단일 요법으로서 또는 면역 체크포인트 차단제(ICB)와의 조합으로 전신 항종양 면역의 생성을 야기한다.
표적 항원
본원에 개시된 조성물 및 방법은 항원 또는 신생항원의 선택에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 항원 및 신생항원의 많은 예가 제공되는 한편, 통상의 기술자는 본원에 개시된 아쥬반트와 선택된 항원 또는 신생항원을 용이하게 이용할 수 있다. 본 기술의 치료 요법에서 사용될 수 있는 예시적, 비-제한적 표적 항원은 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스테인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은
Figure pct00135
, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원을 포함한다. 표적 항원은 또한 상기 열거된 항원의 면역학적 활성 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
면역 체크포인트 차단제(ICB)
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역원성 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함한다. 면역 체크포인트 차단제(ICB) 항체는 면역요법의 선두에 있었으며 수술, 방사선, 및 화학요법을 포함한 암 관리 옵션의 기둥 중 하나로서 수용되어 왔다. 면역 체크포인트는 항종양 면역의 하향조절에 연관되었기 때문에, 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 리간드(CTLA-4, PD-1, 또는 PD-L1)를 표적화하는 약제 또는 항체는 항종양 T-세포를 억압해제하여, 활성화된 T-세포의 증식 및 생존을 야기하는데 성공적하였다. 이는 흑색종, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부암, 요로상피세포암종, 메르켈 세포 암종, PD-L1+ 위 선암종뿐 아니라, 미스매치 회복 결여 및 반복서열 불안정성(MSI) 높은 전이성 고형 종양을 포함한 다양한 조직학적 유형의 진행된 암을 앓는 환자에 대한 다중 면역 체크포인트 차단제(ICB) 약제의 FDA 승인을 야기하였다.
면역 체크포인트 차단제의 비-제한적인 예는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001 및 이의 임의의 조합을 포함한 하나 이상의 체크포인트 단백질의 활성을 조절하는 약제 또는 항체를 포함한다.
본 기술의 약학 조성물 및 제제
본원은 항원 및 예를 들어, 물, 식염수, Tris 버퍼, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유한 용매 또는 분산매일 수 있는 담체 또는 희석제를 함유할 수 있는 아쥬반트로서
Figure pct00136
을 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 항원 및 아쥬반트로서 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 및 열-iMVA를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제 및 보존제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 유효할 수 있다. 일부 실시양태에서, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨, 및 완충제가 포함된다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 또는 담체 분자의 사용에 의해 야기될 수 있다. 다른 부형제는 습윤제 또는 유화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 주사용 제제에 적합한 부형제는 통상의 기술자에게 분명한 것으로서 포함될 수 있다.
항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00137
을 포함하는 약학 조성물 및 제제는 종래의 혼합, 용해, 과립화, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정의 수단에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물은 시험관내, 생체내, 또는 생체외 용도에 적합한 제제의 제형화를 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하는 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 추가 생물학적 활성제(예를 들어, GM-CSF의 병행 투여)와 조합될 수 있고 약학적 허용 담체, 희석제 또는 부형제로 제형화되어, 비경구적 또는 종양내 투여에 적합한 본 발명의 약학적(생물학적을 포함함) 또는 수의학적 조성물을 생성할 수 있다.
통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같은 많은 유형의 제형이 가능하다. 선택된 특정 유형은 당업계에 잘-인식된 바와 같은 선택된 투여 경로에 의존적이다. 예를 들어, 전신 제형은 일반적으로 종양내 전달을 위해 설계된 것뿐 아니라, 주사, 예를 들어 정맥내에 의한 투여를 위해 설계될 것이다. 일부 실시양태에서, 전신 또는 종양내 제형은 살균성이다.
살균 주사액은 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00138
을 요구되는 바와 같이 본원에 열거된 다양한 다른 성분을 갖는 요구되는 양의 적절한 용매 중에 포함시킨 후, 적합한 살균 수단에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산매 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 살균 비히클 내에 다양한 살균된 활성제를 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이는 바이러스 + 이의 사전 살균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 소망하는 성분의 분말을 산출한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항원 및
Figure pct00139
조성물은 수용액, 또는 생리학적으로 양립 가능한 용액 또는 버퍼, 예컨대 행크액, 링거액, 만니톨 용액 또는 생리 식염수 버퍼에서 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 항원 및 열-iMVA 또는 열-iMVAΔE5R 조성물은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제, 침투제 또는 분산제, 버퍼, 동결건조보호제 또는 보존제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80, 1-도데실헥사하이드로-2H-아제핀-2-온(라우로카프란), 올레산, 소듐 시트레이트, Tris HCl, 덱스트로오스, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르비탄 모노라우레이트(Tween®-20), 이소프로필 미리스테이트, 벤질 알코올, 이소프로필 알코올, 에탄올 수크로오스, 트레할로오스를 함유할 수 있으며 당업계에 일반적으로 알려진 다른 것들이 본 발명의 임의의 조성물에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 조성물은 -80℃에서 저장될 수 있다. 백신 주사의 제조를 위해, 예를 들어 102-108 또는 102-109 바이러스 입자가 앰플, 바람직하게는 유리 앰플에서 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에 예를 들어, 100 mL의 포스페이트-완충 식염수(PBS)에서 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 주사용 제제는 제형 중 재조합 폭스바이러스의 단계적 동결-건조에 의해 생산될 수 있다. 이 제형은 추가 첨가제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스, 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 다른 첨가제, 예컨대 항산화제 또는 불활성 가스, 안정제 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)을 함유할 수 있다. 그 다음에, 유리 앰플은 실링되고 4℃ 내지 실온에서 수개월 동안 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 앰플은 -20℃ 미만의 온도에서 저장된다.
요법을 위해, 동결건조물은 수용액, 예컨대 생리 식염수 또는 Tris 버퍼 중에 용해되고, 전신으로 또는 종양내로 투여될 수 있다. 투여의 방식, 투여량, 및 투여의 횟수는 통상의 기술자에 의해 최적화될 수 있다.
본 발명에 따른 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00140
을 포함하는 약학 조성물은 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, Quil A, 세균 세포벽 펩티도글리칸, 바이러스-유사 입자, 폴리사카라이드, 톨-유사 수용체, 나노-비드 등을 포함한 추가 아쥬반트를 포함할 수 있다.
백신
일부 실시양태에서,
Figure pct00141
아쥬반트 및 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물은 백신으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아쥬반트로서 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아쥬반트로서 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 및 열-iMVA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 종양 항원-함유 전세포 백신(예를 들어, 조사된 전세포 백신)이다. 일부 실시양태에서, 백신은 대상체에 투여되어, 이로 제형화된 항원에 대해 면역 반응을 유도한다.
Figure pct00142
일반적으로, 대상체는 약 106 내지 약 1010 플라크 형성 단위(pfu)의 범위 내의
Figure pct00143
의 투여량을 투여받지만, 더 낮거나 높은 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 102 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 103 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 104 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 105 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 106 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 107 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 108 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 109 내지 약 1010 pfu의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여량은 약 107 내지 약 109 pfu이다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가는 사용되는 구체적인 pfu 적정 방법에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 개 바이러스 입자와 동등하고 0.69 pfu는 약 1 TCID50이다.
Figure pct00144
의 치료적 유효량은 처방된 기간 동안 처방된 투여 빈도로 하나 이상의 분할된 용량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 통상의 기술자에게 명확한 바와 같이, 본 발명에 따른 아쥬반트로서
Figure pct00145
의 치료적 유효량은 인자, 예컨대 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 일반 건강, 및 특정 대상체에서 소망하는 면역학적 반응(요법에 대한 대상체의 반응)을 유도하는
Figure pct00146
의 능력에 따라 달라질 수 있다. 대상체에 대한
Figure pct00147
의 전달에서, 투여량은 또한 일반 의학적 병태, 이전의 병력, 질환 유형 및 진행, 종양 부담, 종양에서 종양 침윤성 면역 세포의 존재 또는 부재 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. "본원에 사용된 바와 같은 투여량 단위 형태"는 치료되는 포유동물 대상체에 대한 통합된 투여량으로서 맞추어진 물리적 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약학적 또는 수의학적 허용 담체와 공동으로 소망하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 사전결정된 양을 함유한다.
Figure pct00148
약학 조성물은 통상적으로 이의 의도된 투여 경로와 양립 가능하도록 제형화된다. 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)에서 아쥬반트로서
Figure pct00149
의 투여는 하나 초과의 경로를 사용하여 달성될 수 있다. 투여 경로의 예는, 비제한적으로, 비경구적(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 또는 피하), 종양내, 척추강내, 비강내, 전신, 경피, 이온영동, 피내, 안구내, 또는 국부 투여를 포함한다. 일 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00150
을 포함하는 본 기술의 약학 조성물은 예를 들어, 종양내 주사에 의해 종양 내에 직접 투여되고, 직접 국소 반응이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00151
을 포함하는 본 기술의 약학 조성물은 종양 베드(bed)에 대해 주위에 투여된다. 또한, 투여 경로는 예를 들어, 종양내 주사를 사용한 1 차 투여, 및 정맥내 주사를 통한 후속 투여, 또는 이의 임의의 조합으로 달라질 수 있다. 암 백신 주사에서 아쥬반트로서
Figure pct00152
의 치료적 유효량은 처방된 기간 동안 처방된 투여 빈도로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 기술의 약학 조성물은 다른 치료법, 예컨대 화학요법 또는 방사선과 결합하여 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트로서
Figure pct00153
의 치료적 유효량을 포함하는 본 기술의 약학 조성물은 면역 체크포인트 차단 요법과 결합하여 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00154
을 포함하는 약학 조성물은 매주 또는 매월 적어도 1 회 투여되지만, 필요한 경우, 더욱 자주, 예컨대 수주, 수개월, 수년 동안, 또는 이득이 지속되는 한 오래 무기한으로 매주 2 회 투여된다. 더욱 빈번한 투여는 용인된 경우 및 이들이 지속되거나 증가된 이득을 야기하는 경우 고려된다. 본 발명의 이득은, 비제한적으로, 암 세포의 수의 감소, 종양 크기(예를 들어, 종양 부피)의 감소, 종양의 근절, 말초 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제, 전이 성장의 억제 또는 안정화 또는 근절, 종양 성장의 억제 또는 안정화, 및 삶의 질의 안정화 또는 개선을 포함한다. 또한, 이득은 종양에 대한 면역 반응의 유도, IFN-γ+CD8+ T-세포 증가, IFN-γ+CD4+ T-세포 증가, 이펙터 CD4+ T-세포의 활성화, 이펙터 CD8+ T-세포의 증가, 또는 조절 CD4+ 세포의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종의 맥락에서, 이득은 흑색종의 초기 진단의 1, 2, 3, 4, 5 년 이상 이내의 재발 또는 전이의 결여일 수 있다. 유사한 평가가 결장암 및 다른 고형 종양에 대해 이루어질 수 있다.
B. 방법
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항원 및
Figure pct00155
을 포함하는 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에 투여하여, 면역 반응을 향상시킴으로써 종양을 치료하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 향상시킴으로써 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 및 열-iMVA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 항원에 대해 면역 반응을 유도하기 위해 하나 이상의 항원 및 아쥬반트로서
Figure pct00156
을 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 단계는 다중 용량의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 면역 체크포인트 차단제의 투여와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 대상체에 전달된다.
C. 키트
일부 실시양태에서, 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 용기 수단 및 (a) 항원 및 (b)
Figure pct00157
을 포함하는 아쥬반트 각각의 별도 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아쥬반트는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 및 열-iMVA를 포함한다.
실험 실시예
본 기술은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 임의의 방식의 제한으로서 이해되지 않아야 한다.
일반 물질 및 방법
바이러스 및 세포주. MVA 바이러스는 Gerd Sutter(University of Munich)에 의해 친절하게 제공되었으며, BHK-21(새끼 햄스터 신장 세포, ATCC CCL-10) 세포에서 증식시켰다. MVA는 상업적으로 및/또는 공적으로 이용 가능하다. MVAΔE3L 바이러스는 Gerd Sutter(University of Munich)에 의해 친절하게 제공되었으며, BHK-21 세포에서 증식시켰다. MVAΔE3L 바이러스의 생성 방법이 기재되어 있다(Hornemann et al., 2003). 바이러스를 36% 수크로오스 쿠션(cushion)을 통해 정제하였다. 열-iMVA는 정제된 MVA 바이러스를 55℃에서 1 시간 동안 항온처리함으로써 생성한다. BHK-21을 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA), 및 50 mg/mL 젠타마이신을 함유한 이글스 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium)(Eagle's MEM은 Life Technologies, Cat# 11095-080으로부터 구매할 수 있음)에서 배양하였다. 뮤린 흑색종 세포주 B16-F10을 본래 I. Fidler(MD Anderson Cancer Center)로부터 얻었다. B16-F10 세포를 10% FBS, 100 단위/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 10 mM HEPES 버퍼가 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. 모든 세포를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 성장시켰다. 인간 흑색종 SK-MEL-28 세포를 완전 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 인간 단핵구-유래된 수지상 세포 배양을 위해, 완전 RPMI 1640에 10 mM Hepes, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Media Lab, MSKCC, New York, NY), 50 μM 2-ME(GibcoBRL Life Technologies, Carlsbad, CA), 1% L-글루타민(GibcoBRL), 및 열-불활성화된, 정상 인간 혈청(특정 실험을 위해 구체화된 바와 같은 1% 또는 10%, v/v; Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)을 보충하였다. 살균, 재조합, 내독소-, 발열원-, 마이코플라스마-, 및 담체-없는 인간 사이토카인을 사용하여, 미성숙 및 성숙 혈액 moDC를 생성하였다. 모든 배지 및 시약은 내독소가 없었다. 모든 세포를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 성장시켰다.
마우스. 6 내지 10 주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 Jackson Laboratory로부터 구매하고 생체내 실험을 위해 사용하였다. 이들 마우스를 슬로안 케터링 협회(Sloan Kettering Institute)의 동물 시설에서 유지하였다. 모든 절차를 국립보건원(National Institute of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권고를 엄격히 따라 수행하였다. 프로토콜은 슬로안-케터링 암 협회의 동물 실험 윤리 위원회(Committee on the Ethics of Animal Experiments)에 의해 승인되었다.
재조합 MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L 바이러스의 생성. BHK21 세포를 6-웰 플레이트 내로 계대시켰다. 다음날, 세포를 0.5의 감염 다중도(MOI)에서 MVAΔE3L로 감염시켰다. 1-2 시간 후, 세포를 2 μL 리포펙타민 2000과 함께 0.75 ㎍ pCB-mOX40L-gpt 구축물로 형질주입하였다. 2 일 후, 세포를 수집하고 3 회 냉동/해동하였다. 순수 MVAΔE3L-mOX40L을 선택하기 위해, 재조합 바이러스를 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 gpt 선택 배지에서의 추가 배양을 통해 선택하고, 4-6 라운드의 선택 후 플라크를 정제하였다. PCR 분석을 수행하여, MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L은 TK 유전자의 일부가 결여되고 mOX40L 삽입을 갖는다는 것을 검증하였다.
재조합 바이러스 MVAΔE3L-mOX40L의 PCR 검증. PCR 반응을 사용하여, MVAΔE3L-TK(-)mOX40L 재조합 바이러스의 순도를 검증하였다. PCR 반응을 위해 사용된 프라이머 서열은
Figure pct00158
이다.
mOX40L 및 hFlt3L의 발현의 FACS 분석. 뮤린 B16-F10 흑색종 세포(1 x 106) 또는 SK-MEL-28 세포를 10의 MOI에서 MVAΔE3L, MVAΔE3L-TK(-)-mOX40L, MVAΔC7L, MVAΔC7L-hFlt3L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L로 감염시켰다. 세포를 감염 후 24 시간에 수집하고 FACS 분석 전에 PE-접합된 항-뮤린 OX40L 또는 항-hFlt3L 항체로 염색하였다.
유세포 분석에 의한 종양 침윤성 림프구의 평가를 위한 바이러스를 이용한 종양 이식 및 종양내 주사. 양측 종양 이식 모델을 이 기술에서 사용하였다. B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 우측(5 x 105 세포) 및 좌측(2.5 x 105 세포) 옆구리 상의 면도된 피부에 피내로 이식하였다. 이식 후 7 일 후에, 마우스가 마취 하에 있을 때, 우측 옆구리 상의 대규모 종양(약 3 mm 이상의 직경)에 재조합 바이러스 또는 PBS를 주 당 2 회 주사하였다. 2 차 주사 후 2 또는 3 일에, 종양을 수집하고 칭량하였다. 그 다음에, 이들을 무 혈청 RPMI 배지에서 30 분 동안 37℃에서 Liberase(1.67
Figure pct00159
U/mL) 및 DNase(0.2 mg/mL)와 함께 항온처리하기 전에 갈았다. 70 μm 나일론 필터를 통해 으깸으로써 세포 현탁액을 생성한 다음에, 완전 RPMI 배지로 세척하였다. 세포를 항-CD3, CD45, CD4, 및 CD8 항체를 이용한 표면 표지, 및 또한 세포내 그랜자임 B 염색을 위해 처리하였다. 생세포를 고정 가능한 염료 eFluor506(eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용함으로써 사멸된 세포로부터 구별하였다. 이들을 투과화 키트(eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 추가로 투과화시키고, 그랜자임 B에 대해 염색하였다. 데이터를 LSRII 유세포 분석기(Becton-Dickinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 획득하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(FlowJo, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 분석하였다.
IFN-γ ELISPOT 분석. B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 우측(5 x 105 세포) 및 좌측(2.5 x 105 세포) 옆구리에 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 7 일에, 우측 옆구리 상의 종양에 PBS, 또는 재조합 바이러스를 주사하였다. 주사를 3 일 후 1 회 반복하였다. 2 차 주사 후 2 또는 3 일에, 비장을 상이한 바이러스로 처치된 마우스로부터 수집하고, 70 μm 스트레이너(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 통해 으깨었다. 적혈구를 ACK 용해 버퍼(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 용해시키고 세포를 완전 RPMI 배지에서 재-현탁하였다. CD8+ T 세포를 Miltenyi Biotechnology로부터의 CD8α(Ly-2) 마이크로비드를 사용하여 정제하였다. 효소-연관 면역검사법(ELISPOT) 분석을 수행하여, 제조사의 프로토콜(Becton-Dickinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에 따라 종양 특이적 IFN-γ+ CD8+ T 세포 활성을 측정하였다. CD8+ T 세포를 조사된 B16 세포와 1:1 비(250,000 세포 각각)로 RPMI 배지에서 혼합하고, ELISPOT 플레이트를 염색 전에 37℃에서 16 시간 동안 항온처리하였다.
재조합 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 바이러스의 생성. 2-단계 재조합을 사용하여, 이 바이러스를 생성하였다. 제1 단계는 MVAΔC7L-hFlt3L을 생성하는 것이다. pUC57 벡터를 구축하여, 발현 카세트를 MVA의 C7L 유전자좌 내로 삽입하였으며, 이는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L) 하의 hFlt3L 유전자 및 선택 마커로서 사용된 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하의 GFP를 포함한다. 이 발현 카세트를 C7L 유전자의 좌측 및 우측 상의 C8L 및 C6R의 부분 서열의 측면에 위치시켰다. BHK21 세포를 1 시간 동안 0.5의 감염 다중도(MOI)에서 MVA로 감염시킨 다음에, 상기 기재된 플라스미드 DNA로 형질주입하였다. 감염된 세포를 48 시간에 수집하였다. 재조합 바이러스를 GFP+ foci의 연속 선택에 의해 선택하였다. PCR 분석을 수행하여, MVAΔC7L-hFlt3L은 C7L 유전자가 결여되고 hFlt3L 삽입을 갖는다는 것을 검증하였다. 제2 단계는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 생성하는 것이다. 백시니아 PsE/L의 제어 하의 코돈 최적화된 mOX40L 유전자뿐 아니라, 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 측면에 있는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하의 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 함유하는 pCB 플라스미드를 구축하였다. BHK21 세포를 1 시간 동안 0.5의 감염 다중도(MOI)에서 MVAΔC7L-hFlt3L로 감염시킨 다음에, 상기 기재된 플라스미드 DNA로 형질주입하였다. 감염된 세포를 48 시간에 수집하였다. 재조합 바이러스를 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 gpt 선택 배지에서의 추가 배양을 통해 선택하고, 플라크 정제하였다. PCR 분석을 수행하여, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 C7L 유전자 및 TK 유전자의 일부가 결여되지만, hFlt3L 및 mOX40L 삽입 둘 다를 갖는다는 것을 검증하였다. 또한, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)를 양측에 TK 유전자가 측면에 있는 백시니아 P7.5 프로모터의 제어 하의 gpt 유전자를 함유하는 pCB 플라스미드로 구축하였다. PCR 분석을 수행하여, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)는 C7L 유전자 및 TK 유전자의 일부가 결여되지만, hFlt3L 삽입을 갖는다는 것을 검증하였다.
면역 체크포인트 차단제의 존재 또는 부재 하의 재조합 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 이용한 양측 종양 이식 모델 및 종양내 주사. 간단하게는, B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 105 및 좌측 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 후 9 일에, 우측 옆구리 상의 대규모 종양에 2 x 107 pfu의 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 종양내로 주사하였다. 또한, 마우스를 항-CTLA-4(주사 당 마우스 당 100 ㎍), 또는 항-PD-L1(주사 당 마우스 당 250 ㎍)을 포함한 면역 체크포인트 차단제 항체의 복강내 전달로 매주 2 회 처치하였다. 종양 크기를 측정하고 종양을 1 주 2 회 반복적으로 주사하였다. 마우스의 생존을 모니터링하였다. 종양 부피를 다음 식 l(길이) x w(폭) x h(높이)/2에 따라 계산하였다. 마우스를 고통의 징후 동안 또는 종양의 직경이 10 mm에 도달하였을 때 안락사시켰다.
대규모 수립된 종양의 치료를 위한 면역 체크포인트 차단제의 존재 또는 부재 하의 바이러스 재조합 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 이용한 편측 피내 종양 이식 및 종양내 주사. B16-F10 흑색종(5x 105 세포)을 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리 상의 면도된 피부에 피내로 이식하였다. 이식 후 9 일 후에, 종양이 직경이 5 mm일 때, 마우스가 마취 하에 있을 때, 이들에 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(5 x 107 pfu) 또는 PBS를 주사할 것이다. 바이러스를 매주 2 회 주사하였다. 또한, 마우스를 항-CTLA-4(주사 당 마우스 당 100 ㎍), 항-PD-1(주사 당 마우스 당 250 ㎍), 또는 항-PD-L1(주사 당 마우스 당 250 ㎍)을 포함한 면역 체크포인트 차단제 항체의 복강내 전달로 매주 2 회 처치하였다. 종양 부피를 다음 식 l(길이) x w(폭) x h(높이)/2에 따라 계산하였다. 마우스의 생존을 모니터링하였다. 마우스를 고통의 징후 동안 또는 종양의 직경이 10 mm에 도달하였을 때 안락사시켰다.
원발성 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 제조. SPF 달걀(Charles River, Cat# 10100326)로부터의 9-11 일차의 닭 배아를 사용하였다. 배아를 10-cc 시린지를 통해 살균 50 mL-EP 튜브 내로 스퀴징함으로써 갈았다. 2.5% 트립신/EDTA로 37℃에서 5 분 동안 분해 후, 세포 현탁액을 70 μM 나일론 스트레이너를 통해 여과하였다. 세포 현탁액을 펠릿화하고, 완전 MEM 배지에서 재현탁한 다음에, 세포 층이 융합성이 될 때까지 T-75 플라스크에서 배양하였다.
원발성 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서의 다단계 성장. 5 x 105 CEF 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 세포를 1시간 동안 0.05의 MOI에서 MVA, MVAΔC7L-hFlt3L, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시켰다. 접종물을 제거하고 세포를 PBS로 1 회 세척하고 신선한 배지로 항온처리하였다. 세포를 감염 후 1, 24, 48, 및 72 시간에 수집하였다. 3 회 사이클의 냉동 및 해동 후, 샘플을 초음파처리하고 바이러스 역가를 BHK21 세포의 연속 희석 및 감염에 의해 확인하였다. 공초점 현미경을 사용하여, 계수를 위해 GFP+ foci를 시각화하였다.
인간 단핵구-유래된 수지상 세포의 생성. 인간 표본의 모든 수집 및 사용은 MSKCC의 메모리얼 병원의 생명 윤리 및 사생활 보호 위원회(Institutional Review and Privacy Board)에 의해 검토되고 승인된 프로토콜을 준수하였다. 버피 코트를 뉴욕 혈액원의 건강한 공여자로부터 얻었으며 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 상의 표준 원심분리에 의해 분리하였다. 조직 배양 플라스틱 부착 PBMC는 moDC 전구체를 포함하였으며, 이를 GM-CSF(1000 IU/mL) 및 IL-4(500 IU/mL)가 보충된 완전 RPMI 1640-1% 인간 혈청에서 배양하였다. 신선한 배지 및 사이토카인을 48 시간마다 보충하였다. 미성숙(6 일차) moDC를 1의 MOI에서 열-iMVA, MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-), 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시키거나, 10 ㎍/mL의 폴리 I:C로 처치하였다. 세포를 처치 후 24 시간에 수집하고 FACS 분석 전에 PE-접합된 항-hOX40L 항체로 염색하였다.
이중 루시퍼라아제 리포터 분석. 루시퍼라아제 활성을 제조사의 설명서에 따른 이중 루시퍼라아제 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하여 측정하였다. 간단하게는, 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 구축물, 레닐라 루시퍼라아제 리포터 구축물뿐 아니라, 다른 발현 구축물을 포함하는 발현 플라스미드를 HEK293T 세포 내로 형질주입하였다. 뮤린 cGAS(50 ng) 및 hSTING(10 ng)을 억제제를 확인할 목적으로 준최적 투여량으로 사용하였다. 바이러스 유전자를 함유하는 형질주입된 플라스미드를 200 ng으로 사용하였다. IFNB-반딧불이 루시퍼라아제 리포터 및 대조군 플라스미드 pRL-TK를 각각 50 ng 및 10 ng으로 사용하였다. 형질주입 후 24 시간에, 세포를 수집하고 용해시켰다. 20 μL 세포 용해물을 50 μL의 LARII와 항온처리하여, 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 측정한 다음에, 50 μL의 Stop & Glo 시약과 항온처리하여, 레닐라 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상대적 루시퍼라아제 활성을 IFNB 또는 ISRE 프로모터 하의 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 대조군 플라스미드 pRL-TK로부터의 레닐라 루시퍼라아제 활성에 대해 정규화함으로써 임의의 단위로서 표현하였다. 특정 시험 조건 하의 상대적 루시퍼라아제 활성을 배경 조건 하의 상대적 루시퍼라아제 활성으로 나눔으로써 배수-유도를 계산하였다.
백시니아 E5, K7, B14, B18을 발현하는 레트로바이러스의 생성. HEK293T 세포를 6-웰 플레이트 내로 계대시켰다. 다음날, 세포를 10 μL 리포펙타민 2000과 함께 VSVG(1 ㎍); gag/pol(2㎍); 및 PQCXIP-E5, K7, B14, B18(2㎍)의 3 개의 플라스미드로 형질주입하였다. 2 일 후, 세포 상청액을 수집하고 0.45 μm 필터를 통해 여과하고 -80℃에서 저장하였다.
백시니아 FLAG-태그된 E5, K7, B14, 또는 B18을 안정적으로 발현하는 RAW264.7 세포주의 생성. RAW264.7 세포를 6-웰 플레이트 내로 계대시켰다. 다음날, 세포를 MOI 5에서 E5, K7, B14, 또는 B18을 발현하는 레트로바이러스로 감염시켰다. 2 일 후, 배양 배지를 5 ㎍/mL 푸로마이신을 함유한 신선한 DMEM 배지로 교체하였다. 1 주 후, 생존 세포는 FLAG-태그된 E5, K7, B14, 또는 B18을 안정적으로 발현하는 세포이다. FLAG-태그된 E5, K7, B14, 또는 B18의 발현을 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검증하였다.
RNA 단리 및 정량적 실시간 PCR. RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen)로 전세포 용해물로부터 추출하고 First Strand cDNA 합성 키트(Fermentas)로 역전사하였다. 정량적 실시간 PCR을 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 SYBR 그린 PCR 메이터(Mater) 믹스(Life Technologies) 및 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 기구(Life Technologies)로 삼중으로 수행하였다. 상대적 발현을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)의 수준에 대해 정규화하였다.
시약. 시약에 대한 상업적 공급원은 다음과 같다: 항-hFlt3L 항체를 Thermo Fisher로부터 구매하고 항-hFlt3L에 대한 2 차 항체(PE-접합된 염소 항-마우스)를 BD Biosciences로부터 구매하였다. PE-접합된 mOX40L 및 PE-접합된 항-hOX40L 항체를 각각 Biosciences and R & D로부터 구매하였다. 항-CD3, -CD45, -CD8, 및 -그랜자임 B 항체를 eBioscience(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로부터 구매하였다. CD8α 마이크로비드를 Miltenyi Biotechnology(Somerville, MA)로부터 구매하였다. ELISPOT 분석 키트를 Becton-Dickinson Biosciences(Franklin Lakes, NJ)로부터 구매하였다. 치료 항-CTLA4(클론 9H10 및 9D9), 항-PD1(클론 RMP1-14), 항-PD-L1(클론 10F.9G2)을 BioXcell로부터 구매하고; 유세포 분석을 위해 사용된 항체를 eBioscience(CD45.2 Alexa Fluor 700, CD3 PE-Cy7, CD4 APC-efluor780, CD8 PerCP-efluor710), Invitrogen(CD4 QDot 605, 그랜자임 B PE-Texas Red, 그랜자임 B APC)로부터 구매하였다.
통계. 양측 비쌍 스튜던트 t 검정(Two-tailed unpaired Student's t test)을 연구에서 2 개 그룹의 비교를 위해 사용하였다. 생존 데이터를 로그-순위(만텔-콕스) 검정에 의해 분석하였다. 중요한 것으로 간주되는 p 값은 도면에서 다음과 같이 나타낸다: *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
B2M, MDA5, STING 녹-아웃 세포주의 생성. B16-F10 세포를 리포펙타민 3000 시약(Thermo Scientific)을 사용하여 800 ng의 Cas9 발현 플라스미드(Addgene을 통해 Church lab으로부터 얻어짐) 및 800 ng의 각각의 gRNA 발현 플라스미드로 형질주입하였다. 세포를 형질주입 후 적어도 2 일 동안 성장시켰다. 그 다음에, CRISPR 구축물의 성공을 시험하였다. STING 및 MDA5 CRISPR의 경우에, 표적화된 엑손을 특정 프라이머를 갖는 게놈으로부터 PCR-증폭시킨 다음에, 2 단위의 T7 엔도뉴클레아제(new England biolabs로부터 얻어짐)로 90 분 동안 분해시켰다. 분해 후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하여, 성공적인 CRISPR을 나타내는, T7이 PCR 앰플리콘을 절단하였는지 여부를 확인하였다. gRNA 효능의 확인 후, 개별 세포를 96-웰 플레이트 상에 접종하고 클론 단리물 내로 확장시켰다. 확장 후, 클론 단리물을 다른 라운드의 PCR 증폭 및 T7 분해를 사용하여 스크리닝하였다. 후속 웨스턴 블롯 분석은 표적화된 단백질(STING 또는 MDA5)의 손실을 확인하였다. 베타 2 마이크로글로불린(B2M) CRISPR의 경우에, FACS 분석을 사용하여, 96 웰 플레이트 상에 B2M 결여 세포를 분류하고 클론 단리물 내로 확장시키기 전에 성공적인 CRISPR을 검증하였다.
유방외 파제트병(EMPD)을 앓는 환자로부터의 인간 종양 조직. 인간 종양 조직을 Memorial Sloan Kettering 암 센터의 IRB-승인된 임상 프로토콜 06-107에 등록된 유방외 파제트병(EMPD)을 앓는 환자로부터 얻었다. 3-4 mm 펀치 생검을 병원에서 임상의에 의해 수행하였다. 종양 조직을 얼음 상의 RPMI 배지에서 실험실로 수송하였다. 이들이 실험실에 도착하면, 이들을 메스로 작은 조각으로 절단하고 10의 MOI에서 MVAΔE5R-hFlt3L-hOX40L로 감염시켰다. 감염 후 48 시간에, 조직을 콜라게나아제 D로 37℃에서 45 분 동안 분해하였다. 그 다음에, 이들을 여과하고 CD3, CD4, 및 CD8에 대한 표면 항체로 염색하였다. 그 후에, 이들을 투과화시키고 그랜자임 B 및 Foxp3에 대한 항체로 염색하였다.
실시예 1: 마우스 OX40L를 발현하며 TK-결실을 갖는 재조합 MVA△E3L의 생성.
본 실시예는 뮤린 OX40L(mOX40L)를 발현하며 TK-결실을 갖는 재조합 백시니아 MVA△E3L 바이러스의 생성에 대해 설명한다. 도 1은 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 mOX40L을 발현하도록 설계된 발현 카세트의 개략도이다. 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 있는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)뿐만 아니라 백시니아 PsE/L 제어 하의 코돈 최적화된 mOX40L 유전자를 포함하는 플라스미드가 pCB 플라스미드 DNA와 바이러스 게놈 DNA 사이의 TK 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 표준 재조합 바이러스 기술을 사용하여 구축되었다 (도 1). BHK21 세포는 MVA△E3L로 0.5의 감염다중도(MOI)에서 1시간 동안 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입되었다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함하는 gpt 선택 배지에서 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크를 정제하였다. MVA△E3L-TK(-)-mOX40L에 TK 유전자의 일부가 결여되고 mOX40L이 삽입되었는지 검증하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다 (도 2a). MVA△E3L-TK(-)-mOX40L 바이러스로 감염된 B16-F10 세포 상에서 mOX40L의 발현은 항-mOX40L 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 측정되었다 (도 2b). 간단하게, B16-F10 세포는 10의 MOI에서 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L로 감염되었다. 감염 후 24시간에 세포를 PE-접합된 항-mOX40L 항체로 염색하였다. 감염된 세포 표면 상에서 mOX40L의 발현은 FACS 분석에 의해 평가되었다. 도 2b는 감염된 세포의 대부분이 mOX40L을 발현함을 보여준다.
실시예 2: MVA△E3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 MVA△E3L와 비교하여 먼 종양에서 더 활성화 된 종양 침윤 이펙터 T 세포를 초래한다.
B16-F10 흑색종에서 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVAE3L의 종양내 주사가 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화 및 증식을 유도하는지 평가하기 위하여, 양측 종양 이식 모델을 사용하였다. B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 7일 후, 마우스가 마취 상태 일 때 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양(직경 약 3 mm 이상)에 PBS, MVA△E3L, MVA△E3L-TK(-)-mOX40L을 주 2회 주사하였다. 2차 주사 3일 후, 종양을 채취하고 세포에 항-CD3, CD45, CD4 및 CD8 항체를 사용한 표면 표지 및 세포 내 그랜자임 B 염색을 위한 처리를 하였다. 비주사된 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. PBS-처치 마우스의 종양에서 18% 및 MVA△E3L-처치 마우스의 종양에서 17%부터 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L-처치 마우스의 종양에서 53%까지, 비주사된 종양에서 그랜자임 B를 발현하는 CD8+ T 세포가 급격하게 증가하였다 (도 3a-d). 또한 종양내 바이러스 처치 후, PBS-처치 마우스 종양에서 0.6%부터 MVA△E3L-처치 마우스의 종양에서 4.3%, MVA△E3L-TK(-)-mOX40L-처치 마우스의 종양에서 24%까지, 비주사 종양에서 그랜자임 B를 발현하는 CD4+ T 세포가 크게 증가하였다 (도 3e-h). 이러한 결과는 재조합 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사가 비주사된 종양내에서 세포독성 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포를 유도하는 데 있어 모 바이러스인 MVA△E3L보다 더 강력하다는 것을 나타낸다.
실시예 3: MVA△E3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 전신 항종양 CD8 + T 세포 면역을 생성한다.
MVA△E3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△E3L의 종양내 주사 처치 이후에 마우스가 뮤린 B16-F10 흑색종에 대한 전신 항종양 T 세포 면역을 획득했는지 평가하기 위하여, 효소-연관 면역검사법(Enzyme-linked ImmunoSpot)(ELISpot)이 사용되었다. B16-F10 세포(각각 5 x 105 및 2.5 x 105)를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 종양 이식 7일 후, 오른쪽 옆구리의 종양(직경 약 3 mm)에 PBS, MVA△E3L 또는 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L을 주사하였다. 주사는 3일 후에 반복되었고, 2차 주사 3일 후에 안락사 되었다. 재조합 바이러스로 처치된 마우스의 비장에서 항종양 특이적 CD8+ T 세포의 생성을 평가하기 위하여 ELISpot을 수행하였다. 간단하게, CD8+ T 세포를 비장세포로부터 단리시키고, 3 x 105의 세포를 1.5 x 105의 조사된 B16-F10 세포와 함께 항-IFN-γ-코팅된 BD ELISpot 플레이트 마이크로 웰에서 밤새 37°C에서 배양하였다. CD8+ T 세포는 γ-조사기로 조사된 B16-F10로 자극되었고, IFN-γ 분비는 항- IFN-γ 항체로 검출되었다. 도 4a는 각각 PBS, MVA△E3L 또는 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L로 처치된 개별 마우스로부터의 300,000개의 CD8+ T 세포 당 IFN-γ+ 스폿의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 4b는 각각 PBS, MVA△E3L 또는 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L로 처치된 각 그룹의 개별 마우스로부터의 300,000개의 CD8+ T 세포당 IFN-γ+ 스폿의 수를 보여준다. 이러한 결과는 뮤린 B16-F10 흑색종 양측 이식 모델에서 MVA△E3L-T(-)-mOX40L의 종양내 주사가 처치된 마우스에서 항종양 CD8+ T 세포를 생성하는데 있어 MVA△E3L보다 더 효과적임을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 MVA△E3L-TK(-)-mOX40L이 대상체에서 및 대상체 내에서 증가된 세포독성 CD8+ T 세포에서 면역 반응을 향상시키거나 촉진시키는데 효과적임을 보여준다.
실시예 4: 뮤린 OX40L을 발현하며 TK-결실을 갖는 재조합 MVA△C7L의 생성.
본 실시예는 뮤린 OX40L(mOX40L)을 발현하며 TK-결실을 포함하는 재조합 백시니아 MVA△C7L 바이러스의 생성을 설명한다. 도 5a는 MVA△C7L-hFlt3L을 생성하는 첫 번째 단계를 보여준다. pUC57 벡터는 특정 관심 유전자(SG)를 MVA의 C7L 유전자좌에 삽입하도록 구축되었으며, 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하는 hFlt3L 및 선택 마커로 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP를 발현하도록 설계된 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 C7L 유전자 좌측 및 우측의 C8L 및 C6R의 부분 서열이 측면에 위치하였다 (도 5a). BHK21 세포를 0.5의 감염다중도(MOI)에서 1시간 동안 MVA로 감염시킨 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 GFP+ foci의 연속 선택에 의해 선택되었다. MVA△C7L-hFlt3L에 C7L 유전자가 결여되고 hFlt3L이 삽입되었는지 검증하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다 (데이터는 표시되지 않음). 도 5b는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 생성하는 두 번째 단계를 보여준다. 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 있는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)뿐만 아니라 백시니아 PsE/L 제어 하의 코돈 최적화된 mOX40L 유전자를 포함하는 플라스미드가 구축되었다. BHK21 세포를 0.5의 감염다중도 (MOI)에서 MVA△C7L-hFlt3L로 1시간 동안 감염시킨 다음 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함하는 gpt 선택 배지에서의 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크 정제하였다. PCR 분석을 수행하여 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L에 C7L 유전자와 TK 유전자의 일부가 결여되지만 hFlt3L 및 mOX40L 삽입이 모두 이루어졌음을 검증하였다. 대조적으로, 모 MVA 게놈은 예상대로 C7L 및 TK 유전자를 포함한다(도 5c). MVA△C7L-TK(-)-mOX40L 바이러스에 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포 상에서 mOX40L의 발현은 항-hFlt3L 항체(도 6) 및 항-mOX40L 항체(도 7)를 사용한 FACS 분석에 의해 측정되었다. 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포의 대부분은 높은 mOX40L 발현 수준을 가졌다 (도 7).
실시예 5: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 활성화된 CD8 + 및 CD4 + T 세포를 비주사된 원거리 종양으로 동원시킨다.
IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 전신 항종양 면역을 생성하는지 여부를 평가하기 위하여 양측 B16-F10 종양 이식 모델이 사용되었다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 (5 x 105 세포) 및 왼쪽 (2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 7일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 PBS, MVA△C7L, MVA△C7L-hFlt3L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 2 x 107 pfu의 MOI로, 또는 동일한 양의 열-불활성화된 MVA△C7L-hFlt3L (열-iMVA△C7L-hFlt3L)를 주 2회 주사하였다. 2차 주사 2일 후, 종양을 채취하고 세포에 항-CD3, CD45, CD4 및 CD8 항체를 사용한 표면 표지 및 세포 내 그랜자임 B 염색을 위한 처리를 하였다. 비주사된 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 다른 처치 그룹과 비교하여 비주사된 종양에서 종양 1그램당 총 그랜자임 B+ CD8+ T 세포뿐만 아니라 종양 1 그램당 총 CD8+ T 세포 수가 가장 많은 결과를 나타냈다 (도 8a-8c). 놀랍게도, IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 다른 처치 그룹과 비교하여 비주사된 종양에서 종양 1그램당 총 그랜자임 B+ CD4+ T 세포뿐만 아니라 종양 1그램당 총 CD4+ T 세포의 수가 가장 많은 결과를 나타냈다 (도 9a-9c). 이러한 결과는 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 비주사된 종양내에서 세포독성 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 유도하는데 있어 모 바이러스 MVA△C7L 또는 MVA△C7L-hFlt3L보다 더 효과적임을 보여준다. 또한, 이러한 조작된 재조합 MVA는 항종양 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 유도하는데 있어 불활성화된 MVA△C7L-hFlt3L보다 더 강력하다.
실시예 6: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 주사는 MVA△C7L와 비교하여 가장 강력한 전신 항종양 CD8 + T 세포 면역을 유도한다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 처치된 마우스의 비장에서 항종양 특이적 CD8+ T 세포의 생성을 평가하기 위하여 ELISpot을 수행하였다. 간단하게, CD8+ T 세포를 비장세포에서 단리시키고 3 x 105 세포를 1.5 x 105 의 조사된 B16-F10 세포와 함께 항-IFN-γ 코팅된 BD ELISpot 플레이트 마이크로 웰에서 37°C에서 밤새 배양하였다. CD8+ T 세포를 γ-조사기로 조사한 B16-F10 세포로 자극하고 항-IFN-γ 항체를 통해 IFN-γ 분비를 검출하였다. 도 10a는 각각 PBS, MVA△C7L, MVA△C7L-hFlt3L, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L, 또는 열-iMVA△C7L로 처치된 개별 마우스로부터의 CD8+ T 세포 300,000개당 IFN-γ+ 스폿의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 10b는 각각 PBS, MVA△C7L, MVA△C7L-hFlt3L, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 열-iMVA△C7L로 처치된 각 그룹의 개별 마우스로로부터의 CD8+ T 세포 300,000개당 IFN-γ+ 스폿의 수를 보여준다. 이러한 결과는 뮤린 B16-F10 흑색종 양측 이식 모델에서 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 주사가 처치된 마우스에서 항종양 CD8+ T 세포를 생성하는데 있어 MVA△C7L보다 더 효과적임을 보여준다.
실시예 7: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 의 IT 주사는 주사 및 비주사된 종양 모두에서 종양 성장을 근절 또는 지연시키고 마우스의 생존을 연장하는데 효과적이다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달이 항종양 효과를 생성하는지 여부를 시험하기 위하여, 양측 뮤린 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하였다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다 (오른쪽 옆구리에 5 x 105, 왼쪽 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 9일 후, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(2 x 107 PFU) 을 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 주 2회, 항-CTLA-4 항체(9D9 클론, 마우스당 100 μg) 또는 항-PD-L1(마우스당 250 μg) 또는 이소타입 대조군과 함께 복강내(IP) 주사를 병행하여, 전달하였다. 종양 크기를 일주일에 두 번 측정하고 마우스 생존을 모니터링하였다(도 11a). 개별 마우스의 주사 및 비주사된 종양의 부피는 도 11b 및 도 11c에 도시되어 있다. 0일, 7일 및 11일의 주사 및 비주사된 종양의 부피가 도 11d및 도 11e에 도시되어 있다. PBS로 처치된 마우스에서, 종양이 빠르게 성장하여 7일의 생존 중간값으로 조기 사망을 초래하였다(도 11f 및 11g). MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시키고, 생존기간을 향상시켰으며, 생존 중간값이 14일로 연장되었다(도 11f 및 11g). B16-F10 흑색종은 매우 공격적인 종양이다. 본 발명자들은 처치를 시작하기 전에 종양 이식 후 9일 동안 의도적으로 기다렸다.
실시예 8: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 주사와 면역 체크포인트 차단제 전신 전달의 조합은 상승적인 항종양 반응을 생성한다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1의 전신 전달과의 조합은 IT 바이러스 단독과 비교하여 우수한 항종양 효능을 나타냈다. 주사 및 비주사된 종양 모두에서 평균 종양 부피는 IT 바이러스 단독 또는 PBS 모의 처치와 비교했을 때 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 그룹에서 더 작았고, IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항 CTLA-4 그룹이 그 뒤를 이었다 (도 11b-11e). 마우스의 생존 중간값은 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-CTLA-4 그룹에서 21일, IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + 항-PD-L1 에서 26.5 일로 연장되었다 (도 11f 및 11g). 이러한 결과는 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L에 의해 유도되는 항종양 효과가 양측 뮤린 마우스 종양 모델에서 면역 체크포인트 차단제의 존재 하에 향상될 수 있음을 나타낸다. 이러한 B16-F10 종양 모델에서, 면역 체크포인트 차단제 항체 단독으로는 효과적이지 않으며, 이는 본 발명자의 실험실을 포함한 많은 실험실에서 입증된 바와 같다.
실시예 9: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 주사와 면역 체크포인트 차단제의 전신 전달의 조합은 대규모로 자리 잡은 B16-F10 흑색종을 축소 및 근절하는데 IT 바이러스 단독과 비교하여 더 효과적이다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1의 전신 전달의 조합이 IT 바이러스 단독과 비교하여 대규모로 자리잡은 B16-F10 흑색종에 대해 우수한 항종양 효능이 있는지 평가하기 위하여, 5 x 105 세포가 C57B/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식되었다. 종양 이식 9일 후, 종양의 직경이 5 mm일 때 IT PBS, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + IP 항-CTLA-4, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + IP 항-PD-1 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L + IP 항-PD-L1을 주 2회 처치하였다. 종양 부피를 측정하고 마우스 생존을 모니터링하였다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독으로 일부 항종양 효과가 있지만, IT 바이러스와 항-PD-1의 조합이 최고의 상승작용 효과를 보였고, IT 바이러스 + 항-PD-L1 및 IT 바이러스 + 항-CTLA-4의 조합이 뒤를 이었다.
실시예 10: 인간 OX40L을 발현하며 TK-결실을 갖는 재조합 MVA△C7L-hFlt3의 생성.
본 실시예는 인간 OX40L(hOX40L)을 발현하며 TK-결실을 포함하는 재조합 백시니아 MVA△C7L-hFlt3L 바이러스의 생성을 설명한다. 도 13a는 실시예 4에 기재된 바와 같이, MVA△C7L-hFlt3L을 생성하는 첫 번째 단계를 보여준다. 도 13b는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L를 생성하는 두 번째 단계를 보여준다. 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 있는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 mCherry뿐만 아니라 백시니아 PsE/L 제어 하의 인간 OX40L 유전자를 포함하는 플라스미드를 구축하였다. BHK21 세포는 MVAC7L-hFlt3L로 0.5의 감염다중도(MOI)에서 1시간 동안 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입 되었다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. mCherry foci를 검출하여 재조합 바이러스를 선별하고 플라크를 정제하였다. MVA△C7L-hFlt3L-T(-)-hOX40L에서 C7L 유전자와 TK 유전자의 일부가 결여되고 hFlt3L 및 hOX40L이 모두 삽입되었는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다(데이터는 표시되지 않음). 삽입물은 서열의 정확도를 확인하기 위하여 시퀀싱되었다.
실시예 11: 재조합 바이러스 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L은 닭 배아 섬유아세포에서 효율적으로 복제된다.
MVA는 일반적으로 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 제조된다. 재조합 MVA 바이러스, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L이 CEF에서 복제되는지 여부를 시험하기 위하여 다단계 복제 분석을 수행하였다. 5 x 105 CEF 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 세포를 MVA, MVA△C7L-hFlt3L, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 0.05의 MOI 에서 1시간 동안 감염시켰다. 접종물을 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 신선한 배지에서 항온처리하였다. 세포는 감염 후 1, 24, 48 및 72시간에 수집되었다. 바이러스 역가는 BHK21 세포에서 결정되었다. 도 14a는 CEF에서 감염 후 시간에 따른 MVA, MVA△C7L-hFlt3L, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L의 바이러스 역가를 보여준다. 모든 바이러스는 CEF에서 효율적으로 복제되며, 역가가 1,000배에서 10,000배 이상 증가하였다(도 14b). 재조합 MVA 바이러스는 모 MVA와 비교하여 바이러스 역가가 약간 감소한다(도 14a 및 14b).
실시예 12: 재조합 바이러스 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L은 감염된 세포의 표면상에 hOX40L 단백질을 발현한다.
감염된 세포 표면 상에서의 hOX40L의 발현을 확인하기 위하여 FACS 분석을 사용하였다. 간단하게, BHK21 세포는 10의 MOI에서 MVA△C7L-hFlt3L 또는 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L로 감염되었다. 감염 후 24시간에 세포를 PE-접합 항-hOX40L 항체로 염색하였다. 감염된 세포 표면 상에서의 hOX40L의 발현은 FACS 분석에 의해 평가되었다. 도 15a는 감염된 BHK21 세포에서 GFP 및 hOX40L의 발현 수준을 보여준다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L이 인간 단핵구-유래된 DC(mo-DCs)를 감염시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 부착성 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 인간 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 5일 동안 배양하였다. 6일 차에 세포를 10 ㎍/mL의 폴리 I:C로 처치하거나, 1의 MOI에서 열-iMVA, MVA△C7L-TK(-) 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L로 감염시켰다. 감염 후 24시간에, 세포를 수집하고 FACS 분석 전에 PE-접합된 항-hOX40L 항체로 염색하였다. 뮤린 B16-F10 세포와 비교하여 인간 mo-DC는 기준선에서 hOX40L을 발현한다. 폴리 I:C 처치는 세포 표면에서의 hOX40L 발현을 약간 증가시킨다. 열-iMVA 감염은 hOX40L의 발현을 감소시킨다. mo-DC의 MVA△C7L-hFlt3L 및 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L 감염은 각각 약 50% 및 75%의 GFP+ 세포라는 결과를 초래하였다. 오직 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L 감염만이 감염된 mo-DC에서 hOX40L의 발현을 증가시켰다(도 15b). 이러한 결과는 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L이 인간 mo-DC를 효과적으로 감염시키고 감염된 세포의 표면 상에 hOX40L을 발현시킬 수 있음을 나타낸다. 이는 항원 특이적 및 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 생존 및 증식의 촉진뿐만 아니라, OX40L-OX40 상호작용을 통해 T 세포와 상호작용하는데 잠재적으로 중요할 수 있다.
실시예 13: 재조합 바이러스 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-hOX40L은 감염된 세포에서 hOX40L mRNA를 높은 수준으로 발현한다.
감염된 BHK21 및 B16-F10 흑색종 세포에서 hOX40L mRNA 발현 수준을 평가하기 위하여 정량적 RT-PCR 분석을 사용하였다. 간단하게, BHK21 및 B16-F10 흑색종 세포는 MVA 또는 MVA△C7L-hFlt3L 또는 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L로 8시간 또는 16시간 동안 감염되었다. RNA를 세포에서 추출하고 정량적 RT-PCR 분석을 수행하여 hOX40L mRNA의 발현을 평가하였다. 백시니아 E3L mRNA 수준 또한 평가하였다. BHK21 및 B16-F10 흑색종 세포의 감염은 감염 후 8시간 및 16시간에 E3L 및 hOX40L 모두의 발현을 초래한다. 16시간에서 E3L 및 hOX40L의 mRNA 수준은 모두 감염 후 8시간의 수준보다 높았다 (도 16a 및 16b). 전반적으로, hOX40L의 발현은 B16-F10 세포와 비교하여 MVA△C7L-TK(-)-hOX40L에 감염된 BHK21 세포에서 더 높았으며, 이는 BHK21 (허용) 및 B16-F10 (비허용)에서의 해당 바이러스의 복제 효율과 일치한다.
실시예 14: 백시니아 바이러스 초기 유전자의 발현 벡터로의 클로닝.
백시니아 바이러스 초기 유전자를 cGAS/STING 세포질 DNA-감지 경로를 억제하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 이를 위하여, 72개의 백시니아 바이러스 초기 유전자를 선택하고 이들의 오픈 리딩 프레임을 PCR-증폭하였으며 게이트웨이 클로닝 기술을 사용하여 발현 벡터 (pcDNA3.2-DEST)로 클로닝하였다 (도 17).
실시예 15: cGAS/STING 경로의 바이러스 억제제를 확인하기 위한 스크리닝 전략.
SV40 대형 T 항원으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주인 HEK293T-세포에서 cGAS/STING 경로의 잠재적 백시니아 바이러스 억제제를 스크리닝하기 위하여 이중 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하였다 (도 18). HEK293T- 세포를 IFNB-반딧불이 루시퍼라아제 리포터를 발현하는 플라스미드, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK, 뮤린 cGAS, 인간 STING, 및 표시된 바와 같은 개별 백시니아 바이러스 초기 유전자로 형질주입시켰다. 뮤린 cGAS (50 ng) 및 hSTING (10 ng)은 억제제를 식별할 목적으로 준최적 투여량으로 사용되었다. 바이러스 유전자를 포함하는 형질주입된 플라스미드는 200 ng 사용되었다. IFNB-반딧불이 루시퍼라아제 리포터 및 대조군 플라스미드 pRL-TK는 각각 50 ng 및 10 ng으로 사용하였다. 이중 루시퍼라아제 분석은 형질주입 후 24시간에 수행되었다. 상대적인 루시퍼라아제 활성은 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 레닐라 루시퍼라아제 활성으로 정규화함으로써 임의의 단위로 표현되었다. 아데노바이러스 E1A는 STING과의 상호 작용을 통해 이 경로를 억제하는 것으로 나타났으며 (Lau et al., Science (2015)) 이러한 스크리닝 분석을 위한 양성 대조군으로 사용되었다.
실시예 16: cGAS/STING 경로를 억제할 잠재성이 있는 8개의 백시니아 바이러스 초기 유전자의 확인.
cGAS/STING 경로의 백시니아 바이러스 억제제를 스크리닝하기 위하여 전술한 이중-루시퍼라아제 분석 시스템을 사용 하였다. 총 8개의 백시니아 바이러스 초기 유전자 (B18R (WR200), E5R, K7R, B14R, C11R, M1L, N2L 및 WR199)가 이 경로의 잠재적인 억제제로 확인되었다. 이들 백시니아 바이러스 초기 유전자 중 5개 (B18R (WR200), E5R, K7R, B14R 및 C11R)와 관련된 데이터가 도 19a-19c에 도시되어 있다. 이들은 I형 IFN 결합 단백질을 암호화하는 B18R (WR200)을 포함하여, I형 IFN 시스템 억제 기능이 알려진 일부 바이러스 유전자를 포함한다 (Alcami et al., (1995)). K7R, B14R 및 C11R은 백시니아 독성 인자로 기술되고 있으나, I형 IFN 경로에서 E5R, K7R, B14R 및 C11R의 역할은 이전에 밝혀지지 않았다 (Benfield et al., J. Gen. Virol. (2013), Chen et al., (2008); McCoy et al., (2010); Martin et al., (2012)). E5R은 바이로좀 관련된 바이러스 초기 단백질로 보고되었다 (Murcia-Nicolas et al., (1999)). 면역 회피에서의 역할은 보고된 바 없다.
실시예 17: B18R, E5R, K7R, C11R 또는 B14R의 과잉발현이 HEK293-T 세포에서 cGAS 및 hSTING의 공동 형질주입에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현을 하향 조절한다는 것 확인.
B18R (WR200), E5R, K7R, C11R 및 B14R이 cGAS/STING-유도된 IFNB 유전자 발현에서 억제 역할을 한다는 것을 확인하기 위하여, 양성 대조군으로서 E1A 뿐만 아니라, 표시된 바와 같이 IFNB-반딧불이 루시퍼라아제 리포터를 발현하는 플라스미드, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK, 뮤린 cGAS (도 20a), 또는 인간 cGAS(도 20b), 또는 인간 STING 개별 백시니아 바이러스 초기 유전자로 HEK293T-세포를 공동 형질주입시켰다. B18R(WR200), E5R, K7R, C11R 또는 B14R 유전자의 과잉발현은 뮤린 cGAS/인간 STING에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현의 감소를 초래하였다 (도 20a). E5R, K7R, C11R 또는 B14R 유전자의 과잉발현은 인간 cGAS/인간 STING에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현의 감소를 초래하였다. 그러나, B18R(WR200)의 과잉발현은 인간 cGAS/인간 STING에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현을 억제하지 못한다 (도 20b). 도 20c는 FLAG-표지된 바이러스 유전자 B18R(WR200), E5R, K7R, C11R 또는 B14R이 뮤린 cGAS/인간 STING에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현을 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 18: 안정적인 뮤린 대식세포 세포주에서 FLAG-표지된 E5R, B14R, K7R 및 B18R 유전자의 과잉발현은 열-불활성화 MVA로 감염 또는 면역-자극 DNA로 형질주입에 의해 유도된 IFNB 유전자 발현을 억제한다.
E5R-FLAG, B14R-FLAG, FLAG-K7R 또는 B18R-FLAG 유전자를 과잉발현하는 안정한 세포주 RAW264.7이 생성되었다. 간단하게, RAW264.7은 CMV 프로모터 및 퓨로마이신 선택 마커 하에 백시니아 E5R-FLAG, B14R-FLAG, FLAG-K7R 또는 B18R-FLAG 유전자의 발현 구축물을 포함하는 레트로 바이러스로 형질도입되었다. 대조군 세포주 생성을 위하여 약물 선택 마커가 있는 빈 벡터를 사용하였다. 약물 내성 세포를 획득하여 다음 실험에 사용하였다. 세포는 열-iMVA로 감염되거나 면역-자극 DNA(ISD) (10 ㎍/mL)로 형질주입되었다. 처치 후 12시간에 세포를 수집하였다. RNA가 생성되었고 정량적 RT-PCR을 수행하여 IFNB 유전자의 발현을 평가하였다. 대조군 세포주에서 열-iMVA 감염 또는 ISD 처치는 각각 8배 및 32배의 IFNB 유전자 유도를 초래하였다. IFNB의 유도는 E5, B14, K7 또는 B18을 과잉-발현하는 세포에서 현저하게 감소되었다 (도 21). 이러한 결과는 백시니아 E5R, B14R, K7R 및 B18R이 세포질 DNA-감지 경로를 억제하고 IFNB 유전자 유도를 차단함을 나타낸다.
실시예 19: 재조합 MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R 바이러스의 생성.
면역 조절에서 E5R, K7R 및 B14R의 역할을 더욱 확립하기 위하여, MVA△E5R, MVA△K7R 및/또는 MVA△B14R 바이러스의 생성이 확립될 것이다. pE5RGFP 벡터, pK7RGFP 벡터 또는 pB14RGFP 벡터가 특정 관심 유전자(SG)를 MVA의 E5R, K7R 또는 B14R 유전자좌에 삽입하도록 구축된다. 이 경우, 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP가 선택 마커로 사용된다. BHK21 세포는 0.05의 MOI에서, LacZ를 발현하는 MVA 바이러스로 1시간 동안 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 E5R, K7R 또는 B14R 유전자좌에 GFP를 삽입하여 녹색 형광으로 식별된다. 양성 클론은 4-5회 플라크 정제된다. 그 후, 재조합 바이러스 MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R이 각각 E5R, K7R 또는 B14R을 잃었는지 확인하기 위하여 PCR 분석이 수행된다.
실시예 20: cDC의 MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R 감염은 MVA보다 더 높은 수준의 I 형 IFN 유전자 발현을 유도한다.
통상적인 수지상 세포(cDC)의 MVA 감염은 cGAS/STING/IRF3-의존 메커니즘을 통해 I형 IFN을 유도하는 것으로 나타났다. E5R, K7R 또는 B14R이 세포질 DNA-감지 경로의 유도에 억제 역할을 하는지 시험하기 위하여, MVA△E5R, MVA△K7R 및/또는 MVA△B14R 대 MVA에 대한 골수유래 DC(BMDC)의 내재 면역 반응이 분석된다. BMDC는 10의 MOI에서 각각 MVA△E5R, MVA△K7R, MVA△B14R 또는 MVA로 감염된다. 세포는 감염 후 3시간 및 6시간에 수집된다. I형 IFN 유전자 발현 수준은 정량적 PCR 분석에 의해 결정된다. MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R 감염은 감염 후 3시간 및 6시간에 cDC에서 MVA보다 훨씬 더 높은 수준의 I형 IFN 유전자 발현을 유도할 것으로 예상된다. MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R이 인간 면역 세포에서 더 높은 수준의 I형 IFN 유전자 활성화를 유도하는지 여부를 시험하기 위하여 널리 사용되는 분화된 THP-1 세포가 사용된다. THP-1 세포는 10의 MOI에서 각각 MVA△E5R, MVA△K7R, MVA△B14R 또는 MVA로 감염되며 감염 후 3시간 및 6시간에 수집된다. MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA△B14R 감염은 THP-1 세포에서 MVA보다 더 높은 수준의 I형 IFN 유전자 발현을 유도할 것으로 예상된다. 이러한 결과는 E5R, K7R 및/또는 B14R이 세포질 DNA-감지 경로를 상쇄하는 억제제임을 보여준다. 따라서 이러한 결과는 MVA△E5R, MVA△K7R 및/또는 MVA△B14R이 타고난 면역 반응을 유도하는 방법에 있어 유용 할 수 있음을 보여줄 것이다.
실시예 21: E5R, K7R 및/또는 B14R 결실을 포함하고, IL-2, IL-12, IL-18, IL-15, 및/또는 IL-21 를 발현하기 위해 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 재조합 바이러스를 백본으로 사용한 사이토카인 생성 재조합 변형 백시니아 안카라 (MVA) 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서의 이의 용도.
본 실시예는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌, 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 재조합 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형종양을 치료하는 방법에서 이의 용도를 설명한다.
재조합 바이러스는 앞선 실시예에 기재된 상동 재조합 방법에 따라 조작될 것이다. 예를 들어, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21, 선택 마커로서 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP 또는 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 발현하도록 설계된다. 발현 카세트는 카세트가 상동 재조합을 통해 삽입될 유전자의 부분 서열(예를 들어, E5R 유전자, K7R 유전자 또는 B14R 유전자)이 측면에 위치할 것이다. BHK21 세포는 0.05의 감염 다중도 (MOI)에서 1시간 동안 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입 된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 gpt 선택 배지에서 추가 배양을 통해 선별되고, 플라크 정제된다. PCR 분석을 수행하여 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스에 E5R 유전자, K7R 유전자 및/또는 B14R 유전자가 결여되었지만 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21 삽입이 있었는지 확인한다. 재조합 바이러스에 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포 상에서 트랜스유전자의 발현은 적절한 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 확인된다. 대부분의 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포 모두 트랜스유전자를 발현할 것으로 예상된다.
재조합 바이러스의 항종양 효능을 평가하기 위하여 양측 종양 이식 모델이 사용될 것이다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포는 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식된다. 이식 7 내지 8일 후, 마우스는 마취 하에 다음으로 주 2회 주사된다: (i) PBS; (ii) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 복강내(IP) MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스; (iii) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 종양내(IT) MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스; (iv) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 복강내(IP) 및 종양내(IT) MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스; (v) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 종양내(IT) MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스 + 복강내(IP) 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체). 마우스의 생존 여부는 모니터링되고 종양 크기는 주 2회 측정된다.
본 실시예의 결과는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스의 항종양 효능을 입증할 것이다. 고형 종양이 있는 마우스로의 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스의 IP 및/또는 IT 투여는 항종양 반응을 유도하고, 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 또한, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제 (예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는 항종양 반응을 유도하고 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 더 나아가, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는, 이와 관련하여, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스 또는 면역 체크포인트 차단제가 단독으로 투여되었을 때에 비해 상승작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
따라서, 본 실시예는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 재조합 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L 바이러스를 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 포함하는 본 기술의 구성이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 22: E5R, K7R 또는 B14R이 결실된 재조합 백시니아 바이러스(VACV△E5R, VACV△K7R 또는 VACV△B14R)의 생성.
pC7LGFP 벡터가 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP를 백시니아 바이러스(VACV)의 E5R, K7R 또는 B14R 유전자좌에 삽입하는데 사용될 것이다. 발현 카세트는 각 측면 상에서 E5R, K7R 또는 B14R 측면 영역의 부분 서열이 측면에 위치할 것이다. BSC40 세포는 0.05의 MOI에서 1시간 동안 발현되는 WT 백시니아 바이러스로 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입 된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 E5R, K7R 또는 B14R 유전자좌에 삽입된 GFP에 의해 녹색 형광으로 식별된다. 양성 클론은 BSC40 세포에서 4-5회 플라크 정제된다. 재조합 바이러스 VAC△E5R, VACV△K7R 또는 VACV△B14R이 각각 E5R, K7R 또는 B14R을 잃었는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행한다.
E5R, K7R 또는 B14R 중 하나가 독성 인자이고 VACV△E5R, VACV△K7R 또는 VACV△B14R이 WT VACV와 비교하여 고도로 약화되는지를 확인하기 위하여, 뮤린 비강내 감염 모델이 사용될 것이다. 다양한 용량의 WT VACV로 비강내 감염 후 C57BL/6J 마우스의 체중 감소를 VACV△E5R, VACV△K7R 또는 VACV△B14R로 감염 후 C57BL/6J 마우스의 체중 감소와 비교할 것이다.
실시예 23: TK 결실, E3L 유전자 파괴, C7 결실을 포함하며 hFlt3L, 항-CTLA-4 및 OX40L을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L)의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서의 그의 용도.
본 실시예는 TK 결실, C7 결실을 포함하고 특이적으로 세포독성 T 림프구 항원 4(항-CTLA-4), hFlt3L 및 OX40L을 표적으로 하는 항체를 발현하는 재조합 백시니아 E3L83N 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도에 대해 설명한다.
바이러스는 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG) (예를 들어, 항-CTLA-4, OX40L, hFtl3L)를 발현하도록 설계된 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 사용하여 생성된다. 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하는 항-CTLA-4, OX40L 및/또는 hFtl3L, 및 선택 마커로서 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP 또는 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 발현하도록 설계된다. 예를 들어, 발현 카세트는 상동 재조합을 통해 C7 유전자좌에 특정 관심 유전자(들)를 삽입하기 위하여 C7L 유전자의 왼측 및 오른측에 있는 C8L 및 C6R의 부분 서열이 측면에 위치한다. 발현 카세트는 상동 재조합을 통해 TK 유전자좌에 특정 관심 유전자(들)을 삽입하기 위하여 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자 (TK-L, TK-R)가 측면에 있을 수 있다. BHK21 세포는 1시간 동안 0.05의 감염 다중도(MOI)에서 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 다음 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 선별 배지에서 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크 정제된다. VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L에 C7L 유전자와 TK 유전자의 일부가 결여되지만 hFlt3L, 항-CTLA-4 및 OX40L 삽입이 있는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행한다. VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스로 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포에서 OX40L의 발현은 항-OX40L 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 확인한다. 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포의 대부분이 OX40L을 발현할 것으로 예상된다.
재조합 바이러스의 항종양 효능을 평가하는 데 양측 종양 이식 모델을 사용한다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포는 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식된다. 이식 7 내지 8 일 후, 마우스는 마취 하에 다음으로 주 2회 주사된다: (i) PBS; (ii) 복강내(IP) VACV△E3L83N-hFlt3L-항 CTLA-4-△C7L-OX40L; (iii) 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L; (iv) 복강내(IP) 및 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L; 또는 (v) 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L + 복강내(IP) 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA -4 항체). 마우스의 생존을 모니터링하고 종양 크기는 주 2회 측정된다.
본 실시예의 결과는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L의 항종양 효능을 입증 할 것이다. 고형 종양이 있는 마우스로의 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L의 IP 및/또는 IT 투여는 항종양 반응을 유도하고, 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 또한 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 및 면역 체크포인트 차단제 (예를 들어, 항 -PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는 항종양 반응을 유도하고 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 더 나아가, VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 및 면역 체크포인트 차단제 (예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는, 이와 관련하여, VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 또는 면역 체크포인트 차단제가 단독으로 투여 되었을 때와 비교하여 상승작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
따라서, 본 실시예는 재조합 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스를 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 포함하는 본 기술의 구성이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 24: IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 E5R, K7R, 및/또는 B14R 유전자좌에 삽입하기 위하여 VACV△E3L83N-hFlt3L-항CTLA-4-△C7L-OX40L 재조합 바이러스를 백본으로 사용하는 사이토카인 생산 재조합 백시니아 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도.
본 실시예는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 재조합 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서의 이의 용도를 설명한다.
재조합 바이러스는 앞선 실시예에 기재된 상동 재조합 방법에 따라 조작될 것이다. 예를 들어, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하는 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21, 및 선택 마커로서 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP 또는 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 발현하도록 설계된다. 발현 카세트는 카세트가 상동 재조합을 통해 삽입될 유전자의 부분 서열(예를 들어, E5R 유전자, K7R 유전자 또는 B14R 유전자)이 측면에 위치한다. BHK21 세포는 0.05의 감염 다중도(MOI)에서 1시간 동안 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 gpt 선택 배지에서 추가 배양을 통해 선별되고 플라크 정제된다. PCR 분석을 수행하여 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스에 E5R 유전자, K7R 유전자 및/또는 B14R 유전자가 결여되었지만 IL-2, IL-12, IL- 18, IL-15 및/또는 IL-21 삽입이 있었는지 확인한다. 재조합 바이러스에 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포에서 트랜스유전자의 발현은 적절한 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 확인된다. 대부분의 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포 모두 트랜스유전자를 발현할 것으로 예상된다.
재조합 바이러스의 항종양 효능을 평가하기 위하여 양측 종양 이식 모델이 사용된다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포는 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 (5 x 105 세포) 및 왼쪽 (1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식된다. 이식 7 내지 8일 후, 마우스는 마취 하에 다음으로 주 2회 주사된다: (i) PBS; (ii) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 복강내(IP) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스; (iii) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스; (iv) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 복강내(IP) 및 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스; 또는 (v) E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 종양내(IT) VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스 + 복강내(IP) 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체). 마우스의 생존 여부는 모니터링되고 종양 크기는 주 2회 측정된다.
본 실시예의 결과는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스의 항종양 효능을 입증할 것이다. 고형 종양이 있는 마우스로의 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스의 IP 및/또는 IT 투여는 항종양 반응을 유도하고, 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 또한, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제 (예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는 항종양 반응을 유도하고 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 더 나아가, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는, 이와 관련하여, E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스 또는 면역 체크포인트 차단제가 단독으로 투여되었을 때와 비교하여 상승작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
따라서, 본 실시예는 E5R 유전자좌, K7R 유전자좌 및/또는 B14R 유전자좌 내에서 트랜스유전자 IL-2, IL-12, IL-18, IL-15 및/또는 IL-21을 발현하는 재조합 VACV△E3L83N-hFlt3L-항-CTLA-4-△C7L-OX40L 바이러스를 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 포함하는 본 기술의 구성이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 25: TK 결실을 포함하며 hFlt3L 및 OX40L을 발현하는 재조합 C7L 돌연변이체 백시니아 바이러스(VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L)의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도.
본 실시예는 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도에 대해 설명한다.
바이러스는 하나 이상의 특정 관심 유전자(SG)(예를 들어, OX40L, hFtl3L) 를 발현하도록 설계된 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 사용하여 생성된다. 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하는 OX40L 및/또는 hFtl3L, 및 선택 마커로서 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP 또는 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 발현하도록 설계된다. 예를 들어, 발현 카세트는 상동 재조합을 통해 C7 유전자좌에 특정 관심 유전자(들)(예를 들어, hFlt3L)를 삽입하기 위하여 C7L 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 있는 C8L 및 C6R의 부분 서열이 측면에 위치한다. 발현 카세트는 상동 재조합을 통해 TK 유전자좌에 특정 관심 유전자(들) (예를 들어, OX40L)을 삽입하기 위하여 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자 (TK-L, TK-R)가 측면에 위치할 수 있다. BHK21 세포는 1시간 동안 0.05의 감염 다중도(MOI)에서 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 다음 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 선택 배지에서 추가 배양을 통해 선별되고 플라크 정제된다. VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L에 C7L 유전자와 TK 유전자의 일부가 결여되지만 hFlt3L 및 OX40L 삽입이 있는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행한다. VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스로 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포에서 OX40L 및 hFlt3L 발현은 항-OX40L 항체 및 항-hFlt3L 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 확인된다. 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포의 대부분이 OX40L 및 hFlt3L을 발현할 것으로 예상된다.
재조합 바이러스의 항종양 효능을 평가하는 데 양측 종양 이식 모델을 사용한다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포는 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 (5 x 105 세포) 및 왼쪽 (1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식된다. 이식 7 내지 8일 후, 마우스는 마취 하에 다음으로 주 2회 주사된다: (i) PBS; (ii) 복강내(IP) VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L; (iii) 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스; (iv) 복강내(IP) 및 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스; 또는 (v) 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L + 복강내(IP) 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA -4 항체). 마우스의 생존 여부는 모니터링되고 종양 크기는 일주일에 두 번 측정된다.
본 실시예의 결과는 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 의 항종양 효능을 입증할 것이다. 고형 종양이 있는 마우스로의 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L의 IP 및/또는 IT 투여는 항종양 반응을 유도하고, 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 또한 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 및 면역 체크포인트 차단제 (예를 들어, 항 -PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는 항종양 반응을 유도하고 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 더 나아가, VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 및 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체)의 조합 투여는, 이와 관련하여 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 또는 면역 체크포인트 차단제가 단독으로 투여 되었을 때와 비교하여 상승작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
따라서, 본 실시예는 재조합 VACV△C7L-TK(-)-hFlt3L-OX40L 바이러스를 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 포함하는 본 기술의 구성이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 26: TK 결실을 포함하며 항-CTLA-4, hFlt3L, OX40L 및 hIL-12를 발현하는 재조합 C7L 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VACV△C7L-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12)의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도.
본 실시예는 재조합 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스의 생성 및 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 고형 종양을 치료하는 방법에서 이의 용도를 설명한다.
재조합 바이러스는 앞선 실시예에 기재된 상동 재조합 방법에 따라 조작될 것이다. 예를 들어, 발현 카세트는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 항-CTLA-4, hFlt3L, OX40L, 및/또는 hIL-12, 및 선택 마커로서 사용되는 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP 또는 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)를 발현하도록 설계된다. 발현 카세트는 카세트가 상동 재조합을 통해 삽입될 유전자의 부분 서열(예를 들어, C7 유전자, TK 유전자 또는 기타 적합한 백시니아 바이러스 유전자)이 측면에 위치할 것이다. BHK21 세포는 0.05의 감염 다중도(MOI)에서 1시간 동안 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입 된다. 감염된 세포는 48시간에 수집된다. 재조합 바이러스는 MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한 선택 배지에서 추가 배양을 통해 선별되고 플라크 정제된다. PCR 분석을 수행하여 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12에 C7L 유전자 및 일부 TK 유전자가 결여되었지만 트랜스유전자 항-CTLA-4, hFlt3L, OX40L, 및 hIL-12 삽입이 있었는지 확인한다. VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스에 감염된 뮤린 B16-F10 세포 및 인간 SK-MEL-28 세포에서 트랜스유전자의 발현은 적절한 항체를 사용한 FACS 분석에 의해 확인된다. 뮤린 B16-F10 및 SK-MEL28 세포 모두 트랜스유전자를 발현할 것으로 예상된다.
재조합 바이러스의 항종양 효능을 평가하기 위하여 양측 종양 이식 모델이 사용될 것이다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포는 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 (5 x 105 세포) 및 왼쪽 (1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식된다. 이식 7 내지 8일 후, 마우스는 마취 하에 다음으로 주 2회 주사된다: (i) PBS; (ii) 복강내(IP) VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12; (iii) 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12바이러스; (iv) 복강내(IP) 및 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스; (v) 종양내(IT) VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스 + 복강내(IP) 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체). 마우스의 생존을 모니터링하고 종양 크기는 주 2회 측정된다.
본 실시예의 결과는 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스의 항종양 효능을 입증할 것이다 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스의 고형 종양이 있는 마우스로의 IP 및/또는 IT 투여는 항종양 반응을 유도하고, 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 또한, VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체)의 조합 투여는 항종양 반응을 유도하고 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시킬 것으로 기대된다. 더 나아가, VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스 및 면역 체크포인트 차단제(예를 들어, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체)의 조합 투여는, 이와 관련하여 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스 또는 면역 체크포인트 차단제가 단독으로 투여 되었을 때와 비교하여 상승작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
따라서, 본 실시예는 재조합 VACV△C7L-TK(-)-항-CTLA-4-TK(-)-hFlt3L-OX40L-hIL-12 바이러스를 단독으로 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합하여 포함하는 본 기술의 구성이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 27: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 모델 항원, 닭 오브알부민(OVA)과 공동투여는 비장 및 배수 림프절(dLNs)에서 OVA-특이적 CD8 + 및 CD4 + T-세포, 및 면역화된 뮤린에서 혈청 항-OVA IgG 항체 생성을 향상시킨다.
본 실시예는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제시를 향상시키는 백신 아쥬반트 역할을 할 수 있음을 보여준다. 마우스를 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L(1 x 107 pfu)와 함께 또는 없이 OVA(10 ㎍)로 마우스에 2주 간격으로 두 번 피하(SC) 면역화 한다. 마우스는 두 번째 백신접종 1주 후에 안락사 되고, OVA-특이적 T 세포 및 항체 평가를 위하여 비장, 배수 림프절(dLNs) 및 혈액을 수집한다. 항-OVA CD8+ T-세포 반응을 확인하기 위하여, 비장세포(500,000개 세포)를 OVA의 MHC 클래스 I (Kb)-제한된 펩티드 에피토프인 OVA 257-264 (SIINFEKL) 펩티드 (서열번호 15)와 함께, 항-CD8 및 항-IFN-γ 항체에 대해 염색되기 전 12시간 동안 항온처리한다. 항-OVA CD4+ T-세포 반응을 시험하기 위하여 비장세포 (500,000개 세포)를 OVA의 MHC 클래스 II I-Ad-제한된 펩티드 에피토프인 OVA 323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) 펩티드 (서열번호 16)와 함께, 항-CD4 및 항-IFN-γ 항체에 대해 염색되기 전 12시간 동안 항온처리한다. OVA SC와 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 공동투여는 OVA 단독과 비교하여 비장에서 항-OVA IFN-γ+CD8+ T-세포 및 항-OVA IFN-γ+CD4+ T-세포의 증가를 초래할 것으로 예상된다.
SC OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 후 항-OVA IFN-γ+CD8+ T-세포 및 항-OVA IFN-γ+CD8+ T- 세포의 유사한 유도가 dLNs에서 관찰 될 것으로 예측된다. 간단하게, dLNs에서 단일 세포 현탁액이 생성되고 500,000 개의 세포가 OVA 257-264 또는 OVA 323-339 펩티드와 함께 항온처리된다. 더 나아가 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 열-iMVA를 OVA와 함께 투여하면 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 OVA와만 함께 투여하는 것과 비교하여 이와 관련한 상승작용 효과를 얻을 것으로 예상된다.
실시예 28: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 항원 특이적 CD8 + 및 CD4 + T-세포 반응을 생성하는 데 있어 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA)보다 우수하다.
완전 프로인트 아쥬반트(CFA)는 qlw대사성 오일(파라핀 오일 및 만니드 모노올레에이트)에서 열-사멸된 결핵균을 포함한다. 또한 TLR2, TLR4 및 TLR9에 대한 리간드를 포함한다. CFA와 함께 항원을 주사하면 Th1-우세 면역 반응을 유도한다. 인체에서 CFA의 사용은 독성 프로필로 인해 현재 허용되지 않으며, 동물에서의 사용은 고통스러운 반응과 주사 부위의 조직 손상 위험으로 인해 피하 또는 복강내 경로로 제한된다. MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 CFA보다 우수한지 여부를 시험하기 위하여, 마우스에 OVA 항원 + MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 OVA + CFA를 2주 간격으로 2번 피하 백신접종한 후, 비장, dLNs 및 혈액을 실시예 27에 기재된 바와 같이 항-OVA CD8+ 및 CD4+T-세포 및 항체 반응을 위하여 채취한다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 OVA의 피하 공동투여는 OVA + CFA 를 사용한 면역화와 비교하여 백신접종된 마우스의 비장에서 더 높은 수준의 항원-특이적 CD8+ 및 CD4+T- 세포를 유도할 것으로 예상된다.
실시예 29: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 항원-특이적 CD8 + 및 CD4 + T-세포 반응을 생성하는데 있어서 폴리 I:C 또는 STING 작용제보다 우수하다.
폴리 IC 및 STING 작용제는 백신 아쥬반트로서 연구되어 온 선천적인 면역 활성제이다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 Poly IC 및 STING 작용제보다 우수한지 여부를 시험하기 위하여 마우스에 OVA 항원 + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 OVA + Poly IC 및 STING 작용제를 2주 간격으로 2번 피하 백신접종한 후, 비장, dLNs 및 혈액을 실시예 27에 기재된 바와 같이 항-OVA CD8+ 및 CD4+T-세포 및 항체 반응을 위하여 채취한다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 OVA의 피하 공동투여는 OVA + Poly IC 및 STING 작용제를 사용한 면역화와 비교하여 백신접종된 마우스의 비장에서 더 높은 수준의 항원-특이적 CD8+ 및 CD4+ T-세포를 유도할 것으로 예상된다.
실시예 30: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-OVA를 사용한 피부 난절은 MVA-OVA와 비교하여 더 강한 OVA-특이적 CD8 + 및 CD4 + T 세포 및 항체를 생성한다.
MVA는 다양한 감염원 및 암에 대한 고도로 약화되고, 비-복제성이며, 안전하고 효과적인 백신 벡터이다. MVA 백신접종을 위한 최적의 투여량은 피부 난절을 통해 시험한다. MVA-OVA(P7.5 프로모터 제어 하에 OVA의 전체 길이를 코딩함) 또는 MVA △C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-OVA를 6-8 주령 암컷 C57BL/6J 마우스의 꼬리에 피부 난절 후, 105, 106 및 107 pfu의 용량으로 투여한다. 백신접종 1주일 후에 마우스를 안락사시키고 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 시험하기 위하여 비장을 단리시킨다. 골수-유래된 DC(BMDC)는 5의 MOI에서 1시간 동안 MVA-OVA로 감염된 다음 BMDC가 12시간 동안 비장세포와 함께 항온처리되기 전 5시간 동안 항온처리된다. 세포는 IFN-γ+CD8+ T 세포에 대해 세포 내 사이토카인 염색(ICS)을 위하여 처리된다. 대안적으로, BMDC는 1시간 동안 SIINFEKL 펩티드 (서열번호 15)와 항온처리 된 다음 비장세포와 함께 12시간 동안 항온처리된다. SIINFEKL 펩티드 (서열번호 15)에 반응하는 IFN-γ+CD8+ T 세포에 대해 ICS가 수행된다.
STING 또는 Batf3-의존성 DC, OX40이 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-OVA-유도된 백신접종 효과에 일정 역할을 하는지 시험하기 위하여, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-OVA 106 pfu 용량을 STINGGt/Gt, Batf3-/- 또는 OX40-/- 마우스의 꼬리에 피부 난절 후 투여한다. 본 실시예는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-OVA가 MVA-OVA와 비교하여 개선된 백신 벡터이며, 그 기능은 STING, Batf3 의존성 DC 및 OX40-OX40L 상호작용이 필요함을 입증할 것으로 예상된다.
실시예 31: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 GM-CSF-배양 골수-유래된 수지상 세포(BMDC)의 MHC-I 발현을 유도하지만, 항원의 식세포 작용을 증가시키지는 않는다.
BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 감염은 STING-매개 세포질 DNA-감지 경로에 의존하는 DC 성숙을 유도한다 (Dai et al., Science Immunology 2017). 본 실시예에서, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L에 의한 BMDC의 세포 표면에서의 MHC-I 발현 유도를 폴리 I:C와 비교한다. BMDC는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 존재 또는 부재 하에서 OVA와 함께 3 또는 16시간 동안, 또는 폴리 IC와 함께 16시간 동안 항온처리 된다. 세포 표면 MHC-I (H-2Kb) 발현은 항-H-2Kb 항체를 사용하여 FACS에 의해 결정된다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 공동 항온처리는 H-2Kb의 세포 표면 발현을 증가시킬 것으로 예상된다. 결과는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 폴리 IC에 비해 BMDC에서 MHC-I 발현의 더 강한 유도자임을 입증할 것으로 예상된다.
BMDC의 형광 표지된 모델 항원 OVA(OVA-647)의 흡수 능력이 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 처치에 의해 영향을 받는지를 평가하기 위하여, BMDC를 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 로(1의 MOI) 1시간 감염시키고, OVA-647과 함께 1시간 동안 항온처리한다. BMDC에서 식균된 OVA-647의 형광 강도는 유세포 분석으로 측정된다. 본 실험의 결과는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 처치된 BMDC가 성숙을 거치지만, 성숙의 결과로 항원에 대한 식세포 활동 능력이 감소한다는 것을 입증할 것으로 예상된다.
실시예 32: GM-CSF 배양된 BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 OVA와의 공동항온처리는 시험관내 OT-I 및 OT-II T-세포의 증식을 향상시킨다.
살아있는 WT 백시니아에 의한 표피 수지상 세포의 감염은 항원 특이적 T 세포를 활성화하는 DC의 능력을 억제한다(Deng et al., JVI, 2006). BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 감염이 항원 특이적 OT-I 및 OT-II T-세포의 증식을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, BMDC를 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 존재 또는 부재하에 다양한 농도에서 OVA와 함께 3시간 동안 항온처리한다. 세포를 세척하여 흡수되지 않은 OVA 또는 바이러스를 제거한 다음, 카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE) 표지된 OT-I T 세포와 3일 동안 공동배양한다 (BMDC:OT-I T 세포=1:5). OT-I 세포의 CFSE 강도를 측정하기 위하여 유세포 분석을 적용한다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과의 사전 항온처리는 분열되는 세포에서 CSFE 희석으로 표시되는 바와 같이, OT-I T 세포의 증식을 자극하는 DC의 능력을 향상시킬 것으로 예상된다. 또한 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 폴리 IC로의 전처치는 DC에서 MHC-II가 제시하는 OVA-항원을 인식하는 OT-II T 세포의 증식을 자극하는 DC의 능력을 향상시킬 것으로 예상된다. 또한 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 열-iMVA의 조합 투여는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독 투여와 비교하여 이와 관련하여 상승작용 효과를 생성할 것으로 예상된다.
실시예 33: Flt3L-배양된 BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 OVA와의 공동 항온처리는 시험관내 OT-I T-세포의 증식을 향상시킨다.
FMS-유사 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt3L)는 Batf3-의존성 CD103+/CD8a+DC 및 형질세포양 DC(pDCs)의 분화를 위한 중요한 성장 인자이다. Flt3L-배양된 BMDC는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 존재 또는 부재 하에 OVA와 함께 펄스된 다음, 3일 동안 CFSE-표지된 OT-I 세포와 공동배양 된다(BMDC:OT-I=1:5). OT-I 세포의 CFSE 강도를 측정하기 위하여 유세포 분석을 적용한다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 매우 낮은 OVA 농도에서도 MHC-I에 제시된 OVA257-264 (SIINFEKL) 펩티드(서열번호 15)를 인식하는 OT-I 세포의 증식을 자극할 것으로 예상된다. 더 나아가, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 열-iMVA의 조합 투여는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독 투여와 비교하여 이와 관련하여 상승작용 효과를 생성할 것으로 예상된다.
실시예 34: 형질세포양 수지상 세포(pDC)는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 매개 백신 아쥬반트 효과에서 중요한 역할을 한다.
형질세포양 DC(pDC)는 항원을 교차제시하여 CD8+ T-세포 반응을 자극할 수 있다. pDC가 생체 내에서 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 매개 아쥬반트 효과에서 역할을 하는지를 시험하기 위하여, 항-PDCA-1 항체를 0일 및 14일에 수행되는 OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L로의 피내 면역화 하루 전과 하루 후에 사용한다. 비장 및 dLN은 항원특이적 CD8+ T-세포 분석을 위하여 21일에 단리시킨다. OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 피내 조합 투여는 비장의 CD8+ T-세포 중 IFN-γ+ T-세포의 비율을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한 pDC의 고갈은 비장의 CD8+ T-세포 중 IFN-γ+ T- 세포의 비율을 감소시킬 것으로 예상된다. 본 실험의 결과는 생체 내 펩티드 백신접종 모델에서 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 유도 백신 아쥬반트 효과에서의 pDC의 역할을 입증 할 것으로 예상된다.
실시예 35: 이동성 수지상 세포 서브셋 랑게린 - CD11b - 및 CD11b + DC는 OVA 항원 흡수에 효율적이다.
이동성 DC 및 상주 DC를 포함하는 많은 DC 서브셋이 림프절에 존재한다. 이동성 DC는 MHC-IIIntCD11c+이다. 상주 수지상 세포 집단은 MHC-IIIntCD11c+이다. 이동성 DC는 CD11b+DC, 랑게린-CD11b-DC 및 랑게린+DC로 더 나눌 수 있다. 랑게린+DC는 CD103+DC 및 랑게르한스 세포로 구성되는 반면, 상주 DC는 CD8α+ 상주 DC 및 CD8α- 상주 DC로 구성된다. 어떤 DC 서브셋이 형광 염료(OVA-647)로 표지 된 OVA 항원을 식균하는데 효율적이고 dLN으로 이동할 수 있는 능력을 가지고 있는지 시험하기 위하여, OVA-647을 오른쪽 옆구리에 피내 (ID) 주사하고, 주사 후 24시간에 dLN을 채취한다. 백신 아쥬반트 Addavax 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 존재 또는 부재 하의 OVA-647의 조합 투여가 랑게린-CD11b- 및 CD11b+DC 중 OVA-647+ 세포의 비율에 영향을 미치는지 여부를 비교하기 위하여, OVA-647을 Addavax 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 존재 또는 부재 하에 피내 (ID) 주사하고, 랑게린-CD11b- 및 CD11b+ DC 중 OVA-647+ 를 분석하였다. OVA와 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 조합 투여는 랑게린-CD11b- 및 CD11b+ DC 중 OVA-647+ 세포의 비율을 증가시키는 반면, OVA와 Addavax의 조합 투여는 그렇지 못할 것으로 예상된다. Addavax는 유럽에서 아쥬반트된독감 백신에 대해 허가된 MF59와 유사한 제형을 가진 잘 허용되는 스쿠알렌 기반의 수중유 나노 에멀젼이다. 본 실험의 결과는 OVA-647와 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 조합 투여가 식균된 항원을 dLN으로 수송하는 이동성 DC의 능력을 향상시킴을 시사할 것으로 예상된다. 또한 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 열-iMVA의 조합 투여는 MVA△C7L-hFlt3L-TK (-)-mOX40L 단독 투여와 비교하여 이와 관련하여 상승작용 효과를 생성할 것으로 예상된다.
실시예 36: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 조사된 전세포 백신에 대한 강력한 면역 아쥬반트다.
펩티드 종양항원 또는 신생항원보다 방사선 조사된 전세포 백신을 사용하는 이점은 다음을 포함한다: (i) 종양 세포는 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있는 다중 종양항원을 제공하고; (ii) 종양항원 또는 신생항원을 식별하기 위한 필요성 또는 시간을 우회할 수 있다. 조사된 B16-OVA와 함께 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 추가가 백신접종 효능을 개선하는지 여부와, 항-PD-L1의 전신 전달이 백신접종 효능을 더욱 향상시킬 수 있는지 여부를 분석한다. 마우스에 B16-OVA를 피내 이식하고, 방사선 조사된 B16-OVA, B16-OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 B16-OVA + 폴리 IC를 반대쪽 옆구리에 3일, 6일 및 9일에 세 번 피내 백신접종한다.
조사된 B16-OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 사용한 백신접종은 조사된 B16-OVA 단독과 비교하여 생존 중간값을 연장할 것으로 예상된다. 또한 항-PD-L1 항체의 존재 하에 조사된 B16-OVA + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L로 백신접종하면 조사된 B16-OVA + 항-PD- L1과 비교하여 생존 중간값이 연장될 것으로 예상된다. 이러한 결과는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 방사선 조사된 전세포 백신접종을 위한 강력하고 안전한 백신 아쥬반트임을 입증할 것으로 예상된다.
실시예 37: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 신생항원 펩티드 백신접종을 위한 면역 아쥬반트다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L이 신생항원 펩티드 백신접종을 위한 백신 아쥬반트로서 작용할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 마우스에 B16-F10 세포(마우스당 7.5 x 104 개 세포)를 처음 이식하는 피하 백신접종 모델을 사용했다. 이식 후 3일, 7일 및 10일에, 마우스는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 폴리 I:C가 있거나 없는 신생항원 펩티드 (M27 (REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD) (서열번호 17), M30 (PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL) (서열번호 18) 및 M48 (SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS) (서열번호 19))의 혼합물로 반대쪽 옆구리에 피하(SC) 백신접종된다. 종양 성장 및 마우스 생존을 모니터링한다. 신생항원 펩타이드 단독 SC 백신접종은 전신 항종양 면역을 생성하고, 신생항원 펩티드 믹스를 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L와 조합 투여하면 항종양 효과가 향상될 것으로 예상된다.
실시예 38: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L은 바이러스 항원 펩티드 백신접종을 위한 면역 아쥬반트다.
바이러스 항원은 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있는 강력한 면역원이다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 바이러스 항원(예를 들어 인간 유두종 바이러스 E7의 합성 긴 펩티드(SLP))의 조합이 항 바이러스 T 세포를 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, 마우스에 E7 SLP 단독, 또는 E7 SLP + MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 E7 + 폴리 I:C 를 2주 간격으로 두 번 피내 백신접종한 후, 비장을 채취하고, 항-CD8+ 및 CD4+ T-세포 및 항체 반응을 위하여 dLN 및 혈액을 채취한다. 치료 백신 모델에서 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 역할을 시험하기 위하여 E7 발현 암세포(TC-1)를 피내에 이식한 다음, 2주 간격으로 아쥬반트와 함께 또는 없이 예방 접종을 실시하고, 종양 부피 및 마우스 생존을 뒤이어 확인한다.
실시예 39: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-E7을 사용한 피부 난절은 MVA-E7과 비교하여 더 강력한 항-E7 CD8 + 및 CD4 + T 세포 반응을 생성한다.
HPV E7 유전자를 발현하는 재조합 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 바이러스는 백시니아 psE/L 프로모터 제어 하의 HPV E7 유전자를 MVA E5R 또는 K7R 유전자좌에 삽입함으로써 생성 될 것이다. MVA-E7(TK 유전자좌에 삽입된 psE/L 프로모터 제어 하의 HPV E7의 전체 길이를 코딩함) 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-E7을 6-8 주령 암컷 C57BL/6J 마우스의 꼬리에 피부 난절 후, 106 또는 107 pfu의 용량으로 투여한다. 백신접종 1주일 후에 마우스를 안락사시키고 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 시험하기 위하여 비장을 단리시킨다. 골수-유래된 DC(BMDC)는 5의 MOI에서 1시간 동안 MVA-E7로 감염된 다음 BMDC가 12시간 동안 비장세포와 함께 항온처리되기 전 5시간 동안 항온처리 된다. 세포는 IFN-γ+CD8+ T 세포에 대해 세포 내 사이토카인 염색(ICS)을 위하여 처리된다. 대안적으로, BMDC는 1시간 동안 E7 펩티드에서 항온처리된 다음 비장세포와 함께 12시간 동안 항온처리된다. E7 펩티드에 반응하는 IFN-γ+CD8+ T 세포에 대해 ICS가 수행된다.
실시예 40: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-E7의 비강내 감염은 MVA-E7과 비교하여 폐에서의 (E7을 발현하는) TC-1 세포 성장으로부터 마우스를 더 잘 보호한다.
6-8 주령 암컷 C57BL/6J 마우스를 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-E7, 또는 MVA-E7(2 x 107 pfu에서), 또는 PBS 대조군으로 비강내 감염시킨다. 비강내 감염 1주일 후, 마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해 1 x 105 TC-1 세포로부터 공격받는다. 3주 후에 마우스를 안락사 시켜 폐의 종양 성장을 평가한다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L-E7 백신접종은 MVA-E7와 비교하여 폐에서 E7 발현 종양 세포 성장에 대해 더 나은 보호를 제공할 것으로 예상된다.
실시예 41: 종양내(IT) 백신접종이 항원 특이적 면역 반응을 생성하는데 있어 피하(SC) 백신접종보다 우수한지 시험.
근거: 열-iMVA의 종양내(IT) 주사는 주사된 종양을 근절하고, Batf3 의존성 CD103+/CD8a+ DC 및 STING-매개 세포질 DNA 감지 경로를 필요로 하는 전신 항종양 면역을 유도한다는 것을 이전에 보였다. 열-iMVA의 IT 전달은 cGAS/STING 경로 활성화를 통해 종양 면역억제 미세환경을 부분적으로 변경하고, CD103+ DC에 의한 종양 항원 제시를 촉진한다. 열-iMVA + 모델 항원 또는 신생항원의 IT 전달은 종양 침윤성 DC에 의한 항원 제시를 향상시키고, 열-iMVA + 항원의 SC 전달과 비교하여 우수한 후천 면역을 생성할 것이라는 가설을 세웠다.
방법: IT 백신접종이 항원 특이적 면역 반응을 생성하는데 있어 SC 백신접종보다 우수한지 시험하기 위하여, B16-F10 흑색종 세포 (5 x 105 세포)를 오른쪽 옆구리에 피내 이식한다. 이식 후 7일차에, 종양의 직경이 2-3 mm인 경우 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 OVA 단백질을 종양에 직접 주사하거나 오른쪽 옆구리의 종양에서 1 cm 떨어진 곳에 SC 주사한다. 주사 1주일 후에 TDLN과 비장이 수집되고 항-OVA CD4 및 CD8 T 세포가 FACS에 의해 분석된다.
대안적으로, B16-F10 신생항원 펩티드 믹스(M27/M30/M48)는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 함께 오른쪽 옆구리에 있는 종양에 직접 주사되거나, 오른쪽 옆구리의 종양에서 1 cm 떨어진 곳에 SC 주사된다. 주사 후 1주일차에, TDLN 및 비장이 수집되고 ELISPOT 분석을 위하여 16 시간 동안 M27 (REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD) (서열번호 17), M30 (PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL) (서열번호 18) 또는 M48 (SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS) (서열번호 19) 펩티드와 함께 공동배양된다.
실시예 42: 면역 체크포인트 차단제의 존재 하에 항원 특이적 면역 반응을 생성하는데 있어서 종양내(IT) 백신접종이 피하(SC) 백신접종보다 우수한지 시험.
항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1을 포함하는 면역 체크포인트 차단 항체의 존재 하에 항원 특이적 면역 반응을 생성함에 있어 IT 백신접종이 SC 백신접종보다 우수한지 시험하기 위하여, B16-F10 흑색종 세포 (5 x 105 세포)를 오른쪽 옆구리에 피내 이식한다. 이식 후 7 일차에, 종양의 직경이 2-3 mm일 때, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 OVA 단백질을 3일 간격으로 2회, 종양에 직접 주사하거나 오른쪽 종양에서 1cm 떨어진 곳에 SC 주사한다. 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 또는 이소타입 대조군 항체는 3일 간격으로 2회 복강내 투여될 것이다. 2차 주사 후 2 일차에 TDLN 및 비장이 수집되고, 항-OVA CD4 및 CD8 T 세포가 FACS에 의해 분석된다.
대안적으로, B16-F10 신생항원 펩티드 믹스 (M27/M30/M48)는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L과 함께 3일 간격으로 2회, 오른쪽 옆구리의 종양에 직접 주사되거나 오른쪽 종양에서 1cm 떨어진 곳에서 SC 주사된다. 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 또는 이소타입 대조군 항체는 3일 간격으로 2회 복강내 투여 될 것이다. 2차 주사 후 2 일차에 TDLN 및 비장이 수집되고 ELISPOT 분석을 위하여 16시간 동안 M27, M30 또는 M48 펩티드와 함께 공동배양된다.
실시예 43: E3L△83N-TK - -hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L - -mOX40L 또는 VAC-TK - -항-muCTLA-4/C7L - -mOX40L 재조합 바이러스는 복제 가능하다.
E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 의 복제 능력은 뮤린 B16-F10 흑색종 세포를 0.1의 MOI에서 감염시켜 결정하였다. 감염 후 다양한 시점 (예를 들어, 1, 24, 48 및 72시간)에서 세포를 수집하였으며 BSC40 세포를 적정하여 바이러스 수율(log pfu)을 결정하였다. 도 24a는 감염 후 시간에 대한 바이러스 수율의 그래프를 보여준다. E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 및 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L은 모두 B16-F10 세포에서 효율적으로 복제되었으며 바이러스 역가는 감염 후 72시간 째에 각각 1421 및 32142배 이상으로 증가하였다. 감염 후 1시간 째에 대한 72시간 째에 바이러스 수율의 배수 변화를 계산하였다 (도 24b). 재조합 바이러스 E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 및 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L은 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 효율적으로 복제되었다.
Figure pct00160
실시예 44: E3L△83N-TK - -hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L - -mOX40L 바이러스의 감염을 통한 B16-F10 흑색종 세포에서 항-muCTLA-4, hFlt3L 및 mOX40L의 발현.
E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 재조합 바이러스가 원하는 특정 유전자를 발현할 수 있는지 확인하기 위하여, B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 10의 MOI에서 E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L로 감염 시켰고, 항-muCTLA-4, hFlt3L 및 mOX40L의 발현을 측정하였다. 세포 용해물은 감염 후 다양한 시간 (예를 들어, 7, 24 및 48시간)에 수집되었다. 항체 및 단백질의 수준을 결정하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 25에 도시 된 바와 같이 E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스에 감염된 B16-F10 세포에서 항-muCTLA-4 항체(중쇄(HC) 및 경쇄(LC)), hFlt3L 및 mOX40L 단백질이 풍부하게 발현되었다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 바이러스의 서로 다른 유전자좌로부터 관심있는 여러 특정 유전자를 동시에 발현할 수 있는 능력을 가지고 있으며 원하는 생성물을 세포에 전달하는 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 45: E3L△83N-TK - -hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L - -mOX40L 또는 VAC-TK - -항-muCTLA-4/C7L - -mOX40L의 감염을 통한 B16-F10 흑색종 세포에서 mOX40L의 세포 표면 발현.
mOX40L이 E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 재조합 바이러스로 감염된 뮤린 B16-F10 세포의 표면에서 발현되는지 결정하기 위하여, B16-F10 세포를 E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4, E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L로 10의 MOI에서 감염시켰다. 세포 표면 mOX40L 발현은 감염 후 24시간에 항-mOX40L 항체를 사용하여 FACS에 의해 결정한다. 도 26에 도시된 바와 같이, E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-muCTLA-4/C7L--mOX40L 바이러스로 감염된 뮤린 B16-F10 세포에서 mOX40L 단백질이 풍부하게 세포 표면 발현된다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 특정 관심 유전자를 발현하는 능력을 가지고 있으며 원하는 생성물을 세포 및 세포 표면에 전달하는 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 46: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1 항체의 전신 전달과의 조합은 B16-F10 흑색종 편측 이식 모델에서 전체 반응 및 치료율을 현저히 증가시킨다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1의 전신 전달의 조합은 뮤린 B16-F10 흑색종 편측 이식 모델에서 우수한 항종양 효능을 입증했다. 간단하게, 5 x 105개의 B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 9일 후, 종양에 PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 일주일에 두 번 주사하였다. 항-PD-L1 항체는 마우스 당 250㎍으로 복강내 투여하였다 (도 27). 개별 마우스의 종양 부피를 측정하고 (도 28a-28c) 마우스의 전체 생존율을 모니터링하였다 (도 29a-29b). MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 생존을 향상시켰는데, 생존 중간값은 13일이었다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체의 조합은 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독과 비교하여 종양 근절에 있어 더 나은 항종양 효능을 보였는데, 마우스의 60%는 종양이 없고 처치 후에 생존하였다.
실시예 47: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1 항체의 전신 전달의 조합은 MC38 결장암 편측 이식 모델에서 전체 반응과 치료율을 크게 증가시킨다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1의 전신 전달의 조합은 MC38 결장암 편측 이식 모델에서 우수한 항종양 효능을 가졌다. 간단하게, 5 x 105개의 MC38 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 9일 후, 종양에 PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 일주일에 두 번 주사하였다. 항-PD-L1 항체는 마우스 당 250㎍으로 복강내 투여하였다 (도 30). 개별 마우스의 종양 부피를 측정하고 (도 31a-31c) 마우스의 전체 생존율을 모니터링하였다 (도 32a-32b). MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시켰는데, 생존 중간값은 28일로 연장되었다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 항-PD-L1 항체의 조합은 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독과 비교하여 종양 근절에 있어 더 나은 항종양 효능을 보였는데, 마우스 62.5%는 종양이 없고 처치 후에 생존하였다.
실시예 48: MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1 항체의 전신 전달의 조합은 MB49 방광암 편측 이식 모델에서 전체 반응과 치료율을 크게 증가시킨다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1의 전신 전달의 조합은 MB49 방광암 편측 이식 모델에서 우수한 항종양 효능을 가졌다. 간단하게, 2.5 x 105개의 MB49 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 8일 후, 종양에 PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 주 2회 주사하거나, 마우스에 항-PD-L1 항체를 주 2회 투여하였다. 항-PD-L1 항체는 마우스 당 250 ㎍으로 복강내 투여하였다 (도 33). 개별 마우스의 종양 부피를 측정하고 (도 34a-34d) 마우스의 전체 생존율을 모니터링하였다 (도 35a-35b). PBS로 처치한 마우스에서 종양이 빠르게 성장하여 조기 사망을 초래하였는데, 생존 중간값은 13일이었다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 PBS에 비해 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시켰는데, 생존 중간값이 23일로 연장되었다. 항-PD-L1 항체의 단독 IP 전달은 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 생존 중간값이 21.5일로 연장된 부분 반응을 보였지만 마우스는 종양을 거부할 수 없었다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체의 조합은 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독 또는 항-PD-L1 항체 단독과 비교하여 MB49 종양 근절에 더 효과적이며 생존 중간값이 43.5일로 연장되었다. 마우스의 50%는 종양이 없었으며 처치 후 생존하였다.
실시예 49: 자연적 유방암은 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1 항체 전신 전달의 조합 요법에 반응한다.
MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1 전신 전달의 조합은 자연적 유방암에서 우수한 항종양 효능을 가졌다. MMTV-PyMT 암컷은 92일의 평균 잠복기를 갖는 여러 개의 만질 수 있는 유방 종양이 발생하는데, 이는 일반적으로 자연적 종양 모델로 사용된다 (도 36). 첫 번째 종양이 만져진 후, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L을 오른쪽 옆구리 종양에 주사하고 항-PD-L1 항체를 마우스 당 250μg으로 복강내 투여하였다. 종양 크기는 일주일에 두 번 측정되었다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체 처치된 2마리 마우스의 종양을 채취하고, 항-CD45, CD3, CD8, CD4, CD103 및 CD69 항체를 사용한 표면 표지를 위하여 단일 세포 현탁액으로 처치하였다. 살아있는 종양 침윤성 T 세포는 FACS에 의해 분석되었다. 개별 마우스의 종양 부피를 측정하였다(도 37). PBS로 처치한 마우스는 여러 종양을 발생시켰고 종양은 빠르게 성장하였다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 종양내 주사는 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시켰다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체의 조합은 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 단독과 비교하여 종양 발생 및 성장 억제에 더 효과적이다. 종양 침윤 림프구의 FACS 분석은 T 세포가 PyMT 종양의 종양 미세환경에 풍부함을 보여주었다 (도 38). IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체 처치는 CD8+ T 세포에서 CD103+CD69+세포 집단의 비율을 더 높게 유도했으며 (도 39), 이는 활성화된 유사 기억 CD8+ T 세포를 나타낸다. IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 IP 항-PD-L1 항체 처치는 CD4+ T 세포에서 CD103+CD69+ 세포 집단의 비율을 더 높게 유도하지 않았으며 (도 40), MMTV-PyMT 종양 모델에서 조합 요법의 항종양 효과는 주로 CD8+ T 세포 활성화에 의존했음을 보여준다.
실시예 50: hFlt3L 또는 mOX40L을 과잉-발현하는 B16-F10 안정 세포주의 생성.
본 실시예는 hFlt3L 또는 mOX40L을 과잉발현하는 B16-F10 안정 세포주의 생성을 보여준다. 간단하게, B16-F10 세포를 hFlt3L 또는 mOX40L을 발현하는 레트로바이러스로 형질주입시켰다. 2 ㎍/mL 퓨로마이신에서 1주 동안 선별한 후, 세포를 채취하고 FACS를 통해 세포 표면에서의 hFlt3L (도 41a) 또는 mOX40L (도 41b) 발현을 검출하고 확인하였다.
실시예 51: hFlt3L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포는 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다.
hFlt3L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포(B16-F10-hFlt3L)는 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다. 간단하게, 5 x 105개의 B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하고 5 x 105 개의 B16-F10-hFlt3L 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 왼쪽 옆구리에 피내 이식하였다. 종양 이식 9일 후, PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L을 양 옆구리의 종양에 주 2회 종양내 주사하였다 (도 42). 개별 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리 종양 부피를 측정하였다 (도 43a-43d). 2차 주사 2일 후에 종양을 채취하고 종양 침윤 림프구를 FACS로 분석하였다 (도 44a-44e 및 45a-45e). PBS로 처치된 B16-F10 및 B16-F10-hFlt3L 종양은 유사한 성장률을 가졌다. MVA△C7L로 처치된 마우스에서, B16-F10-hFlt3L 종양 성장은 B16-F10 종양과 비교하여 현저하게 억제되었다. MVA△C7L의 종양내 주사는 B16-F10 및 B16-F10-hFlt3L 둘 다에서 PBS 그룹과 비교하여 CD8+ T 세포의 비율을 높이고 (도 44a 및 45a) CD4+ T 세포 (도 44c 및 45c) 및 CD4+FoxP3+ T 세포 (도 44e 및 45e)를 감소시켰다. IT MVA△C7L은 B16-F10-hFlt3L 종양에서 더 많은 CD8+그랜자임B+ (도 44b 및 45b) 및 CD4+그랜자임B+ T 세포 (도 44d 및 45d)를 유도하였다. 이러한 결과는 hFlt3L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포가 향상된 T 세포 활성화와 함께 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다는 것을 보여준다.
실시예 52: mOX40L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포는 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다.
mOX40L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포(B16-F10-OX40L)는 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다. 간단하게, 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하고 5 x 105 B16-F10-OX40L 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 왼쪽 옆구리에 피내 이식하였다. 종양 이식 9일 후, PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L을 양 옆구리의 종양에 주 2 회 종양내 주사하였다 (도 46). 개별 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리 종양 부피를 주 2회 측정하였다 (도 47a-47d). 2차 주사 2일 후에 종양을 채취하고 종양 침윤 림프구를 FACS로 분석 하였다 (도 48a-48e 및 49a-49e). B16-F10-OX40L 종양은 PBS 처치군에서도 B16-F10 종양보다 느리게 성장하였다 (도 47a 및 47c). MVA△C7L가 종양내 처치된 마우스에서, B16-F10 종양 성장이 지연되었고 (도 47b) B16-F10-OX40L 종양 성장이 상당히 억제되었다 (도 47d). MVA△C7L의 종양내 주사는 PBS 처치군과 비교하여 B16-F10 종양에서 더 활성화 된 CD8+ (도 48a 및 49a) 및 CD4+ T 세포 (도 48c 및 49c)를 생성하였다. 놀랍게도, B16-F10-OX40L 종양에 침윤하는 99%~100% CD8+ 및 CD4+ T 세포는 그랜자임B+였다 (도 48b 및 48d; 49b 및 49d). 더 많은 CD4+FoxP3+ T 세포가 B16-F10 종양보다 B16-F10-OX40L 종양에 침윤했지만 IT MVA△C7L은 전체 CD4+ T 세포 중 평균 60%에서 15%까지 효율적으로 이들 세포를 고갈시켰다 (도 48e 및 49e). 이러한 결과는 OX40L을 과잉발현하는 B16-F10 흑색종 세포가 MVA△C7L의 종양내 전달에 더 반응한다는 것을 보여준다. OX40L은 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화에 중요한 역할을 한다. IT MVA△C7L은 종양 미세환경에서 CD4+FoxP3+ T 세포를 고갈시킬 수 있다.
실시예 53: FTY720 처치는 B16-F10 흑색종 편측 이식 모델에서 지연된 종양 성장 및 연장된 생존으로 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 항종양 효능을 향상시킨다.
IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 처치에서 림프절 T 세포 프라이밍 및 활성화가 종양 근절에 중요한지 여부를 결정하기 위하여, B16-F10 흑색종 이식 모델에서 FTY720 (도 50b)을 사용하여 림프 기관에서 나오는 T 세포를 차단하였다. 간단하게, 5 x 105 개의 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다. 종양 이식 9일 후, PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L을 종양내로 2회 주사하였다. 첫 번째 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L 주사 1일 전부터 시작하여, 50% 에탄올에서 마우스 당 25 ㎍의 FTY720을 치료 동안 매일 복강내로 투여하였다 (도 51). 종양 크기를 측정하고 (도 52a-d; 53a 및 53b) 생존을 모니터링하였다 (도 53c 및 53d). 도 50a는 FTY720의 면역 조절 기능의 메커니즘을 보여주는 개략도다. FTY720 처치 후 T 세포는 림프절에 갇힌다. PBS로 처치된 마우스에서 종양은 빠르게 성장하고 FTY720의 영향을 받지 않았다 (도 52a 및 52c). IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L 단독은 종양 성장을 지연시켰다 (도 52b). FTY720은 지연된 종양 성장 (도 52d) 및 개선된 생존 (도 53d)으로 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L의 항종양 효과를 향상시켰다. 이러한 결과는 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-muOX40L 처치에서, 종양 발달 중에 종양내에 축적된 T 세포가 종양 근절에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
실시예 54: 백시니아 E5는 폭스바이러스 패밀리 내에서 고도로 보존된다.
백시니아 E5는 aa 112-222 및 aa 233-328의 C-말단에 2개의 BEN 도메인을 포함하는 341개 아미노산 폴리펩티드이다 (도 54a). BEN은 BANP/SMAR1, 폭스바이러스 E5R 및 NAC1에 존재함을 바탕으로 명명되었다. BEN 도메인 함유 단백질은 염색질 조직, 전사 조절 및 아마도 바이러스 DNA 조직에 포함된다. E5는 폭스바이러스 패밀리 멤버 사이에서 고도로 보존되어 있다. 레포리폭스 속에 속하는 점액종 바이러스의 E5 올소로그는, 인간에서 천연두, 사지부전증(마우스두), 우두 및 원두를 유발하는 바리올라 바이러스를 포함하여, 다른 모든 폭스바이러스 패밀리 멤버 중에서 가장 다양하다 (도 54b).
실시예 55: 백시니아 E5는 독성 인자이다.
백시니아 E5가 독성 인자인지 여부를 시험하기 위하여, 인접 유전자 E4L 및 E6R에서 상동 재조합을 통해 재조합 VACV△E5R 바이러스를 생성하였다. E5R 유전자는 p7.5 프로모터 제어 하의 mCherry를 코딩하는 유전자로 대체되었다 (도 55a). 2 x 106 pfu에서 야생형 백시니아(WT VACV), 및 2 x 107 pfu 또는 2 x 106 pfu에서 E5가 결실된 백시니아 바이러스(VACV△E5R)를 사용한 비강내 감염 실험은 6-8 주령 C57BL/6J 암컷 마우스를 사용하여 수행되었다. WT VACV에 감염된 모든 마우스는 감염 둘째 날부터 빠르게 체중이 감소하였다. 모든 마우스는 감염 후 7 내지 8 일에 30% 이상의 체중 감소로 인해 죽거나 안락사되었다 (도 55b 및 55c). 대조적으로, 2 x 107 pfu 또는 2 x 106 pfu의 VACV△E5R에 감염된 마우스는 감염 후 5일 및 6일에 각각 평균 초기 체중의 15% 또는 20% 가까이 감소한 다음 체중이 증가했으며, 감염으로부터 회복되었다 (도 55b 및 55c). 이러한 결과는 VACVE5R이 WT VACV와 비교하여 크게 약화되고 E5가 독성 인자임을 보여준다.
실시예 56: VACV△E5R은 MVA와 비교하여 골수-유래된 수지상 세포(BMDC)로부터 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
BMDC의 WT VACV 감염은 I형 IFN을 유도하지 못하는 반면, MVA 감염은 유도할 수 있다 (Dai et al. PLoS Pathogens (2014)). VACV에서 E5R의 결실이 감염된 BMDC에서 IFNB를 유도하는 능력을 얻었는지 여부를 조사하였다. C57BL/6J의 골수 세포는 GM-CSF의 존재 하에 배양되었다. BMDC는 10의 MOI에서 MVA, VACV 또는 VACV△E5R로 감염되었다. 세포는 감염 후 6시간에 수집되었다. RNA를 추출하고 RT-PCR을 수행하였다. 감염 후 21시간에 상청액을 수집하고 ELISA로 IFN-β 수준을 측정하였다. RT-PCR 결과는 미처치 대조군(NT)과 비교하여 BMDC의 WT VACV 감염이 29배의 IFNB 유전자 발현을 유도하고, MVA 감염은 387배를 유도하였으며 VACV△E5R은 1316 배를 유도하였음을 나타냈다 (도 56a). ELISA 결과는 BMDC의 VACV 감염이 BMDC에서 IFN-β 분비를 유도하지 못했음을 보여주었다. 그러나 MVA 또는 VACV△E5R에 감염된 BMDC의 상청액에서 IFN-β 수준은 각각 375.5 pg/ml 및 660 pg/ml였다 (도 56b). 이러한 결과는 VACV△E5R이 MVA와 비교하여 BMDC에서 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 단백질 분비를 유도함을 보여준다.
실시예 57: MVA△E5R은 MVA와 비교하여 BMDC 및 BMDM에서 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한다.
MVA 게놈에서 E5의 결실이 IFNB 유전자 유도를 유도하는 능력을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, 측면 유전자 E4L 및 E6R에서 상동 재조합을 통해 재조합 MVA△E5R을 생성하였으며, 이는 E5R 유전자를 p7.5 프로모터 제어 하의 mCherry를 코딩하는 유전자로 대체하는 결과를 초래했다 (도 57a). 재조합 MVA△K7R 또한 인접 유전자 K5,6L 및 F1L에서 상동 재조합을 통해 생성되었으며, 이는 또한 K7R 유전자를 p7.5 프로모터 제어 하의 mCherry를 코딩하는 유전자로 대체하는 결과를 초래했다 (도 57b).
BMDC 또는 BMDM은 각각 GM-CSF 또는 M-CSF의 존재 하에 골수 세포를 배양함으로써 생성되었다. BMDC 및 BMDM은 10의 MOI에서 MVA, MVA△E5R 또는 MVA△K7R로 감염되었다. 감염 후 6시간에 세포를 수집하였다. RT-PCR은 BMDC의 MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA 감염이 "블랭크" 대조군과 비교하여 IFNB 유전자를 각각 2452배, 22배 또는 12배 유도한 것으로 나타났다 (도 57c). BMDM에서, MVA△E5R, MVA△K7R 또는 MVA 감염은 "블랭크" 대조군과 비교하여 IFNB 유전자 발현의 4510배, 35배 또는 4배 유도를 초래하였다 (도 57d). 이러한 결과는 E5가 BMDC 및 BMDM에서 IFNB 유전자 유도의 지배적인 억제제이며, MVA 게놈에서 E5의 결실이 IFNB의 극적인 유도로 이어진다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 K7이 BMDC 및 BMDM에서 IFNB 유전자 유도의 억제제임을 보여준다.
실시예 58: MVA△E5R은 MVA와 비교하여 BMDC에서 더 높은 수준의 IFNA, CCL4 및 CCL5 유전자 발현을 유도한다.
BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 감염 후 6시간에 세포를 수집하였다. RT-PCR 분석은 MVA△E5R이 MVA와 비교하여 훨씬 더 높은 수준의 IFNA(도 58a), CCL4(도 58b) 및 CCL5(도 58c) 유전자 발현을 유도함을 보여주었다. 이러한 결과는 MVA△E5R 감염이 I형 IFN 및 케모카인의 유도를 유발하여 면역 세포를 감염 부위로 모집시키는 것을 촉진한다는 것을 시사한다.
실시예 59: MVA△E5R은 열-불활성화 MVAE5R(열-iMVA△E5R)와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한다.
열-불활성화 MVA는 살아있는 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 I형 IFN 및 전 염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도한다 (Dai et al. Science Immunology (2017)). MVA△E5R에 감염된 BMDC 대 열-iMVA△E5R에 감염된 BMDC에 의한 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 분비 유도를 비교 조사하였다. 간단하게, BMDC는 MOI 0.25, 1, 3 또는 10에서 MVA△E5R 또는 열-iMVA△E5R로 감염되었다. 1시간 감염 후 세포를 세척하고 새로운 배지를 추가하였다. 세포 및 상청액은 감염 후 14시간 에 수집하였다. IFNB 및 E3 유전자 발현은 RT-PCR을 통해 결정하였다. 상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA를 통해 결정하였다. RT-PCR 결과는 MVA△E5R이 용량 의존적으로 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 분비를 유도하고, 열-iMVA△E5R와 비교하여 훨씬 많이 유도하였음을 보여준다. MOI 3 또는 10에서 MVA△E5R은 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비 유도의 최대 수준을 나타냈다 (도 59a 및 59c). MVA△E5R은 백시니아 E3 유전자를 발현한 반면, 열-불활성화 된 MVA△E5R은 예상대로 발현하지 못하였다(도 59b).
실시예 60: MVA△E5R-유도된 IFNA 및 IFNB 유전자 발현 및 BMDC로부터의 IFN-b 단백질 분비는 세포질 DNA 센서 cGAS를 필요로 한다.
BMDC의 MVA△E5R 감염은 살아있는 MVA, 열-불활성화 MVA 또는 열-불활성화 MVA△E5R와 비교하여 높은 수준의 IFNA 및 IFNB 유전자 유도 및 IFN-β 단백질 분비를 유도하였다. MVA△E5R 유도 IFN 유전자 발현 및 단백질 분비에 cGAS가 필요한지 여부를 확인하기 위하여, WT 및 cGAS-/- 마우스로부터 BMDC를 생성하고, 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 감염 후 6시간 째에 세포를 수집하였다. RT-PCR 분석은 MVA△E5R-유도된 IFNB (도 60a) 및 IFNA (도 60b) 유전자 발현이 cGAS에 의존하는 반면, MVA 및 MVA△E5R 모두 WT 또는 cGAS-/- 세포에서 E3L 유전자를 발현함을 보여주었다 (도 60c). WT 및 cGAS-/- 마우스의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R으로 감염시켰고, 감염 후 8시간 및 16시간에 상청액을 수집하였다. 상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA로 측정하였다. MVAE5R-은 감염 후 8시간에 MVA, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R과 비교하여 WT BMDC에서 더 높은 수준의 IFN-β 분비를 유도하였다. 감염 후 16시간에, MVA△E5R에 감염된 WT BMDC의 상청액의 IFN-β 수준은, 감염 후 8 시간에 수집된 상청액에서보다도 더 높아졌다 (도 60d). MVA△E5R에 감염된 BMDC에 의한 IFN-β 분비 유도는 cGAS에 완전히 의존적이었다 (도 60d).
실시예 61: MVA△E5R-유도된 IFNB 유전자 발현 및 BMDC 및 BMDMS로부터의 IFN-b 단백질 분비는 STING을 필요로 한다.
STING은 세포질 DNA-감지 경로에 중요한 소포체(ER)-국부 단백질이다. DNA 결합시 cGAS가 활성화되어 ATP 및 GTP에서 2차 전달자 사이클릭 GMP-AMP(cGAMP)를 생성한다. cGAMP는 STING에 결합하고, 이어서 STING을 활성화하여 전사 인자 IRF3를 활성화하며 IFNB 유전자를 유도한다. MVA△E5R-유도된 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비가 STING을 필요로 하는지 여부를 시험하기 위하여, 기능성 STING 단백질이 없는 연령 일치 WT 및 STINGGt/Gt 마우스에서 BMDC 및 BMDM를 생성하였다. MVA△E5R 및 열-iMVA△E5R은 WT BMDC에서 IFNB 유전자 발현을 유도하였지만 STINGGt/Gt 세포에서는 유도하지 않았다(도 61a). 유사하게, MVA△E5R은 WT BMDM에서 IFN-β 단백질 분비를 유도하였지만 STINGGt/Gt 세포에서는 유도하지 않았다 (도 61b).
실시예 62: BMDC의 MVA△E5R-유도된 IFN-β 단백질 분비는 IRF3, IRF7 및 IFNAR1을 필요로 한다.
전사 인자 IRF3 및 IRF7은 IFNB 유전자 발현의 유도에 중요하다. 일단 분비된 I형 IFN은 IFNAR에 결합하여 JAK/STAT 경로를 활성화하고 IFN-자극 유전자(ISG)를 유도한다. IRF3, IRF7 및 IFNAR1이 BMDC 및 BMDM에서 IFN-β 단백질 분비를 유도하는데 필요한지 여부를 확인하기 위하여, WT 및 IRF3-/- 마우스의 BMDC 및 BMDM을 MVA, MVA△E5R, 열-iMVA, 또는 열-iMVA△E5R로 감염시켰다. 상청액은 감염 후 8시간 및 16시간에 수집하였다. 상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA에 의해 확인하였다. IRF3-/- BMDC에서 MVA△E5R-유도된 IFN-β 분비는, 8시간 및 16시간에서 각각 96% 및 94% 감소했다 (도 62a). 또한, IRF3-/- BMDC에서 MVA△E5R-유도된 IFN-β 분비는 8시간 및 16시간에서 각각 63% 및 75% 감소했다 (도 62b).
WT 및 IRF7-/-마우스로부터의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA△E5R로 감염시키거나 모의 대조군으로 처치하였다. 감염 후 16시간에 상청액을 수집하였다. 상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA를 통해 확인하였다. MVA△E5R-유도된 IFN-β 분비는 IRF7-/-BMDC에서 89%까지 감소하였다 (도 62c).
WT, cGAS-/-또는 IFNAR1-/- 마우스로부터의 BMDC를 MVA, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R로 감염시켰다. 감염 후 16시간에 상청액을 수집하였다. 상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA를 통해 확인하였다. MVA△E5R-유도된 IFN-β 분비는 cGAS-/- BMDC에서 사라졌고 IFNAR1-/- BMDC에서 79% 감소했다 (도 62d).
종합하면, 이들 결과는 IRF3/IRF7/IFNAR1이 BMDC에 의한 IFN-β 생산 유도에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
실시예 63: WT VACV-유도된 cGAS 분해(degradation)는 프로테아좀 의존적 경로를 통해 매개된다.
WT VACV 감염이 뮤린 배아 섬유아세포(MEF) 및 BMDC에서 cGAS의 분해를 유발하는 것으로 확인되었다. VACV-유도된 cGAS 분해 메커니즘을 확인하기 위하여, 사이클로헥시미드(CHX); 프로테아좀 억제제, MG132; 팬 카스파아제 억제제, Z-VAD; 또는 AKT1/2 억제제 VIII로 MEF를 30분간 전처치하였다. MEF는 각 약물의 존재 하에 WT VACV로 감염되었다. 세포는 감염 후 6시간에 수집되었다. 웨스턴 블롯 분석은 MG132의 존재 하에, WT VACV- 유도 cGAS 분해가 차단되었음을 보여주었다 (도 63a). 대조군으로서, DMSO 또는 MG132를 사용한 MEF의 처치는 cGAS 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 63b). 백시니아 E5가 WT VACV 매개 cGAS 분해의 원인인지 여부를 시험하기 위하여, BMDC를 MG132의 존재 또는 부재 하에 WT VACV 또는 VACV△E5R에 감염시켰다 (도 63c). BMDC의 WT VACV 감염으로 인해 cGAS가 분해되는 반면 VACV△E5R 감염은 그렇지 않았다. 또한, WT VACV로 인한 cGAS 분해는 MG132의 존재 하에서 차단되었다. 이러한 결과는 백시니아 바이러스의 E5가 WT VACV-유도된 cGAS 분해에 책임이 있다는 것을 추가로 뒷받침한다.
실시예 64: MVA의 E5R 유전자는 BMDC에서 cGAS 분해(degradation)를 매개하는데 중요하다.
MVA의 E5R 유전자가 백시니아 E5R 유전자와 유사한 역할을 하는지를 시험하기 위하여, BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 세포는 감염 후 2, 4, 6, 8 및 12시간에 수집되었다. 감염이 없는 cGAS-/- BMDC 샘플 또한 포함되었다. 웨스턴 블롯 분석은 MVA에 의한 BMDC의 감염 또한 cGAS의 급속한 분해를 유발하는 반면, MVA△E5R에 의한 감염은 훨씬 적은 cGAS 분해를 초래한다는 것을 보여주었다 (도 64). 이러한 결과는 MVA의 E5R 유전자가 cGAS 분해에도 책임이 있음을 보여준다.
실시예 65: MVA△E5R은 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 인산화된 Stat2를 유도한다.
BMDC의 MVA△E5R 감염이 더 강한 IFNR 다운스트림 시그널링을 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 세포는 감염 후 2, 4, 6, 8 및 12시간에 수집하였다. 항-포스포-STAT2, 항-STAT2 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 65). 결과는 MVA△E5R이 MVA와 비교하여, 특히 감염 후 4시간 및 6시간에, 더 높은 수준의 p-STAT2를 유도한다는 것을 보여준다. STAT2는 유도 IFN- 자극 유전자의 중요한 전사 인자다. 인산화된 STAT2는 세포질에서 핵으로 이동하여 IFN-민감성 반응 요소(ISRE)에 결합하여 ISG 발현을 유도한다. 이러한 결과는 MVA△E5R 감염이 MVA와 비교하여, p-STAT2를 통해 수백 개의 ISG를 더 강력하게 유도할 수 있음을 보여준다. 일부 ISG는 중요한 사이토카인 및 케모카인으로, T 세포 활성화 및 감염 부위에 대한 다른 면역 세포의 동원에 중요하다.
실시예 66: MVA△E5R은 감염된 BMDC에서 높은 수준의 cGAMP 생산을 유도한다.
DNA 결합시 cGAS가 활성화되고, ATP와 GTP를 2차 전달자 역할을 하는 사이클릭 GMP-AMP(cGAMP)로 전환하여, STING/TBK1/IRF3 축의 활성화 및 I형 IFN 유도가 초래된다. MVA△E5R이 더 높은 수준의 cGAMP 생산을 유도하는지 확인하기 위하여, 2.5 x 106 BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 감염 후 2, 4, 6 및 8시간에 세포를 수집하였다. cGAMP 농도는 2개의 유도성 리포터 구축물의 안정적인 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 유래된, 투과성 분화 THP1-Dual?? 세포와 함께 세포 용해물을 배양함으로써 측정되었다 (도 66). 상청액을 24 시간에 수집하고,(IRF 경로 활성화에 대한 지표로서) 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. cGAMP 수준은 cGAMP 표준과 비교하여 계산되었다. MVA△E5R은 감염 후 6시간에 400 ng/107세포 및 8시간에 900ng/107 세포에 가깝게 유도하였다. 대조적으로, MVA-유도된 cGAMP 수준은 질량 분석법보다 덜 민감한, 본 방법으로는 검출할 수 없었다. MVA△E5R 감염의 첫 8시간 동안 생성된 cGAMP 수준의 증가를 감안할 때, E5 단백질은 cGAS에 의한 모 바이러스 DNA 인식을 방지할 뿐만 아니라, cGAS에 의한 자손 바이러스 DNA 검출도 방지한다는 것이 타당하다. E5는 바이러스 DNA 복제가 일어나는 바이로좀/바이러스 공장에 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 E5가 cGAS에 의한 cGAMP 생산을 억제함을 보여준다.
실시예 67: MVA△E5R은 형질세포양 수지상 세포(pDC)로부터 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
pDC는 강력한 I형 IFN 생산 세포이다. pDC의 MVA△E5R 감염이 I형 IFN 생산을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, 비장세포에서 분류된 1.2 x 105 pDC(B220+PDCA-1+)를 MVA, 열-iMVA 또는 MVA△E5R에 감염시켰다. 감염되지 않은 비장세포는 대조군으로 포함되었다. 상청액은 감염 후 18시간에 수집되었다. ELISA로 상청액의 IFN-β 수준을 측정하였다. MVA△E5R은 MVA 및 열-iMVA와 비교하여 비장 pDC에서 더 높은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도하였다 (도 67a); MVA△E5R에 감염된 비장 pDC의 상청액에서 517.5 pg/ml, MVA에 감염된 비장 pDC의 상청액에서 43.5 pg/ml, 열-iMVA에 감염된 비장 pDC의 상청액에서 220 pg/ml이었다 (도 67a).
실시예 68: pDC로부터의 MVA△E5R-유도된 IFN-β 단백질 분비는 cGAS에 의존한다.
pDC는 일반적으로 엔도솜-국부적인 TLR7 및 TLR9를 사용하여 엔도솜 RNA 및 DNA를 검출하여 강력한 I형 IFN 반응을 유도한다. MyD88은 TLR7 및 TLR9 모두를 위한 어댑터이다. 최근에는 cGAS가 pDC에서 세포질 DNA를 검출하는데도 중요하다는 사실이 밝혀졌다. cGAS 또는 MyD88 경로가 MVA△E5R-유도된 I형 IFN 생산에 중요한지 여부를 시험하기 위하여, WT, cGAS-/- 또는 MyD88-/- 마우스에서 얻은 Flt3L-배양 BMDC (B220+PDCA-1+)에서 pDC를 분류하였다. 2 x 105 세포는 MVA 또는 MVA△E5R로 감염되었다. 미처치(NT) 대조군이 포함되었다. 상청액은 감염 후 18시간에 수집되었다. ELISA로 상청액의 IFN-β 수준을 측정하였다. 결과는 MVA△E5R로 유도된 IFN-β 생산이 cGAS-/- Flt3L-pDC에서 사라지고 MyD88-/- Flt3L-pDC에서 크게 변하지 않았음을 보여준다 (도 68).
실시예 69: CD103 + DC에서 MVA△E5R-유도된 IFN-β 단백질 분비는 cGAS에 의존한다.
CD103+ DC는 항원의 교차제시에 중요한 통상적인 DC의 서브셋이다. 전사 인자 Batf3는 CD103+ DC의 개발에 중요하다. CD103+ DC는 종양 항원을 교차제시하는데 중요하며 항종양 면역을 시작한다. MVA△E5R이 분류된 Flt3L-CD103+ DC에서 IFN-β 단백질 분비를 유도하는지 여부와 cGAS 또는 MyD88이 유도에 중요한지 여부를 시험하기 위하여, CD103+ DC를 WT, cGAS-/- 또는 MyD88-/- 마우스에서 얻은 Flt3L-배양 BMDC(CD11c+CD103+) 으로부터 분류하였다. 2 x 105 세포는 MVA 또는 MVA△E5R로 감염되었다. NT 대조군이 포함되었다. 상청액은 감염 후 18시간에 수집되었다. ELISA로 상청액의 IFN-β 수준을 측정하였다. 결과는 MVA△E5R이 분류된 Flt3L-CD103+ DC에서 IFN-β 단백질 분비를 강력하게 유도한다는 것을 보여준다. MVA△E5R-감염 CD103+DC의 상청액에서 IFN-β 농도는 3610 pg/ml 인 반면, MVA-감염 CD103+DC의 상청액의 IFN-β 농도는 365.5 pg/ml였다(도 69). 더 나아가, MVA△E5R에 의한 분류된 Flt3L-CD103+ DC에서 IFN-β 단백질 분비 유도는 cGAS에 전적으로 의존하고, 유도 효과를 위하여 MyD88이 필요하지 않다 (도 69).
실시예 70: BMDC의 MVA△E5R 감염은 MVA와 비교하여 낮은 수준의 세포 사멸을 초래한다.
MVA-감염 BMDC와 비교하여 정규 배지로 며칠간 배양한 후 살아남은 MVA△E5R-감염 BMDC의 일부를 정량화하기 위하여, BMDC를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 세포를 감염 후 16시간에 채취하고 LIVE/DEAD 고정 가능한 생존력 염료로 염색하였으며 유세포 분석을 실시하였다. FACS 결과는 PBS-모의 감염된 BMDC의 76.4%가 살아있는 반면, MVA로 감염된 BMDC의 10.5%만이 살아있었음을 보여준다. 대조적으로, MVA△E5R로 감염된 BMDC의 66.7%는 감염 후 16시간에 살아있었다(도 70).
실시예 71: MVA△E5R 감염은 cGAS 의존 방식으로 DC 성숙을 촉진한다.
MVA△E5R에 감염된 BMDC는 수상돌기의 연장과 함께 활성화된 표현형을 나타내는 것으로 알려져 있다. CD40 및 CD86은 두 가지의 알려진 DC 활성화 마커이다. MVA△E5R 감염이 DC 활성화를 유도하는지 여부와, DC 성숙이 cGAS-의존 매커니즘을 통해 발생하는지 여부를 확인하기 위하여, WT 및 cGAS-/- 마우스의 BMDC를 10의 MOI에서 MVA-OVA 또는 MVA△E5R-OVA로 감염 또는 모의 감염시켰다. 세포를 감염 후 16시간에 수집하고 DC 성숙 마커에 대해 염색하였다: CD40 (도 71a) 및 CD86 (도 71b). BMDC는 높은 수준의 MHCII를 발현한다. MVA△E5R-OVA 감염 시, CD40은 WT BMDC에서 상향 조절되었지만 cGAS-/- BMDC에서는 상향 조절되지 않았다 (도 71a). BMDC의 MVA△E5R-OVA 감염은 WT BMDC에서 CD86 발현을 강력하게 상향 조절했지만, cGAS-/- BMDC에서는 그렇지 않았다. WT BMDC의 89.2%는 MVA△E5R 감염 후 CD86+였던 반면, cGAS-/- BMDC의 16.5%만이 MVA△E5R 감염 후 CD86+였다. WT BMDC에서 MVA 감염은 50.2% CD86+ BMDC를 초래했지만 CD86+ cGAS-/- BMDC는 16.3%에 불과했다 (도 71b). 이러한 결과는 BMDC의 MVA△E5R 감염이 cGAS-의존 방식으로 CD40 및 CD86을 포함한 성숙 마커의 상향 조절로 나타나는 DC 성숙을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 72: BMDC의 MVA△E5R 감염은 T 세포 활성화에 의해 측정되는 항원 교차제시를 촉진한다.
MVA, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R에 의해 유도된 BMDC 활성화의 기능적 중요성을 시험하기 위하여, BMDC를 MVA, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R로 3시간 동안 3의 MOI에서 감염시켰으며 뒤이어 닭 오브알부민(OVA)과 함께 3시간 동안 항온처리 하였다. OVA 단백질을 세척하고 세포를 OT-I 세포(OVA257-264 SIINFEKL 펩티드를 인식함)와 함께 3 일 동안 항온처리 하였다. BMDC:OT-1 세포 비율은 1:1이었다. OT-1 세포를 항-CD69 및 항-CD8 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 점 도표는 CD69를 발현하는 CD8+ 세포를 나타낸다 (도 72a-72g). 결과는 MVA△E5R-감염 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양으로 65.7% CD69+ CD8+ T 세포가 생성되는 반면, MVA-감염 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양은 10.1% CD69+CD8+ T 세포의 결과를 초래함을 보여준다. BMDC의 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R 감염은 또한 OVA-펄스 BMDC : OT-1 T 세포 공동배양에서 OT-1 T 세포의 활성화를 초래하였다. 이러한 결과는 BMDC의 MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R 감염이 BMDC에 의한 항원 교차제시를 촉진한다는 것을 보여준다.
실시예 73: BMDC의 MVA△E5R 감염은 활성화된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산에 의해 측정되는 항원 교차제시를 촉진한다.
실시예 72에 개략된 실험에서 3 일의 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양이 끝날 때 상청액을 수집하였다. 상청액의 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 확인하였다. 결과는 MVAE5R 또는 열-iMVA△E5R-감염 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양이 상청액에서 높은 수준의 IFN-γ 단백질을 생성했음을 보여준다 (도 73). 이러한 결과는 BMDC의 MVA△E5R 또는 열-iMVA△E5R 감염이 BMDC에 의한 항원 교차제시를 촉진함을 보여준다.
실시예 74: BMDC의 VACV△E5R 감염은 활성화 된 T 세포에 의한 IFN-γ 생산에 의해 측정되는 항원 교차제시를 촉진한다.
BMDC의 VACV△E5R 감염이 MVA보다 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 생산을 유도한다는 것이 앞서 관찰되었다 (도 56a 및 56b). BMDC의 VACV△E5R 감염이 항원 교차제시를 촉진하는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다음 실험을 수행하였다. 간단하게, BMDC를 3시간 동안 3의 MOI에서 MVA, MVA△E5R 또는 VACV△E5R에 감염시켰다; 또는 BMDC를 cGAMP(20 μM) 또는 모의 대조군과 함께 3시간 동안 항온처리 하였다. 이어서 BMDC를 OVA와 함께 3시간 동안 항온처리한 다음 OVA 단백질을 세척하였다. 그 후 세포를 OT-I 세포(OVA257-264 SIINFEKL 펩티드를 인식함)와 함께 3 일 동안 항온처리 하였다. 상청액을 수집하고 IFN-γ 수준을 ELISA에 의해 확인하였다 (도 74). 결과는 MVA△E5R-감염된 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양이 상청액에서 가장 높은 수준의 IFN-γ를 생성했음을 보여준다. VACV△E5R에 감염된 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양은 cGAMP-처치 OVA-펄스 BMDC:OT-1 T 세포 공동배양과 비교하여 더 높은 수준의 IFN-γ를 분비하였다. 이러한 결과는 BMDC의 VACV△E5R 감염이 항원 교차제시를 촉진한다는 것을 보여준다.
실시예 75: MVA 게놈에서의 E5R 유전자 결실은 백신접종 효능을 향상시킨다.
MVA는 중요하고 안전한 백신 벡터이다. MVA가 BMDC에서 IFN-β 분비를 적당히 유도하고 DC 성숙에 대한 활성화 효과가 적당하다는 점을 감안할 때, 면역억제 매커니즘의 식별은 MVA- 기반 백신 벡터 설계를 개선할 수 있다. 본 발명자들은 MVA에서 E5R 유전자의 결실이 백신접종 효능을 향상시키는지 시험하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 간단하게, 0 일차에, C57BL/6J 마우스를 피부 난절 또는 피내 주사를 통해 2 x 107 pfu에서 MVA-OVA 또는 MVA△E5R-OVA로 백신접종하였다 (도 75a). 1 주일 후에 안락사 된 마우스로부터 비장을 채취하고 12시간 동안 OVA257-264 (SIINFEKL) 펩티드 (10 ㎍/mL) 펄스 BMDC와 공동배양하였다. CD8+ T 세포의 세포 내 IFN-γ 수준은 유세포 분석으로 측정되었다(* p<0.05; ** p<0.01). 도 75b는 MVA-OVA 또는 MVA△E5R-OVA를 사용한 피부 난절을 통한 백신접종 후 활성화된 CD8+ T 세포를 보여준다. 도 75c는 MVA-OVA 또는 MVA△E5R-OVA의 피내 주사를 통한 백신접종 후 활성화된 CD8+ T 세포를 보여준다. 이러한 결과는 피부 난절 또는 피내 주사를 통한 MVA△E5R-OVA 백신접종이 MVA-OVA 백신접종과 비교하여 더 높은 활성화된 CD8+ T 세포를 유도한다는 것을 보여준다. 따라서 MVA 게놈에서 E5R 유전자를 제거하면 백신접종 효과가 향상된다.
실시예 76: MVA△E5R 감염은 cGAS-의존 방식으로 뮤린 원발성 섬유아세포로부터 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 분비를 유도한다.
본 발명자들은 수지상 세포 및 대식세포 외에도, 피부 진피 섬유아세포의 MVA△E5R 감염 또한 I형 IFN 생성을 유도하는지 여부를 조사하였다. 암컷 WT 및 cGAS-/- C57BL/6J 마우스로부터 피부 진피 섬유아세포를 생성하였다. 세포는 MVA, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 열-iMVA△E5R로 감염되었다. 세포 및 상청액은 감염 후 16시간에 수집되었다. RT-PCR 결과는 MVA△E5R 감염이 WT 진피 섬유아세포에서 IFNB 유전자 발현을 유발하였지만 cGAS-/- 세포에서는 그렇지 않음을 보여주었다 (도 76a). ELISA 결과는 MVA△E5R-감염 WT 진피 섬유아세포에서 MVAE5R이 IFN-β 단백질 분비를 유도했지만 감염된 cGAS-/- 세포에서는 분비되지 않음을 보여주었다 (도 76b). 대조적으로, WT의 MVA 감염은 WT 진피 섬유아세포로부터 낮은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도하였다 (도 76b). MVA-감염 WT 진피 섬유 아세포의 상청액에서 IFN-β 단백질 농도는 MVA△E5R-감염 WT 진피 섬유아세포의 상청액에서의 10970 pg/ml과 비교하여 350 pg/ml였다. 이러한 결과는 E5가 MVA-감염 진피 섬유 아세포에서 IFN 생성의 강력한 억제제이고, MVA△E5R이 피부 진피 섬유아세포에 강력한 면역 활성화 효과를 생성한다는 것을 보여준다. 이러한 면역 활성화 효과는 피부 난절이나 피내 감염을 통해 백신의 효능 향상에 기여할 가능성이 높다. 또한, MVA△E5R은 유사한 매커니즘을 통해 종양 간질 세포 또는 암 관련 섬유아세포를 활성화할 가능성이 있으며, 이는 종양 면역억제 미세환경을 변경하는 데 기여할 것이다.
실시예 77: MVA△E5R은 cGAS- 또는 IFNAR1-결여 피부 원발성 진피 섬유아세포에서 DNA를 복제하는 능력을 얻는다.
cGAS 또는 IFNAR1이 피부 진피 섬유아세포에서 MVA 또는 MVA△E5R 바이러스의 숙주 제한에 기여하는지 여부를 시험하기 위하여, WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 마우스로부터의 피부 원발성 진피 섬유아세포를 MVA 또는 MVA△E5R로 3의 MOI에서 감염시켰다. 세포를 감염 후 1, 4, 10 및 24시간에 수집하였다. 바이러스 DNA 복제 수는 정량적 PCR에 의해 확인되었다. MVA는 WT 진피 섬유아세포에서 바이러스 게놈을 복제하는 능력이 제한적이지만, 복제 능력은 cGAS-/- 세포에서 극적으로 증가하고 IFNAR1-/- 세포에서 적당히 증가하였다 (도 77a 및 77b). 예를 들어, MVA DNA 복제 수는 WT 진피 섬유아세포에서 감염 후 1시간과 비교하여 감염 후 4시간에 2배에서, 10시간에 28배, 24시간에 41배로 증가하였다. cGAS-/- 세포에서, MVA DNA 복제 수는 감염 후 1시간과 비교하여 감염 후 4시간에 8배에서, 10시간에 120배, 24시간에 390배로 증가하였다. IFNAR1-/- 세포에서, MVA DNA 복제 수는 감염 후 1시간과 비교하여 감염 후 4시간에 5배에서, 10시간에 50배, 감염 후 24시간에 107배로 증가하였다 (도 77a 및 77b).
유사하게, WT 진피 섬유아세포에서 MVA△E5R DNA 복제 수는 감염 후 1 시간과 비교하여 감염 후 4시간에 1배에서, 10시간에 18배, 24시간에 21배 증가하였다. cGAS-/- 세포에서 MVA△E5R DNA 복제 수는 감염 후 1시간과 비교하여 감염 후 4시간에 1.8배, 10시간에 87배, 24시간에 832배로 증가하였다. IFNAR1-/- 세포에서 MVA△E5R DNA 복제 수는 감염 후 1시간과 비교하여 감염 후 4시간에 1.9배, 10시간에 57배, 24시간에 181배로 증가하였다 (도 77c 및 77d). 이러한 결과는 진피 섬유아세포에서 cGAS-매개 감지 메커니즘이 MVA 및 MVA△E5R 바이러스 DNA 복제를 제어하는데 중요했으며, IFNAR-매개 I형 IFN 양성 피드백 루프가 부분적인 역할을 한다는 것을 보여준다.
실시예 78: MVA△E5R은 cGAS-결여 피부 원발성 진피 섬유아세포에서 감염성 자손 바이러스를 생성하는 능력을 얻는다.
MVA는 진피 섬유아세포에서 비-복제성이다. cGAS-매개 세포질 DNA-감지 경로와 IFANR 경로가 감염성 비리온의 생성을 제한하는 역할을 하는지 확인하기 위하여, WT, cGAS-/- 또는 IFNAR1-/- 마우스로부터의 피부 원발성 진피 섬유아세포를 MVA 또는 MVA△E5R 로 0.05의 MOI에서 감염시켰다. 세포는 감염 후 1, 24 및 48시간에 수집되었다. 바이러스 역가는 BHK21 세포에 대한 적정에 의해 확인되었다. WT 진피 섬유아세포에서 MVA와 MVA△E5R은 모두 비-복제성이다. 그러나, cGAS-/- 세포에서, 감염 후 48시간에서의 MVA 역가는 감염 후 1시간에서의 역가와 비교하여 148 배 증가하였다 (도 78a 및 78b). 더욱 놀랍게도, 감염 후 48시간에 MVA△E5R 역가는 감염 후 1 시간에서의 역가와 비교하여 583배 증가하였다 (도 78c 및 78d). IFNAR1-/- 세포에서 MVA 및 MVA△E5R은 감염 후 1시간에서의 역가와 비교하여 감염 후 48시간에서의 역가를 각각 12배 및 19배 증가시켰다 (도 78a-77d). 이러한 결과는 cGAS가 피부 진피 섬유아세포에서 MVA 및 MVA△E5R 복제를 제한하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
실시예 79: 뮤린 흑색종 세포의 MVA△E5R 감염은 STING-의존 방식으로 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
종양 세포의 MVA△E5R 감염이 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, WT 및 STING-/- B16-F10 세포(STING의 CRISPR-cas9 유전자 표적화에 의해 생성됨)를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R로 감염시켰다. 세포는 감염 후 18시간에 수집되었다. RNA를 추출하고 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. RT-PCR 결과는 MVA△E5R이 WT B16-F10 세포에서 IFNB 유전자 발현을 유도했지만 STING-/- 세포에서는 유도하지 않았음을 보여준다. MVA 감염은 MVA△E5R과 비교하여 WT B16-F10 세포에서 IFNB 유전자 발현의 더 약한 유도를 나타냈다 (도 79a). 감염 후 18 시간에 수집된 MVA 또는 MVA△E5R로 감염된 WT 및 STING-/- B16-F10 세포의 상청액에서 IFN-β 단백질 수준의 ELISA 결과는 MVA△E5R이 WT B16-F10 세포에서 적절한 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도하지만, STING-/- 세포에서는 그렇지 않음을 보여준다 (도 79b). MVA 감염은 IFN-β 단백질 분비를 초래하지 않았다 (도 79b).
실시예 80: 뮤린 흑색종 세포의 MVA△E5R 감염은 면역원성 세포 사멸의 특징인 ATP 방출을 유도한다.
도 80은 뮤린 흑색종 세포의 MVA△E5R 감염이 면역원성 세포 사멸의 특징인 ATP 방출을 유도함을 보여준다. 간단하게, B16-F10 세포는 10의 MOI에서 WT 백시니아, MVA 또는 MVA△E5R로 감염되었다. 바이러스 감염 1시간 후 세포를 세척하고 새로운 배지를 추가하였다. 상청액은 감염 후 48시간에 수집되었다. ATP 수준은 ATPlite 1 단계 발광 ATP 검출 분석 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA)을 사용하여 확인하였다. 그 결과는 뮤린 흑색종 세포의 MVA 및 MVA△E5R 감염이 백시니아 바이러스보다 더 높은 ATP 방출을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 MVA 및 재조합 MVA가 종양 세포에서 면역원성 세포 사멸을 유도했음을 보여준다. 향후 연구에서는 종양 세포의 MVA 또는 MVA△E5R 감염이 면역원성 세포 사멸의 또 다른 특징 인 HMGB1 방출을 유도하는지 여부를 조사할 것이다.
실시예 81: hFlt3L 및 hOX40L을 발현하는 재조합 MVA△E5R의 생성.
본 실시예는 hFlt3L 및 hOX40L을 발현하는 재조합 MVA△E5R 바이러스의 생성을 설명한다. 도 81은 MVA 게놈의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 hFlt3L 및 hOX40L을 발현하는 재조합 MVA△E5R을 생성하는 도식을 보여준다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L 및 hOX40L을 모두 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하는데 pMA 벡터가 사용되었다. hFlt3L 및 hOX40L의 코딩 서열은 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되었다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 hFlt3L 및 hOX40L에 대한 발현 카세트의 삽입을 초래하였다. 도 82a 및 82b는 재조합 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L 바이러스가 PCR 분석에 의해 확인된 바와 같이 예상되는 삽입을 가지고 있음을 보여준다. DNA 삽입물도 생어 시퀀싱을 받았으며 서열은 예상한 바와 같았다.
실시예 82: MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L로 감염된 세포에 의한 hFlt3L 및 hOX40L의 발현.
재조합 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L 바이러스가 감염된 세포 표면에서 hFlt3L과 hOX40L을 모두 발현하는지 시험하기 위하여, BHK-21, 뮤린 B16-F10 흑색종 세포 및 인간 SK-MEL28 흑색종 세포를 플레이팅하고 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L로 감염시켰다. 바이러스가 없는, 모의 감염 대조군이 포함되었다. 감염 24시간 후, hFlt3L 및 hOX40L 항체로 표면 염색을 하기 위하여 세포를 채취하였다. hFlt3L 및 hOX40L의 표면 발현은 FACS 분석에 의해 분석되었다. 도 83a는 감염 후 BHK-21 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L의 표면 발현의 점 도표다. 도 83b는 감염 후 B16-F10 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L의 표면 발현의 점 도표다. 도 83c는 감염 후 SK-MEL28 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L의 표면 발현의 점 도표다. 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L이 BHK-21, B16-F10 및 SK-MEL28 세포에서 hOX40L 및 hFlt3L을 효율적으로 발현했음을 보여준다. MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L이 B16-F10 또는 SK-MEL28에서 복제되지 않는다는 점을 감안할 때, 감염된 종양 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L의 발현이 강력했다.
MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L 바이러스가 BHK21 세포에서 hFlt3L 및 hOX40L을 발현하는지 여부를 시험하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 84). 간단하게, BHK21 세포는 MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L로 모의 감염되거나 감염되었다. 세포 용해물은 감염 후 24시간에 수집되었다. 웨스턴 블롯 결과는 hFlt3L 및 hOX40L이 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L-감염 BHK21 세포에 의해 발현되었지만, MVA에 의해 발현되지 않았음을 보여준다 (도 84).
실시예 83: 재조합 VACV-TK-항-CTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L의 생성.
본 실시예는 TK 유전자좌에서 세포독성 T 림프구 항원 4를 선택적으로 표적화하는 항체를 발현하고 E5R 유전자좌에서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 또는 MVA 바이러스의 생성을 설명한다(VAC-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L). 도 85a는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 항체의 중쇄 및 경쇄를 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트의 개략도를 보여준다. 9D9의 중쇄(muIgG2a) 및 경쇄의 코딩 서열은 리보솜 스키핑을 가능하게 하기 위하여 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되었다. 양측에 티미딘 키나아제(TK) 유전자가 있는 백시니아 P7.5 프로모터 조절 하의 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자(gpt)뿐만 아니라 백시니아 PsE/L 조절 하의 항-mu-CTLA-4 유전자를 포함하는 pCB 플라스미드를 구축하였다. TK 유전자좌로부터 항-mu-CTLA-4를 발현하는 재조합 바이러스는 pCB 플라스미드 DNA와 바이러스 게놈 DNA 사이의 TK 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다. 도 85b는 단일 발현 카세트에서 융합 단백질로서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L을 모두 발현하기 위하여 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용한 개략도이다. 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L의 코딩 서열은 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트로 분리되어, 리보솜 스키핑을 가능하게 하였다. 양 측에 E4L 및 E6R 유전자가 있는 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 유전자를 포함하는 pUC57 플라스미드를 구축하였다. E5R 유전자좌로부터 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스는 pUC57 플라스미드 DNA와 바이러스 게놈 DNA 사이의 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다. VAC-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L을 생성하기 위하여, 먼저 BSC-40 세포를 1시간 동안 0.05의 감염 다중도(MOI)에서 백시니아 바이러스로 감염시킨 다음, 전술한 pCB 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함하는 gpt 선택 배지에서 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크 정제하였다. TK 유전자의 일부가 결실되고 항-muCTLA-4가 삽입된 재조합 바이러스를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. TK 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 항-mu-CTLA-4 및 gpt 발현 카세트를 바이러스 게놈 DNA에 삽입하여 VAC-TK-항-muCTLA-4를 생성하였다. 두 번째 단계에서, BSC-40 세포는 1시간 동안 0.1의 MOI에서 VAC-TK-항-muCTLA-4로 감염된 다음, 전술한 pUC57 플라스미드 DNA로 형질주입되었다. 감염된 세포는 48 시간에 수집되었다. GFP 마커 및 플라크 정제를 통해 재조합 바이러스를 선별했다. PCR 분석을 수행하여 E5R 유전자가 결실되고 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 유전자가 삽입된 재조합 바이러스를 확인하여 VAC-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L 재조합 바이러스를 생성하였다.
실시예 84: 재조합 VACV-TK - -항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L의 PCR 검증 및 재조합 바이러스로 감염된 세포에 의한 항-muCTLA-4 항체의 발현.
재조합 VACV-TK--항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L을 검증하기 위하여 PCR 분석을 사용 하였다 (도 86a및 86b). 재조합 바이러스 감염으로 인해 항-CTLA-4 항체가 생성되는지 여부를 확인하기 위하여, 인간 SK-MEL-28 흑색종 세포를 E3L△83N-TK--벡터, E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4, E3L△83N-TK--hFlt3L-항-muCTLA-4-C7L--mOX40L, VACV, VAC-TK--항-muCTLA-4-C7L--mOX40L 또는 VAC-TK--항-muCTLA-4-E5R--hFlt3L-mOX40L로 MOI 10에서 감염 또는 모의 감염시켰다. 세포 용해물은 감염 후 24시간에 수집되었고, 폴리펩티드는 10% SDS-PAGE를 사용하여 분리되었다. HRP-연결된 항-마우스 IgG(중쇄 및 경쇄) 항체를 사용하여 항-muCTLA-4 항체의 전장(FL), 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 검출하였다. 웨스턴 블롯 분석은 바이러스 감염 후 SK-MEL-28 흑색종 세포주에서 항-CTLA-4 항체의 전장(FL), 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 발현을 보여준다 (도 86c). 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 항-CTLA-4 항체를 발현하는 능력을 가지고 있으며 항체를 세포에 전달하는 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 85: 백시니아 E5는 폭스바이러스 패밀리 중에서 고도로 보존되어 있다.
백시니아 E5는 폭스바이러스 패밀리 중에서 고도로 보존되어있다. 도 87은 폭스바이러스 패밀리의 여러 멤버로부터의 E5 올소로그의 단백질 서열 정렬을 보여준다. E5 올소로그는 N-말단에서 차이를 나타내지만 중간에서 C-말단까지 높은 보존을 보여준다. 도 88a는 백시니아 WR 및 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)로부터의 E5의 단백질 서열 정렬을 보여준다. MVA는 VACV와 비교하여 N-말단에서 처음 10개의 아미노산과 점 돌연변이체가 없다. 도 88b는 백시니아 바이러스로부터의 E5 및, 점액종 바이러스의 E5 올소로그인 M31의 단백질 서열 정렬을 보여준다. M31과 백시니아 바이러스의 E5은 약 20%의 상동성을 공유한다.
실시예 86: 백시니아 E5의 올소로그인 점액종 바이러스 M31은, cGAS 및 STING 유도 IFN-β 경로를 억제한다.
cGAS 및 STING 유도 IFN-β 경로에서, 백시니아 E5의 올소로그인 점액종 바이러스 M31의 역할을 조사하기 위하여, HEK293T 세포를 플라스미드를 발현하는 E5R, M31R또는 pcDNA 벡터 대조군과 함께 뮤린 cGAS, 인간 STING을 발현하는 플라스미드로 형질주입시켰다. 24시간 후, 루시퍼라아제 분석을 위하여 세포를 채취하였다. 도 89a는 E5와 M31 모두 IFN-β 생산을 억제할 수 있음을 보여주었다. 점액종 M31은 E5보다 더 강한 억제 효과를 나타냈다. 도 89b는 HEK293T가 플라스미드를 발현하는 E5R, M31R 또는 pcDNA 벡터 대조군과 함께 뮤린 STING을 발현하는 플라스미드로 형질주입되었음을 보여준다. 형질주입 24시간 후, 루시퍼라아제 신호가 결정되었다. E5는 IFN-β 생산을 차단하지 않았지만 M31은 여전히 STING-유도된 IFN-β 생산을 억제했으며, 이는 M31이 cGAS 및 STING 유도 IFN-β 경로의 다운스트림에 작용할 수 있음을 나타냈다.
실시예 87: 백시니아 E5는 cGAS 유비퀴틴화를 촉진한다.
E5가 cGAS 유비퀴틴화를 촉진하여 cGAS 유도 IFN-β 경로를 차단하는지 여부를 평가하기 위하여, HEK293T 세포를 Flag-cGAS 및 HA-유비퀴틴으로 형질주입시켰다. 24시간 후, 세포는 WT VACV 또는 VACVE5R로 감염되었다. 세포 용해는 감염 후 6시간에 수집되었다. cGAS는 항-Flag 항체로 면역 침전되었고 유비퀴틴화는 항-HA 항체에 의해 검출되었다 (도 90a). 도 90b는 전체 세포 용해물(WCL) 상에서 cGAS 및 β-액틴의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. VACV는 감염 후 cGAS 유비퀴틴화를 유도한 반면, VACV△E5R은 낮은 수준의 cGAS 유비퀴틴화를 유도했으며, 이는 백시니아 E5가 cGAS 유비퀴틴화를 촉진한다는 것을 나타냈다.
실시예 88: MVA△E5R의 종양내 전달은 뮤린 B16-F10 흑색종 편측 종양 이식 모델에서 종양 성장을 지연시키고 생존을 연장시킨다.
MVA△E5R의 IT 전달이 항종양 효과를 생성하는지 여부를 시험하기 위하여, 편측 뮤린 B16-F10 종양 이식 모델이 사용되었다. 간단하게, 5 x 105 개의 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다. 종양 이식 8 일 후, 종양에 PBS 또는 4 x 107 pfu의 MVA, MVA△E5R 또는 열-iMVA를 주 2회 주사하였다. 종양 크기를 주 2회 측정하고 마우스 생존을 모니터링하였다 (도 91a). 마우스 생존율은 도 91b에 도시되어 있다. PBS로 처치 한 마우스에서 B16-F10 종양은 빠르게 성장하여, 11일의 생존 중간값으로 조기 사망을 초래하였다. MVA△E5R의 종양내 주사는 MVA보다 우수한 항종양 효과를 나타내어, 종양 성장이 지연되고 생존이 향상되었다. IT MVA△E5R은 열-iMVA와 동등한 항종양 효과를 받았으며 MVA△E5R 및 열-iMVA 처치군 모두에서 마우스의 60%가 생존하였다.
실시예 89: BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L△E5R 감염은 MVA△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 초래한다.
도 92a-c는 BMDC의 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L△E5R 감염이 MVA△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 초래함을 보여준다. 도 92a-92c는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R 바이러스 생성의 개략도를 보여준다. 첫 번째 단계는 C8L 및 C6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해, C7L 유전자를 PsE/L 프로모터 제어 하의 hFlt3L로 대체하는, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R의 생성을 수반하였다. 두 번째 단계는 TK 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 TK 유전자를 PsE/L 프로모터 제어 하의 mOX40L로 대체하는, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L의 생성을 수반하였다. 생성된 바이러스는 도 5a 및 도 5b에 기재되어 있다. 세 번째 단계는 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R을 생성하는 것이며, 이는 E5R 유전자를 P7.5 프로모터 제어 하의 mCherry로 대체하였다. 도 92d는 MVA△E5R, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-) mOX40L△E5R에 감염된 BMDC에서 IFNB 유전자 발현의 RT-PCR 결과를 보여준다. WT 및 IFNAR-/- BMDC는 10의 MOI에서 MVA△E5R, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L△E5R로 감염 또는 모의 감염되었다. 세포는 감염 후 16시간에 수집되었고 RT-PCR이 수행되었다. 도 92e는 MVA△E5R, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)mOX40L△E5R에 감염된 BMDC의 상청액에서 IFN-β 단백질 수준의 ELISA 결과를 보여준다. WT 및 IFNAR-/- BMDC는 10의 MOI에서 MVA△E5R, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 또는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-) mOX40L△E5R로 감염 또는 모의 감염되었다. 감염 후 16시간에 상청액을 수집하고 IFN-β 단백질 수준을 측정하기 위하여 ELISA를 수행하였다. MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R은 MVA△E5R 및 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L와 비교하여 WT BMDC에서 RNA 수준과 단백질 분비 모두에서 가장 높은 IFN-β 생산을 유도하였다. IFNAR-/- BMDC에서, MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R에 의해 유도된 IFN-β 생산은 WT BMDC에서보다 훨씬 낮았으며, 이는 MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L△E5R 유도 IFN-β 생산은 부분적으로 IFNAR 경로에 의존하는 것을 나타냈다.
실시예 90: MVA△C7L△E5R-hFlt3L-mOX40L 및 MVA△C7L-OVA-△E5R-hFlt3L-mOX40L 생성.
도 93a 및 93b는 MVA△C7L△E5R-hFlt3L-mOX40L 및 MVA△C7L-OVA-△E5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 보여준다. 도 93a는 MVA△C7L△E5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 보여준다. pMA 플라스미드는 단일 발현 카세트에서 융합 단백질로서 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L을 모두 발현하기 위하여 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하도록 구축되었다. 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L의 코딩 서열은 2A 펩티드(Pep2A) 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되었다. E5R 유전자좌로부터 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스는 pMA 플라스미드와 MVA△C7L 바이러스 게놈 사이의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다. 도 93b는 MVA△C7L-OVA-△E5R-hFlt3L-mOX40L을 생성하는 도식을 보여준다. E5R 유전자좌로부터 인간 Flt3L 및 뮤린 OX40L 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스는 pMA 플라스미드와 MVAC7L-OVA 바이러스 게놈 사이의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다.
실시예 91: 점액종 M64는 IFN-β유도된 IFN-민감성 반응 요소 활성화의 억제 역할을 갖는다
점액종 M62 또는 M64가 IFNAR 시그널링에 대하여 C7과 유사한 억제 효과를 갖는지를 확인하기 위하여, HEK293T 세포를 ISRE-반딧불이 루시퍼라아제 리포터, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK, 점액종 M62R, 점액종 M62R-HA, 점액종 M64R, 점액종 M64R-HA, 백시니아 C7L-발현 또는 대조군 플라스미드로 형질주입시켰다. 형질주입 24시간 후, 세포를 채취하기 전에 추가 24시간 동안 IFN-β로 처치하였다. 루시퍼라아제 활성이 측정되었다. 결과는 점액종 M64의 일시적인 과잉발현이 IFN-β-유도된 ISRE 활성화를 억제함을 보여준다 (도 94a).
점액종 M62 또는 M64가 STING-유도된 IFNB 프로모터 활성화에 대하여 C7과 유사한 억제 효과를 갖는지를 확인하기 위하여, HEK293T 세포를 점액종 M62R, 점액종 M62R-HA, 점액종 M64R, 점액종 M64R-HA, 백시니아-C7L 발현 또는 대조군 플라스미드와 함께 ISRE-반딧불이 루시퍼라아제 리포터, 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 대조군 플라스미드 pRL-TK 및 STING-발현 플라스미드로 형질주입시켰다. 결과는 점액종 M64 또는 M62의 일시적인 과잉발현이 STING-유도된 IFNB 프로모터 활성화를 억제하지 못한다는 것을 보여준다 (도 94b).
실시예 92: 본 기술의 조작된 폭스바이러스의 IT 주사와, (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및 (iii) 면역 조절 약물 (즉, 핑골리모드 (FTY720))의 임의의 조합의 전신 전달과의 조합이 고형 종양 치료에 있어서 IT 바이러스 단독보다 더 효과적이다.
본 기술의 조작된 폭스바이러스 (예를 들어,
Figure pct00161
Figure pct00162
)의 IT 전달과 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및 (iii) 면역 조절 약물 (즉, 핑골리모드 (FTY720))의 임의 조합의 전신 전달과의 조합이 대규모로 수립된 B16-F10 흑색종에 대해 IT 바이러스 단독과 비교하여 더 우수한 항종양 효능을 갖는지 시험하기 위하여, 5 x 105개의 세포를 C57B/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다. 종양 이식 9일 후, 종양의 직경이 5 mm일 때, 다음 중 하나로 주 2회 처치된다:
Figure pct00163
Figure pct00164
+ (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제 (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및 (iii) 면역 조절 약물(즉, 핑골리모드(FTY720));의 IP 투여. 종양 부피를 측정하고 마우스 생존을 모니터링한다. 본 기술의 하나 이상의 조작된 폭스바이러스 및 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및/또는 (iii) 면역 조절 약물(즉, 핑골리모드 (FTY720))의 조합 투여는 조작된 폭스바이러스 단독 투여와 비교하여 향상된 항종양 효과를 초래할 것으로 예상된다.
따라서, 이러한 결과는 본 기술의 조작된 폭스 바이러스 및 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및/또는 (iii) 면역 조절 약물(즉, 핀골리 모드(FTY720))의 조합 투여가 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여줄 것이다. 더 나아가, 본 기술의 조작된 폭스바이러스 및 (i) 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제 및/또는 하나 이상의 면역계 자극제; (ii) 하나 이상의 항암 약물; 및/또는 (iii) 면역 조절 약물(즉, 핀골리 모드(FTY720))의 조합 투여는 이와 관련하여 조작된 폭스바이러스 단독 투여와 비교하여 상승작용 효과를 생성할 것으로 예상된다.
실시예 93: hFlt3L 및 mOX40L을 발현하는 재조합 MVA△E5R의 생성.
본 실시예는 hFlt3L 및 mOX40L을 발현하는 재조합 MVA△E5R 바이러스의 생성을 설명한다. 도 95는 MVA 게놈의 E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 hFlt3L 및 mOX40L을 발현하는 재조합 MVAE5R을 생성하는 도식을 보여준다. pUC57 벡터는 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 hFlt3L 및 mOX40L을 모두 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하는데 사용된다. hFlt3L 및 mOX40L의 코딩 서열은 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리되었다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 hFlt3L 및 mOX40L에 대한 발현 카세트의 삽입을 초래한다.
실시예 94: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L로 감염된 세포에 의한 hFlt3L 및 mOX40L의 발현.
재조합 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 바이러스가 감염된 세포 표면에 hFlt3L과 mOX40L을 모두 발현하는지 시험하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. BHK-21, 뮤린 B16-F10 흑색종 세포 및 인간 SK-MEL28 흑색종 세포는 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L로 감염되었다. 바이러스가 없는 감염 대조군도 포함되었다. 감염 24시간 후, hFlt3L 및 mOX40L 항체로 표면 염색을 위하여 세포를 채취하였다. hFlt3L 및 mOX40L의 표면 발현은 FACS 분석에 의해 분석되었다. 도 96a는 감염 후 BHK-21, B16-F10 및 SK-MEL28 세포에서 hFlt3L 및 mOX40L의 표면 발현에 대한 점 도표이다. 도 96b는 감염 후 BHK-21, B16-F10 및 SK-MEL28 세포에서 hFlt3L 및 mOX40L 발현의 평균 형광 강도(MFI)의 막대 그래프이다. 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 감염 후 24시간에 BHK-21, B16-F10 및 SK-MEL28 세포에서 mOX40L 및 hFlt3L을 효율적으로 발현했음을 보여준다. MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 B16-F10 또는 SK-MEL28에서 복제되지 않는다는 점을 감안할 때, 감염된 종양 세포에서 hFlt3L 및 mOX40L의 발현은 강력했다.
실시예 95: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 MVA, MVA△E5R 또는 열-iMVA와 비교하여 더 강한 전신 항종양 T 세포 면역을 유도한다.
MVA, MVA△E5R, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA로 처치된 마우스의 비장에서 항종양 특이적 T 세포의 생성을 평가하기 위하여 ELISpot을 수행하였다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 8일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 4 x 107 pfu의 MVA, MVA△E5R 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 동등한 양의 열-iMVA를 주 2회 주사하였다. ELISpot 분석을 위하여 비장을 채취하였다(도 97). 1,000,000개의 비장세포를 항-IFN-γ-코팅된 BD ELISpot 플레이트 마이크로 웰에서 밤새 37°C에서 조사된 1.5 x 105 B16-F10 세포와 함께 배양하였다. 비장세포를 γ-조사기로 조사한 B16-F10 세포로 자극하고, 항-IFN-γ 항체로 IFN-γ 분비를 검출하였다. 도 98a-98b는 PBS, MVA△E5R, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA로 처치된 개별 마우스의 1,000,000 비장세포당 IFN-γ+ 스폿의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 99a-99c는 PBS, MVA△E5R, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA로 처치된 각 그룹에서 개별 마우스의 비장세포 1,000,000 개당 IFN-γ+ 스폿 수를 보여준다. 이러한 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사가뮤린 B16-F10 흑색종 양측 이식 모델에서 처치된 마우스에서 항종양 T 세포를 생성하는데 MVA, MVA△E5R 또는 열-iMVA보다 더 효과적임을 보여준다.
실시예 96: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 주사 및 비주사된 원거리 종양 모두에서 CD8 + 및 CD4 + T 세포의 활성화를 유도한다.
IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 국소 및 전신 항종양 면역의 생성을 초래하는지 평가하기 위하여, 실시예 3에 기술 된 바와 같이 양측 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하였다. 2차 주사 2일 후, 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4 및 CD8 항체로 표면 표지 및 세포 내 그랜자임 B 염색을 위하여 처리하였다. 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 열-iMVA와 비교하여 비주사된 종양에서 총 CD8+ T 세포뿐만 아니라 그랜자임B+ CD8+ T 세포의 비율이 더 높은 결과를 나타냈다 (도 100a-100c). 놀랍게도, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 열-iMVA와 비교하여 비주사 종양에서 총 CD4+ T 세포뿐만 아니라 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 비율이 더 높은 결과를 나타냈다 (도 101a-101c). 또한, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 열-iMVA와 비교하여 주사 종양에서 총 CD8+ T 세포 및 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율이 더 높은 결과를 나타내기도 했다 (도 102a-102c). 또한, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 Heat-iMVA에 비해 주사 종양에서 그랜자임 B+ CD4+ T 세포의 더 높은 비율을 유도하였다 (도 103a-103c). 이러한 결과는 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 주사 및 비주사된 종양 모두에서 세포독성 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 유도하는데 있어 열-iMVA보다 더 효과적임을 나타내고, 이러한 바이러스 구축물이 고형 종양 치료 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 97: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 주사된 원거리 종양에서 조절 T 세포의 감소를 유도한다.
IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 종양 침윤 조절 T 세포에 영향을 미치는지 평가하기 위하여, 실시예 95에 기술된 바와 같이 양측 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하였다. 2차 주사 2일 후, 종양을 채취하고, 세포를 항-CD3, CD45, CD4, CD8 및 OX40 항체를 사용한 표면 표지 및 세포 내 FoxP3 염색을 위하여 처리하였다. 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 주사된 종양에서 CD4+ FoxP3+ T 세포의 비율과 절대 수를 감소시켰다 (도 103a-103c). PBS, 열-iMVA 및 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 처치군 간에 비주사 종양의 Treg의 비율 및 절대 수에는 유의미한 차이가 없었다 (도 104a-104c). OX40L의 수용체인 OX40은 CD4+FoxP3+T 세포에서 높게 발현되었다 (도 105a-105c). IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 주사된 종양에서 OX40+CD4+FoxP3+ T 세포의 비율과 절대 수를 감소시켰으며 (도 105a-105c), 이는 비주사된 종양에서는 관찰되지 않았다 (도 106a-106c). OX40은 CD4+FoxP3-T 세포(도 107a-107c) 및 CD8+ T 세포 (도 108)에서 고도로 발현되지 않았다. 이러한 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사가 주사된 종양에서 OX40+CD4+FoxP3+ T 세포를 감소시키고, 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 98: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 전달에 의한 주사된 원거리 종양에서 조절 T 세포(Treg)의 감소는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에 의한 OX40L 발현에 의존적이다.
MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의한 Treg의 감소가 mOX40L 발현에 의존하는지 평가하기 위하여, 양측 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하고 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 대 MVA△E5R 의 IT 전달에 의한 감소의 효율성을 비교하였다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 야생 C57BL/6J의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 8일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 4 x 107 pfu의 MVA△E5R 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS를 주 2회 주사하였다. 2차 주사 2일 후, 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4 및 CD8 항체를 사용한 표면 표지 및 세포 내 FoxP3 염색을 위하여 처리하였다. 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. 주사된 종양에서, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 PBS와 비교하여 주사된 종양에서 CD4+FoxP3+ T 세포의 비율과 절대 수를 현저히 감소시켰다 (도 109a-109c). 대조적으로, MVA△E5R의 IT 주사는 CD4+FoxP3+ T 세포의 비율에 유의미한 영향을 미치지 않았다 (도 109a-109c). 이러한 결과는 주사된 종양에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의한 Tregs의 고갈이 재조합 바이러스에 의한 OX40L 발현에 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 99: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 WT 마우스와 비교하여 OX40 -/- 의 주사된 종양에서 CD8 + 및 CD4 + T 세포의 더 강력한 활성화를 유도한다.
WT 및 OX40-/- 마우스에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의해 유도된 면역 반응을 비교하기 위하여, 양측 B16-F10 종양 이식 모델이 사용되었다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 야생형 C57BL/6J 또는 OX40-/-마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 10일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 4 x 107 pfu의 MVA△E5R 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L를 주 2회 주사하였다. 2차 주사 2일 후, 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4, CD8 및 OX40 항체를 사용한 표면 표지, 및 세포 내 그랜자임 B, Ki67 및 FoxP3 염색을 위하여 처리하였다. 종양내 살아있는 면역 세포 침윤을 FACS로 분석하였다 (도 110). 야생형 및 OX40-/- 마우스 모두에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 PBS 그룹과 비교하여 주사된 종양에서 총 CD8+ T 세포 및 CD8+그랜자임 B+ T 세포의 더 높은 비율과 수를 초래하였다 (도 111a-111e). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 또한 야생형 및 OX40-/- 마우스 모두에서 주사된 종양의 총 CD4+ T 세포 및 CD4+그랜자임 B+ T 세포의 더 높은 비율과 수를 초래하였다 (도 112a-112e). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-주사 종양의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 그랜자임 B 발현은 WT 마우스와 비교하여 OX40-/- 마우스에서 더 높았다 (도 111a-112e). 이러한 결과는 OX40 발현이 종양의 면역억제와 관련이 있을 수 있음을 시사한다. 종양에 침윤하는 Treg는 높은 수준의 OX40을 발현하기 때문에, 이론에 얽매이지 않고, 조절 T 세포에서 OX40 발현이 면역억제 기능에 중요할 수 있다고 가정한다.
실시예 100: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 야생형 마우스로부터는 주사된 종양의 조절 T 세포를 감소시키지만 OX40 -/- 마우스에서는 그렇지 않다.
MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의한 조절 T 세포의 감소가 OX40L-OX40 상호 작용 때문인지 여부를 시험하기 위하여, CD4+ T 세포 중 CD4+FoxP3+ T 세포의 비율을 PBS 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L로 처치된 야생형 마우스 대 PBS 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L로 처치된 OX40-/-마우스에서 비교하였다. WT 마우스에서 CD4+ T 세포 중 CD4+FoxP3+ T 세포의 비율은 PBS-처치 종양과 비교하여 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-처치 종양에서 감소하였다. 대조적으로, OX40-/- 마우스에서, CD4+ T 세포 중 CD4+FoxP3+ T 세포의 비율은 PBS 및 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 그룹에서 유사했다 (도 113a-113b). WT 마우스에서, OX40+FoxP3+CD4+ 세포의 비율은 PBS-처치된 종양에서 48%로부터 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-처치된 종양에서 19%로 감소했다 (도 114a-114c). 종양 그램당 OX40+FoxP3+CD4+ 세포의 절대 수는 PBS-처치된 종양에서 -로부터 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-처치딘 종양에서 --로 감소했다 (도 114b). 예상대로, FoxP3+CD4+ 세포에 대한 OX40 발현은 없었다 (도 114c). 이러한 결과는 주사된 종양에서 Treg의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-유도된 Treg감소가 Treg에서의 OX40의 발현에 의존할 가능성이 있음을 보여준다.
FoxP3-CD4+에 대한 OX40의 발현은 또한 WT 마우스에서 PBS-처치된 종양과 비교하여 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L-처치된 종양에서 감소되었다(도 115a-115c). 이론에 얽매이지 않고, OX40L/OX40 상호 작용으로 인해 이러한 세포에서 OX40 발현을 검출하지 못할 가능성이 있다.
실시예 101: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 WT 마우스와 비교하여 OX40 -/- 마우스의 비주사 종양에서 CD8 + 및 CD4 + T 세포의 더 강력한 활성화 및 증식을 초래한다.
IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 비주사 종양에서 면역 반응을 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, 비주사 종양을 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS로의 2차 주사 2일 후에 채취하였다. CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 그랜자임 B(활성화 마커) 및 Ki67(증식 마커) 발현을 평가하기 위하여 FACS 분석이 수행되었다. IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 PBS로 처치된 세포와 비교하여 CD8+ 세포 중 그랜자임 B+CD8+ 세포의 비율을 증가시킬 뿐만 아니라 CD45+ 세포 중 CD8+ 세포의 비율을 증가시킨다 (도 116a-116e). 또한, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 PBS로 처치된 세포와 비교하여 CD8+ T 세포 중 Ki67+CD8+ 세포의 증가를 초래한다 (도 117a-117c). OX40-/- 마우스에서, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 WT 마우스와 비교하여 비주사 종양에서 CD8+ T 세포에 대해 더 강력한 활성화 및 증식 반응을 유도했다 (도 116a-117c).
IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L로 처치한 마우스의 비주사 종양에서 CD4+T 세포 중 그랜자임 B+CD4+ 및 Ki67+CD4+T 세포의 비율을 PBS로 처치 한 것과 비교했을 때 유사한 관찰이 이루어졌다. IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 또한 WT 마우스와 비교하여 OX40-/- 마우스의 비주사 종양에서 CD4+T 세포에 대해 더 강한 활성화 및 증식 반응을 유도했다 (도 118a-119c). 이러한 결과는 OX40이 주사 및 비주사 종양 모두에서 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에 의해 유도된 면역 반응을 음성 조절함을 시사한다. OX40이 OX40+FoxP3+CD4+T 세포의 면역억제 기능에 중요하여 CD4+ 및 CD8+ 이펙터 T 세포 기능을 모두 약화시킬 가능성이 있다. 이러한 결과는 IT 면역원성 및 IFN-유도된 MVA, 예를 들어 MVA△E5R와 OX40 차단제, 예를 들어 항-OX40L 항체의 전신 전달의 조합이 주사 및 비주사 종양 모두에서 강력한 항종양 효과를 유발할 수 있음을 시사하며, 이러한 바이러스 구축물이 고형 종양을 치료하는 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 102: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 B16-F10 양측 종양 이식 모델에서 주사 종양에서의 국소 CD8 + T 세포의 활성화를 유도한다.
림프 기관에서 말초 혈액으로 이동하는 T 세포를 차단하는 것이 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에 의해 유발되는 항종양 효과에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위하여, 양측 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하고, 림프구가 림프 조직에서 떠나는 것을 억제하는 면역 조절 약물 인 FTY720을 사용하였다(Figure. XX 슬라이드 27). 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 7일 후, 각 마우스에 격일로 25 mg FTY720 또는 DMSO를 대조군으로 복강내 주사하였다. 이식 9일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 4 x 107 pfu의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS를 3 일 간격으로 주 2회 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하였다. 2차 주사 이틀 후에 종양을 채취하고 무게를 측정하였다. 세포는 항-CD3, CD45, CD4, CD8 및 OX40 항체를 사용한 표면 표지 및 세포 내 그랜자임 B 및 Ki67 염색을 위하여 처리되었다. 종양내 살아있는 면역 세포 침윤물을 FACS로 분석 하였다 (도 120).
PBS 처치군에서, 주사 및 비주사 종양은 모두 DMSO 대조군과 비교하여, FTY720의 존재 하에 더 공격적으로 성장했다 (도 121). 대조적으로, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 FTY720 또는 DMSO 처치된 마우스 모두에서 주사 및 비주사 종양 모두의 성장을 억제하였다 (도 121).
주사 종양에서 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율은 DMSO 대조군에서 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 사용하여 증가하였다. FTY720 처치 후, CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율은 DMSO/PBS 그룹보다 약간 낮았으며 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 처치는 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율을 증가시키지 않았다 (도 122a-122d) XXB). 대조적으로, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 DMSO 및 FTY720 그룹 모두에서 그랜자임 B+CD8+ T 세포의 비율을 상당히 증가시켰다 (도 122a 및 122c). IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 또한 DMSO 및 FTY720 그룹 모두에서 Ki67+CD8+T 세포의 비율을 증가시켰다 (도 122d).
또한, FTY720의 존재 하에, IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L은 DMSO와 비교하여 주사된 종양의 TDLN에서 활성화된 그랜자임 B+CD8+ 및 Ki67+CD8+T 세포의 더 높은 비율을 초래했으며(도 123a-124b), 이는 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에 의해 유도된 활성화 CD8+ T 세포가 FTY720의 존재 하에 LN에 포획되었음을 보여준다. 이러한 결과는 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 국소 CD8+ T 세포를 활성화하고 림프 기관으로부터 T 세포를 모집하지 않고도 종양 성장을 억제할 수 있으며 고형 종양 치료 방법에 유용함을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스 바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 103: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 AT3 삼중 음성 유방암 모델에서 종양 성장을 지연시킨다.
유방 종양에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의해 생성된 항종양 효과를 평가하기 위하여, 양측 AT3 뮤린 유방 종양 이식 모델이 사용되었다(도 125). 간단하게, 1 x 105 AT3 세포를 C57BL/6J 마우스의 4번째 지방 패드에 이식하였다. 종양 이식 14일 후, 6 x 107 pfu의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA 또는 PBS를 3일 간격으로 두 번 종양내 주사하였다. 종양은 각 주사 전에 측정되었다. 2차 주사 2일 후, 주사된 종양을 측정하고 체중 측정 및 FACS 분석을 위하여 채취하였다. MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 열-iMVA 또는 PBS와 비교하여 지연된 종양 성장을 초래하였다 (도 126a). IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 종양은 두 번의 주사 후 열-iMVA 또는 PBS와 비교하여 더 작았다 (도 126b). 이러한 결과는 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 AT3 유방 종양 이식 모델에서 열-iMVA와 비교하여 더 강력한 항종양 효과를 초래했음을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료에 유용함을 보여준다.
실시예 104: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 AT3 삼중 음성 유방암 모델에서 주사된 종양에서의 CD8 + T 세포 활성화 및 조절 T 세포의 감소를 유도한다.
유방 종양에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의해 유도된 면역 반응을 평가하기 위하여, 실시예 103에 기재된 바와 같이 양측 AT3 뮤린 유방 종양 이식 모델을 사용하였다 (도 125). 2차 주사 2일 후에, 주사된 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4 및 CD8 항체를 사용한 표면 표지 및, 세포 내 그랜자임 B 및 FoxP3 염색을 위하여 처리하였다. MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 열-iMVA 또는 PBS와 비교하여 CD8+ T 세포의 더 높은 비율과 절대 수를 초래하였다 (도 127b). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사는 또한 열-iMVA와 비교하여 그랜자임B+CD8+ T 세포의 더 높은 비율을 유도한다 (도 127a 및 127c). 그러나, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA의 IT 주사는 모두 더 높은 비율의 그랜자임B+CD4+ T 세포를 유도하지 않았다 (도 128a-128e). CD4+FoxP3+ T 세포의 비율은 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA를 사용하여 31%에서 약 11%로 감소하였다 (도 129a-129c). 이러한 결과는 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L이 AT3 유방 종양 이식 모델에서 CD8+ T 세포의 활성화 및 조절 T 세포의 감소를 유도하고, 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 105: MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사와 항-PD-L1 항체의 전신 전달의 조합은 양측 B16-F10 흑색종을 치료한다.
MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 전달 및 항-PD-L1의 전신 전달의 조합이 IT 바이러스 단독과 비교하여 우수한 항종양 효능을 갖는지를 시험하기 위하여, 양측 뮤린 B16-F10 종양 이식 모델을 사용하였다. 간단하게, B16-F10 흑색 종 세포를 C57B/6 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다(오른쪽 옆구리에 5 x 105, 왼쪽 옆구리에 1 x 105). 종양 이식 7일 후, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L(4 x 107 PFU)은 항 -PD-L1(마우스 당 250 μg)의 복강내(IP) 주사와 함께, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 주 2회 전달되었다. 종양 크기를 일주일에 두 번 측정하고 마우스 생존을 모니터링하였다 (도 130). 개별 마우스의 주사 및 비주사 종양의 부피는 도 131a-131b에 도시되어 있다. PBS로 처치된 마우스에서, 종양이 빠르게 성장하여 12.5일의 생존 중간값으로 조기 사망을 초래하였다 (도 131a-132b). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 주사는 PBS와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 25일로 연장된 생존 중간값으로, 생존을 향상시켰다 (도 131a-131b). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달과 항-PD-L1의 복강내 전달의 조합으로 처치된 마우스는 모두 마지막 조사 당시 생존했다. 9 마리 중 7 마리는 종양이 없었으며 B16-f10 흑색종이 완치될 것으로 예상되었다 (도 131a-131b). 양측 종양 모델 또는 대규모 확립된 종양 모델 모두에서 IT MVA△C7L-hFlt3L-TK(-)-mOX40L 및 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1의 전신 전달의 이전의 조합 요법을 기반으로, 이론에 얽매이지 않고, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 전달과 항-항-CTLA-4 또는 항-PD-1의 전신 전달의 조합은 양측 종양 모델 또는 대규모 확립된 종양 모델 모두에서 IT 바이러스 단독과 비교하여 우수한 결과를 생성할 것으로 예상된다
실시예 106: MVA△E5R-hFlt3L-OX40L은 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한다.
MVA△E5RhFlt3L-hOX40L 대 MVA-감염된 BMDC에 의한 IFNB 유전자 발현 유도 및 IFN-β 분비를 조사하였다. 간단하게, BMDC(1 x 106)는 10의 MOI에서 MVA△E5RhFlt3L-hOX40L 또는 MVA로 감염되었다. 1시간 감염 후 세포를 세척하고 신선한 배지를 첨가하였다. 세포는 감염 후 6시간에 수집되었고 상청액은 감염 후 19시간에 수집되었다. IFNB 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 확인되었다 (도 132a). ELISA에 의해 상청액의 IFN-β 단백질 수준을 확인하였다 (도 132b). RT-PCR 결과는 MVA△E5RhFlt3L-hOX40L이 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 분비를 강력하게 유도한다는 것을 보여준다 (도 132a 및 b).
실시예 107: MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L에 의한 생체 외 감염.
유방외 파제트병(EMPD)은 드물고 느리게 성장하는 피부암으로, 상피에서 발생하며 종종 외음부, 음낭 또는 항문 주변 부위의 아포크린샘 세포에서 발생한다. 일반적으로 상피에만 국한되지만, 진행되어 급속히 퍼질 수 있다. 수술, 방사선 치료, 국소 이미퀴모드, 광역동 치료를 포함하는 치료 옵션은 종종 제한된다. MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L을 사용한 생검(biopsy) 표본의 생체 외 배양이 EMPD에서 종양 침윤 림프구의 표현형에 미치는 영향을 분석하였다. 간단하게, 종양 조직을 날카로운 면도칼로 작은 조각으로 자르고 10의 MOI에서 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L로 감염시켰다. 감염 2일 후, 조직을 37°C에서 45분 동안 콜라게나아제 D ()로 분해시켰다. 세포를 여과하고 항-CD3, CD4, CD8 항체로 염색한 다음, 투과화하고 항-그랜자임 B 및 FoxP3 항체로 염색하였다. FACS 분석을 수행하였다. 그랜자임 B+CD8+ T 세포 및 FoxP3+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표가 도시되어 있다 (도 133a 및 133b). 도 134a는 2일 동안 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L 또는 PBS 대조군으로 감염시킨 후 CD8+ 세포 중 그랜자임+CD8+ T 세포의 비율 그래프를 보여준다. 데이터는 평균±SEM (n=3)이다. 도 134b는 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L 또는 PBS 대조군으로 2일 동안 감염된 후 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율 그래프를 보여준다. 데이터는 평균±SEM (n=3)이다. 이러한 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L을 사용한 EMPD의 생체 외 감염이 CD8+ 세포 중 그랜자임+CD8+ T 세포의 비율을 증가시키고 CD4+ 세포 중 FoxP3+CD4+ T 세포의 비율을 감소시킴을 보여주며 (도 134a 및 134b), MVA△E5R-hFlt3L-hOX40L의 면역 자극 기능을 뒷받침한다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 108: MVA△E3L△E5R 및 MVA△E3L△E5R hFlt3L-mOX40L 재조합 바이러스의 생성.
MVA△E5R 또는 MVA△E5RhFlt3L-mOX40L에서 백시니아 E3L 유전자의 결실이 바이러스의 면역원성을 향상시키는지 시험하기 위하여 MVA△E3L△E5R 및 MVA△E3L△E5R hFlt3L-mOX40L을 생성하였다. 프로세스는 여러 단계로 구성되었다. 첫 번째 단계에서, MVA 게놈의 E4 및 E6 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 MVA△E5R 및 MVA△E5R hFlt3L-mOX40L을 생성하였다 (도 135a 및 135b). 두 번째 단계에서, E2L 및 E4L 유전자좌에서 상동 재조합을 통하여 재조합 바이러스로부터 내생 E3L을 제거하기 위하여 E3L-mCherry FRT 구축물을 사용하였다 (도 135c). E3L 유전자좌에 삽입 된 mCherry 구축물의 적절한 통합 및 순도는 PCR에 의해 확인되었다. 생성된 바이러스에는 E3L 및 E5R 유전자가 모두 없었다. 엔지니어링의 이후 단계를 용이하게 하기 위하여, FRT 부위가 E3L 결실에 사용되는 구축물에 포함되었다. 그 구축물은 p7.5 프로모터에 근접한 하나의 FRT 부위와 mCherry에서 멀리 떨어진 또 다른 FRT 부위를 가졌다. 세 번째 단계에서, 이 바이러스는 바이러스의 추가 조작이 필요할 때, 바이러스 게놈에서 mCherry를 제거하기 위하여 Flp 재조합 효소를 발현하는 세포에서 복제하는 것이 허용되었다.
실시예 109: MVA△E3L△E5R은 MVA△E5R과 비교하여 BMDC에서 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하고 유도는 cGAS에 크게 의존한다.
백시니아 E3는 N-말단 Z-DNA 및 C-말단 dsRNA-결합 도메인을 갖는 중요한 독성 인자이다. VACV△E3L의 비강내 감염은 비강내 감염 모델에서 비병원성이다. MVA△E3L은 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 I형 IFN을 유도한다 (Dai et al., Plos Pathogens 2014). MVA△E3L△E5R이 MVA△E5R, 열-iMVA 또는 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 I형 IFN을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, WT C57BL/6J 및 cGAS-/- 마우스의 BMDC (1 x 106)를 10의 MOI에서 MVA△E3L△E5R, MVA△E5R, 열-iMVA 또는 MVA에 감염시켰다. 감염 후 6시간에 세포를 수집하였다. IFNB 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 확인되었다. 결과는 MVA△E3L△E5R이 WT BMDC에서 MVA△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한다는 것을 보여준다. MVA△E5R-유도된 IFNB 유전자 발현은 cGAS-/- 세포에서 완전히 소실되는 반면, MVA△E3L△E5R-유도된 IFNB 유전자 발현은 cGAS-/- 세포에서 크게 감소하여, 예를 들어 MDA5/MAVS-매개 세포질 dsRNA-감지 경로와 같은 추가 경로가 BMDC에서 이 바이러스에 의해 생성된 dsRNA를 검출하는데 작은 역할을 할 수 있음을 시사한다 (도 136).
실시예 110: 뮤린 B16-F10 흑색종 세포의 MVA△E3L△E5R 감염은 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 강력하게 유도한다.
MVA△E3L△E5R 및 MVA△E5가 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 IFNB 유전자 발현 및 단백질 분비를 유도할 수 있는지 여부를 시험하였다. B16-F10 세포는 10의 MOI에서 MVA△E3L, MVA△E5R 또는 MVA△E3L△E5R로 감염되었다. 세포는 감염 후 15시간에 수집되었다. 상청액은 감염 후 24시간에 수집되었다. RT-PCR 분석은 B16-F10 뮤린 흑색종 세포의 MVA△E3L△E5R 감염이 MVA△E3L 또는 MVA△E5R(각각 300 또는 50 배)와 비교하여 IFNB (4000 배)의 매우 강력한 유도를 유도한다는 것을 보여주었다. 이 차이는 매우 현저했다(p<0.0001)(도 137a). 이는 E3L 및 E5R 유전자의 결실이 상승작용 효과가 있음을 나타낸다. ELISA 결과는 B16-F10 세포의 MVA△E3L△E5R 감염이 MVA△E3L에 감염된 세포와 비교하여 감염된 세포의 상청액에서 훨씬 더 높은 수준의 IFN-β 단백질 수준을 유도함을 보여준다 (각각 3498 pg/ml 대 479 pg/ml). MVA△E5R은 B16-F10 세포에서 IFN-β 단백질 분비를 유도하지 못한다. B16-F10 세포에서 MVA△E3L△E5R 감염을 검출하는데 중요한 핵산 감지 경로를 시험하기 위하여 CRISPR-cas9를 사용하여 MDA5-/- 및 MDA5-/-Sting-/- B16-F10 세포주를 생성하고 표적 단백질에 대한 웨스턴 블롯과 표적 엑손의 시퀀싱을 사용하여 각 단백질 및 유전자의 손실을 검증하였다. 이러한 결과는 RT-PCR 및 ELISA에서 MVA△E3L△E5R에 의한 IFNB의 강력한 유도가 MDA5-/- 세포에서 현저하게 감소된 수준으로 나타난 바와 같이 대체로 MDA5 의존적임을 보여준다.
실시예 111: 뮤린 B16-F10 흑색종 세포의 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L 감염은 감염된 세포 표면에서 hFlt3L 및 mOX40L 발현을 강력하게 유도한다.
E3L 유전자의 결실이 hFlt3L 또는 mOX40L의 발현에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위하여, B16-F10 세포를 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVA△E3L△E5R 로 1시간 동안 감염시켰다. 세포를 세척하고 신선한 배지에서 항온처리하였으며 24시간 후에 채취하였다. 항-hFlt3L 및 항-mOX40L 항체로 세포를 염색하고 FACS를 수행하였다. 도 138은 MVA△E3L△E5R hFlt3L-mOX40L 또는 MVA△E5R hFlt3L-mOX40L로 감염된 B16-F10 세포의 표면에서 mOX40L 또는 hFlt3L 세포의 발현을 입증하는 FACS의 대표적인 점 도표를 보여준다. 대조군 바이러스 MVA△E3L△E5R-감염된 B16-F10 세포는 예상대로 hFlt3L 및 mOX40L을 발현하지 못한다. 이러한 결과는 E3L 유전자의 결실이 2개의 트랜스유전자 hFlt3L 및 mOX40L의 발현에 영향을 미치지 못함을 나타낸다.
실시예 112: MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달은 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L와 비교하여 더 강력한 항종양 전신 T 세포 반응을 유도한다.
MVA△E3L△E5R에 의한 BMDC 및 B16-F10의 감염은 cGAS/STING에 의해 매개되는 세포질 DNA-감지 경로와 MDA5/MAVS에 의해 매개되는 세포질 dsRNA-감지 경로 모두를 활성화함으로써 MVA△E5R와 비교하여 더 강력한 I형 IFN 생성을 유도한다는 점을 감안할 때, 이론에 얽매이지 않고, MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L 바이러스의 IT 전달이 더 강력한 항종양 면역 반응을 유도할 것이라는 가설을 세웠다. 이를 시험하기 위하여 B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다 (오른쪽 옆구리에 5 x 105, 왼쪽 옆구리에 2.5 x 105). 종양 이식 7일 후, 2 x 107 pfu의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L, MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L, 동등한 양의 열-iMVA 또는 PBS를 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 주 2회, 3일 간격으로 종양내(IT) 주사하였다. 2차 주사 2일 후에 비장을 채취하고, 비장의 종양 특이적 T 세포를 평가하기 위하여 ELISPOT 분석을 수행하였다. ELISPOT 분석은 조사된 B16-F10 세포(150,000개)와 비장세포(1,000,000개)를 96-웰 플레이트에서 공동배양하여 수행하였다. 도 139a는 동일한 처치 그룹의 마우스로부터의 조합된 비장세포의 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지를 보여준다. 도 139b는 1,000,000 비장세포당 IFN-γ+ 스폿의 그래프를 보여준다. 이러한 결과는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 열-iMVA과 비교하여 처치된 마우스의 비장에서 가장 강력한 항종양 T 세포 반응을 생성했음을 보여준다. 이러한 결과는 종양에서 MDA5/MAVS에 의해 매개되는 세포질 dsRNA-감지 경로의 활성화가 강력한 항종양 적응 면역 반응을 생성하는 데 중요할 수 있음을 시사한다.
실시예 113: MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내 전달은 B2M-결여 B16-F10 세포를 지연시킨다.
베타 2 마이크로글로불린(B2M) 유전자에서 돌연변이는 면역 체크포인트 차단 요법 후 내성과 함께 재발하는 종양에서 관찰되었다. MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 이러한 종양에 대해 효과적인지 시험하기 위하여 CRISPR-cas9 기술을 사용하여 B2M 결여 B16F10 종양 모델을 생성하였다. 베타 2 마이크로 글로불린(B2M)은 MHC 클래스I 복합체의 필수 구성 요소이다. FACS 분석은 항-B2M gRNA로 형질주입된 세포만 고주파에서 표면 MHC를 잃어버리는 것을 보여주어, 효과적인 CRISPR을 나타냈다 (데이터는 표시되지 않음). 세포 분류는 표면 MHC 클래스 I이 없는 세포를 단리시키는데 사용되었다. 시퀀싱 및 후속 생체 내 실험을 위하여 이 분류로부터 단일 클론 단리물을 선택하였다. 이 B2M -/- 클론 단리물은 B2M의 엑손 2에서 178 BP 결실을 가졌으며, 이는 B2M의 코딩 서열의 절반을 제거하고 프레임 이동을 생성한다(데이터는 표시되지 않음).
WT 및 B2M-/-B16-F10 흑색종 세포(2.5x105)를 C57B/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피내 이식하였다. B2M 종양을 성공적으로 이식하기 위하여, WT 또는 B2M-/-B16-F10 세포를 이식한 마우스에서 PK136 항체(-1, 2 및 5 일차에 200 ㎍/마우스)를 사용하여 NK 세포를 고갈시켰다. 종양은 10일 동안 성장하도록 허용되었다. 그 후, 4 x 107 pfu의 MVA△E3L△E5R hFlt3L-mOX40L 또는 PBS를 주 2회 종양내(IT) 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터링 하였다 (도 140).
도 141a는 PBS 또는 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L를 종양내로 처치한 마우스에서 주사된 WT 및 B2M-/-B16-F10 종양의 종양 부피를 보여준다. WT 및 B2M-/-B16-F10 종양 모두 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 처치에 종양 성장 지연으로 반응하였다. 도 141b는 4개 그룹의 카플란 마이어 생존 곡선을 보여준다. IT MVA△E3L△E5R hFlt3L-mOX40L 바이러스는 B2M 결여 또는 WT B16-F10 종양을 가진 마우스에게 명백한 생존 이점을 생성하였다. 24일차까지, 처치되지 않은 마우스는 한 마리도 살아남지 못한 반면 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L로 처치된 B2M-/- 종양이 있는 모든 마우스는 살아 남았다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 114: MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 AT3 삼중 음성 유방암 모델에서 주사된 종양에서의 CD8 + T 세포 활성화 및 증식을 유도한다
유방 종양에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 및 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의해 유도된 면역 반응을 비교하기 위하여, 양측 AT3 뮤린 유방 종양 이식 모델이 사용되었다 (도 142). 간단하게, 1 x 105 AT3 세포를 C57BL/6J 마우스의 4 번째 지방 패드에 이식하였다. 종양 이식 12일 후, 6 x 107 pfu 의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L, 또는 PBS를 3일 간격으로 두 번 종양내 주사하였다. 2차 주사 2일 후, 주사된 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4, CD8 및 OX40 항체로 표면 표지 및, 세포 내 그랜자임 B, Ki67 및 FoxP3 염색을 위하여 처리하였다. 종양내 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L은 PBS와 비교하여 CD45+ 세포 중 CD8+ T 세포의 비율을 더 높게 유도한다 (도 143b). IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L을 사용한 CD8+ T 세포의 절대 수는 PBS 및 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L와 비교하여 더 높았다 (도 143c). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L은 모두 PBS에 비해 그랜자임 B+ CD8+ T 세포의 비율을 증가시켰다 (도 143a, d). IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L을 사용한 그랜자임 B+CD8+ T 세포의 절대 수는 PBS 및 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L와 비교하여 더 높았다 (도 143e). IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L은 또한 Ki67 +CD8+ T 세포의 더 높은 비율과 절대 수를 유도하였다(도 144a-c). 이러한 결과는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 AT3 유방암 모델에서 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L과 비교하여 CD8 T 세포를 활성화하고 CD8+ T 세포 증식을 촉진하는 데 더 효과적임을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 바이러스 구축물이 고형 종양 치료 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 115: MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 CD4 + T 세포를 활성화하고 AT3 삼중 음성 유방암 모델에서 주사된 종양에서의 조절 T 세포를 감소시킨다.
유방 종양에서 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 및 MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 IT 주사에 의해 유도된 면역 반응을 비교하기 위하여, 실시예 114에 기재된 바와 같이 양측 AT3 뮤린 유방 종양 이식 모델을 사용하였다 (도 142). IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L 이후, CD3+ T 세포 중 총 CD4+ T 세포의 비율은 PBS (도 145b)와 비교하여 변하지 않았지만 CD4+ T 세포의 절대 수는 바이러스 주사 후 현저하게 증가하였다 (도 145c). IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L은 또한 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 PBS에 비해 더 많은 그랜자임 B+ D4+ T 세포를 생성하였다 (도 145e). IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 또는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L는 모두 PBS와 비교하여 CD4+ FoxP3+ T 세포의 비율을 크게 감소시키는 결과를 초래하였다 (도 146a, 146b). OX40+ CD4+ FoxP3+ T 세포의 비율은 바이러스 주사 후 감소하였다 (도 147a-c). 이러한 결과는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 AT3 유방암 모델에서 CD4+ T 세포 활성화를 유도하고 조절 T 세포를 감소시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 116: MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 종양내(IT) 주사는 AT3 삼중 음성 유방암 모델에서 주사된 종양의 대식세포 및 DC를 감소시킨다.
IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 유방 종양에서 골수 세포군에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위하여, 실시예 114 (도 142)에 기재된 바와 같이 양측 AT3 뮤린 유방 종양 이식 모델을 사용하였다. 2차 주사 2일 후, 주사된 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD19, CD49b, CD45, MHC-II, CD11c, Ly6G, F4/80, Ly6C 및 CD24 항체로 표면 표지를 위하여 처리하였다. 종양의 살아있는 면역 세포 침윤은 FACS에 의해 분석되었다. IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L은 PBS와 비교하여 총 CD45+ 세포에서 대식세포의 비율과 수를 현저하게 감소시켰다 (도 148a, b). 수지상 세포의 비율은 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L 및 IT MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 사용하여 감소하였으며 (도 148c), CD11b+ 및 CD103+ DC의 비율 모두 감소하였다 (도 148e-h). 이러한 결과는 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L이 AT3 유방암 모델에서 주사된 종양의 대식세포와 DC를 감소시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 117: 자연적 유방암은 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L과 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체의 전신 전달의 조합 요법에 반응한다.
삼중 음성 유방암에서 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체와 조합된 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L의 치료 효능을 평가하기 위하여, MMTV-PyMT 자연적 유방암 모델이 사용되었다. 첫 번째 종양이 만져지면, MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L을 종양에 주사하기 시작하였다. 250 μg의 항-PD-L1 및 100 μg의 항-CTLA-4 항체를 각 마우스에게 복강내로 투여하였다. 종양 크기는 주 2회 측정되었다 (도 149). 조합 처치는 PBS 대조군과 비교하여 종양 성장을 지연시켰다 (도 150). 이러한 결과는 자연적 유방암이 IT MVA△E3L△E5R-hFlt3L-mOX40L과 항-PD-L1 및 항-CTLA-4 항체의 전신 전달의 조합 요법에 반응한다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스 구성이 고형 종양 치료 방법에 유용함을 보여준다.
실시예 118: MVA△E5R hFlt3L-mOX40L△C11R 재조합 바이러스의 생성
백시니아 C11R은 백시니아 성장 인자를 코딩한다. WT 백시니아 (Western Reserve) 게놈에는 두 개의 복제본이 있는 반면 MVA 게놈에는 하나의 복제본이 있다. C11 유전자는 이중-루시퍼 라아제 스크리닝 분석에서 cGAS/STING 경로를 억제하는데 관여하는 8개의 백시니아 초기 유전자 중 하나로 확인되었다 (도 19 및 20). MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에서 C11R 유전자의 결실이 바이러스의 I형 IFN 유도 능력을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, 재조합 바이러스 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40LC11R이 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 게놈의 C17L/C16L 및 C10L 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다 (도 151).
실시예 119: MVA△E5R hFlt3L-mOX40L△C11R은 MVA△E5R hFlt3L-mOX40L와 비교하여 BMDC에서 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
MVA△E5R-hFlt3L-mOX40LC11R이 MVAE5R와 비교하여 더 높은 수준의 I형 IFN을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, WT C57BL/6J 마우스로부터의 BMDC(1 x 106)를 10의 MOI에서 MVA△E5R-hFlt3L- mOX40LC11R, 또는 MVA△E5R, 또는 MVA로 감염시켰다. 감염 후 6시간에 세포를 수집 하였다. 상청액은 감염 후 19시간에 수집되었다. IFNB 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 결정되었다. 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△C11R이 MVA△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한다는 것을 보여준다 (도 152a).
상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA에 의해 측정되었다 (도 152b). 결과는 BMDC의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△C11R 감염이 MVA△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에서 C11R 유전자를 제거하면 바이러스의 IFN 유도 능력이 더욱 향상된다는 것을 나타낸다
실시예 120: MVA△WR199 및 MVA△E5R hFlt3L-mOX40L△WR199 재조합 바이러스의 생성.
백시니아 WR199 유전자는 68-Kda 안키린-반복 단백질을 코딩하며, cGAS/STING 경로의 억제제 스크리닝에서 확인된 8개의 백시니아 초기 유전자 중 하나이다 (도 19). MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에서 WR199 유전자의 결실이 각각 바이러스의 I형 IFN 유도 능력을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, 재조합 바이러스 MVA△WR199 및 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△WR199는 MVA 및 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L 게놈의 B17L 및 B19R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성되었다 (도 153). FRT 부위는 mcherry를 코딩하는 유전자의 측면 영역에 위치하여 바이러스의 추가 조작을 위한 형광색 제거를 용이하게 하였다.
실시예 121: MVA 또는 MVA△E5R hFlt3L-mOX40L에서 WR199 유전자의 결실은 BMDC에서 바이러스의 IFNB 유전자 유도 능력을 향상시킨다.
MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에서 WR199 유전자의 결실이 더 높은 수준의 I형 IFN을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, WT 및 cGAS-/-C57BL/6J 마우스로부터의 BMDC (1 x 106)를 10의 MOI에서 MVA 또는 MVA△WR199 또는 동일한 양의 열-iMVA로 감염시켰다. 세포는 감염 후 6시간에 수집되었다. 상청액은 감염 후 19시간에 수집되었다. IFNB 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 결정되었다. 결과는 BMDC에서 MVA△WR199가 MVA와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하지만, 열-iMVA와 비교하여 더 낮은 수준의 IFNB를 유도한다는 것을 보여준다 (도 154a). cGAS-/-BMDC에서, MVA△WR199-유도된 IFNB 유전자 유도는 완전히 손실되었다 (도 154a).
MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△WR199의 4개의 단리시킨 클론. BMDC가 생성되었고 세포는 4개의 클론, MVA△WR199 또는 MVA△E5R 중 하나로 감염되었다. RT-PCR 분석은 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△WR199가 MVA△E5R 또는 MVA△WR199와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도함을 보여주었다 (도 154b).
상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA에 의해 결정되었다 (도 154c). 결과는 BMDC의 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L△WR199 감염이 MVA△E5R 또는 MVA△WR199와 비교하여 더 높은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 MVA 또는 MVA△E5R-hFlt3L-mOX40L에서의 WR199 유전자 제거는 바이러스의 IFN 유도 능력을 더욱 향상시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 122: B2R이 결실된 재조합 백시니아 바이러스(VACV△B2R)의 생성.
최근에 백시니아 B2R 유전자가 cGAS에 의해 매개되는 세포질 DNA-감지 경로의 면역 회피에 기여하는 2',3'-사이클릭 GMP-AMP(cGAMP)를 분해하는 뉴클레아제를 코딩하는 것으로 보고되었다 (Eaglesham et al., 2019). 이 유전자는 폭스바이러스 과 사이에서 고도로 보존되어 있다. 그러나 MVA의 B2R 유전자는 절단되고 단백질은 비활성이다. vTF7-3 웨스턴 리저브 균주에서 B2R 결실이 있는 돌연변이체 백시니아, 여기서 백시니아 티미딘 키나아제 유전자(TK)가 생성되었고 피부 난절 모델에서 모 바이러스보다 더 약화되는 것으로 밝혀졌다. TK 결실과 무관하게 B2R 유전자 결실이 바이러스 독성에 미치는 영향을 시험하기 위하여, VACV△B2R 돌연변이체 바이러스를 생성하고 비강내 감염 모델에서 바이러스의 독성을 평가하였다.
간단하게, pB2R-FRT GFP 벡터를 사용하여 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP를 백시니아 바이러스(VACV; 웨스턴 리저브 균주)의 B2R 유전자좌에 삽입하였다. 발현 카세트는 양측에 B1R 및 B3R 유전자의 부분 서열이 측면에 위치한다(도 155). BSC40 세포를 0.05의 MOI에서 1시간 동안 WT 백시니아 바이러스로 감염시킨 다음 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 GFP가 B2R 유전자좌에 삽입되어 녹색 형광으로 식별되었다. 양성 클론은 BSC40 세포에서 4-5회 플라크 정제되었다. 재조합 바이러스 VACV△B2R이 B2R 유전자를 잃었는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
실시예 123: 백시니아 B2R 유전자는 독성 인자를 암호화한다.
백시니아 바이러스 B2R 유전자가 비강내 감염 모델에서 독성에 기여하는지 여부를 확인하기 위하여, 6주령 WT 암컷 C57BL/6J 마우스 그룹을 2개의 상이한 용량(2 x107 또는 2 x106 pfu)의 VAVC△B2R 로 비강내 감염시켰다. VACV△B2R로 비강내 감염 후 C57BL/6J 마우스의 체중 감소 및 생존을 모니터링하였다. 각각의 용량에서 VACV△B2R의 감염은 감염 후 6일 즈음에 최대 체중 감소 (초기 체중의 약 20%)를 초래하였다. 마우스는 감염 후 13일에 체중이 회복되었고 모두 생존하였다(도 156a 및 b). 이러한 결과는 VAVC△B2R이 2x105 pfu의 LD50를 가지는 WT VACV와 비교하여, 비강내 감염 모델에서 매우 약화된다는 것을 시사한다.
실시예 124: 재조합 백시니아 바이러스 VACV△E5RB2R 및 VACV△E3L83N△E5R△B2R의 생성.
N-말단 83개 아미노산 Z-DNA 결합 도메인을 코딩하는 DNA 단편이 없는, WT VACV 백그라운드 또는 VACV△E3L83N에서 B2R 및 E5R 유전자 둘 모두의 화합물 결실 효과를 시험하기 위하여, VACV△E5R△B2R 및 VACV△E3L83N△E5R△B2R이 생성되었다. 간단하게, pB2R-FRT GFP 벡터를 사용하여 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP를 돌연변이체 백시니아 바이러스 VACV△E5R (도 157a) 또는 VACV△E3L83N 바이러스에서 E5R 유전자의 결실로 생성된 VACV△E3L83N△E5R (도 157b)의 B2R 유전자좌에 삽입하였다. 발현 카세트는 양측에 B1R 및 B3R 유전자의 부분 서열이 측면에 위치한다 (도 157).
BSC40 세포를 VACV△E5R 또는 VACV△E3L83N△E5R로 1시간 동안 0.05의 MOI로 감염시킨 다음, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 GFP가 B2R 유전자좌에 삽입되어 녹색 형광으로 식별되었다. 양성 클론은 BSC40 세포에서 4-5회 플라크 정제되었다. 재조합 바이러스 VACV△E5R△B2R 및 VACV△E3L83N△E5R△B2R이 B2R 유전자를 상실했는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
실시예 125: 재조합 백시니아 바이러스 VACV△E5R△B2R 및 VACV△E3L83N△E5R△B2R은 뮤린 비강내 감염 모델에서 고도로 약화된다.
6 주령 WT 암컷 C57BL/6J 마우스의 비강내 감염은 2 x 107 pfu의 VACV△E5R, VACV△B2R, VACV△E3L83N△E5R, VACV△E5R△B2R, 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R로 수행되었다. 마우스의 체중 감소 및 생존을 모니터링하였다 (도 158). VACV△E3L83N△E5R△B2R 감염은 이들 마우스에서 최소 체중 감소를 가져왔고, 최대 체중 감소는 초기 체중의 약 10%였다 (도 158). VACV△E5R△B2R 감염은 또한 VAC△VE5R 또는 VACV△B2R와 비교하여 체중 감소가 적었다 (도 158). 모든 마우스는 감염에서 생존하였다. 이러한 결과는 B2R 및 E5R 또는 B2R, E5R 및 E3L83N의 화합물 결실이 바이러스의 추가 약화를 초래함을 나타낸다.
실시예 126: 골수-유래된 수지상 세포 (BMDC)의 VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R 감염은 VACV△B2R 또는 VACV△E5R보다 더 높은 수준의 I형 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
백시니아 E5R 유전자 발현은 cGAS 분해를 유도한다(실시예 63 및 64). 백시니아 B2R 유전자는 cGAS의 산물인 cGAMP를 분해하는 뉴클레아제를 코딩한다. 이론에 얽매이지 않고, 백시니아 게놈에서 B2R 및 E5R 유전자의 이중 결실이 감염된 BMDC에서 향상된 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비의 유도를 이끌 수 있다는 가설이 세워졌다.
이를 시험하기 위하여, WT 및 cGAS-/-BMDC를 10의 MOI에서 VACV△E3L83N△E5R, VACV△E5R△B2R, VACV△E3L83N△E5R△B2R, VACV△E3L83N, VACV△B2R 또는 VACV△E5R, 또는 그와 동등한 양의 열-iMVA로 감염시켰다. 세포는 감염 후 6시간에 수집되었다. RNA가 추출되었다. IFNB 유전자 발현 수준은 정량적 PCR 분석에 의해 결정되었다. 감염 후 24시간에 상청액을 수집하고 ELISA로 IFN-β 수준을 측정하였다. RT-PCR 결과는 BMDC의 WT VACV 감염이 미처치 대조군과 비교하여 225배 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하고, VACV△E3L83N, VACV△B2R 또는 VACV△E5R, VACV△E3L83N△E5R 감염은 미처치 대조군과 비교하여 각각 223, 410, 3054, 3117배 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한 것으로 나타났다. VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R 감염은 미처치 대조군과 비교하여 9970 및 10383 배 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하였다 (도 159a). ELISA 결과는 BMDC의 VACV△B2R, VACV△E5R 또는 VACV△E3L83N△E5R 감염이 BMDC에서 IFN-β 단백질 분비를 유도하여 상청액에서 각각 22, 232 및 189 pg/ml의 IFN-β 수준을 유도하는 것으로 나타났다. VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R 감염은 상청액에서 700 및 763 pg/ml의 IFN-β로 더 높은 수준의 IFN-β 분비를 유도하였다 (도 159b). cGAS-/- BMDC에서, 약화된 백시니아는 IFNB 유전자 발현 또는 IFN-β 단백질 분비를 유도하지 못한다 (도 159a 및 159b).
이러한 결과는 B2R 및 E5R의 조합된 결실이 단일 B2R 또는 E5R 결실과 비교하여 BMDC로부터 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비를 유도함을 나타낸다. 그리고 약화된 돌연변이체 백시니아에 감염된 BMDC로부터 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 단백질 분비 유도는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 127: 골수-유래된 수지상 세포(BMDC)의 VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R 감염은 VACV△B2R 또는 VACV△E5R와 비교하여 STING, TBK1 및 IRF3의 더 높은 수준의 인산화를 유도한다.
WT VACV 게놈에서 B2R 및 E5R의 이중 결실 또는 WT VACV 게놈에서 E3L83N, B2R 및 E5R의 삼중 결실이 cGAS-STING 신호 전달 경로의 더 강력한 활성화를 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, BMDC를 VACV, VACV△B2R, VACV△E5R, VACV△E3L83N△E5R, VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5RB2R로 10의 MOI에서 감염시켰다. 세포 용해물은 감염 후 2, 4 및 6시간에 수집되었다. 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고, 인산화된 STING, TKB1 및 IRF3에 대한 항체로 블롯팅하였다. VACV△E5R△B2R 또는 VACV△E3L83N△E5R△B2R은 VACV△B2R 또는 VACV△E5R와 비교하여 감염된 BMDC에서 STING, TBK1 및 IRF3의 더 높은 수준의 인산화를 유도하였다 (도 160). 이러한 결과는 WT VACV 게놈에서 B2R 및 E5R의 이중 결실 또는 WT VACV 게놈에서 E3L83N, B2R 및 E5R의 삼중 결실이 cGAS/STING/TBK1/IRF3 신호 전달 경로의 더 강력한 활성화를 초래함을 나타낸다.
실시예 128: 재조합 백시니아 바이러스 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 (OV-VACV△E5R) 또는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-B2R (OV-VACV△B2R)의 생성.
본 실시예는 재조합 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R 바이러스의 생성을 설명한다.
도 161은 항-muCTLA-4, hFlt3L, mOX40L 및 mIL12 단백질을 발현하는 재조합 VACV△E3L83N△TK△E5R 바이러스를 먼저 VACV△E3L83N 게놈의 TK 유전자좌에서, 그 다음 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하는 단계적 전략을 보여준다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L) 제어 하의 항-muCTLA-4 항체 중쇄 및 경쇄를 발현시키기 위한 단일 발현 카세트를 삽입하기 위하여 pCB-항-muCTLA-4 gpt 벡터를 사용하였다. TK-L 및 TK-R 부위에서 발생한 상동 재조합은 항-CTLA-4 항체의 발현 카세트를 VACV△E3L83N 게놈의 TK 유전자좌에 삽입하여, 재조합 바이러스 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4를 생성하였다.
백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 반대 방향으로 사용하여 hFlt3L-mOX40L 융합 단백질과 mIL12 단백질 모두를 개별적으로 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하는데 pUC57-hFlt3L-mOX40L-mIL12 mCherry 벡터가 사용되었다. hFlt3L-mOX40L의 코딩 서열은 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되었다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합은 hFlt3L-mOX40L 및 mIL12에 대한 발현 카세트를 VACV△E3L83N-TK-항-muCTLA-4 바이러스의 E5L 유전자좌에 삽입하는 결과를 가져왔다. BSC40 세포는 0.05의 MOI에서 1시간 동안 VACV△E3L83N으로 감염된 후, 플라스미드 pCB-항-muCTLA-4 gpt로 형질주입되었다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함하는 선별 배지에서 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크 정제하였다. 항-muCTLA-4 유전자가 TK 유전자좌에 삽입되었는지 검증하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
hFlt3L-mOX40L-mIL12 발현 카세트를 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4 바이러스의 E5R 유전자좌에 삽입하기 위하여, BSC40 세포를 0.05의 MOI에서 1시간 동안 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4로 감염시킨 다음, 플라스미드 pUC57-hFlt3L-mOX40L-mIL12 mCherry로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 mCherry 양성 플라크를 선택하여 4-5 회 이상 플라크 정제를 통해 단리시켰다. E5R 유전자좌로의 hFlt3L-mOX40L-mIL12 유전자의 삽입을 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
도 162는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스에서 B2R 유전자의 결실을 통한 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-B2R 바이러스의 생성을 보여준다. pB2R-FRT GFP 벡터를 사용하여 백시니아 P7.5 프로모터 제어 하의 GFP를 재조합 바이러스 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12의 B2R 유전자좌에 삽입하였다. BSC40 세포를 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스로 MOI 0.05에서 1시간 동안 감염시킨 다음, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 GFP가 B2R 유전자좌에 삽입되어 녹색 형광과 모바이러스의 mCherry에 의해 확인되었다. 양성 클론은 BSC40 세포에서 4-5 회 플라크 정제되었다. 재조합 바이러스 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스가 B2R 유전자를 상실했음을 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
실시예 129: VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 및 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R은 BSC40 세포 및 B16-F10 흑색종 세포에서 복제 가능하다.
BSC40 세포와 뮤린 B16-F10 흑색종 세포에서 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 및 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R(OV-VACV△E5R△B2R)의 복제 능력은 이들을 0.01의 MOI에서 감염시켜 결정하였다. 세포는 감염 후 다양한 시점에서 수집되었고 바이러스 수율(log pfu)은 BSC40 세포에 대한 적정에 의해 결정되었다. 도 163은 감염 후 시간에 대한 바이러스 수율 그래프를 보여준다. VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 및 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R 모두 BSC40 세포 및 B16-F10 흑색종 세포에서 효율적으로 복제된다.
실시예 130: VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 및 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R(OV-VACV△E5R△B2R) 의 BMDC 감염은 I형 IFNB 유전자의 발현과 IFN-β 단백질의 분비를 유도한다.
재조합 바이러스 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 및 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-B2R(OV-VACV△E5R△B2R)가 BMDC에서 I형 IFN 생산을 유도하는지 시험하기 위하여, WT 및 cGAS-/-BMDC를 10의 MOI에서 이러한 바이러스에 감염시켰다. 감염 6시간 후 세포를 수집하였다. RNA를 추출하였다. IFNB 유전자 발현 수준은 정량적 RT-PCR 분석에 의해 확인되었다. 감염 후 24시간에 상청액을 수집하고 상청액의 IFN-β 수준을 ELISA로 측정하였다. RT-PCR 결과는 BMDC의 WT VACV 감염이 미처치 대조군과 비교하여 225배 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도한 반면, VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R 감염은 비감염 대조군과 비교하여 각각 1546배 및 5501배 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도했음을 보였다 (도 164a). OV-VACV△E5R△B2R 또는 OV-VACV△E5R에 의한 IFNB 유전자 발현 유도는 cGAS-/- BMDC에서 폐지되었다.
ELISA 결과는 BMDC의 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-B2R 감염은 BMDC에서 IFN-β 분비를 유도함을 보였다 (도 164b). 이러한 결과는 BMDC에서 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 또는 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R(OV-VACV△E5R△B2R)은 WT VACV보다 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 단백질 분비를 유도했음을 나타낸다. 또한, BMDC의 OV-VACV△E5R△B2R 감염은 OV-VACV△E5R와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 분비를 유도한다 (도 164). 따라서 OV-VACV△E5R△B2R은 OV-VACV△E5R와 비교하여 더 면역 활성화시킨다.
실시예 131: E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL12 바이러스에 감염된 B16-F10 흑색종 세포에서 항-muCTLA-4-hFlt3L, mOX40L의 발현.
VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 재조합 바이러스가 원하는 트랜스유전자를 발현할 수 있는지 확인하기 위하여, B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 10의 MOI에서 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R)로 감염시켰다. 세포 용해물은 감염 후 다양한 시간(8, 24 및 48시간)에 수집되었다. 항-muCTLA-4 및 hFlt3L 단백질의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 165a에 나타낸 바와 같이, VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스로 감염된 B16-F10 세포에서 항-muCTLA-4 항체 및 hFlt3L의 발현이 풍부하였다. B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 또한 10의 MOI에서 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12로 감염시켰고, 세포 표면에서의 mOX40L의 발현은 FACS 분석에 의해 확인되었다. 도 165b에 나타난 바와 같이, 감염된 세포의 99.5%가 세포 표면에서 mOX40L을 발현했다. 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 감염된 세포에서 관심있는 특정 트랜스유전자를 발현하는 능력을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 132: 종양내 주사된 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스는 생체 내 이식된 종양에서 원하는 트랜스유전자를 발현하는 능력을 가지고 있다.
재조합 바이러스가 생체 내 이식 된 종양에서 특정 트랜스유전자를 발현할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여 편측 종양 이식 모델을 사용하였다. B16-F10 흑색종 세포(5 x 105 세포)를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 종양 이식 8일 후 종양(직경 약 4mm)에 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스를 주사하였다. 종양 샘플은 바이러스 주사 후 48시간에 수집되었다. 웨스턴 블롯 분석은 mIL-12를 발현하는 재조합 바이러스로 처치된 종양에서 mIL-12가 검출되었지만, PBS 처치된 종양에서는 검출되지 않았음을 보여주었다 (도 165c). 이러한 결과는 재조합 VACV△E3L83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스가 생체 내 주사된 종양에서 원하는 특정 트랜스유전자를 발현할 수 있음을 보여준다.
실시예 133: E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스의 감염을 통한 뮤린 B16-F10 흑색종 세포, 4T1 유방암 세포 및 MC38 결장암 세포로부터 mIL-12의 분비.
재조합 바이러스에 감염된 세포가 원하는 단백질을 분비할 수 있는지 조사하기 위하여, B16-F10 뮤린 흑색종 세포, 4T1 유방암 세포 및 MC38 결장암 세포가 모의 감염, 또는 10의 MOI에서 VACV 또는 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 (OV-VACV△E5R)로 감염되었다. 감염 후 24시간 및 48시간에 상청액을 수집하였다. ELISA를 사용하여 상청액 내의 분비된 mIL-12의 농도를 측정하였다. 도 166에 나타낸 바와 같이, E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R) 바이러스에 감염된 B16-F10 흑색종 세포 (도 166a), 4T1 유방암 세포 (그림 166b) 및 MC38 결장암 세포 (그림 166c)의 상청액에는 높은 수준의 mIL-12 단백질이 있다. 이러한 결과는 종양 세포의 OV-VACV△E5R 감염이 mIL-12 방출로 이어진다는 것을 보여준다. mIL-12 독성을 피하기 위하여, 세포 외 기질(matrix) 태그를 IL12 p30 서브 유닛의 C-말단에 삽입하였다. mIL12의 p40 및 p30 서브 유닛의 코딩 서열은 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위에 의해 분리된다. p30 서브 유닛의 C-말단은 기질 결합 서열로 태그된다.
실시예 134: E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12(OV-VACV△E5R)의 종양내 주사는 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 HT-iMVA보다 더 효과적이다.
재조합 바이러스 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12의 생체 내 종양 사멸 활성을 시험하기 위하여 양측 종양 이식 모델을 사용하였다. B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽(5 x 105 세포) 및 왼쪽(1 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 7 내지 8일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양(직경 약 3mm 이상)에 PBS, HT-iMVA, E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 + 항-PD-L1 항체의 복강내(IP) 주사(250 μg/마우스)로 주 2회 종양내 주사하였다. 마우스의 생존을 모니터링하고 종양 크기를 주 2회 측정하였다. 도 167a는 종양 부피를 나타내고 도 167b는 실험의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 도 167b는 PBS 모의 처치된 종양을 가진 마우스가 매우 빠르게 성장하고 마우스가 14일의 생존 중간값으로 사망했음을 보여준다. HT-iMVA의 종양내 주사는 생존 중간값을 18일로 연장시켰다. E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 주사는 생존 중간값을 30일로 증가시킨다. E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12의 종양내 주사 + 항-muPD-L1 항체의 IP 주사 (250 ㎍/마우스)는 또한 생존 중간값을 30일로 증가시켰다. 도 167a는 주사된 종양 및 비주사된 종양에 대해 시간 경과에 따라 측정된 종양 부피를 보여준다. 이러한 결과는 조작된 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 바이러스에 의한 항-muCTLA-4, hFlt3L, mOX40L 및 mIL-12의 발현이 주사 및 비주사 종양 모두에서 종양 부피를 줄이고 종양 성장을 늦출 수 있음을 보여줌으로써, 압스코팔 효과를 보여준다. 따라서, 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
실시예 135: E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12△B2R의 종양내 전달은 E3L△83N-△TK- 항 -muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 열-iMVA과 비교하여 더 강한 항종양 전신 T 세포 반응을 유도한다.
BMDC의 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R 감염은 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12과 비교하여 더 강력한 I형 IFN 생산을 유도한다. 이론에 얽매이지 않고, E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R 바이러스의 IT 전달이 더 강력한 항종양 면역 반응을 유도할 것이라는 가설을 세웠다. E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12에서 B2R의 추가 결실이 항종양 효능을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6J 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 (오른쪽 옆구리에 5 x 105, 왼쪽 옆구리에 2.5 x 105) 피내 이식하였다. 종양 이식 7일 후, 2 x 107 pfu의 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R, E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 동등한 양의 열-iMVA 또는 PBS를 3일 간격으로 두 번 오른쪽 옆구리의 큰 종양에 종양내 주사하였다. 2차 주사 3일 후에 비장을 채취하고, 비장의 종양 특이적 T 세포를 평가하기 위하여 ELISPOT 분석을 수행하였다. ELISPOT 분석은 조사된 B16-F10 세포 (150,000개)와 비장세포 (1,000,000개)를 96-웰 플레이트에서 공동배양하여 수행하였다. 도 168a는 1,000,000 비장세포당 IFN-γ+ 스폿의 그래프를 보여준다. 도 168b는 동일한 처치군의 마우스로부터 조합된 비장세포의 삼중 샘플의 ELISPOT의 이미지를 보여준다. 이러한 결과는 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12-△B2R의 IT 주사가 E3L△83N-△TK-항-muCTLA-4-△E5R-hFlt3L-mOX40L-mIL-12 또는 열-iMVA 과 비교하여 처치된 마우스의 비장에서 가장 강력한 항종양 T 세포 반응을 생성했음을 보여준다.
실시예 136: TK-E3L△83N-E5R 결실을 포함하고 항-huCTLA-4, hFlt3L, hOX40L 및 hIL-12 를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV△E3L83N-△TK-항-huCTLA-4-△E5R-hFlt3L-hOX40L-hIL-12)의 생성.
본 실시예는 재조합 VACV△E3L83N-△TK-항-huCTLA-4-△E5R-hFlt3L-hOX40L-IL-12 바이러스의 생성을 설명한다.
도 169는 항-huCTLA-4, hFlt3L, hOX40L 및 hIL12 단백질을 발현하는 재조합 VACV△E3L83N△TK△E5R 바이러스를 먼저 VACV△E3L83N 게놈의 TK 유전자좌에서, 그 다음 E5R 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 생성하는 단계적 전략을 보여준다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L) 제어 하의 항-huCTLA-4 항체 중쇄 및 경쇄를 발현시키기 위한 단일 발현 카세트를 삽입하는데 pCB-항-huCTLA-4 gpt 벡터가 사용되었다. TK-L 및 TK-R 부위에서 발생한 상동 재조합은 항-huCTLA-4 항체의 발현 카세트를 VACV△E3L83N 게놈의 TK 유전자좌에 삽입하여, 재조합 바이러스 VACVE3L83N-TK-항-huCTLA-4를 생성한다. 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 반대 방향으로 사용하여 hFlt3L-hOX40L 융합 단백질과 hIL12 단백질 모두를 개별적으로 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하는데 pUC57-hFlt3L-hOX40L-hIL12 mCherry 벡터가 사용되었다. hFlt3L-hOX40L의 코딩 서열은 Pep2A 서열이 뒤따르는 퓨린 절단 부위를 포함하는 카세트에 의해 분리되었다. E4L 및 E6R 유전자좌에서 상동 재조합은 hFlt3L-hOX40L 및 hIL12에 대한 발현 카세트를 VACV△E3L83N-△TK-항-huCTLA-4 바이러스의 E5L 유전자좌에 삽입하는 결과를 가져왔다. BSC40 세포는 0.05의 MOI에서 1시간 동안 VACV△E3L83N으로 감염된 후, 플라스미드 pCB-항-muCTLA-4 gpt로 형질주입되었다. 감염된 세포는 바이러스 감염 후 48시간에 수집되었다. MPA, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함하는 선별 배지에서 추가 배양을 통해 재조합 바이러스를 선별하고 플라크 정제하였다. 항-muCTLA-4 유전자가 TK 유전자좌에 삽입되었는지 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. hFlt3L-hOX40L-hIL12 발현 카세트를 VACV△E3L83N-△TK-항-huCTLA-4 바이러스의 E5R 유전자좌에 삽입하기 위하여, BSC40 세포는 0.05의 MOI에서 1시간 동안 VACV△E3L83N-△TK-항-huCTLA-4로 감염된 후, 플라스미드 pUC57-hFlt3L-hOX40L-hIL12 mCherry로 형질주입된다. 감염된 세포는 바이러스 감염 후 48시간에 수집된다. mCherry 양성 바이러스 플라크를 선택하여 플라크 정제를 통해 재조합 바이러스를 단리시킨다. PCR 분석을 수행하여 hFlt3L-hOX40L-hIL12 유전자가 E5R 유전자좌에 삽입되었는지 확인한다. 백시니아 B2R, B18R 및 WR199 유전자는 이 바이러스의 선천적 면역 반응을 향상시키기 위하여 추가로 결실될 것이다.
실시예 137: 재조합 점액종 바이러스 Myxoma△M063R 및 Myxoma△M064R의 생성.
점액종 M063R(M63R) 및 M064R(M64R)은 백시니아 C7의 올소로그이다. 모 게놈에서 M063R 또는 M064R의 결실이 점액종 바이러스의 IFN 유도 능력을 향상시키는지 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 형질주입된 플라스미드와 모 점액종 바이러스 게놈의 상동성 팔에서 상 동 재조합을 통해 Myxoma△M063R 및 Myxoma△M064R을 생성하였다 (도 170). 백시니아 바이러스 합성 전기 및 후기 프로모터(PsE/L)를 사용하여 EGFP를 발현하도록 설계된 단일 발현 카세트를 삽입하는데 pUC57 벡터가 사용된다. M062R 및 M064R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 EGFP에 대한 발현 카세트의 삽입 및 M063의 결실을 초래한다. 유사하게, M063R 및 M065R 유전자좌에서 발생한 상동 재조합은 EGFP에 대한 발현 카세트의 삽입 및 M064의 결실을 초래한다. 간단하게, BGMK 세포를 0.05의 MOI에서 1시간 동안 모 점액종 바이러스 Myxoma△M127-mcherry(Myxoma-mcherry)로 감염시킨 후, 전술한 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다. 감염된 세포는 48시간에 수집되었다. 재조합 바이러스는 M063 또는 M064 유전자좌에 EGFP가 삽입되어 녹생형광 및 모 바이러스의 mCherry에 의해 확인되었다. 이중 양성 클론은 BGMK 세포에서 6-8 회 정제되었다. 재조합 바이러스 Myxoma△M063R(M63R) 및 Myxoma△M064R(M064R)이 각각 M063R 및 M064R 유전자를 상실했음을 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다.
실시예 138: Myxoma△M063R 및 Myxoma△M064R은 모 바이러스와 비교하여 BMDC에서 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현과 IFN-β 단백질 분비를 유도한다.
모 점액종 바이러스(Myxoma-mcherry)에서 M063R 유전자 또는 M064R 유전자의 결실이 더 높은 수준의 I형 IFN을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, WT C57BL/6J 마우스로부터의 BMDC(1 x 106)를 10의 MOI에서 Myxoma-mcherry, Myxoma△M063R, Myxoma△M064R 또는 MVA로 감염시켰다. 감염 후 6시간에 세포를 수집하였다. 상청액은 감염 후 19시간에 수집되었다. IFNB 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 결정되었다. 결과는 BMDC에서 Myxoma△M063R 및 Myxoma△M064R 둘 다 Myxoma-mcherry와 비교하여 더 높은 수준의 IFNB 유전자 발현을 유도하지만 MVA와 비교하여 더 낮은 수준의 IFNB를 유도한다는 것을 보여준다 (도 171a).
상청액의 IFN-β 단백질 수준은 ELISA에 의해 확인되었다 (도 171b). 결과는 BMDC의 Myxoma△M064 및 Myxoma△M063 감염이 모두 Myxoma-mcherry와 비교하여 더 높은 수준의 IFN-β 단백질 분비를 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 점액종 바이러스에서 백시니아 C7 올소 로그를 제거하면 바이러스의 IFN 유도 능력이 더욱 향상된다는 것을 나타낸다.
실시예 139: Myxoma-mcherry 또는 Myxoma△M064R의 종양내 전달은 B16-f10 흑색종 모델에서 처치 2일 후에 주사된 종양에서의 CD8 및 CD4 T 세포 활성화를 유도한다.
모 점액종 바이러스 또는 Myxoma△M064R의 IT 전달이 면역억제 종양 미세환경을 변화시키는지를 평가하기 위하여, 다음 실험을 수행하였다. 간단하게, B16-F10 흑색종 세포를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 (5 x 105 세포) 및 왼쪽 (2.5 x 105 세포) 옆구리의 면도된 피부에 피내 이식하였다. 이식 7일 후, 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에 4 x 107 pfu의 Myxoma-mcherry, Myxoma△M064 또는 MVA△E5R 또는 PBS를 한 번만 주사하였다. 주사 2일 후, 종양을 채취하고 세포를 항-CD3, CD45, CD4, CD8를 사용한 표면 표지 및 세포 내 그랜자임 B 염색을 위하여 처리하였다. 종양내 살아있는 면역 세포 침윤물을 FACS로 분석하였다 (도 172). 도 173a는 그랜자임 B+CD8+ 세포의 대표적인 점 도표를 보여준다. IT Myxoma-mcherry, Myxom△M064 또는 MVAE5R은 주사된 종양에서 CD8+ T 세포의 활성화를 초래한다. 도 173b는 PBS로 처치된 종양과 비교하여 IT Myxoma-mcherry, Myxom△M064 또는 MVA△E5R이 주사된 종양에서 더 많은 수의 CD45+ 세포를 생성함을 보여준다. 도 173c는 PBS로 처치된 종양과 비교하여 IT Myxoma-mcherry, Myxoma△M064 또는 MVA△E5R가 주사된 종양에서 그랜자임 B+CD8+세포의 비율이 더 높은 결과를 초래함을 보여준다. 도 174a는 그랜자임 B+CD4+ T 세포의 대표적인 점 도표를 보여준다. IT Myxoma-mcherry, Myxom△M064 또는 MVA△E5R은 주사된 종양에서 CD4+ T 세포의 활성화를 초래한다. 도 174b는 PBS로 처치된 종양과 비교하여 IT Myxoma-mcherry, Myxoma△M064 또는 MVA△E5R이 주사된 종양에서 그랜자임 B+CD4+ 세포의 더 높은 비율을 초래한다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 기술의 재조합 폭스바이러스가 고형 종양 치료 방법에 유용하다는 것을 보여준다.
동등물
본 기술은 본 기술의 개별 측면의 단일 예시로서 의도된, 본 출원에 설명된 특정 구현예의 관점에 제한되지 않는다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 기술의 많은 수정 및 변형은 그 정신 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본 명세서에 열거된 것들에 더하여, 본 기술의 범위 내의 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 수정 및 변경은 첨부된 청구 범위 내에 속하도록 의도된다. 본 기술은 첨부된 청구범위의 용어와 그러한 청구범위가 부여되는 동등물의 전체 범위에 의해서만 제한된다. 본 기술은 당연히 변할 수 있는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
또한, 본 개시 내용의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 통상의 기술자는 본 개시 내용이 또한 마쿠쉬 그룹의 멤버의 임의의 개별 멤버 또는 하위 그룹의 관점에서 설명된다는 것을 인식할 것이다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 특히 서면 설명을 제공하는 측면에서, 임의의 및 모든 목적을 위하여, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포함한다. 나열된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 본 명세서에서 논의된 각 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1로 등으로 쉽게 나눠질 수 있다. 또한, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 "최대", "적어도", "보다 큼", "보다 작음" 등은, 언급된 숫자를 포함하고 상기 논의된 바와 같이 이후에 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 멤버를 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 세포를 갖는 그룹을 의미한다. 유사하게, 1-5 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 세포 등을 갖는 그룹을 의미한다.
본 명세서에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명시적인 교시와 일치하지 않는 범위까지 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전체가 참고로 포함된다.
다음의 청구범위 내에 다른 구현예가 제시된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER <120> RECOMBINANT POXVIRUSES FOR CANCER IMMUNOTHERAPY <130> 115872-0754 <140> PCT/US2019/051343 <141> 2019-09-16 <150> 62/731,876 <151> 2018-09-15 <150> 62/767,485 <151> 2018-11-14 <150> 62/828,975 <151> 2019-04-03 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 177923 <212> DNA <213> Vaccinia virus <400> 1 gtaagattaa attaattata aaattatgta tataatatta attataaaat tatgtatatg 60 atttactaac tttagttaga taaattaata atacataaat tttagtatat taatattata 120 aattaataat acataaattt tagtatatta atattatatt ttaaatattt atttagtgtc 180 tagaaaaaaa tgtgtgacca acgaccgtag gaaactctag agggtaagaa aaatcaatcg 240 ctttatagag accatcagaa agaggtttaa tatttttgtg agaccatcga aggagaaaga 300 gataaaactt ttttacgact ccatcagaaa gaggtttaat atttttgtga gaccatcgaa 360 gagagaaaga gataaaactt ttttacgact ccatcagaaa gaggtttaat atttttgtga 420 gaccatcgaa gagagaaaga gataaaactt ttttacgact ccatcagaaa gaggtttaat 480 atttttgtga gaccatcgaa ggagaaagag ataaaacttt tttacgactc catcagaaag 540 aggtttaata tttttgtgag accatcgaag gagaaagaga taaaactttt ttacgactcc 600 atcagaaaga ggtttaatat ttttgtgaga ccatcgaagg agaaagagat aaaacttttt 660 tacgactcca tcagaaagag gtttaatatt tttgtgagac catcgaagag agaaagagat 720 aaaacttttt tacgactcca tcagaaagag gtttaatatt tttgtgagac catcgaagga 780 gaaagagata aaactttttt acgactccat cagaaagagg tttaatattt ttgtgagacc 840 atcgaagaga gaaagagaat aaaaatattt tagtgacacc atcagaaaga ggtttaatat 900 ttttgtgaga ccatcgaaga gagaaagaga taaaactttt ttacgactcc atcagaaaga 960 ggtttaatat ttttgtgaga ccatcgaagg agaaagagat aaaacttttt tacgactcca 1020 tcagaaagag gtttaatatt tttgtgagac catcgaagag agaaagagat aaaacttttt 1080 tacgactcca tcagaaagag gtttaatatt tttgtgagac catcgaagag agaaagagat 1140 aaaacttttt tacgactcca tcagaaagac catcgaagag agaaagagaa agagatagtt 1200 agtctagata tttttcttag tacaaaagtc aatgttttaa aatatatgga caagaatttg 1260 tctgtataaa aacttgtgtg aaattttgta ccaaagaaaa aatgtgagca gtatccccta 1320 catggatttt actagatcat ttatatacca aaaaatatta tacgatctac gttttattat 1380 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taaacggaag agatatagca ccgcatgcac catccgatgg aaagtgtaaa gacaacgaat 189360 acaaacgcca taatttgtgt ccgggaacat acgcttccag attatgcgat agcaagacta 189420 acacacaatg tacgccgtgt ggttcgggta ccttcacatc tcgcaataat catttacccg 189480 cttgtctaag ttgtaacgga agacgcgacc gtgtaacacg actcacaata gaatctgtga 189540 atgctctccc ggatattatt gtcttctcaa aggatcatcc ggatgcaagg catgtgtttc 189600 ccaaacaaaa tgtggaatag gatacggagt atccggagac gtcatctgtt ctccgtgtgg 189660 tctcggaaca tattctcaca ccgtctcttc cgcagataaa tgcgaacccg tacccagtaa 189720 tacctttaac tatatcgatg tggaaattaa tctgtatcca gttaacgacc actaccggtc 189780 tcagcgaatc catctcaacg tcggaactaa ctattactat gaatcataaa gactgtaatc 189840 ccgtatttcg tgaggaatac ttctccgtcc ttaataaggt agcaacttca ggtttcttta 189900 caggagaaag gtgtgcactc tgaatttcga gattaaatgc aataacaaaa atttttcctc 189960 caaacagtta acgaaagcaa agaatgatga cggtatcatg ccgcattcgg agactgtcta 190020 tctagcgtcg acatctatat actatatagt aataccaata ctcaagacta cgaaactgat 190080 acaatctctt atcatgtggg taatgttctc gatgtcgata 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atatcataaa ataatgttta taatttacac gttaaaatca 193440 tataataaaa cgtagatcgt ataatatttt ttggtatata aatgatctag taaaatccat 193500 gtaggggata ctgctcacat tttttctttg gtacaaaatt tcacacaagt ttttatacag 193560 acaaattctt gtccatatat tttaaaacat tgacttttgt actaagaaaa atatctagat 193620 caactatctc tttctctttc tctcttcgat ggtctcacaa aaatattaaa cctctttctg 193680 atggagtcgt aaaaaagttt tatctctttc tctcttcgat ggtctcacaa aaatattaaa 193740 cctctttctg atggagtcgt aaaaaagttt tatctctttc tctcttcgat ggtctcacaa 193800 aaatattaaa cctctttctg atggagtcgt aaaaaagttt tatctctttc tctcttcgat 193860 ggtctcacaa aaatattaaa cctctttctg atggagtcgt aaaaaagttt tatctctttc 193920 tctcttcgat ggtctcacaa aaatattaaa cctctttctg atggagtcgt aaaaaagttt 193980 tatctctttc tctcttcgat ggtctcacaa aaatattaaa cctctttctg atggagtcgt 194040 aaaaaagttt tatctctttc tccttcgatg gtctcacaaa aatattaaac ctctttctga 194100 tggagtcgta aaaaagtttt atctctttct ctcttcgatg gtctcacaaa aatattaaac 194160 ctctttctga tggagtcgta aaaaagtttt atctctttct ctcttcgatg gtctcacaaa 194220 aatattaaac ctctttctga tggagtcgta aaaaagtttt atctctttct ccttcgatgg 194280 tctcacaaaa atattaaacc tctttctgat ggagtcgtaa aaaagtttta tctctttctc 194340 cttcgatggt ctcacaaaaa tattaaacct ctttctgatg gagtcgtaaa aaagttttat 194400 ctctttctct cttcgatggt ctcacaaaaa tattaaacct ctttctgatg gagtcgtaaa 194460 aaagttttat ctctttctct cttcgatggt ctcacaaaaa tattaaacct ctttctgatg 194520 gtctctataa agcgatcgat ctttcttaca ctctagagtt tcctacagtc atgggtcaca 194580 catttttttc tagacactaa ataaaattag taaaattaaa ttaattataa aattatatat 194640 ataatttact aactttagtt agataaatta ataatatata agttttagta cattaatatt 194700 atattttaaa t 194711 <210> 3 <211> 5498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct ttttatctgc gcggttaacc 60 gcctttttat ccatcaggtg atctgttttt attgtggagt ctagattatc acagtgggac 120 ttggttcact gtactgtgat aactgccctc aggagcacag taacctggtg tgagttggac 180 aacgataagt tctccatcgt tgatttgcaa atgctcgcac aaggtatcag gagcgtttac 240 ggtcaagtac accttatcct tgaaggccag tgaagcgact acagtaaaga cgattcttct 300 gccgtcgttc aacataggga ttgagatagg gttgtgatcc tccctgaagt ggaggtcaat 360 tttgacctcc tggaaaaaag atcctttcaa gtagatgatg tacagtccgt cacacttaat 420 cactacggag ttattctgga cttccatcgt ctgatactcg ttcttgtaag aagaaataaa 480 caattgacca tcttcacagc gggtcacagc cccccgaagg cgttgtatgg gggggtcttt 540 tgcaggtgaa gagctaagtt gcaaacacac atatatgaag cacagcaaca taccggcccc 600 cttgatgccg cttacaacga gcctaagagt cttcttccat ttaaagcgag ggcgagaccc 660 gttttcgagg ttctcgtcca gaggctggac cccctcgccc tccatggtgg tggcctagaa 720 ttcgatatca agctcaggcc tagatctgtc gacttcgagc ttatttatat tccaaaaaaa 780 aaaaataaaa tttcaatttt taagctttca ctaattccaa acccacccgc tttttatagt 840 aagtttttca cccataaata ataaatacaa taattaattt ctcgtaaaag tagaaaatat 900 attctaattt attgcacggt aaggaagtag atcataactc gaggaattgg ggatctctat 960 aatctcgcgc aacctatttt cccctcgaac actttttaag ccgtagataa acaggctggg 1020 acacttcaca tgagcgaaaa atacatcgtc acctgggaca tgttgcagat ccatgcacgt 1080 aaactcgcaa gccgactgat gccttctgaa caatggaaag gcattattgc cgtaagccgt 1140 ggcggtctgg taccgggtgc gttactggcg cgtgaactgg gtattcgtca tgtcgatacc 1200 gtttgtattt ccagctacga tcacgacaac cagcgcgagc ttaaagtgct gaaacgcgca 1260 gaaggcgatg gcgaaggctt catcgttatt gatgacctgg tggataccgg tggtactgcg 1320 gttgcgattc gtgaaatgta tccaaaagcg cactttgtca ccatcttcgc aaaaccggct 1380 ggtcgtccgc tggttgatga ctatgttgtt gatatcccgc aagatacctg gattgaacag 1440 ccgtgggata tgggcgtcgt attcgtcccg ccaatctccg gtcgctaatc ttttcaacgc 1500 ctggcactgc cgggcgttgt tctttttaac ttcaggcggg ttacaatagt ttccagtaag 1560 tattctggag gctgcatcca tgacacaggc aaacctgcgg atcccagctt ttgttccctt 1620 tagtgagggt taattgcgcg cagttatagt agccgcactc gatgggacat ttcaacgtaa 1680 accgtttaat aatattttga atcttattcc attatctgaa atggtggtaa aactaactgc 1740 tgtgtgtatg aaatgcttta aggaggcttc cttttctaaa cgattgggtg aggaaaccga 1800 gatagaaata ataggaggta atgatatgta tcaatcggtg tgtagaaagt gttacatcga 1860 ctcataatat tatatttttt atctaaaaaa ctaaaaataa acattgatta 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Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 9 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 atggagggcg agggggtcca gcctctggac gagaacctcg aaaacgggtc tcgccctcgc 60 tttaaatgga agaagactct taggctcgtt gtaagcggca tcaagggggc cggtatgttg 120 ctgtgcttca tatatgtgtg tttgcaactt agctcttcac ctgcaaaaga cccccccata 180 caacgccttc ggggggctgt gacccgctgt gaagatggtc aattgtttat ttcttcttac 240 aagaacgagt atcagacgat ggaagtccag aataactccg tagtgattaa gtgtgacgga 300 ctgtacatca tctacttgaa aggatctttt ttccaggagg tcaaaattga cctccacttc 360 agggaggatc acaaccctat ctcaatccct atgttgaacg acggcagaag aatcgtcttt 420 actgtagtcg cttcactggc cttcaaggat aaggtgtact tgaccgtaaa cgctcctgat 480 accttgtgcg agcatttgca aatcaacgat ggagaactta tcgttgtcca actcacacca 540 ggttactgtg ctcctgaggg cagttatcac agtacagtga accaagtccc actgtga 597 <210> 10 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Glu Gly Glu Gly Val Gln Pro Leu Asp Glu Asn Leu Glu Asn Gly 1 5 10 15 Ser Arg Pro Arg Phe Lys Trp Lys Lys Thr Leu Arg Leu Val Val Ser 20 25 30 Gly Ile Lys Gly Ala Gly Met Leu Leu Cys Phe Ile Tyr Val Cys Leu 35 40 45 Gln Leu Ser Ser Ser Pro Ala Lys Asp Pro Pro Ile Gln Arg Leu Arg 50 55 60 Gly Ala Val Thr Arg Cys Glu Asp Gly Gln Leu Phe Ile Ser Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Asn Glu Tyr Gln Thr Met Glu Val Gln Asn Asn Ser Val Val Ile 85 90 95 Lys Cys Asp Gly Leu Tyr Ile Ile Tyr Leu Lys Gly Ser Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Val Lys Ile Asp Leu His Phe Arg Glu Asp His Asn Pro Ile Ser 115 120 125 Ile Pro Met Leu Asn Asp Gly Arg Arg Ile Val Phe Thr Val Val Ala 130 135 140 Ser Leu Ala Phe Lys Asp Lys Val Tyr Leu Thr Val Asn Ala Pro Asp 145 150 155 160 Thr Leu Cys Glu His Leu Gln Ile Asn Asp Gly Glu Leu Ile Val Val 165 170 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Lys Gln Met Lys Met 100 105 110 Arg Arg Val Ala Asp Gly Val Pro Phe Glu Glu Lys Leu Lys Arg Asp 115 120 125 Glu Ala Ile Arg Gln Lys Asn Lys Lys Asp Tyr Phe Glu Ile Lys Lys 130 135 140 Leu Tyr Met Arg Leu Lys Lys Phe Val Arg Gly Lys Lys Ser Ala Asp 145 150 155 160 Asp Asn Met Leu Cys Asn Lys Val Arg Met Ile Tyr Gly His Ile Asn 165 170 175 Glu Ile Glu Arg Val Ala Val Asn Glu Tyr Ser Met Ala Lys Ser Leu 180 185 190 Leu His Tyr Val Phe Pro Asn Leu Phe Asn Asp Asp Lys His His Leu 195 200 205 Phe Tyr Arg Cys Thr Lys Met Asp Gly Leu Gly Val Leu Pro Ser Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Leu Ile Arg Val Ile Leu Glu Asn Lys Phe Lys Ile Ser 225 230 235 240 Lys Arg Lys Trp Thr Met Leu Lys Lys Tyr Ile Asp Thr Val Cys Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Leu Arg Val Arg Leu Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr Lys Leu 260 265 270 Lys Ser Leu Asn Ala Leu Val Ala Ser Tyr Gln Gly Asp Ser Val Asp 275 280 285 Glu Leu Lys Thr Leu Val Leu Ser Ser Phe Ser Leu Val Asp Leu Thr 290 295 300 Glu Lys Leu Ile Lys Thr Thr Phe Pro Glu Val Val 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accgagatag 420 cgaaggaatt ctttttcggt gccgctagta cccttaatca tatcacatag tgttttatat 480 tccaaatttg tggcaataga cggtttattt ctatacgata gtttgtttct ggaatccttt 540 gagtattcta taccaatatt attctttgat tcgaatttag tttcttcgat attagatttt 600 gtattaccta tattcttgat gtagtacttt gatgattttt ccatggccca ttctattaag 660 tcttccaagt tggcatcatc cacatattgt gatagtaatt ctcggatatc agtagcggct 720 accgccattg atgtttgttc attggatgag taactactaa tgtatacatt ttccatttat 780 aacacttatg tattaacttt gttcatttat attttttcat tattatgttg atattaacaa 840 aagtgaatat ataagcttga tcaggccttc actaattcca aacccacccg ctttttatag 900 taagtttttc acccataaat aataaataca ataattaatt tctcgtaaaa gtagaaaata 960 tattctaatt tattgcacgg taaggaagta gatcataact cgacatggtg agcaagggcg 1020 aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 1080 ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 1140 cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 1200 tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 1260 actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 1320 acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 1380 aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 1440 tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 1500 tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 1560 acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 1620 tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 1680 actccaccgg cggcatggac gagctgatca cgaattgtta acctgcattt catctttctc 1740 caatactaat tcaaattgtt aaattaataa tggatagtat aaatagttat tagtgataaa 1800 atagtaaaaa taattattag aataagagtg tagtatcata gataactctc ttctataaaa 1860 atggatttta ttcgtagaaa gtatcttata tacacagtag aaaataatat agatttttta 1920 aaggatgata cattaagtaa agtaaacaat tttaccctca atcatgtact agctctcaag 1980 tatctagtta gcaattttcc tcaacacgtt attactaagg atgtattagc taataccaat 2040 ttttttgttt tcatacatat ggtacgatgt tgtaaagtgt acgaagcggt tttacgacac 2100 gcatttgatg cacccacgtt gtacgttaaa gcattgacta agaattattg gatcccgggc 2160 ccgtcgactg cagaggcctg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 2220 tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 2280 aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 2340 ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 2400 gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 2460 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 2520 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 2580 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 2640 aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 2700 ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 2760 tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 2820 tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 2880 ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 2940 tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 3000 ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 3060 tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 3120 aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 3180 aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 3240 aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 3300 ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 3360 acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 3420 ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 3480 gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 3540 taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 3600 tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 3660 gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 3720 cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 3780 aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 3840 cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 3900 tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 3960 gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 4020 tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 4080 gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 4140 ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 4200 cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 4260 agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 4320 gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 4380 tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 4425 <210> 23 <211> 4978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360 aggccgcatt ggaggttcgt cagcggctct agtttgaatc atcatcggcg tagtattcct 420 acttttacag ttaggacacg gtgtattgta tttctcgtcg agaacgttaa aataatcgtt 480 gtaactcaca tcctttattt tatctatatt gtattctact cctttcttaa tgcattttat 540 accgaataag agatagcgaa ggaattcttt ttcggtgccg ctagtaccct taatcatatc 600 acatagtgtt ttatattcca aatttgtggc aatagacggt ttatttctat acgatagttt 660 gtttctggaa tcctttgagt attctatacc aatattattc tttgattcga atttagtttc 720 ttcgatatta gattttgtat tacctatatt cttgatgtag tactttgatg atttttccat 780 ggcccattct attaagtctt ccaagttggc atcatccaca tattgtgata gtaattctcg 840 gatatcagta gcggctaccg ccattgatgt ttgttcattg gatgagtaac tactaatgta 900 tacattttcc atttataaca cttatgtatt aactttgttc atttatattt tttcattatt 960 atgttgatat taacaaaagt gaatatatgg atccaaaaat tgaaatttta tttttttttt 1020 ttggaatata aataagctcg aagtcgacga attcatgaca gtactagctc cagcttggtc 1080 cccgacaaca taccttctac tactactatt gctatcctcc ggactatctg gaacccagga 1140 ttgctctttt cagcactctc cgatctcgtc tgatttcgcg gttaagatca gagagctatc 1200 cgactacttg ctacaggatt acccagtaac cgtcgcgtcc aacctacaag atgaagaact 1260 atgtggtgga ctttggagac tagtcctagc gcaaagatgg atggaaagac ttaagaccgt 1320 agcgggatct aagatgcagg gactactaga aagagtcaac accgagatcc acttcgtcac 1380 aaagtgtgcg tttcaaccac caccgtcctg tctaagattc gtccagacaa acatctccag 1440 actactacaa gaaacctccg agcagctagt agcgctaaaa ccgtggatca caagacagaa 1500 cttctcgaga tgtctagagc tacagtgtca gccggattct tctacattac caccaccatg 1560 gtcaccaaga ccactagaag ctacagctcc aactgctcca caaccaccat tgctactttt 1620 gctattgcta cccgtcggat tgctactatt agctgctgct tggtgtctac actggcagag 1680 aactagaaga agaactccaa gaccgggaga acaagtacca ccagtaccat ctccacagga 1740 cctactacta gtcgagcaca gaagaagaag 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900 tacattttcc atttataaca cttatgtatt aactttgttc atttatattt tttcattatt 960 atgttgatat taacaaaagt gaatatatgg atccaaaaat tgaaatttta tttttttttt 1020 ttggaatata aataagctcg aagtcgacga attcatgaca gtactagctc cagcttggtc 1080 cccgacaaca taccttctac tactactatt gctatcctcc ggactatctg gaacccagga 1140 ttgctctttt cagcactctc cgatctcgtc tgatttcgcg gttaagatca gagagctatc 1200 cgactacttg ctacaggatt acccagtaac cgtcgcgtcc aacctacaag atgaagaact 1260 atgtggtgga ctttggagac tagtcctagc gcaaagatgg atggaaagac ttaagaccgt 1320 agcgggatct aagatgcagg gactactaga aagagtcaac accgagatcc acttcgtcac 1380 aaagtgtgcg tttcaaccac caccgtcctg tctaagattc gtccagacaa acatctccag 1440 actactacaa gaaacctccg agcagctagt agcgctaaaa ccgtggatca caagacagaa 1500 cttctcgaga tgtctagagc tacagtgtca gccggattct tctacattac caccaccatg 1560 gtcaccaaga ccactagaag ctacagctcc aactgctcca caaccaccat tgctactttt 1620 gctattgcta cccgtcggat tgctactatt agctgctgct tggtgtctac actggcagag 1680 aactagaaga agaactccaa gaccgggaga acaagtacca ccagtaccat ctccacagga 1740 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cttgctgtaa acaagtttgg 420 attatcgtaa gaggctagta tagaaattgt tgctcccatg gaatgaccca ataagtagat 480 ttaatagtta ccacgtgctg taccaaagtc atcaatcatc attttttcac cattacttct 540 tccatgtcca atatgatcat gtgagaatac taaaattcct aacgatgata tgttttcagc 600 tagttcgtca taacgtccag aatgtttacc agctccatga cttatgaata ctaatgcctt 660 aggatatgta atcattgtcc agattgaaca tacagtttgc actcatgatt cacgttatat 720 aactatcaat attaacagtt cgtttgatga tcatattatt tttatgtttt attgataatt 780 gtaaaaacat acaattaaat caatatagag gaaggagacg 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accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 1320 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 1380 cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 1440 gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 1500 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 1560 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 1620 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 1680 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 1740 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtcca agctgagcaa agaccccaac 1800 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 1860 atggacgagc tgtacaagta atgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttccggt 1920 taaccggtga tatcacctct ctggaagaca gcgtgaataa tgtactcatg aaacgtttgg 1980 aaactatacg ccatatgtgg tctgtcgtat atgatcattt tgatattgtg aatggtaaag 2040 aatgctgtta tgtgcatacg catttgtcta atcaaaatct tataccgagt actgtaaaaa 2100 caaatttgta catgaagact atgggatcat 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tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 3000 gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 3060 ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca 3120 gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 3180 actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 3240 tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3300 acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3360 cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3420 ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc 3480 gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 3540 ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 3600 acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 3660 ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 3720 tgaattatta acgcttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 3780 atttcacacc gcatacaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctattttcg 3840 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3900 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3960 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4020 ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4080 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4140 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4200 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4260 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4320 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4380 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4440 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 4500 ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 4560 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 4620 gagcgcagcg agtca 4635 <210> 31 <211> 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gggactggct gctattgggc 3300 gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 3360 atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 3420 caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 3480 gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 3540 gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 3600 atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 3660 gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 3720 tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 3780 ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg 3840 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg 3900 gaaatgtgcg cggaacccct attttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 3960 aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 4020 ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 4080 gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 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cacatccttt attttatcta tattgtattc tactcctttc ttaatgcatt ttataccgaa 180 taagagatag cgaaggaatt ctttttcggt gccgctagta cccttaatca tatcacatag 240 tgttttatat tccaaatttg tggcaataga cggtttattt ctatacgata gtttgtttct 300 ggaatccttt gagtattcta taccaatatt attctttgat tcgaatttag tttcttcgat 360 attagatttt gtattaccta tattcttgat gtagtacttt gatgattttt ccatggccca 420 ttctattaag tcttccaagt tggcatcatc cacatattgt gatagtaatt ctcggatatc 480 agtagcggct accgccattg atgtttgttc attggatgag taactactaa tgtatacatt 540 ttccatttat aacacttatg tattaacttt gttcatttat attttttcat tattatgttg 600 atattaacaa aagtgaatat aagctagcgc ggttaaccgc ctttttatcc atcaggtgat 660 ctgtttttat tgtggagtct agaactagtg gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatatca 720 agctcaggcc tagatctgtc gacttcgagc ttatttatat tccaaaaaaa aaaaataaaa 780 tttcaatttt taagcttttg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttccactaat 840 tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 900 aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acggtaagga agtagatcat 960 aactcgagga 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ctaccgctag agttgaccaa gaacgagtcc tgcctaaact ccagagaaac ctccttcatc 1380 accaacggat cttgcctagc gtctagaaag acctctttca tgatggcgct atgcctatcc 1440 tctatctacg aggacctaaa gatgtaccag gtcgaattca agaccatgaa cgcgaagcta 1500 ctaatggacc cgaagagaca gatcttcttg gaccagaata tgctagcggt catcgacgaa 1560 ctaatgcagg cgctaaactt caactctgaa accgtgccgc agaagtccag tttagaagaa 1620 ccggatttct acaagaccaa gatcaagcta tgcatcctac tacacgcgtt cagaatcaga 1680 gcggtcacca tcgatagagt catgtcttac ctaaacgcgt ccagaagacc gaaaggaaga 1740 ggaaagagaa gaagagaaaa gcaaagaccg accgactgcc atctatga 1788 <210> 36 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val 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aagaacaaaa cctttcttaa gtgtgaggcc cctaattatt ccggaagatt tacatgcagc 420 tggttggtcc agcgcaatat ggacctcaaa tttaatatca agtcttcttc cagctcccca 480 gattctcggg cagtgacttg cggcatggca tccctctccg ctgagaaagt aacattggat 540 caacgagact acgagaagta ctctgttagt tgtcaagagg acgttacatg ccctaccgca 600 gaagagacat tgccaattga attggccctt gaagcacgcc agcagaataa gtacgaaaat 660 tacagtacaa gctttttcat ccgagacata attaaacccg atcctcctaa gaatctccaa 720 atgaaacctt tgaagaatag ccaagtggaa gtttcatggg agtatccaga ttcctggtcc 780 acaccacatt cctatttctc ccttaagttc ttcgtcagaa tccagaggaa gaaagaaaag 840 atgaaggaaa ccgaggaagg ctgcaaccag aagggcgcct ttctggtaga gaaaaccagc 900 actgaggttc agtgtaaggg gggaaacgtg tgtgtgcagg cacaagatcg atactacaac 960 tcaagctgta gtaaatgggc ctgcgtacct tgtcgggttc gatccagacg acgccggaga 1020 cgagctacca atttttcctt gctcaagcag gcaggcgatg tggaggaaaa cccagggccc 1080 cttgacatgt gtcagagccg gtacctcctt ttcctcgcaa ccctggctct gcttaaccac 1140 ctctcactgg ctagggtaat tcccgtatct gggcctgccc gatgcctcag ccagagtcgg 1200 aatctcctta agaccacaga cgatatggta aaaacagcaa gggagaaact caaacattac 1260 tcttgtacag cagaggacat cgatcatgaa gacataaccc gggaccagac ctcaacattg 1320 aaaacttgtc tgccactgga gcttcataag aacgagtcct gccttgccac acgagagacc 1380 tctagcacta cacgggggtc ctgcctgcct ccacagaaaa cctccttgat gatgaccctg 1440 tgtctcggca gtatttacga agatttgaag atgtaccaaa cagagtttca ggccattaac 1500 gcagcattgc aaaaccataa tcaccagcag ataatccttg ataagggtat gctggtagcc 1560 atcgacgaac ttatgcaatc tctgaatcat aatggcgaaa ctctgcgaca aaagccccca 1620 gttggagaag ccgaccccta ccgagtcaag atgaaactct gcatactcct gcatgccttt 1680 tccacacggg ttgttactat caatcgagtc atggggtatc tttcttcagc acggcgccct 1740 aaagggcgcg gaaaacgccg ccgggaaaaa caaagaccta ctgattgcca tctgtga 1797 <210> 38 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr 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gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccatcaaa 420 ataaaattgg ataaggaaaa gacgttcaaa ttcgtcatcg tattggaacc ggagtggata 480 gatgagataa aacctatata catgaaagtt aacgacgagt cggtggagtt agaattagac 540 tataaagacg ccatcaaacg catctattcg gcggaggtgg tattatgttc agattccgtg 600 atcaacctgt tcagtgacgt cgacgtgtct tatacgtgcg aataccctac gattaaggtg 660 aatacgataa aaaaatacta cagcgtacag aacagaggga tgacctacgt acatatagaa 720 tcgcccatta atacgaaaga taaatgctgg ttcgtggaaa agaacggatg gtacgaggat 780 agaacacatt cgtaattttt ttatatagtg aaaaataatg tgagcattac gagcgtgggt 840 ttatctacac ggctagcaaa aattgaaatt ttattttttt tttttggaat ataaataagc 900 tcgaagtcga cagatctagg cctggtacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 960 gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 1020 ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 1080 ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 1140 gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 1200 aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 1260 ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 1320 tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 1380 tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 1440 acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 1500 acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 1560 accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 1620 ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaaa gctagcgatc aggccttttt ttttattgaa 1680 aaataatagt aagaaaacgt tgccgtaaac atggaggagg gtatcgtgca taaattagac 1740 gtgtttctca tcgacgaaaa cgtgtctata aaacacgtta atttgttcga cggggatagt 1800 tacgggtgca acatccattt aaagaccgcc acgtgtaagt acatcacctt tatattagtc 1860 ttagaacccg attgggagaa catagtcgag gcaaaaccca ttcacatgag attgaacggc 1920 aaaaagatac gcgtaccact cgtagcaaaa acccacacgt cacttattta taaagtcgtt 1980 atctacgtgg aggaagacgc cctcgcacga ttctacagcg acgtggaaag gtcgtacacg 2040 gacgtgtatc ccacgtttct agtcaatacg gatacgcgac gttattacat tttggatagc 2100 ggacggacgt atacgtacat agatccgttt atatcggacg aagcttggcg taatcatggt 2160 catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 2220 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 2280 tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 2340 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 2400 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 2460 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 2520 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 2580 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 2640 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 2700 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 2760 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 2820 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 2880 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 2940 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3000 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3060 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3120 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3180 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3240 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 3300 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 3360 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 3420 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 3480 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 3540 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 3600 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 3660 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 3720 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 3780 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 3840 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 3900 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 3960 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 4020 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 4080 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 4140 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 4200 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 4260 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag 4320 aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 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gcgagatgta tgcgggtgtc ggcgacgacc catcgatcgt agacagtagc gatagcgacg 780 attataccag cagtgaggaa gacacggagg aggaagacac ggaggaggaa gaagattgat 840 tttttttatt gaaaaataat agtaagaaaa cgttgccgta aacgctagca aaaattgaaa 900 ttttattttt tttttttgga atataaataa gctcgaagtc gacagatcta ggcctggtac 960 catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 1020 cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 1080 cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 1140 cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 1200 gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 1260 cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 1320 ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 1380 caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 1440 cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc 1500 cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca 1560 ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt 1620 cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta 1680 aagctagcga tcaggcctgt ttttattata atgattttta aatttaaacg ttattaaaaa 1740 tggaaccggt atctatggac aaacccttta tgtacttcga tgaaatagac gatgaattag 1800 agtatgaacc cgaaagcgtt aacgaaacac ctaaaaaact cccccaccag gggcagttga 1860 aattattgct aggcgagttg ttttttctaa gtaaattaca acgccacggc attttagacg 1920 gatccacgat cgtgtatata ggatccgctc ccggcaccca catcaaatac ttacgcgatc 1980 attttatgtc tatgggattg gttattaaat ggatgttgat cgacggacgc acgcacgatc 2040 ccatccttga aggattacgc gacgtaattc tcattaccaa gttcgtcgac gaggcgtaca 2100 ttcgacagtt gaagaaacaa ctgtatccgt ctagggttat tctcatttcg gacgtgcgct 2160 cgaaacgggg acagaaaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 2220 gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 2280 gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 2340 cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 2400 tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2460 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2520 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2580 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2640 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 2700 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 2760 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 2820 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 2880 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 2940 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3000 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 3060 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3120 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3180 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 3240 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 3300 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 3360 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 3420 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 3480 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 3540 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 3600 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 3660 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 3720 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 3780 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 3840 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 3900 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3960 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 4020 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 4080 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 4140 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 4200 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 4260 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 4320 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 4380 cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 4416 <210> 41 <211> 4416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accatggaac 420 tgataaaatc tttacacacg tccacggact taacggtcta cagaacatca atgctccatc 480 accgtaatat gcccgagaag gagtactgct tcacgcagat atactcggct acgttaaaca 540 tagacaccaa gtcgaccgtc agttttcgta gtacgataca cgacgggttt ctttcgacgt 600 atccgacgat ctacattaat ccggaggaaa aatattacaa agtccagaac aaaggacgtc 660 tgcggatgcg ggtggttaca cctatcttaa acagcgacaa actacagttc atggataagg 720 gcgagatgta tgcgggtgtc ggcgacgacc catcgatcgt agacagtagc gatagcgacg 780 attataccag cagtgaggaa gacacggagg aggaagacac ggaggaggaa gaagattgat 840 tttttttatt gaaaaataat agtaagaaaa cgttgccgta aacgctagca aaaattgaaa 900 ttttattttt tttttttgga atataaataa gctcgaagtc gacagatcta ggcctggtac 960 catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 1020 cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 1080 cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 1140 cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 1200 gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 1260 cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 1320 ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 1380 caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 1440 cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc 1500 cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca 1560 ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt 1620 cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta 1680 aagctagcga tcaggcctgt ttttattata atgattttta aatttaaacg ttattaaaaa 1740 tggaaccggt atctatggac aaacccttta tgtacttcga tgaaatagac gatgaattag 1800 agtatgaacc cgaaagcgtt aacgaaacac ctaaaaaact cccccaccag gggcagttga 1860 aattattgct aggcgagttg ttttttctaa gtaaattaca acgccacggc attttagacg 1920 gatccacgat cgtgtatata ggatccgctc ccggcaccca catcaaatac ttacgcgatc 1980 attttatgtc tatgggattg gttattaaat ggatgttgat cgacggacgc acgcacgatc 2040 ccatccttga aggattacgc gacgtaattc tcattaccaa gttcgtcgac gaggcgtaca 2100 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tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3000 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 3060 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3120 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3180 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 3240 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 3300 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 3360 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 3420 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 3480 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 3540 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 3600 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 3660 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 3720 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 3780 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Ile Lys Phe Arg Ile Phe Ser Pro Phe Lys Leu 145 150 155 160 Asn Leu Ile Arg Ile Leu Val Glu Glu Lys Phe Tyr Asn Asn Glu Ser 165 170 175 Lys Phe Arg Lys Trp Lys Ala Ile Gly Thr Gln Val Asp Lys Met Leu 180 185 190 Ala Ala Glu Ser Ala Lys Tyr Lys Ile Asn Glu Met Tyr Arg Leu Arg 195 200 205 Ser Ile His Arg Ile Lys Thr Asp Ser Glu Asp Asp Thr Ile Phe Ile 210 215 220 Lys His Met Ala Glu Lys Cys Ser Thr Ser Gln Glu Leu Val Glu Lys 225 230 235 240 Val Leu Lys Leu Leu Phe Ala Asp Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Lys 245 250 255 Leu Tyr Arg His Asp Asp Asp Val Glu Asn Gly Phe Ile Gly Leu Asp 260 265 270 Lys Ile Lys Leu Asp Ile Val His Glu Ile Val Glu Pro Cys Met Thr 275 280 285 Gly Ser Arg Thr Leu Ala Ser Ala Pro Cys Lys Glu Met Ile Asn Lys 290 295 300 Tyr Phe Glu Asn Pro Leu His Ile Ile Gly Lys Asn Ile Gln Glu Cys 305 310 315 320 Ile Glu Ile Ala Arg Ser 325 <210> 60 <211> 327 <212> PRT <213> Skunkpox virus <400> 60 Met Ser Gly Ser Phe Val Gly Gln Phe Glu Glu Met Asp Glu Glu Ser 1 5 10 15 Val Tyr His Gln Asp His Lys Phe Thr Leu Lys Arg Lys Tyr Asn Ile 20 25 30 Asn Ser Glu Glu Thr Ile Met Glu Thr Thr Glu Lys Lys Arg Thr Lys 35 40 45 Phe Gln Ser Arg Ala Lys Leu Val Lys Glu Val Asn Gly Thr Ile Arg 50 55 60 Ala Ala Gln Met His Tyr Ile Ser Leu Lys Arg Gly Tyr Ile Val Phe 65 70 75 80 Lys Lys Met Leu Lys Thr Thr Thr Leu Asp Ala Ile Thr Ser Ile Pro 85 90 95 Asn Phe Gln Lys Ile Tyr Lys Leu Phe Phe Asp Ile Ser Ala Ile Ser 100 105 110 Asn Val Ala Thr Ser Pro Arg Lys Met Val Tyr Ala Leu Leu Leu Tyr 115 120 125 Met Phe Pro Asn Leu Phe Gly Gly Asp Asn Arg Phe Ile His Tyr Arg 130 135 140 Ile Gln Pro Leu Ser Lys Ile Lys His Lys Ile Phe Ser Pro Phe Lys 145 150 155 160 Ile Asn Leu Ile Arg Ile Leu Val Glu Glu Lys Phe Tyr Asn Asn Glu 165 170 175 Ser Lys Tyr Arg Arg Trp Lys Met Ile Gly Ser Gln Val Asp Lys Met 180 185 190 Leu Ala Ala Glu Ser Ala Lys Cys Thr Val Asp Thr Met Tyr Arg Leu 195 200 205 Arg Pro Ile His Arg Ile Lys Thr Asp Ser Asp Asp Asp Thr Ile Phe 210 215 220 Ile Lys Gln Ile Ala Glu Lys Cys Ser Thr Ser Gln Glu Leu Val Glu 225 230 235 240 Lys Val Leu Lys Leu Leu Phe Thr Asp Leu Phe Lys Ser Gly Asp Tyr 245 250 255 Lys Val Phe Arg His Asp Glu Asp Ala Glu Asn Gly Phe Ile Gly Leu 260 265 270 Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ile Val His Glu Ile Val Glu Pro Cys Leu 275 280 285 Ser Val His Arg Ser Leu Ala Arg Ala Pro Cys Lys Glu Met Val Asn 290 295 300 Lys Tyr Phe Glu Asn Pro Leu His Ile Ile Gly Lys Asn Leu Gln Glu 305 310 315 320 Cys Ile Asp Phe Val Arg Ser 325

Claims (370)

  1. 돌연변이체 C7 유전자, 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(modified vaccinia Ankara)(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L).
  2. 제1항에 있어서,
    바이러스가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  4. 제3항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스가 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L).
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  11. 제10항에 있어서,
    OX40L이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  12. 제11항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  13. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L이 C7 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 MVA 바이러스가 다음 특징 중 하나 이상을 나타내는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스:
    상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도;
    상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및
    상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소.
  16. 제15항에 있어서,
    종양 세포가 흑색종 세포를 포함하는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  22. 제21항에 있어서,
    면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    상응하는 MVAΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및
    상응하는 MVAΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  31. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  37. 제34항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  38. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔC7L-OX40L 또는 MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  39. 돌연변이체 E3 유전자, 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE3L-OX40L).
  40. 제39항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  41. 제40항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  42. 제41항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  44. 제43항에 있어서,
    OX40L이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  45. 제44항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 MVA 바이러스가 다음 특징 중 하나 이상을 나타내는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스:
    상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도;
    상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및
    상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소.
  48. 제47항에 있어서,
    종양 세포가 흑색종 세포를 포함하는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  49. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  50. 제49항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  52. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  54. 제53항에 있어서,
    면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    상응하는 MVAΔE3L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및
    상응하는 MVAΔE3L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  62. 제59항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  63. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  64. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  68. 제66항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  69. 제66항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔE3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔE3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  71. 돌연변이체 C7 유전자, 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔC7L-OX40L).
  72. 제71항에 있어서,
    바이러스가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스(VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L).
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  74. 제73항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  75. 제74항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  77. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스가 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스(VACVΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L).
  80. 제71항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 백시니아 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  81. 제80항에 있어서,
    OX40L이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  82. 제81항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  83. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L이 C7 유전자 내부로부터 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  84. 제71항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L). E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), E5R, K7R, C12L(IL18BP), B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  85. 제83항에 있어서,
    바이러스가 hIL-12를 코딩하는 이종 핵산 및 항-huCTLA-4를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스(VACVΔC7L-항-huCTLA-4-hFlt3L-OX40L-hIL-12).
  86. 제71항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스가 다음 특징 중 하나 이상을 나타내는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스:
    상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가의 유도;
    상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가의 유도; 및
    상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 접촉된 종양 세포와 비교하여 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스와 접촉된 종양 세포에서 종양 부피의 감소.
  87. 제86항에 있어서,
    종양 세포가 흑색종 세포를 포함하는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  88. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  89. 제88항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  91. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  92. 제91항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  93. 제92항에 있어서,
    면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    상응하는 VACVΔC7L 바이러스로 감염된 종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 이펙터 T-세포의 수준 증가; 및
    상응하는 VACVΔC7L 바이러스와 비교하여 이펙터 T-세포의 비장 생산 증가.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  99. 제98항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  100. 제98항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  101. 제98항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  102. 제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  103. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  104. 제103항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  106. 제105항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  107. 제105항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  108. 제105항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  109. 제103항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
    VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L과 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔC7L-OX40L 또는 VACVΔC7L-hFlt3L-OX40L의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  110. 서열번호 1의 위치 75,560 내지 76,093의 핵산 서열, 또는 이의 일부가 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, 변형된 백시니아 앙카라(MVA)가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는, 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열.
  111. 제110항에 있어서,
    서열번호 1의 위치 18,407 내지 18,859의 핵산 서열, 또는 이의 일부가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되는, 재조합 MVA.
  112. 서열번호 1의 위치 75,798 내지 75,868의 핵산 서열, 또는 이의 일부가 OX40L을 코딩하거나 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, 변형된 백시니아 앙카라(MVA)가 E3 돌연변이체를 추가로 포함하는, 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스 핵산 서열.
  113. 서열번호 2의 위치 80,962 내지 81,032의 핵산 서열, 또는 이의 일부가 OX40L을 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되고, 백시니아 바이러스(VACV)가 C7 돌연변이체를 추가로 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스(VACV) 핵산 서열.
  114. 제113항에 있어서,
    서열번호 2의 위치 15,716 내지 16,168의 핵산 서열, 또는 이의 일부가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 개방형 해독틀을 포함하는 이종 핵산 서열로 치환되는, 재조합 VACV.
  115. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열.
  116. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열.
  117. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스를 코딩하는 핵산 서열.
  118. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스 또는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  119. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  120. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항의 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스 또는 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  121. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  122. 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 MVAΔC7L-OX40L 바이러스.
  123. 제39항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 E3 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  124. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 MVAΔE3L-OX40L 바이러스.
  125. 제71항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  126. 제73항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가 적어도 부분적으로 결실되거나, 발현되지 않거나, 효과를 갖지 않을 정도로 낮은 수준에서 발현되거나, 비-기능성 단백질로서 발현되는, 재조합 VACVΔC7L-OX40L 바이러스.
  127. 항원, 및 돌연변이체 C7 유전자 및 OX40L을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔC7L-OX40L)를 포함하는 아쥬반트의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  128. 제127항에 있어서,
    MVAΔC7L-OX40L 바이러스가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 추가로 포함하는(MVAΔC7L-hFlt3L-OX40L), 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  130. 제129항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 방법.
  131. 제130항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  132. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 방법.
  133. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산을 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 방법.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  135. 제128항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 hFlt3L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하고, 바이러스가 TK 유전자의 적어도 일부의 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는 돌연변이체 TK 유전자를 추가로 포함하는(MVAΔC7L-hFlt3L-TK(-)-OX40L), 방법.
  136. 제127항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 MVA 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 방법.
  137. 제136항에 있어서,
    OX40L이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, 방법.
  138. 제137항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되는, 방법.
  139. 제129항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서,
    OX40L이 TK 유전자 내부로부터 발현되고 hFlt3L이 C7 유전자 내부로부터 발현되는, 방법.
  140. 제127항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, E5R, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, 방법.
  141. 제127항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  142. 제127항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 단계가 항원 및 아쥬반트를 하나 이상의 용량으로 투여하는 것을 포함하고/하거나 항원 및 아쥬반트가 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여되는, 방법.
  143. 제127항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  144. 제143항에 있어서,
    항원 및 아쥬반트가 면역 체크포인트 차단제의 투여와 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 대상체에 전달되는, 방법.
  145. 제127항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  146. 제145항에 있어서,
    면역 반응의 유도, 향상, 또는 촉진이 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 T-세포에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 발현의 수준 증가;
    미처치된 대조군 샘플과 비교하여 비장, 배수 림프절, 및/또는 혈청에서 항원-특이적 T-세포의 수준 증가; 및
    미처치된 대조군 샘플과 비교하여 혈청에서 항원-특이적 면역글로불린의 수준 증가.
  147. 제146항에 있어서,
    항원-특이적 면역글로불린이 IgG1 또는 IgG2인, 방법.
  148. 제127항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 및 아쥬반트가 종양내, 근육내, 피내, 또는 피하 투여되도록 제형화되는, 방법.
  149. 제127항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 대장암, 유방암, 방광암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 난소암, 피부의 편평세포 암종, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 위암, 간암, 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  150. 제127항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔC7L-OX40L 바이러스가 약 105 내지 약 1010 플라크-형성 단위(plaque-forming unit)(pfu)의 투여 당 투여량으로 투여되는, 방법.
  151. 제127항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인, 방법.
  152. 제127항 내지 제140항 중 어느 한 항의 항원 및 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물.
  153. 제152항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  154. 제152항 또는 제153항에 있어서,
    항원이 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
  155. 제152항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  156. 사용 설명서, 용기 수단, 및 제127항 내지 제140항 중 어느 한 항의 (a) 항원; 및 (b) 아쥬반트 각각의 별도 부분을 포함하는 키트.
  157. 제156항에 있어서,
    항원이 종양 분화 항원, 암 정소 항원, 신생항원, 바이러스 항원(종양발생 바이러스 감염과 연관된 종양의 경우), GPA33, HER2/neu, GD2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제, p15, gp75, 베타-카테닌, ErbB2, 암 항원 125(CA-125), 암배아 항원(CEA), RAGE, MART(흑색종 항원), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1 및 2, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라아제 V 인트론 V 서열), 전립선암 psm, PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, p53, kras, 폐 저항 단백질(LRP) Bcl-2, 전립선 특이적 항원(PSA), Ki-67, CEACAM6, 결장-특이적 항원-p(CSAp), NY-ESO-1, 인간 유두종 바이러스 E6 및 E7, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서,
    (c) 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제를 추가로 포함하는, 키트.
  159. 제141항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이
    Figure pct00165
    , 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원인, 방법.
  160. 제154항 또는 제155항에 있어서,
    항원이
    Figure pct00166
    , 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원인, 면역원성 조성물.
  161. 제157항 또는 제158항에 있어서,
    항원이
    Figure pct00167
    , 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생항원인, 키트.
  162. 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스(MVAΔE5R).
  163. 제162항에 있어서,
    바이러스가 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  164. 제163항에 있어서,
    돌연변이체 E5R 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  165. 제164항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, MVAΔE5R 바이러스(MVAΔE5R-OX40L).
  166. 제165항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R-OX40L 바이러스(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L).
  167. 제166항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 C11R 유전자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L 바이러스(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L-ΔC11R).
  168. 제167항에 있어서,
    돌연변이체 C11R 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  169. 제168항에 있어서,
    돌연변이체 C11R 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  170. 제166항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 WR199 유전자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L(MVAΔE5R-OX40L-hFlt3L-ΔWR199).
  171. 제170항에 있어서,
    돌연변이체 WR199 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  172. 제170항에 있어서,
    돌연변이체 WR199 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  173. 제164항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, MVAΔE5R 바이러스(MVAΔE5R-hFlt3L).
  174. 제163항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, MVAΔE5R 바이러스.
  175. 제162항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  176. 제175항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  177. 제162항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  178. 제177항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  179. 제178항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  180. 제162항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 E3L 유전자(ΔE3L)를 추가로 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  181. 제180항에 있어서,
    돌연변이체 E3L 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  182. 제181항에 있어서,
    돌연변이체 E3L 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  183. 제181항 또는 제182항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, 바이러스.
  184. 제183항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, 바이러스.
  185. 제181항 또는 제182항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는, 바이러스.
  186. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항의 MVAΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  187. 제186항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  188. 제186항 또는 제187항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  189. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항의 MVAΔE5R 바이러스 또는 제186항 내지 제188항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  190. 제189항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  191. 제189항 또는 제190항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  192. 제189항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 전립선 암종, 또는 유방외 파제트병(Extramammary Paget disease)(EMPD)인, 방법.
  193. 제177항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  194. 제177항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  195. 제193항 또는 제194항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  196. 제195항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  197. 제195항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  198. 제195항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  199. 제193항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서,
    MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  200. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제186항 내지 제188항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  201. 제200항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  202. 제201항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  203. 제202항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  204. 제202항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  205. 제202항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  206. 제201항 또는 제202항에 있어서,
    MVAΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MVAΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  207. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항의 MVAΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산.
  208. 제162항 내지 제185항 중 어느 한 항의 MVAΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  209. 돌연변이체 E5R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔE5R).
  210. 제209항에 있어서,
    바이러스가 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199(ΔWR199) 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, VACVΔE5R 바이러스.
  211. 제210항에 있어서,
    돌연변이체 E5R 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, VACVΔE5R 바이러스.
  212. 제211항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, VACVΔE5R 바이러스(VACVΔE5R-OX40L).
  213. 제212항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, VACVΔE5R-OX40L 바이러스(VACVΔE5R-OX40L-hFlt3L).
  214. 제211항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, VACVΔE5R 바이러스(VACVΔE5R-hFlt3L).
  215. 제210항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, VACVΔE5R 바이러스.
  216. 제209항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 추가로 포함하는, VACVΔE5R 바이러스.
  217. 제216항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, VACVΔE5R 바이러스.
  218. 제209항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 C7 유전자를 추가로 포함하는, VACVΔE5R 바이러스.
  219. 제218항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  220. 제219항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  221. 제209항 내지 제220항 중 어느 한 항의 VACVΔE5R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  222. 제221항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  223. 제221항 또는 제222항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  224. 제209항 내지 제220항 중 어느 한 항의 VACVΔE5R 바이러스 또는 제221항 내지 제223항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  225. 제224항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  226. 제224항 또는 제225항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  227. 제224항 또는 제225항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  228. 제224항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  229. 제224항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  230. 제228항 또는 제229항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  231. 제230항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  232. 제230항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  233. 제230항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  234. 제228항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서,
    VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  235. 제209항 내지 제220항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제221항 내지 제223항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  236. 제235항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  237. 제236항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  238. 제237항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  239. 제237항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  240. 제237항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  241. 제236항 또는 제237항에 있어서,
    VACVΔE5R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  242. 제209항 내지 제220항 중 어느 한 항의 VACVΔE5R 바이러스를 코딩하는 핵산.
  243. 제209항 내지 제220항 중 어느 한 항의 VACVΔE5R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  244. 돌연변이체 M31R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 점액종(myxoma) 바이러스(MYXV)(MYXVΔM31R).
  245. 제244항에 있어서,
    바이러스가 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199의 점액종 올소로그(ortholog) 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스.
  246. 제244항 또는 제245항에 있어서,
    돌연변이체 M31R 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스.
  247. 제246항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스(MYXVΔM31R-OX40L).
  248. 제247항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, MYXVΔM31R-OX40L 바이러스(MYXVΔM31R-OX40L-hFlt3L).
  249. 제246항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스(MYXVΔM31R-hFlt3L).
  250. 제245항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백시니아 바이러스 유전자의 점액종 올소로그 내부로부터 발현되는, MYXVΔM31R 바이러스.
  251. 제244항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스.
  252. 제251항에 있어서,
    돌연변이체 TK 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스.
  253. 제244항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 백시니아 바이러스 C7 유전자의 돌연변이체 점액종 올소로그를 추가로 포함하는, MYXVΔM31R 바이러스.
  254. 제253항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트의 삽입을 포함하는, 바이러스.
  255. 제254항에 있어서,
    돌연변이체 C7 유전자가, 유전자의 전부 또는 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, 바이러스.
  256. 제244항 내지 제255항 중 어느 한 항의 MYXVΔM31R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  257. 제256항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  258. 제256항 또는 제257항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  259. 제244항 내지 제255항 중 어느 한 항의 MYXVΔM31R 바이러스 또는 제256항 내지 제258항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  260. 제259항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  261. 제259항 또는 제260항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  262. 제259항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  263. 제259항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  264. 제259항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  265. 제263항 또는 제264항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  266. 제265항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  267. 제265항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  268. 제265항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  269. 제263항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서,
    MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  270. 제244항 내지 제255항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제256항 내지 제258항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  271. 제270항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  272. 제271항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  273. 제272항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  274. 제272항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  275. 제272항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  276. 제271항 또는 제272항에 있어서,
    MYXVΔM31R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MYXVΔM31R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  277. 제244항 내지 제255항 중 어느 한 항의 MYXVΔM31R 바이러스를 코딩하는 핵산.
  278. 제244항 내지 제255항 중 어느 한 항의 MYXVΔM31R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  279. 돌연변이체 B2R 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 백시니아 바이러스(VACV)(VACVΔB2R).
  280. 제279항에 있어서,
    바이러스가 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, VACVΔB2R 바이러스.
  281. 제280항에 있어서,
    바이러스가 VACVΔE3L83NΔB2R, VACVΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83NΔE5RΔB2R, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-huCTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-hIL-12-ΔB2R 중 하나 이상으로부터 선택되는, VACVΔB2R 바이러스.
  282. 제281항에 있어서,
    돌연변이체 B2R 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, VACVΔB2R 바이러스.
  283. 제282항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 OX40L을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, VACVΔB2R 바이러스(VACVΔB2R-OX40L).
  284. 제282항 또는 제283항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, VACVΔB2R-OX40L 바이러스(VACVΔB2R-OX40L-hFlt3L).
  285. 제282항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 카세트가 인간 Fms-유사 티로신 키나아제 3 리간드(hFlt3L)를 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는, VACVΔB2R 바이러스(VACVΔB2R-hFlt3L).
  286. 제280항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 핵산이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 유전자 내부로부터 발현되는, VACVΔB2R 바이러스.
  287. 제279항 내지 제286항 중 어느 한 항의 VACVΔB2R 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  288. 제287항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  289. 제287항 또는 제288항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  290. 제279항 내지 제286항 중 어느 한 항의 VACVΔB2R 바이러스 또는 제287항 내지 제289항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  291. 제290항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  292. 제290항 또는 제291항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  293. 제290항 내지 제292항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  294. 제290항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  295. 제290항 내지 제293항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  296. 제294항 또는 제295항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  297. 제296항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  298. 제296항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  299. 제296항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  300. 제294항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서,
    VACVΔB2R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔE5R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  301. 제279항 내지 제286항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제287항 내지 제289항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  302. 제301항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  303. 제302항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  304. 제303항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  305. 제303항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  306. 제303항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  307. 제302항 또는 제303항에 있어서,
    VACVΔB2R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 VACVΔB2R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  308. 제279항 내지 제286항 중 어느 한 항의 VACVΔB2R 바이러스를 코딩하는 핵산.
  309. 제279항 내지 제286항 중 어느 한 항의 VACVΔB2R 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  310. (i) 돌연변이체 M63R 유전자(MYXVΔM63R); (ii) 돌연변이체 M64R 유전자(MYXVΔM64R); 및 (iii) 돌연변이체 M62R 유전자(MYXVΔM62R)로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이체를 포함하도록 유전적으로 조작된 점액종 바이러스(MYXV).
  311. 제310항에 있어서,
    바이러스가 OX40L, hFlt3L, hIL-2, hIL-12, hIL-15, hIL-15/IL-15Rα, hIL-18, hIL-21, 항-huCTLA-4, 항-huPD-1, 항-huPD-L1, GITRL, 4-1BBL, 또는 CD40L 중 하나 이상을 코딩하는 이종 핵산 분자, 및/또는 백시니아 바이러스 티미딘 키나아제(TK), C7(ΔC7L), E3L(ΔE3L), E3LΔ83N, B2R(ΔB2R), B19R(B18R; ΔWR200), IL18BP, K7R, C12L, B8R, B14R, N1L, C11R, K1L, M1L, N2L, 또는 WR199(ΔWR199)의 점액종 올소로그, 또는 점액종 M31R(ΔM31R) 중 임의의 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는, MYXV 바이러스.
  312. 제310항 또는 제311항에 있어서,
    돌연변이체 M63R 유전자, M64R 유전자, 및/또는 M62R 유전자가, 유전자의 적어도 일부의 이종 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 유전자 카세트로의 치환을 포함하는, MYXV 바이러스.
  313. 제311항 또는 제312항에 있어서,
    이종 핵산이 티미딘 키나아제(TK) 유전자, C7 유전자, C11 유전자, K3 유전자, F1 유전자, F2 유전자, F4 유전자, F6 유전자, F8 유전자, F9 유전자, F11 유전자, F14.5 유전자, J2 유전자, A46 유전자, E3L 유전자, B2R 유전자, B18R(WR200) 유전자, E5R 유전자, K7R 유전자, C12L 유전자, B8R 유전자, B14R 유전자, N1L 유전자, K1L 유전자, C16 유전자, M1L 유전자, N2L 유전자, 및 WR199 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백시니아 바이러스 유전자의 점액종 올소로그 내부로부터 발현되는, MYXV 바이러스.
  314. 제310항 내지 제313항 중 어느 한 항의 MYXV 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  315. 제314항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  316. 제314항 또는 제315항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  317. 제310항 내지 제313항 중 어느 한 항의 MYXV 바이러스 또는 제314항 내지 제316항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  318. 제317항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  319. 제317항 또는 제318항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  320. 제317항 내지 제319항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  321. 제317항 내지 제320항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  322. 제317항 내지 제321항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  323. 제321항 또는 제322항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  324. 제323항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  325. 제323항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  326. 제323항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  327. 제321항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서,
    MYXVΔM62R, MYXVΔM63R, 및/또는 MYXVΔM64R 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MYXVΔM62R, MYXVΔM63R, 및/또는 MYXVΔM64R 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  328. 제310항 내지 제313항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제314항 내지 제316항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  329. 제328항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  330. 제329항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  331. 제330항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  332. 제330항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  333. 제330항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  334. 제329항 또는 제330항에 있어서,
    MYXV 바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 MYXV 바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  335. 제310항 내지 제313항 중 어느 한 항의 MYXV 바이러스를 코딩하는 핵산.
  336. 제310항 내지 제313항 중 어느 한 항의 MYXV 바이러스, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  337. 제180항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 hIL-12를 코딩하는 이종 핵산 분자를 추가로 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  338. 제337항에 있어서,
    바이러스가 MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12를 포함하는, MVAΔE5R 바이러스.
  339. 제338항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 C11R 유전자를 추가로 포함하는, MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12 바이러스(MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12ΔC11R).
  340. 제339항에 있어서,
    바이러스가 hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는, MVAΔE3LΔE5R-hFlt3L-OX40LΔWR199-hIL-12 바이러스.
  341. 제213항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 ΔE3L83N, 돌연변이체 티미딘 키나아제(ΔTK), 돌연변이체 B2R(ΔB2R), 돌연변이체 WR199(ΔWR199), 및 돌연변이체 WR200(ΔSR200)을 추가로 포함하고, 항-CTLA-4를 코딩하는 핵산 분자 및 IL-12를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, VACVΔE5R-OX40L-hFlt3L 바이러스(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200).
  342. 제341항에 있어서,
    hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200 바이러스(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200- hIL-15/IL-15Rα).
  343. 제341항에 있어서,
    돌연변이체 C11R 유전자(ΔC11R)를 추가로 포함하는, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200 바이러스(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200ΔC11R).
  344. 제343항에 있어서,
    hIL-15/IL-15Rα를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는, VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200ΔC11R 바이러스(VACVΔE3L83N-ΔTK-항-CTLA-4-ΔE5R-hFlt3L-OX40L-IL-12ΔB2RΔWR199ΔWR200- hIL-15/IL-15RαΔC11R).
  345. 제310항 또는 제311항에 있어서,
    바이러스가 돌연변이체 M62R 유전자(ΔM62R), 돌연변이체 M63R 유전자(ΔM63R), 및 돌연변이체 M64R 유전자(ΔM64R)를 포함하도록 유전적으로 조작된, MYXV 바이러스(MYXVΔM62RΔM63RΔM64R).
  346. Figure pct00168
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 폭스바이러스(poxvirus).
  347. 제346항의 재조합 폭스바이러스를 코딩하는 핵산 서열.
  348. 제346항의 재조합 폭스바이러스를 포함하는 키트.
  349. 제346항의 재조합 폭스바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  350. 제349항에 있어서,
    약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  351. 제349항 또는 제350항에 있어서,
    약학적 허용 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  352. 제349항의 재조합 폭스바이러스 또는 제349항 내지 제351항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양 치료를 필요로 하는 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법.
  353. 제352항에 있어서,
    치료가 다음 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것 또는 대상체에서 종양에 대해 진행 중인 면역 반응을 향상시키거나 촉진하는 것, 종양의 크기를 감소시키는 것, 종양을 근절하는 것, 종양의 성장을 억제하는 것, 종양의 전이 성장을 억제하는 것, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는 것, 또는 대상체의 생존을 연장시키는 것.
  354. 제352항 또는 제353항에 있어서,
    조성물이 종양내 또는 정맥내 주사 또는 종양내 및 정맥내 주사의 동시 또는 순차 조합에 의해 투여되는, 방법.
  355. 제352항 내지 제354항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양이 흑색종, 결장, 유방, 방광, 또는 전립선 암종인, 방법.
  356. 제352항 내지 제355항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 추가로 포함하는, 방법.
  357. 제352항 내지 제356항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물, 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  358. 제356항 또는 제357항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  359. 제358항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  360. 제358항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  361. 제358항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  362. 제356항 내지 제358항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 폭스바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 재조합 폭스바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 또는 핑골리모드(FTY720) 단독의 투여와 비교하여 종양의 치료에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  363. 제346항의 바이러스 또는 제349항 내지 제351항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 자극하는 방법.
  364. 제363항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제; 하나 이상의 항암 약물; 핑골리모드(FTY720); 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 대상체에 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  365. 제364항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 이필리무맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 람브롤리주맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, MPDL3280A, BMS-936559, MEDI-4736, MSB 00107180, LAG-3, TIM3, B7-H3, B7-H4, TIGIT, AMP-224, MDX-1105, 아렐루맙, 트레멜리무맙, IMP321, MGA271, BMS-986016, 리릴루맙, 우렐루맙, PF-05082566, IPH2101, MEDI-6469, CP-870,893, 모가물리주맙, 발릴루맙, 갈릭시맙, AMP-514, AUNP 12, 인독시모드, NLG-919, INCB024360, CD80, CD86, ICOS, DLBCL 억제제, BTLA, PDR001, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
    하나 이상의 항암 약물이 Mek 억제제(U0126, 셀루미티닙(AZD6244), PD98059, 트라메티닙, 코비메티닙), EGFR 억제제(라파티닙(LPN), 엘로티닙(ERL)), HER2 억제제(라파티닙(LPN), 트라스투주맙), Raf 억제제(소라페닙(SFN)), BRAF 억제제(다브라페닙, 베무라페닙), 항-OX40 항체, GITR 작용제 항체, 항-CSFR 항체, CSFR 억제제, 파클리탁셀, TLR9 작용제 CpG, 및 VEGF 억제제(베바시주맙), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  366. 제365항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-L1 항체를 포함하는, 방법.
  367. 제365항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-PD-1 항체를 포함하는, 방법.
  368. 제365항에 있어서,
    하나 이상의 면역 체크포인트 차단제가 항-CTLA-4 항체를 포함하는, 방법.
  369. 제363항 내지 제365항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 폭스바이러스와 면역 체크포인트 차단제, 항암 약물, 및/또는 핑골리모드(FTY720)의 조합이 재조합 폭스바이러스의 투여 또는 면역 체크포인트의 투여와 비교하여 면역 반응의 자극에서 상승작용 효과를 갖는, 방법.
  370. 제346항에 있어서,
    폭스바이러스가
    Figure pct00169
    로부터 선택되고, 바이러스가 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 또는 항- CTLA-4의 발현 대신에 또는 이와 함께 항-CTLA-4와 항-PD1 항체의 조합을 발현하도록 조작될 수 있는, 재조합 폭스바이러스.
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