KR20080084528A - 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명의 실시태양은 티미딘 키나제 결핍된 백시니아 바이러스를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 백시니아 바이러스를 증가된 바이러스 농도로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또다른 측면은 종양에서의 세포의 종양살상을 유도하기에 충분한, TK-결핍되고 GM-CSF-발현하는 복제-가능한 백시니아 바이러스 벡터의 1 x 10⁸ 이상의 바이러스 입자를 종양을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 환자에서의 종양살상 유도 방법 또는 종양 혈관계의 붕괴 유도 방법을 포함한다.

티미딘 키나제 결핍된 백시니아 바이러스, 복제 가능한 백시니아 바이러스 벡터, 종양살상 유도, 종양살상형 바이러스

Description

종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료 {ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS CANCER THERAPY}

본 발명은 일반적으로 종양학 및 바이러스학의 분야와 관련이 있다. 더욱 특히, 본 발명은 특히 암 치료에 적합한 종양살상형 백시니아 바이러스를 포함하는 폭스바이러스에 관한 것이다.

정상 조직 항상성은 세포 증식 및 세포 사멸의 고도로 조절된 과정이다. 세포 증식 또는 세포 사멸의 불균형은 암성 상태로 발전될 수 있다 ([Solyanik et al., 1995]; [Stokke et al., 1997]; [Mumby and Walter, 1991]; [Natoli et al., 1998]; [MagiGalluzzi et al., 1998]). 예를 들면, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 췌장암, 직장결장암 및 뇌암은 생성될 수 있는 많은 암들 중 단지 몇몇 예일 뿐이다 ([Erlandsson, 1998]; [Kolmel, 1998]; [Mangray and King, 1998]; [Gertig and Hunter, 1997]; [Mougin et al., 1998]). 사실, 암의 발생은 매우 높아서 미국에서만 암으로 인해 매년 500,000 이상의 사망자가 발생한다.

세포 증식 및 세포 사멸의 유지는 적어도 부분적으로 원종양유전자 및 종양 억제자에 의해 조절된다. 원종양유전자 또는 종양 억제자는 세포성 증식을 유도하 는 단백질 (예를 들어, sis, erbB, src, ras 및 myc), 세포성 증식을 억제하는 단백질 (예를 들어, Rb, p16, p19, p21, p53 및 NF1 및 WT1) 또는 예정된 세포 사멸을 조절하는 단백질 (예를 들어, bc1-2)을 코딩할 수 있다 ([Ochi et al., 1998]; [Johnson and Hamdy, 1998]; [Liebermann et al., 1998]). 하지만, 이러한 원종양유전자 및 종양 억제자의 유전적 재배열 또는 돌연변이는 원종양유전자를 강력한 암유발 종양유전자로 전환시키거나 또는 종양 억제자를 비활성 폴리펩티드로 전환시키는 결과를 가져온다. 종종, 단일 점 돌연변이는 형질전환을 달성하기에 충분하다. 예를 들면, p53 종양 억제자 단백질에서의 점 돌연변이는 야생형 p53 기능을 완전히 상실시킨다 ([Votelstein and Kinzler, 1992]).

현재, 많은 일반적인 암 유형의 치료에 대한 효과적인 선택 방법은 거의 없다. 개인에 대한 치료 과정은 진단, 질병의 발달 단계 및 환자의 나이, 성 및 일반적인 건강과 같은 인자에 따른다. 암 치료의 가장 통상적인 선택 방법은 수술, 방사선 요법 및 화학요법이다. 수술은 암의 진단 및 치료에 중심적인 역할을 한다. 통상적으로, 수술적 접근은 생검 및 암 성장의 제거에 필요하다. 하지만, 암이 전이되었거나 널리 퍼졌을 경우, 수술을 통해 치료되지 못할 것이며, 또다른 접근법을 선택해야만 한다.

방사선 요법 및 화학요법은 암의 수술적 치료에 대한 가장 보편적인 대안책이다 ([Mayer, 1998]; [Ohara, 1998]; [Ho et al., 1998]). 방사선 요법은 고에너지 방사선을 정확히 조준하여 암 세포를 파괴하는 것을 수반하며, 수술과 마찬가지로, 전이되지 않은 국소적 암 세포의 치료에만 주로 유효하다. 방사선 요법의 부 작용은 피부 자극, 연하의 어려움, 구강 건조, 구역, 설사, 탈모 및 에너지의 손실을 포함한다 ([Curran, 1998]; [Brizel, 1998]). 항암제로 암을 치료하는 것은 암 치료의 또다른 양식인데, 대부분의 화학요법은 많은 다양한 암에 대한 반응 속도를 증가시키는 것으로 입증된 1 이상의 항암제의 병용을 포함한다 (본원에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 5,824,348; 미국 특허 5,633,016 및 미국 특허 5,798,339). 하지만, 화학요법 약물의 주요 부작용은 이들이 정상 조직 세포에도 또한 영향을 미치는데, 몇몇 경우에 가장 많이 영향을 받을 가능성이 있는 세포들은 빠르게 분열하는 세포들이다 (예를 들어, 골수, 위장관, 생식기 계통 및 모낭). 화학요법 약물의 다른 독성 부작용은 구내염, 연하의 어려움, 구강 건조, 구역, 설사, 구토, 피곤, 출혈, 탈모 및 감염을 포함할 수 있다.

복제-선택성 종양살상형 바이러스는 암의 치료에 대해 희망을 가져왔다 ([Kirn et al., 2001]). 이들 바이러스는 직접 복제-의존성 종양살상 작용 및/또는 바이러스 유전자 발현-의존성 종양살상 작용을 통해 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있다 ([Kirn et al., 2001]). 나아가, 바이러스는 숙주내의 세포-매개 항종양 면역의 유도를 향상시킬 수 있다. ([Todo et al., 2001]; [Sinkovics et al., 2001]). 또한 이들 바이러스를 종양 내에서 발현되는 치료학적 형질전환 유전자로 조작하여 항종양 효율을 향상시킬 수 있다 ([Hermiston, 2000]). 하지만, 이러한 치료학적 접근에 대해 많은 제한들이 존재한다.

따라서, 암의 치료를 위한 더욱 효과적이고 독성이 덜한 치료법이 필요하다. 종양살상형 바이러스의 사용은 개발의 잠재적인 영역을 제공하지만, 논의된 제한들이 극복되어야만 한다.

<발명의 요약>

본 발명의 실시태양은 티미딘 키나제 결핍된 백시니아 바이러스를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 백시니아 바이러스를 증가된 바이러스 농도로 투여하는 것을 포함한다. 본 방법은 종양에서의 세포의 종양살상을 유도하기에 충분한, TK-결핍되고 GM-CSF-발현하는 복제-가능한 백시니아 바이러스 벡터의 1 x 10⁸ 이상의 바이러스 입자를 종양을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 환자에서의 종양살상 유도 방법 또는 종양 혈관계의 붕괴 유도 방법을 포함한다. 어떤 면에서, 환자에게 적어도 2 x 10⁸, 5 x 10⁸, 1 x 10⁹, 2 x 10⁹, 5 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 5 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 5 x 10¹¹, 1 x 10¹², 5 x 10¹² 이상의 바이러스성 입자 또는 플라크 형성 단위 (pfu)를 투여하는데, 이들은 다양한 값 및 이들 사이의 다양한 범위를 포함한다. 바이러스의 단일 투여량이란 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 24 시간에 걸쳐 환자 또는 종양에 투여되는 양을 지칭하는 것으로 생각된다. 투여량은 시간에 걸쳐 분포될 수 있거나 또는 별도의 주입을 통해 분포될 수 있다. 통상 적으로, 단일 투여량은 동일한 일반적인 표적 구역, 예컨대 종양 부근에 투여하거나 또는 정맥 투여의 경우에는 입자는 환자의 혈류 또는 림프계의 지점으로 들어간다. 또다른 측면에서, 백시니아 바이러스 벡터는 2, 3, 4, 5 회 이상 투여된다. 또다른 측면에서, 백시니아 바이러스는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 주 이상에 걸쳐 투여된다. 특정 실시태양에서 환자는 인간이다. 환자는 암 및 특히 종양으로 고통받을 수 있다. 특정 실시태양에서, 종양은 치료 전에는 절제가능하지 않고, 치료 후에는 절제가능하다. 종양은 뇌암 종양, 두경부암 종양, 식도암 종양, 피부암 종양, 폐암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 간암 종양, 난소암 종양, 자궁암 종양, 방광암 종양, 고환암 종양, 직장암 종양, 유방암 종양 또는 췌장암 종양일 수 있다. 특정 실시태양에서, 종양은 간세포성 종양이다. 다른 실시태양에서, 종양은 방광 종양이다. 또다른 실시태양에서, 종양은 흑색종이다. 종양은 재발성, 원발생, 전이성 및/또는 다중 약물 내성 종양일 수 있다. 특정 측면에서, 본 방법은 또한 환자에게 제2 암 치료를 행하는 것을 포함한다. 제2 암 치료는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 냉동요법, 독소 요법 및/또는 수술, 이들의 조합일 수 있다. 본 방법은 또한 상기 백시니아 바이러스 벡터의 제2 투여를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 치료 전, 치료 동안, 치료 후, 또는 이들의 조합된 시기에 종양 세포 생존성을 측정하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 바이러스는 혈관내, 종양내, 또는 이들의 조합 부위에 투여된다. 또다른 측면에서, 투여는 종양 물질 내로 주입을 통해 행해진다. 또다른 실시태양에서, 투여는 종양 혈관 내로의 주입 또는 종양 혈관의 구역 내의 주입의 통 해 행해진다. 또다른 실시태양에서, 투여는 상기 종양에 대한 림프계 또는 혈관계 구역내로의 주입을 통해 행해진다.

또다른 측면에서, 본 방법은 투여 전 또는 투여 동안 종양을 영상화하는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 환자는 면역손상될 수 있다. 특정 측면에서, 바이러스는 상기 종양 중 20% 이상의 세포, 상기 종양 중 30% 이상의 세포, 상기 종양 중 40% 이상의 세포, 상기 종양 중 50% 이상의 세포, 상기 종양 중 60% 이상의 세포, 상기 종양 중 70% 이상의 세포, 상기 종양 중 80% 이상의 세포 또는 상기 종양 중 90% 이상의 세포의 종양살상을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다.

특정 실시태양에서, 백시니아 바이러스는 1 이상의 변형된 바이러스 유전자를 포함한다. 1 이상의 변형된 바이러스 유전자는 (a) 인터페론 조정 폴리펩티드; (b) 보체 조절 폴리펩티드; (c) TNF 또는 케모카인 조정 폴리펩티드; (d) 세린 프로테아제 억제제; (e) IL-1β 조정 폴리펩티드; (f) 비감염성 EEV 형태 폴리펩티드; (g) 세포로부터 감염성 바이러스의 방출을 억제하는 작용을 하는 바이러스성 폴리펩티드 (비감염성 바이러스형 폴리펩티드) 또는 이들의 조합 중 1 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시태양은 보편적이고 결정적인 암 경로를 표적화한다. 이들 경로의 표적화는 다수의 유효한 메카니즘, 예컨대 종양살상: 괴사, 혈관 폐쇄, CTL 공격 유도, 전신성: IT, IV; 종양-특이적 CTL을 유발하는 다양한 세포 메카니즘 (예를 들어, 세포성 티미딘 키나제 농도: E2F-반응성; EGF-R 경로 활성화; 면역 보 호 (immune sanctuary): 항바이러스성 IFN 반응 (ras, p53); VEGF-유도된 혈관 공극 크기: 침착 IV)의 조정을 수반한다.

제1상 임상 시험을 거친 본 발명의 실시태양은 암 치료로서의 백시니아 바이러스의 안전성 및 유효성을 증명하였다. 남은 수명 예상치의 중앙값이 6 개월 미만인 등록된 7 명의 환자로의 전이성 흑색종 임상 시험은 2 주마다 투여량 단계적 증량 연구에서 종양내 주입을 통해 수행되었다. 이러한 시험은 백시니아 바이러스가 안전하고 잘-허용되었고, 5 명의 환자에서 71%의 종양 관해를 나타냈고, 2 명은 질병이 없어진 장기간 생존자였다.

제1상/제2상 시험으로부터의 초기 결과는 또한 JX-594의 계속된 안전성을 증명하였다. 어떠한 DLT 또는 치료-관련된 SAE, 4 등급 치료-관련된 AE, 또는 LFT의 상당한 변화도 관찰되지 않았다. 독감 유사 증후군은 5 내지 8 일 동안 관찰되었다. plt, 림프, ANC (통상적으로 Grl-2)의 일시적 감소 또한 관찰되었다. 연구 8 일 째, 1 명이 사망하였으나, 이는 치료와 아무런 관련이 없는 것으로 결론이 났다. 전체적으로, JX-594 바이러스혈증은 즉각적인 후-주입(15-30 분): 혈액 내 최대 3 x 10⁸, 총 유전자 및 복제 피크 (5-8 일): 혈액 내 최대 10¹⁰ 총 유전자에서 잘-허용되었다.

본 발명의 다른 실시태양은 본 출원을 통해 완전하게 논의된다. 본 발명의 일 측면에 대해 논의된 임의의 실시태양은 본 발명의 다른 측면에도 마찬가지로 적용되며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 실시예 부분에서의 실시태양은 본 발명의 모든 측면에 적용가능한 본 발명의 실시태양에 대해 이해된다.

특허청구범위 및/또는 명세서에서 사용되는 용어 "억제", "감소" 또는 "예방 또는 이들 용어의 변형어는 원하는 결과를 달성하기 위한 임의의 측정가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함한다.

특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 단어 "하나(a/an)"의 사용은 단지 "일(one)"을 의미할 수 있을 뿐 아니라, 또는 "1 이상", "적어도 하나" 및 "1 또는 1 초과"의 의미와 일치한다.

본원에서 논의되는 임의의 실시태양은 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물에 대해 구현될 수 있음을 고려하며, 그 반대의 경우도 마찬가지로 고려된다. 나아가, 본 발명의 조성물 및 키트는 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.

본 출원에서의 용어 "약"은 특정 값이 그 값을 측정하는데 사용되는 장치 또는 방법에서의 표준 범위에서의 오차를 포함함을 나타낸다.

특허청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은, 단지 양자택일만을 지칭하거나 또는 그 대안들이 상호 배타적임을 명백히 나타내지 않는다면, 그 개시가 단지 양자택일 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다고 하더라도, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.

특허청구범위 및 명세서에서 사용된 단어 "포함하는(comprising)" (및 "포함한다"와 같은 이의 임의의 형태), "갖는" (및 "갖는다"와 같은 이의 임의의 형태), "포함하는(including)"(및 "포함한다"와 같은 이의 임의의 형태) 또는 "함유하는" (및 "함유한다"와 같은 이의 임의의 형태)는 포괄적이거나 제한이 없음을 의미하며, 추가적이고 인용되지 않는 요소 또는 반응 단계를 배척하지 않는다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 하지만, 본 발명의 구체적인 실시태양을 나타내는 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시일 뿐이며, 본 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이라는 것을 이해해야만 한다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 암의 치료를 위한 종양살상형 폭스바이러스의 사용에 관한 것이다. 특히, 종양살상의 특정 정도를 달성하기 위한, GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스의 사용을 기술한다. 또다른 실시태양에서, GM-CSF-발현 폭스바이러스를 유전자 제품의 변이 또는 변형을 통해, 암 세포 사멸에서는 더욱 효과적이고 더욱 효율적이고/이거나 비-암세포에 대한 독성 또는 손상은 더욱 낮아지도록 조작하여, 변형물이 바이러스가 숙주에 더욱 잘 감염할 수 있게 만들어, 숙주 세포에 대한 독성을 낮추고/낮추거나, 암세포에 더 잘 감염될 수 있게 한다. 특정 변형은 바이러스의 티미딘 키나제 (TK) 기능을 결핍시킨다.

I. 폭스바이러스

A. 백시니아 바이러스

백시니아 바이러스는 약 190K bp의 선형 이중 나선 DNA 유전자를 가지고 있 으며, 약 250 유전자에 대해 코딩하는 크고, 복잡한 외피성 바이러스이다. 천연두를 근절시킨 백신으로서의 백시니아의 역할은 주지되어 있다. 천연두의 근절 후, 과학자들은 생물학적 조직 내로 유전자를 전달하기 위한 도구로서의 백시니아의 사용을 연구하여 왔다 (유전자 치료 및 유전 공학). 백시니아 바이러스는 DNA 바이러스 중에서 특이한데, 이는 단지 숙주 세포의 세포질에서만 복제하기 때문이다. 따라서, 바이러스 DNA 복제를 위해 필요한 바이러스 효소 및 단백질을 코딩하기 위해서는 큰 게놈이 요구된다. 복제 동안, 백시니아는 이들의 외막에서와는 상이한 몇몇 감염 형태인 세포내 성숙 비리온 (IMV), 세포내 외피성 비리온 (IEV), 세포 관련된 외피성 비리온 (CEV) 및 세포외 외피성 비리온 (EEV)을 생산한다. IMV는 가장 풍부한 감염 형태이며 이는 숙주 간의 분포에 관여하는 것으로 생각된다. 한편, CEV는 세포와 세포의 분포에 일정한 역할을 하는 것으로 생각되며, EEV는 숙주 기관 내의 긴 범위 전파에 중요한 것으로 생각된다.

백시니아는 인터페론에 내성인 바이러스를 생산하는 몇몇 단백질을 코딩한다. K3L은 eIF-2α와 상동성을 가지는 단백질이다. K3L 단백질은 인터페론의 활성제인 PKR의 작용을 억제한다. E3L은 PKR 활성을 억제하는 또다른 백시니아 단백질이며, 이 또한 이중 나선 RNA에 결합할 수 있다.

백시니아 바이러스는 우두를 일으키는 단백질과 밀접한 관련이 있다. 백시니아의 정확한 기원은 밝혀지지 않았지만, 가장 일반적인 견해는 천연두의 원인 제제인 백시니아 바이러스, 우두 바이러스 및 배리올라 바이러스 모두가 공통적인 조상 바이러스로부터 유래했다는 것이다. 또한 백시니아 바이러스가 원래 말로부터 단리되었다는 의견도 있다. 백시니아 바이러스 감염은 건강한 개체에서는 경미하고 통상적으로 무증상이지만, 이는 지극히 낮은 치사율을 가지는 경미한 발진 및 열을 일으킬 수도 있다. 백시니아 바이러스 감염에 대해 발생된 면역 반응은 사람을 치사성 천연두 감염으로부터 보호한다. 이러한 이유로, 백시니아 바이러스는 천연두에 대해 생-바이러스로서 사용되었다. 백시니아 바이러스 백신은 천연두 바이러스를 함유하지 않기 때문에 안전하지만, 특히 백신이 면역손상되었을 때에는, 때때로 어떠한 합병증 및/또는 백신 부작용을 일으킬 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 백시니아 바이러스는 많은 외래 단백질을 발현시키기도록 조작되어 왔다. 이러한 하나의 단백질은 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 또는 GM-CSF이다. GM-CSF는 과립구 (중성구, 호산구 및 호염기구) 및 대식세포를 생산하는 줄기 세포를 자극하는 대식세포를 통해 분비되는 단백질이다. 인간 GM-CSF는 아미노산 잔기 23 (루신), 27 (아스파라긴), 및 39 (글루탐산)에서 글리코실화된다 (참고문헌으로 인용하는 미국 특허 5,073,627 참조). GM-CSF는 또한 몰그라모스팀(molgramostim), 또는 단백질이 효모 세포에서 발현되는 경우에는 사르그라모스팀(sargramostim, 상표등록된 루킨(Leukine)®)으로서 공지되어 있으며, 이는 백혈구의 생산, 특히 과립구 및 대식세포의 생산을 자극하는 투약법으로서, 화학요법 후에 사용된다. GM-CSF를 발현하는 백시니아 바이러스는 이전에 보고되어 있었다. 하지만, 이는 종양살상제로서 개발되지 않았으며, 단지 GM-CSF에 대한 전달 벡터로만 개발되었다. 이에 따라, 이는 환자에게 상당한 종양살상을 달성할 수 있는 것 보다 낮은 용량으로 투여되어 왔다. 본원에서는 몇몇 실시태양에서 1 x 10⁸ pfu 또는 입자 초과의 농도로 투여되는 GM-CSF를 발현되는 백시니아 바이러스 의 사용을 기술한다.

B. 변형된 폭스바이러스

바이러스는 인터페론 (-α, -β, -γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNFα)와 같은 면역조정 분자에 의해 자주 불활성화되거나, 억제되거나 또는 제거된다 ([Moss, 1996]). 숙주 조직 및 염증/면역 세포는 흔히 바이러스 감염에 대해 이러한 분자를 분비한다. 이러한 분자들은 직접적인 항바이러스 작용을 가지고/가지거나 염증 세포 및 림프구의 동원 및/또는 활성을 통한 간접적인 작용을 가질 수 있다. 이러한 면역학적 제거 메카니즘의 중요성을 고려할 때, 바이러스는 이러한 사이토카인/케모카인 및 인터페론의 유도 및/또는 기능을 억제하는 유전자 생성물을 발현하도록 발달되어 왔다. 예를 들면, 백시니아 바이러스 (VV; 및 몇몇 다른 폭스바이러스)는 CC 케모카인(예를 들어, RANTES, 에오탁신(eotaxin), MIP-1-알파)에 결합하여 억제하는 분비 단백질 vCKBP (B29R)를 코딩한다 ([Alcami et al., 1998]). 몇몇 VV 균주는 또한 TNF(예를 들어, 리스터(Lister) A53R)에 결합하여 불활성화시키는 분비 바이러스성 단백질을 발현한다 ([Alcami et al., 1999]). 대부분의 폭스바이러스 균주는 인터페론-α/β(예를 들어, B19R) 또는 인터페론 (B8R)에 결합하여 이의 기능을 억제하는 분비 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는다. vC12L은 IL-18이 IFN-γ 및 NK 세포/세포독성 T-세포 활성을 유도하는 것으로부터 방지하는 IL-18-결합 단백질이다.

대부분의 폭스바이러스 독력 조사는 마우스에서 수행되었다. 모두는 아니지만 많은 이러한 단백질은 마우스에서 활성이다 (예를 들어, B19R은 활성이 아니다). 이러한 단백질이 표적 사이토카인의 마우스 버젼에 대해 활성인 상황에서, 이러한 유전자의 결실은 이러한 유전자의 결실 또는 이러한 유전자의 기능적 돌연변이를 갖는 VV 돌연변이의 독력을 감소시키고 안전성을 증가시키는 것을 유도한다. 또한, 이러한 돌연변이에 대한 염증/면역 반응 및 이러한 돌연변이의 바이러스 제거는 종종 억제 단백질을 발현하는 모 바이러스 균주에 비해 증가된다. 예를 들어, 폭스바이러스 분비 단백질의 T1/35kDa 족(케모카인-결합/-억제 단백질)의 결실은 바이러스 감염된 조직에서의 백혈구 침윤의 특징적인 증가를 유발할 수 있다 ([Graham et al., 1997]). VV에서의 vC12L 유전자의 결실은 마우스에서 비내 투여 후 바이러스성 역가/독성의 감소를 유발하며, 나아가 NK 세포 및 세포독성 T-림프구성 활성은 IFN-γ 유도와 함께 증가한다 ([Smith et al., 2000]). (IFN-γ 및 넓은 범위의 케모카인에 결합할 수 있는) 믹소마(Myxoma) 바이러스 T7 유전자의 결실은 독성 모델에서의 감소된 독력 및 상당히 증가된 조직 염증/침윤을 나타냈다 ([Upton et al., 1992]; [Mossman et al., 1996]). 믹소마 바이러스로부터의 M-T2 유전자의 결실은 또한 토끼 모델에서의 감소된 독력을 나타냈다 ([Upton et al., 1991]). B18R 항-인터페론-α/β 유전자 생성물의 결실은 또한 IFN-매개된 제거에 대한 바이러스 감수성의 향상, 정상 조직에서의 역가의 감소 및 독력의 감소를 유발한다 ([Symons et al., 1995]; [Colamonici et al., 1995]; [Alcami et al., 2000]). 요약하자면, 이들 바이러스 유전자 생성물은 바이러스 감염된 조직내에서 항바이러스성 면역 반응 및 염증성 세포 침윤을 감소시키는 기능을 한다. 결실/돌연변이를 통한 단백질 기능의 상실은 숙주 조직내에서의 바이러스의 독력 감소 및/또는 전염증성 성질의 증가를 유발한다.

사이토카인 및 케모카인은 강력한 항종양 작용을 가질 수 있다 ([Vicari et al., 2002]; [Homey et al., 2002]). 이들 작용은 종양 세포 그 자체에 직접 행할 수 있거나 (예를 들어, TNF), 또는 이들은 비-암성 세포에의 작용을 통해 간접적으로 행할 수 있다. 후자의 예로는 TNF가 있는데, 이는 종양 관련 혈관에 대해 독성을 일으킴으로써 항종양 작용을 가질 수 있으며, 이는 종양 괴사 후 종양으로의 혈류의 상실을 유발한다. 또한, 케모카인은 중성구, 호산구, 대식세포 및/또는 림프구와 같은 면역 이펙터(effector) 세포를 동원하는 (몇몇 경우에는 이에 더하여 활성화시키는) 작용을 할 수 있다. 이러한 면역 이펙터 세포는 많은 메카니즘을 통해 종양을 파괴시킬 수 있다. 이러한 메카니즘은 항종양 사이토카인(예를 들어, TNF)의 발현, fas-리간드의 발현, 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)의 발현, 자연 살해 세포의 동원 등을 포함한다. 염증 반응은 궁극적으로 전신성 종양 특이적 면역반응을 유도할 수 있다. 결국, 많은 이러한 사이토카인(예를 들어, TNF) 또는 케모카인은 화학요법 또는 방사선 요법과 상승적으로 작용하여 종양을 파괴시킬 수 있다.

이러한 면역자극성 단백질의 재조합 버젼의 임상적으로 유효한 전신 투여는 (1) 전신성 투여에 의한 심각한 독성을 유발하고 (2) 국소적 침윤 및 항종양 작용을 자극하는데 종양 조직 내의 국소적 발현이 필요하기 때문에 편리하지 못하다. 전신적 순환에서의 농도를 최소화시키면서도 종양 물질 내의 이러한 분자의 높은 국소적 농도를 달성하기 위한 접근이 필요하다. 사이토카인 또는 케모카인 유전자의 효능을 향상시키기 위한 시도에서 사이토카인 또는 케모카인 유전자를 발현하도록 바이러스를 조작할 수 있다. 복제-선택성 벡터로부터의 이들 유전자의 발현은 비-복제성 벡터로부터의 발현에 비해 잠재적인 이점을 갖고 있다. 복제성 바이러스로부터의 발현은 종양 물질 내의 보다 높은 국소적 농도를 생산할 수 있고; 나아가 복제성 바이러스는 종양 세포 파괴/종양살상을 통해 항종양성 면역의 유도 및 전염증성 환경에서의 종양 항원의 방출을 도울 수 있다. 하지만, 이러한 접근에는 몇가지 제약이 있다. 높은 국소적 농도에서 발현되는 경우 독성일 수 있는 유전자에 의해 (종양 선택성이면서) 복제-가능한 바이러스의 환경으로 방출되는 것에 대한 심각한 안전성이 우려된다. 이에 따라 이들의 게놈으로부터 강력한 전염증성 유전자를 발현하는 바이러스가 치료받는 환자 및 일반 공중에게 안전성의 위험성을 야기시킬 수 있다. 이러한 유전자를 발현하는 종양-표적화, 복제-선택성 바이러스라고 하더라도, 유전자 발현은 정상 조직에 독성을 일으킬 수 있다. 나아가, 크기 제약은 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터의 다수이고/이거나 큰 유전자의 발현을 막는데, 이러한 분자는 조합시 더욱 효과적으로 작용함은 명백할 것이다. 결국, 사용되는 많은 종양살상형 바이러스는 항염증성 단백질을 발현시키며 이에 따라 이들 바이러스는 감염된 종양 물질 내에서 전염증성 환경의 유도를 방해할 것이다. 항종양 면역, 항바이러스성 작용 및 화학요법성/방사선요법성 감작화의 유도를 억제하는 결과를 가져올 것이다.

C. 백시니아 바이러스

1. 인터페론 조정 폴리펩티드

인터페론-α/β는 몇몇 메카니즘을 통해 바이러스 복제를 차단한다. 인터페론-γ는 보다 약한 직접적인 바이러스 억제 작용을 가지지만, 몇몇 메카니즘을 통해 세포-매개된 면역의 강력한 유도자이다. 바이러스는 인터페론의 항바이러스 작용을 길항할 수 있는 분비 유전자 생성물을 발현하도록 발달되어 왔다. 예를 들면, 백시니아 바이러스 (및 다른 폭스바이러스)는 각각 인터페론-γ 및 인터페론-α/β에 결합하는 분비 단백질 B8R 및 B18R을 코딩한다 ([Smith et al., 1997]; [Symons et al., 1995]; [Alcami et al., 2000]). 인터페론 유도를 감소시키는 백시니아 유전자 생성물의 또다른 예는 인터페론-γ 유도 인자 IL-18의 활성을 억제하는 카스파제-1 억제제 B13R이다. 인터페론 조정 폴리펩티드는 백시니아 바이러스의 코펜하겐(Copenhagen) 균주와 같은 다른 바이러스 균주에서는 B19R로 명명될 수 있는 B18R; B8R; B13R; vC12L; A53R; E3L 및 유사한 활성 또는 성질을 갖는 다른 바이러스성 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다. IFN 조정 폴리펩티드를 바람직하게는 IFNα 및/또는 β 경로를 조정하는 것들 (예컨대 B18R, B8R, B13R 또는 vC12L) 및 IFNγ 경로를 조정하는 것들 (예를 들어 B18R, B13R 또는 vC12L)의 비배타적 카테고리로 나눌 수 있다.

암 세포는 흔히 인테페론의 작용에 내성이 있다. 많은 메카니즘이 연루되어 있다. 이들은 암 세포의 공통적인 특징인 ras 신호 도입 경로 활성화 (예를 들어, ras 돌연변이, 상류 성장 인자 수용체 과발현/돌연변이 등)가 PKR 억제를 유발한다 는 사실을 포함한다. 나아가, 림프구는 종종 종양 세포에 의한 IL-10 생산 및 fas-L 발현을 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 종양 물질에서 억제된다. 림프구가 인터페론-γ 생산의 주요 공급원이므로, 림프구 억제는 종양에서 인터페론-γ 생산을 감소시킨다. 따라서 종양 물질은 인터페론의 작용으로부터 피신처인 경향이 있다. 나아가, 인터페론 그자체는 항종양 작용을 가질 수 있다. 예를 들어, IFN-γ는 MHC 클래스-I 관련 항원 제시를 증가시킬 수 있는데, 이는 보다 효과적인 CTL 매개의 종양 세포 사멸을 가능하게 할 것이다. 예를 들면, IFNα/β는 종양 물질 내에서 혈관신생을 차단하여 종양 성장을 차단할 수 있다.

2. 보체 조절 폴리펩티드

바이러스 병원체의 제거에 있어서의 주요 메카니즘은 보체-의존성 메카니즘을 통해 기관내에서 숙주내에 감염된 세포 또는 비리온을 사멸시키는 것이다. 감염된 세포가 사멸함에 따라, 감염성 바이러스를 계속해서 생산할 수 없게 된다. 나아가, 세포자멸사 동안, DNA를 분해하는 세포내 효소가 방출된다. 이러한 효소는 바이러스 DNA 분해 및 바이러스 불활성화를 유발할 수 있다. 세포자멸사는 활성화된 보체의 결합 및 보체 막 공격 복합체를 포함하는 수많은 메카니즘을 통해 유도될 수 있다. 백시니아와 같은 폭스바이러스는 바이러스 및/또는 바이러스 감염 세포의 보체 매개 제거를 길항할 수 있는 유전자 생성물을 발현하도록 발달되어 왔다. 이로써 이들 유전자는 세포자멸사를 방지하고 보체-의존성 메카니즘에 의한 바이러스 제거를 억제하여, 바이러스 감염을 진행시키고 바이러스 독력을 증기사키게 할 수 있다. 예를 들어, 백시니아 바이러스 보체 조절 단백질 (VCP; 예를 들어 C21L)은 보체 매개 세포 사멸 및/또는 바이러스 불활성화를 방지하는 역할을 한다 ([Isaacs et al., 1992]). VCP는 또한 항염증 작용을 갖는데, 이는 이의 발현이 바이러스 감염된 조직내로의 백혈구 침윤을 감소시키기 때문이다. 보체 조절 폴리펩티드는 C3L 또는 C21L로서도 또한 공지된 VCP를 비제한적으로 포함한다.

암 세포는 흔히 세포성 항-보체 단백질을 과발현하는데, 이는 암 세포가 보체 공격에도 생존할 수 있게 한다. 따라서, 이들의 보체 매개 사멸에의 고유 내성을 통해 종양 세포를 표적화하는 바람직한 제제는 광범위한 인간 암에서 선택성 및 잠재적인 효능을 가져야 할 것이다 ([Durrant et al., 2001]). 또한, 암 세포의 특징 중 하나는 정상적인 세포자멸 메카니즘의 상실이다 ([Gross et al., 1999]). 세포자멸사에 대한 내성은 면역 제제, 화학요법제 및 방사선요법제를 포함하는 항종양제에 대한 내성 뿐 아니라 발암현상을 촉진시킨다 ([Eliopoulos et al., 1995]). 세포자멸사 억제는 전세포자멸성 분자 기능(예를 들어, bax)의 상실, 항세포자멸성 분자(예를 들어, bcl-2)의 농도/기능의 증가 및 마지막으로 보체 감작성의 상실에 의해 매개될 수 있다.

3. TNF 조정 폴리펩티드

바이러스 병원균의 제거에 있어서의 다양한 메카니즘 중 하나는 상기 기술한 바와 같은 세포자멸사의 유도에 의한 숙주 내에서의 감염된 세포의 사멸이다. 세포자멸사는 TNF 및 림프독소-알파(LTα)의 세포성 TNF 수용체에의 결합을 포함하는 수많은 메카니즘을 통해 유도될 수 있는데, 이는 세포내 신호 케스케이드를 촉발한다. TNF 수용체의 활성은 세포자멸성 세포 사멸의 유도 뿐 아니라, 면역 및 염증 반응 조절의 기능을 한다 ([Wallach et al., 1999]).

몇몇 백시니아 바이러스 균주를 포함하는 폭스바이러스의 다양한 균주는 바이러스 및/또는 바이러스 감염된 세포의 TNF-매개된 제거에 길항할 수 있는 유전자 생성물을 발현하도록 발달되어 왔다. 이러한 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포외 TNF에 결합하고 서열화함으로써 TNF의 활성을 유도하는 전염증성 및 세포자멸사를 회피하여, 바이러스 제거를 억제한다. 바이러스가 제거되지 않기 때문에, 바이러스 감염은 진행될 수 있고, 이에 따라 바이러스 독력이 증가한다. 폭스바이러스 족의 다양한 원들은 분비된 바이러스성 TNF 수용체 (vTNFR)를 발현한다. 예를 들어, 몇몇 폭스바이러스는 vTNRF, 예컨대 믹소마 (T2 단백질), 카우폭스를 코딩하고, 백시니아 바이러스 균주 에컨대 리스터(Lister)는 CrmB, CrmC (A53R), CrmD, CrmE B28R 단백질 및/또는 이들의 균등물 중 1 이상을 코딩할 수 있다. 이러한 vTNFR은 TNF 매개 세포 사멸 및/또는 바이러스 불활성화를 방지하는 역할을 한다 ([Saraiva and Alcami, 2001]). TNF 조정 폴리펩티드는 A53R, B28R (이 단백질은 존재하지만, 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주에서 불활성화될 수 있음) 및 유사한 활성 또는 성질을 갖는 다른 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다.

암 세포의 특징 중 하나는 이상 유전자 발현인데, 이는 TNF의 항암 활성에의 감작성과 같은 성장 조정을 위한 많은 분자 메카니즘에 대한 감작성을 상실시킬 수 있다. 따라서, 종양 미세환경 내에서의 바이러스의 전파에 있어 바이러스 면역조정 메카니즘은 요구되지 않을 수 있다.

4. 세린 프로테아제 억제제

바이러스 병원체의 제거에 있어서의 주요 메카니즘은 숙주 내에서 감염된 세포의 세포자멸사를 유도하는 것이다. 감염된 세포가 사멸함에 따라, 감염성 바이러스를 계속해서 생산할 수 없게 된다. 나아가, 세포자멸사 동안, DNA를 분해하는 세포내 효소가 방출된다. 이러한 효소는 바이러스 DNA 분해 및 바이러스 불활성화를 유발할 수 있다. 세포자멸사는 사이토카인의 결합 (예를 들어, 종양 괴사 인자), 세포독성 T-림프구에 의한 그랜자임 생성 또는 fas-리간드 결합을 포함하는 수많은 메카니즘을 통해 유도될 수 있으며; 카스파제 활성은 최종 공통 세포자멸사 경로의 결정적인 부분이다. 바이러스는 fas-리간드 또는 종양 괴사 인자 (TNF)/TNF 관련 분자 (예를 들어, 아데노바이러스의 E3 10.4/14.5, 14.7 유전자 ([Wold et al., 1994]); 아데노바이러스의 E1B-19kD ([Boyd et al., 1994]); 카우폭스바이러스로부터의 crm A; 백시니아 바이러스로부터의 B13R)을 포함하는 분자를 통해 유도되는 세포내 신호 캐스캐이드를 길항할 수 있는 유전자 생성물을 발현하도록 발달되어 왔다 ([Dobbelstein et al., 1996]; [Kettle et al., 1997]). 이들 유전자 생성물은 세포자멸사 유도 분자에 의한 세포자멸사를 방지하여, 항바이러스성 세포자멸사 유도 사이토카인, fas, 그랜자임 또는 세포자멸사의 다른 자극제의 존재에도 불구하고 바이러스 복제를 진행시킬 수 있다.

VV SPI-2/B13R은 카우폭스 CrmA에 대해 높은 상동성이며, SPI-1(VV)은 CrmA에 대해 약한 상동성이다 ([Dobbelstein et al., 1996]). 이들 단백질은 세르핀(serpin, 세린 프로테아제 억제제)이고 CrmA 및 SPI-2 모두 세포자멸사의 다양한 형태를 방지하는 역할을 한다. 예를 들어, 인터루킨-1β 전환 효소 (ICE) 및 그랜 자임의 억제는 감염 세포의 세포자멸사를 억제할 수 있다. 이러한 유전자 생성물은 또한 항염증 작용을 가진다. 이들은 IFN-γ의 IL-18 매개 유도를 감소시킬 것인 IL-18의 활성을 억제할 수 있다. 이에 따라 세포 매개 면역에서의 IFN-γ의 면역자극 작용은 억제된다 ([Kettle et al., 1997]). SPI는 B13R, B22R 및 유사한 활성 또는 성질을 갖는 다른 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다.

암세포의 특징 중 하나는 정상적인 세포사멸 메카니즘의 상실이다 ([Gross et al., 1999]). 세포자멸사에 대한 내성은 면역 제제, 화학요법제 및 방사선요법제를 포함하는 항종양제에 대한 내성 뿐 아니라 발암현상을 촉진시킨다 ([Eliopoulos et al., 1995]). 세포자멸사 억제는 전세포자멸성 분자 기능(예를 들어, bax)의 상실 또는 항세포자멸성 분자(예를 들어, bcl-2)의 농도/기능의 증가에 의해 매개될 수 있다.

5. IL -1β 조정 폴리펩티드

IL-1β는 국소적으로, 나아가 전신적으로 작용하는 생물학적 활성 인자이다. IL-1β와 IL-1α 간의 단지 몇몇 기능적 차이점에 대해서만 기술되어져 있다. IL-1β의 수많은 생물학적 기능은 IL-1을 기술하기 위해 사용된 많은 상이한 두문자에 의해 예시되어 있다. IL-1은 돼지 세포에 불활성인 인간 IL-1β를 제외하고는 종 특이성을 나타내지 않는다. IL-1의 몇몇 생물학적 활성은 ACTH(코르티코트로핀), PGE2(프로스타글란딘 E2), PF4 (혈소판 인자 4), CSF (콜로니 자극 인자), IL-6 및 IL-8을 포함하는 다른 매개자의 합성의 유도를 통해 간접적으로 매개된다. IL-1의 합성은 TNF-α, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ를 포함하는 다른 사이토카인 및 나아가 박테리아 내독소, 바이러스, 미토젠, 및 항원을 통해 유도될 수 있다. IL-1의 주요 생물학적 활성은 T-보조 세포의 자극인데, 이의 유도를 통해 IL-2를 분비하고 IL-2 수용체를 발현한다. 바이러스 감염 대식세포는 T-세포 돌연변이 결점을 가진 환자에서 기회 감염 및 세포의 형질전환을 지지할 수 있는 많은 양의 IL-1 억제제를 생산한다. IL-1은 B-세포에 직접 작용하여, 이들의 증식 및 면역글로불린의 합성을 촉진시킨다. IL-1은 또한 IL-5에 반응성인 B-세포를 제조하는 기폭 인자 중 하나로서 기능한다. IL-1은 NK-세포, 섬유모세포, 가슴샘세포, 아교모세포종 세포의 증식 및 활성을 자극한다.

바이러스 단백질에 의한 IL-1β의 합성 차단은 IL-1에 의해 유도되는 전신성 항바이러스 반응을 억제하거나 또는 감소할 수 있는 바이러스 전략과 관련이 있다. B1 5R과 유사한 활성을 갖는 IL-1의 기능을 효과적으로 차단하는 단백질에 결합하는 것 또한 카우폭스 바이러스의 유전자에 의해 코딩됨이 밝혀졌다. 백시니아 바이러스는 또한 B8R로 명명된 또다른 단백질을 코딩하는데, 이는 사이토카인에 대한 수용체처럼 행동한다 ([Alcami and Smith, 1992]; [Spriggs et al., 1992]). IL-1 조정 폴리펩티드는 B13R, B15R, 및 유사한 활성 또는 성질을 갖는 다른 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다.

암 세포의 특징 중 하나는 이상 유전자 발현인데, 이는 IL-1의 항암 활성에의 감작성과 같은 성장 조정을 위한 많은 분자 메카니즘에 대한 감작성을 상실시킬 수 있다. 따라서, 종양 미세환경 내에서의 바이러스의 전파에 있어 바이러스 면역조정 메카니즘은 요구되지 않을 수 있다.

6. EEV 형태

전이성 종양 부위로의 바이러스 분포, 및 심지어는 감염된 고체 종양 물질 내에서의 분포는 일반적으로 비효율적이다 ([Heise et al., 1999]). 정맥내 투여는 통상적으로 항체 (예를 들어, 아데노바이러스) ([Kay et al., 1997]) 및/또는 보체계 (예를 들어, HSV) ([Ikeda et al., 1999])에 의한 바이러스 제거 또는 불활성화를 나타낸다. 이러한 면역 매개 메카니즘 이외에, 이들 바이러스의 생분포는 종양 물질에서보다는 정상 조직내의 침착한 매우 많은 정맥내 바이러스 침착을 나타낸다. 예를 들면, 정맥내 아데노바이러스는 우선 간 및 비장에서 소실되는데, 면역결핍 마우스에서조차, 투여 바이러스의 0.1% 미만이 종양 내에 침착한다 ([Heise et al., 1999]). 따라서, 면역결핍 마우스 종양 모델에서 매우 높은 상대적 투여량을 사용시 몇몇 적당한 항종양 효능이 증명될 수 있지만, 정맥내 전달은 매우 비효율적이며 상당히 제한된 효능을 나타낸다.

백시니아 바이러스는 고체 종양 내에서 복제능을 가지므로 괴사를 일으킨다. 나아가, 티미딘 키나제 결핍 돌연변이는 종양 물질 및 난소 조직을 감염시킬 수 있고 바람직하게는 마우스 종양 모델계에서 마커 유전자를 발현한다 ([Gnant et al., 1999]). 하지만, 이러한 연구는 일반적으로 5 일 후의 마커 유전자 발현에 기재하여 종양 표적화를 결정하였기 때문에, 바이러스가 바람직하게는 종양/난소 조직에서 침착하는지, 여기서 유전자를 발현하는지 또는 여기에서 복제하는지가 불분명하다 ([Puhlmann et al., 2000]). 메카니즘과 무관하게, 추가적 형질전환 유전자가 없는 이러한 바이러스의 항종양 효능은 통계학적으로 유의하지 않다 ([Gnant et al., 1999]). 이와는 대조로, 종양내 유전자 주입은 상당한 항종양 효능을 가졌다 ([McCart et al., 2000]). 따라서, 종양으로의 i.v. 전달이 개선되었을 경우에만, i.v. 효능이 개선될 수 있다.

백시니아 바이러스는 세포내에서 복제하고 세포내 바이러스 (IMV, 세포내 성숙 바이러스; IEV, 세포내 외피성 바이러스) 및 세포외 바이러스 (REV, 세포외 외피성 바이러스; CEV, 세포 관련 세포외 바이러스) 모두를 생성한다 ([Smith et al., 1998]). IMV는 야생형 백시니아 바이러스 균주에 의한 복제 후의 바이러스 수득율의 약 99%를 나타낸다. 이러한 바이러스 형태는 환경에서 상대적으로 안정하므로, 개체 간의 분포의 주요 원인이 되는 반면, 이러한 바이러스는 세포로부터의 비효율적 방출 및 보체 및/또는 항체 중화에의 감작성으로 인해 감염된 숙주 내에서 효율적으로 분포되지 않는다. 이와는 대조로, EEV는 세포외 환경으로 방출되고 통상적으로 바이러스 수득율의 약 1% 만을 나타낸다 ([Smith et al., 1998]). EEV는 감염된 숙주 내에서의 바이러스 분포의 원인이 되며 숙주 밖에서 상대적으로 쉽게 분해된다. 중요한 것은, EEV가 혈류 내에서 이의 중화를 억제하도록 하는 몇몇 메카니즘을 나타낸다는 것이다. 첫째, EEV는 상대적으로 보체에 내성이 있는데 ([Vanderplasschen et al., 1998]), 이러한 특징은 이의 외막 코팅에의 보체의 숙주 세포 억제제의 혼입 및 국소적 세포외 환경으로의 백시니아 바이러스 보체 조절 단백질 (VCP)의 분비에 기인한 것이다. 둘째, EEV는 IMV에 비해 항체 작용을 중화시키는데 상대적으로 내성이 있다 ([Smith et al., 1997]). EEV는 또한 IMV (세포 사멸 동안/후에만 단지 방출됨)에 비해 감염 후 더욱 이른 시간에 (예를 들어, 4 내지 6 시간) 방출되므로, EEV 형태의 분포가 더욱 빠르다 ([Blasco et al., 1993]).

하지만, 불행하게도, 야생형 백시니아 균주는 상대적으로 매우 소량의 EEV만을 생산한다. 나아가, 백시니아 바이러스로의 치료 (즉, 바이러스의 투여 용량)는 현재까지 세포내 바이러스 형태로 제한된다. 표준 백시니아 바이러스 (VV) 제조 및 정제 과정은 EEV의 불활성화를 유발하고 ([Smith et al., 1998]), 비인간 세포주가 종종 바이러스의 제조에 사용되는데, 비인간 세포로부터의 EEV는 세포 매개 제거로부터 보호되지 않을 것이다 (EEV를 통해 세포로부터 얻어진 보체 억제성 단백질은 작용이 제한된 종류를 갖는다). 따라서 백시니아 바이러스 효능은 중화에 대한 IMV 형태의 상대적인 감작성에 의해 제한되고 고체 종양 물질 내에서의 이의 비효율적 분포를 통해 제한되므로, 이러한 분포는 통상적으로 세포에서 인접한 세포로 행해진다. 혈류 또는 림프계를 통해, 먼 종양 물질로의 IMV 분포 또한 비효율적이다.

따라서, 백시니아 바이러스의 드문 EEV 형태는 현재까지 환자에서 사용되는 백시니아 바이러스 형태 (IMV)보다 우수한 자연 획득된 특징을 가지며, EEV는 고체 종양을 국소적으로 통과해서 일정 구역 또는 먼 종양 부위로의 빠르고 효율적인 분포에 최적이다. EEV는 상대적으로 보체 작용에 내성이 있으므로, 이것이 동일한 종으로부터의 세포 형태로 성장할 때, 이러한 바이러스 형태는 (배타적으로 IMV만을 함유하는) 백시니아 바이러스의 표준 제제보다 정맥내 투여후 향상된 안정성을 가질 것이고 혈액 내에서 보다 오랫동안 활성을 보유할 것이다 ([Smith et al., 1998]). EEV가 항원 매개 중화에 내성이 있기 때문에, 이러한 바이러스 형태는 (거의 배타적으로 IMV만을 함유하는) 백시니아 바이러스의 표준 제제보다 정맥내 투여후 혈액 내에서 보다 오랫동안 활성을 보유할 것이다 ([Vanderplasschen et al., 1998]). 이러한 특징은 특히 일단 중화 항체 농도가 증가된 경우의 반복적 투여에 있어 특히 중요한데, 모든 승인된 항암 치료는 반복 투여를 요구한다. 따라서, 백니이나의 EEV 형태, 및 다른 폭스바이러스는 혈류를 통해 치료적 바이러스 및 이들의 유전적 물질(payload)의 종양으로의 보다 우수한 전달을 나타낸다. 이것은 표준 폭스바이러스 제제에 비해 향상된 전신성 효능을 유발할 것이다. 마지막으로, 일반 공중에서의 개인들로의 전파의 위험성은 상당히 감소되어야만 하는데, 이는 EEV가 체외에서 매우 불안정하기 때문이다. 바이러스의 EEV 형태의 조정에 수반되는 폴리펩티드는 A34R, B5R 및 폭스바이러스의 EEV 형태의 생성에 영향을 주는 다양한 다른 단백질을 비제한적으로 포함한다. A34R의 코돈 151에서의 라이신에서 아스파르트산으로의 돌연변이 (K151D 돌연변이)를 통해 A34R 단백질이 EEV 형태를 세포막에 덜 구속될 수 있게 한다. B5R은 보체에 결합할 수 있는 EEV 막 결합 폴리펩티드이다. A43R의 총 결실은 증가된 EEV 방출을 유발할 수 있지만, 바이러스의 감염성을 현저하게 감소시키는 반면, K151D 돌연변이는 방출된 바이러스의 감염성은 유지하면서 EEV 방출을 증가시킨다. B5R은 VCP (항-보체)와 서열 상동성을 가지지만, 보체 억제는 아직까지 입증되지 않았다.

요약하자면, 강화된 EEV 형태를 확인하는 하나의 방법은 다음과 같다. EEV는 얼음같이 찬 MEM에서 희석시키고, 얼음같이 찬 MEM에 희석된 (혈청의 최종 희석 도 1/10, 1/20 또는 1/30) 활성 또는 열 불활성된 혈청과 혼합시켰다 (1:1 부피). 7℃에서 75 분 동안 인큐베이션 후, 시료를 얼음에서 냉각시키고 mAb 5Br/2F2를 신선한 EEV 시료에 첨가하여 임의의 오염물 (IMV 및 파열된 EEV)을 중화시켰다. 그 후, 비리온을 1 시간 동안 얼음에서 RK13 세포에 결합시키고, 보체 및 비결합된 비리온을 세척하고, 플라크의 수를 2일 후에 계수하였다. 플라크의 수가 더 높을수록, 보체에의 내성이 더욱 증가하였다 (본원에 참고문헌으로 인용되는, [Vanderplasschen et al., PNAS 1998; 95(13): 7544-7549] ). 백시니아 바이러스의 EEV 형태의 단리를 기술하는 예시적 방법은 문헌 [Blasco et al., 1992] (본원에 참고문헌으로 인용됨)에서 발견될 수 있다.

7. 다른 폴리펩티드

다른 바이러스성 면역조정 폴리펩티드는 면역 반응의 다른 조정자에 결합하고/하거나 면역 반응과 관련된 분자 경로를 조정하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 케모카인은 B29R (이 단백질은 존재하지만, 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주에서 불활성화될 수 있음), C23L, vCKBP, A41L과 같은 폴리펩티드 및 유사한 활성 또는 성질을 갖는 폴리펩티드에 결합한다. 다른 백시니아 바이러스, 예컨대 바이러스 EGF-유사 성장 인자인 백시니아 바이러스 성장 인자 (예를 들어, C11L)은 또한 본 발명의 몇몇 실시태양의 변형에 있어 표적이 될 수 있다. 바이러스 면역조정 인자로 분류될 수 있는 다른 폴리펩티드는 B7R, N1L 또는 활성 또는 성질이 폭스바이러스의 독력을 증가시키는 다른 폴리펩티드를 비제한적으로 포함한다.

8. 백시니아 바이러스 유도된 세포 융합

본 발명의 특정 실시태양에서, 핵 유전자를 코딩하는 A56R 또는 K2L의 변형, 결실, 또는 돌연변이는 VV 감염에 의해 유도되는 세포-세포 융합 또는 융합체 형성을 유발할 수 있다. 백시니아 바이러스 유도된 세포 융합은 통상적으로 종양내 바이러스 분포로 인해 VV의 항종양 효능을 증가시킬 것이다. 세포 융합에 의한 종양내 바이러스 분포는 통상적으로 바이러스가 항체 및 면역 반응의 중화를 피하게 할 수 있을 것이다. 아쥬반트 감염되지 않은 세포의 사멸 또는 감염은 (즉, "방관자 효과") 이러한 유전자 중 하나 또는 양쪽 모두에서 돌변연이를 갖는 VV에서 더욱 효율적일 수 있는데, 이는 개선된 국소적 항종양 작용을 나타낼 수 있다.

D. 다른 폭스바이러스

백시니아 바이러스는 폭스비리대(Poxviridae) 족, 코르도폭스비리내(Chordopoxvirinae) 아족 및 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 종의 일원이다. 오르토폭스바이러스 종은 코르도폭스비리대 아족의 다른 일원보다 상대적으로 더욱 상동성이며, 11 개의 뚜렷하지만 가까운 관계의 종을 포함하는데, 여기에는 백시니아 바이러스, 배리올라 바이러스 (천연두의 원인제), 카우폭스 바이러스, 버팔로폭스 바이러스, 멍키폭스 바이러스, 마우스폭스 바이러스 및 홀스폭스 바이러스 종 뿐 아니라 다른 것들도 포함한다 ([Moss, 1996] 참조). 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시태양은 오르토폭스바이러스 종의 다른 일원 뿐 아니라, 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), 아비폭스바이러스(Avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(Capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus), 수이폭스바이러 스(Suipoxvirus), 몰루시폭스바이러스(Molluscipoxrivus), 및 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus) 종까지 확대될 수 있다. 폭스바이러스 족의 종은 일반적으로 실험실 동물에서의 중화 및 교차-반응성을 포함하는 혈청학적 수단을 통해 정의된다. 오르토폭스마이러스 종의 다양한 일원 뿐 아니라 코르도비리내 아족의 다른 일원 또한 본원에서 제공되는 예인 면역조정 물질을 이용하여 숙주 기관의 면역 반응을 길항한다. 따라서, 본원에 기술된 발명은 백시니아 바이러스에 제한되지 않고 많은 바이러스에 적용가능할 수 있다.

E. 바이러스 전파

백시니아 바이러스는 본원에 참고문헌으로 인용되는 문헌 [Earl and Moss in Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, pages 16.15.1 to 16.18.10]에 기술되어 있는 방법을 사용하여 전파될 수 있다.

II . 제약 제제, 전달 및 치료 요법

본 발명의 실시태양에서는 백시니아 바이러스와 같은 변경된 폭스바이러스의 전달에 의한 암과 같은 과증식성 질병의 치료 방법을 고려한다. 치료에 고려되는 예로는 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 자궁경부암, 위장관암, 림프종, 폐에서의 전암 병변, 결장암. 흑색종, 방광암 및 임의의 다른 암 또는 치료될 수 있는 종양이 포함된다.

본원에서의 제약 조성물의 유효량이란 종양의 성장 또는 이의 크기를 서서히 억제 또는 감소시키는 것 뿐 아니라, 암 세포의 종양살상 또는 파괴 또는 용해를 유도하기에 충분한 것으로서 정의되며 임의의 경우에는 종량의 근절을 포함한다.

바람직하게는, 환자는 충분한 골수 기능 (2,000/mm³ 초과의 절대 말초성 과립구 계수 및 100,000/mm³의 혈소판 계수로 정의됨), 충분한 간 기능 (빌리루빈 < 1.5 mg/dl 및 충분한 신장 기능 (크레아티닌 < 1/5 mg/dl)을 가질 것이다.

A. 투여

종양살상을 유도하기 위해, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, GM-CSF를 발현하는 폭스바이러스와 종양을 접촉시킬 것이다. 투여 경로는 병변의 위치 및 성질에 따라 당연히 다양할 것이며, 예를 들어, 피내, 경피(transdermal), 비경구, 정맥내, 근육내, 비내, 피하, 구역 (예를 들어, 종양에의 근접 구역, 특히 종양의 혈관 또는 인접한 혈관을 통함), 경피(percutaneous), 기관내, 복막내, 동맥내, 방광내, 종양내, 흡입, 관류, 세척, 및 경구 투여 및 제제를 포함한다.

종양내 주입 또는 종양 혈관으로의 직접 주입은 특히 분리된, 접근가능한 고체 종양에 대해 고려된다. 국소적이거나, 구역적이거나 또는 전신적 투여 또한 적절할 수 있다. 4 cm 초과의 종양에 있어, 투여되는 부피는 약 4 내지 10 ml (바람직하게는 10 ml)일 것이며, 4 cm 미만의 종양에 있어서는, 약 1 내지 3 ml (바람직하게는 3 ml)의 부피가 사용될 것이다. 단일 투여량으로 전달되는 다중 주입은 약 0.1 내지 약 0.5 ml 부피를 포함한다. 바이러스 입자는 약 1 cm 간격으로 떨어져 있는 종양에의 다중 주입 투여를 통해 유리하게 접촉될 수 있다. 수술적 개입의 경우에, 본 발명은 수술전에 사용되어 수술불가능한 종양 대상의 절제를 가능하게 한다. 예를 들어, 종양 또는 종양 혈관내로 카테터를 삽입함으로써 계속적 투여 또한 적절한 곳에 적용될 수 있다. 이러한 계속적 관류는 치료 시작 후 약 1 내지 2 시간에서부터, 약 2 내지 6 시간까지, 약 6 내지 12 시간까지, 약 12 내지 24 시간까지, 약 1 내지 2 일까지, 약 1 내지 2 주까지, 또는 더 긴 시간 동안 행해질 수 있다. 일반적으로, 계속적 관류를 통한 치료 조성물의 투여량은 관류가 일어나는 동안의 시간에 걸쳐 조절되는, 단일 또는 다중 주입을 통해 주어지는 것과 균등할 것이다. 또한 특히 흑색종 및 육종의 치료에서의 본 발명의 치료적 조성물을 투여하는데 사지 관류를 사용할 수 있음을 고려한다.

치료 요법 또한 마찬가지로 다양할 수 있으며, 흔히 종양 유형, 종양 지역, 질병 진행, 및 환자의 건강 및 나이에 따른다. 명백하게는, 종양의 임의의 유형은 더욱 공격적인 치료를 요구할 것인데, 이러한 시간 동안 동시에 어떠한 환자는 더욱 고생스러운 프로토콜을 견딜 수 없다. 치료적 제제의 공지된 효능 및 독성 (존재하는 경우)에 기초하여 상기에 대한 결정을 하는 데에는 임상학자가 가장 적합할 것이다.

어떤 실시태양에서, 치료되는 종양은 적어도 초기에는 절제가능하지 않을 수 있다. 치료적 바이러스 구조물로의 치료는 가장자리의 수축 또는 어떠한 특히 침윤성인 부분의 제거를 통해 종양의 절제가능성을 증가시킬 수 있다. 치료 후, 절제는 가능할 수 있다. 절제 후의 추가적 치료는 종양 부위에서의 극히 작은 남아있는 질병을 제거하는데 기여할 것이다.

치료법은 다양한 "단위 투여량"을 포함할 수 있다. 단위 투여량은 치료적 조성물의 미리결정된 양을 함유하는 것으로 정의된다. 투여되는 양 및 특정 경로 및 제제는 임상학적 분야의 당업자에게 통상적이다. 단위 투여량은 단일 주입으로서 투여되는 것이 필요하지 않으며 설정된 일정 시간에 걸친 연속적 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 투여량은 통상적으로 바이러스 구조물에 대한 플라크 형성 단위 (pfu)로 기술될 수 있다. 단위 투여량은 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ pfu 이상의 범위에 있다. 별법으로, 바이러스의 종류 및 도달가능한 역가에 따라, 1 내지 100, 10 내지 50, 100 내지 1000 또는 약 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 1 x 10¹², 1 x 10¹³, 1 x 10¹⁴, 또는 1 x 10¹⁵ 이하 또는 적어도 약 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, 1 x 10¹¹, 1 x 10¹², 1 x 10¹³, 1 x 10¹⁴, 또는 1 x 10¹⁵ 또는 그 이상의 감염성 바이러스 입자 (vp)를 종양 또는 종양 부위에 전달할 것이다.

B. 주입가능한 조성물 및 제제

본 발명에서 폭스바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 코딩하는 발현 구조물 또는 바이러스를 암 또는 종양 세포로 전달하는 바람직한 방법은 종양내 주입을 통해서이다. 하지만, 본원에 기술된 제약 조성물은 미국 특허 5,543,158; 미국 특허 5,641,515 및 미국 특허 5,399,363 (각각은 이의 전체가 구체적으로 본원에 참고문 헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같이 비경구, 정맥내, 피내, 근육내, 경피 또는 심지어는 복막내로 투여될 수 있다.

핵산 구조물의 주입은 발현 구조물이 주입에 요구되는 특정 바늘 게이지를 통과할 수 있는 한, 용액의 주입에 사용되는 주사기 또는 임의의 다른 방법을 통해 전달될 수 있다. 신규한 바늘이 없는 주입 시스템은 최근에 기술되었는데 (미국 특허 5,846,233), 이는 용액을 보유하기 위한 앰플 챔버를 한정하는 노즐 및 노즐 밖의 전달 부위로 노즐로부터 용액을 밀어내기 위한 에너지 장치를 갖는다. 유전자 요법에의 사용하기 위한, 임의의 깊이에 정확하게 용액의 미리결정된 양을 다중 주입할 수 있게 하는 시린지 시스템 또한 기술되어 있다 (미국 특허 5,846,225).

유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물에서, 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다. 주입가능한 사용에 적합한 제약 형태는 무균 수성액 또는 분산액 및 주입가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함한다 (이의 전체가 구체적으로 본원에 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 5,466,468). 모든 경우에, 형태는 무균이어야만 하며 용이하게 주입가능한 정도로 유동성이어야만 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야만 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 유를 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 렉틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입도의 유지, 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 등으로 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴을 사용함으로써 주입가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.

수용액의 비경구 투여를 위해서는, 예를 들어, 용액을 필요하다면 적절하게 완충시켜야만 하고 액체 희석제를 우선 충분한 염수 또는 포도당으로 등장성으로 만들어야만 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복막내 투여에 적합하다. 이에 더하여, 사용될 수 있는 무균 수성매는 본 기재의 관점에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 일 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있고 1000 ml의 피하(hypodermoclysis) 유체에 첨가하거나 또는 제안된 주사 부위에 주입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량은 치료받는 환자의 상태에 따라 당연히 어느 정도 변형될 것이다. 임의의 경우에는, 투여를 책임지는 사람이 개별 환자에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 나아가, 인간 투여에 있어, 제제는 무균성, 발열성, 일반적 안전성 및 FDA 관청의 생물학 표준 기준(Biologics standard)에 의해 요구되는 순도 표준 기준을 충 족시켜야만 한다.

상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 요구되는 양의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요한 경우에는 그 후 여과 멸균시켜 주입가능한 멸균 용액을 제조한다. 일반적으로, 기본 분산매 및 상기 열거한 것들 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 분산액을 제조한다. 주입가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조의 바람직한 방법에는 활성 성분과 임의의 추가적인 바람직한 성분이 합해진 분말을 이들의 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 수득하는 진공 건조법 및 동결 건조법이 있다.

본원에 기재된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노 기와 함께 형성됨)을 포함하는데, 이는 무기산 예컨대 염산 및 인산, 또는 유기산 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 등과 함께 형성된다. 유리 카르복실 기와 함께 형성된 염은 무기 염기, 예컨대 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화 제2철, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다. 제제화 시, 용액은 투여 제제에 적합한 방식으로 치료학적 유효량으로 투여될 것이다. 제제는 주입가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여형으로 쉽게 투여된다.

본원에 사용된 "담체"는 임의의 모든 용액, 분산매, 비히클, 코팅제, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현 탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 제약상 활성 물질에 대해 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 부적합한 경우를 제외하고는, 치료 조성물에의 이의 사용을 고려한다. 보충 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

어구 "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 허용되는"은 인간에 투여시 알러지 또는 유사한 부적당한 반응을 생성하지 않은 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업계에서 잘 이해된다. 통상적으로, 이러한 조성물은 주입가능하도록 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되며, 주입 전의 액체 중의 용액 또는 액체 중의 현탁액에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다.

C. 병용 요법

1. 수술

약 60%의 암 환자는 예방, 진단 또는 병리결정, 치유 및 완화 수술을 포함하는 몇몇 유형의 수술을 받을 것이다. 치유적 수술은 다른 치료, 예컨대 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.

치유적 수술은 모든 암 조직 또는 일부 암 조직을 부분적으로 제거, 절제(excise), 및/또는 파괴하는 절제(resection)를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부분을 물리적으로 제거하는 것을 지칭한다. 종양 절제 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동외과수술, 전기수술, 및 현미경적 조절 수술 (모 스(Mohs)의 수술)을 포함한다. 이는 또한 표면적 암, 전암 또는 우발적 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있다.

모든 암 세포, 조직, 또는 종양의 부분의 절제시, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 관류, 직접 주입 또는 추가적 항암 요법을 통한 그 영역의 국소적 적용에 의해 치료를 수행할 수 있다. 이러한 치료는 예를 들면, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5 주 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 월에 반복될 수 있다. 이러한 치료는 또한 다양한 용량으로 행해질 수 있다.

2. 다른 제제

다른 제제는 치료의 치료학적 효과를 개선시키기 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 추가적 제제는 면역조정제, 세포 표면 수용체 및 GAP 이음부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 접착 억제제, 세포자멸사 유도제에 대한 과증식성 세포의 감작성을 증가시키는 제제, 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. 면역조정제는 종양 괴사 인자; 인터페론-α, -β 및 -γ; IL-2 및 다른 사이토카인; F24K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1.베타., MCP-1, RANTES, 및 다른 케모라인(chemoline)을 포함한다. 또한 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드, 예컨대 Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL (Apo-2 리간드)의 상향조절은 과증식성 세포 상에서의 자가분비 또는 주변분비 작용의 확립을 통해 본 발명의 세포자멸사 유도능을 증강시킬 것으라고 또한 생각된다. GAP 이음부의 수의 상승을 통한 세포내 신호전달의 증가는 이 웃하는 과증식성 세포수에 대한 항-과증식성 작용을 증가시킬 것이다. 다른 실시태양에서, 세포증식억제제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 세포 접착 억제제는 본 발명의 효능을 개선시키기 위해 고려된다. 세포 접착 억제제의 예로는 국소 접착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 또한 과증식성 세포의 세포자멸사에 대한 감작성을 증가시키는 다른 제제, 예컨대 항체 c225는 치료 효능을 증가시키기 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

Apo2 리간드 (Apo2L, TRAIL로도 지칭됨)는 종양 괴사 인자 (TNF) 사이토카인 족의 인원이다. TRAIL은 암 세포의 많은 유형에서는 빠른 세포자멸사를 활성화하지만, 정상 세포에는 독성이 없다. TRAIL mRNA는 매우 다양한 조직에서 발생된다. 대부분의 정상 세포는 TRAIL의 세포독성 작용에 저항성이 있는 것처럼 보이는데, 이는 TRAIL에 의한 세포자멸사 유도에 대해 보호할 수 있는 메카니즘의 존재를 암시한다. 사멸 수용체 4 (DR4)로 불리는 TRAIL에 대해 기술된 제1 수용체는 세포질 "사멸 도메인"을 함유하며, DR4는 TRAIL에 의해 운반되는 세포자멸사 신호를 전파한다. 또다른 수용체는 TRAIL에 결합하는 것으로 확인되었다. DR5로 불리는 하나의 수용체는 DR4와 매우 비슷한 세포질 사멸 도메인 및 신호 세포자멸사 도메인을 함유한다. DR4 및 DR5 mRNA는 많은 정상 조직 및 종양 세포주에서 발현된다. 최근, DcR1 및 DcR2와 같은 유인 수용체(decoy receptor)가 TRAIL이 DR4 및 DR5를 통해 세포자멸사를 유도하는 것을 방지하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 유인 수용체는 세포 표면에서 전세포자멸성 사이토라인(cytoline)에 대한 감작성을 직접 적으로 조절하는 신규한 메카니즘을 나타낸다. 정상 조직에서의 이러한 억제 수용체의 바람직한 발현은 TRAIL이 정상 세포는 남겨두면서 암 세포에서의 세포자멸사를 유도하는 항암제로서 유용할 수 있음을 암시한다 ([Marsters et al., 1999]).

세포독성 화학요법 약물의 도입 후 암 치료에는 많은 진전이 있어왔다. 하지만, 화학요법의 결과 중 하나는 약물 내성 표현형의 발달/획득 및 다중 약물 내성의 발달이다. 약물 내성의 발달은 이러한 종양의 치료에 주요 장애로 남아있으며, 따라서 유전자 요법과 같은 별도의 접근이 명백히 필요하다.

화학요법, 방사선 요법 또는 생물학적 요법과 함께 사용하기 위한 치료의 또다른 형태는 온열요법을 포함하는데, 이는 모 조직을 고온 (106˚F 이하)에 노출시키는 방법이다. 외부 또는 내부 가열 장치가 국소, 구역 또는 전신에의 온열요법의 적용에 수반될 수 있다. 국소적 온열요법은 종양과 같은 작은 영역에 열을 가하는 것을 수반한다. 열은 체외 장치로부터 종양을 표적화하는 고주파 파장과 함께 외부에서 발생될 수 있다. 내부 열은 가온수로 채워진 얇은 가열된 전선 또는 중공 관, 삽입된 마이크로파 안테나 또는 고주파 전극을 포함하는, 멸균 탐침을 수반할 수 있다.

환자의 기관 또는 사지는 구역적 요법으로 가열되는데, 이는 자석과 같은 고에너지를 생성하는 장치를 사용하여 수행된다. 별법으로, 환자의 혈액 중 일부를 제거하여 가열한 후에, 이를 내부적으로 가열될 영역 내로 관류시킬 수 있다. 전신 가열은 또한 암이 신체의 도처에 분포된 경우에 실행될 수 있다. 가온수 블랜킷(blanket), 고온 왁스, 유도성 코일 및 열 챔버는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.

호르몬 요법은 또한 상기 기술된 임의의 다른 암 치료법과 함께 또는 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 호르몬의 사용은 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 어떠한 호르몬의 농도를 낮추거나 또는 이의 작용을 차단하기 위해, 유방암, 전립선암, 난소암, 또는 자궁경부암과 같은 암의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료는 종종 선택적 치료법으로서나 또는 전이의 위험성을 감소시키기 위해 1 이상의 다른 암 치료법과 함께 사용된다.

TABLE-US-00007 TABLE 6 종양유전자 공급원 인간 질병 기능 성장 인자 HST/KS 형질감염 FGF 족 일원 INT-2 MMTV 촉진제 FGF 족 삽입원 INTI/WNTI MMTV 촉진제 인자-유사 삽입 SIS 원숭이 육종 PDGR B 바이러스 수용체 티로신 키나제 ERBB/HER 조류 증폭된, EGR/TGR-알파./에리트로(erythro) 결실된 편평 앰피레귤린(Amphiregulin)/배아 세포 암; 헤타셀룰린 바이러스; ALV 아교모세포종 수용체 촉진체 삽입; 증폭된 인간 종양 ERBB-2/NEU/형질감염 증폭된 유방, 래트 난소로부터의 HER-2에 의해 조절됨, 위 NDF/아교모세포종 암 헤레귤린 및 EGF-관련된 인자 FMS SM 고양이 MGR/스틸(steel) 육종 바이러스 수용체 조혈 TRK 형질감염 NGF (인간 성장 인자로부터의 신경) 결장 암 수용체 MET 형질감염 산포 인자/인간 HGF 수용체 골육종 RET로부터의 전위 산발성 갑상선 고아 수용체(orphan receptor) 및 점 암 (point cancer); 잘 알려진 Tyr 돌연변이 수질 갑상선 키나제 암; 복합 내분비샘 신생물 2A 및 2B ROS URII 조류 고아 수용체 육종 바이러스 Tyr 키나제 PDGF 수용체 전위 만성 TEL (ETS-유사 골수단구 전사 백혈병 인자)/PDGR 수용체 유전자 융 합.

III . 실시예

하기 실시예들은 본 발명의 다양한 실시태양을 예시하기 위한 목적으로 주어진 것이며, 임의의 양식으로 본 발명을 제한하려는 것을 의미하지 않는다. 당업자는 본 발명이 목적을 수행하여, 언급된 목표 및 이점뿐 아니라, 본원에 고유한 목적, 목표 및 이점들을 달성하기 위해 잘 변형됨을 쉽게 인식할 것이다. 본 실시예는 본원에 기술된 방법과 함께, 현재 바람직한 대표예이며, 예시적일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 의도되지 않는다. 특허청구범위의 권리범위에서 정의된 본 발명의 취지 내에 포함되는 이의 변형 및 다른 사용은 당업자에 의해 가능할 것이다.

실시예 1

간 암종의 치료

A. 목적

본 목적은 (1) 종양내(IT) 주입을 통해 투여된 JX-594의 최대내용량(MTD) 및/또는 최대실행량(maximum-feasible dose, MFD)을 결정하는 것, (2) I.T. 주입을 통해 투여된 JX-594의 안전성을 평가하는 것, (3) I.T. 주입을 통해 투여된 JX-594의 복제/약력학을 평가하는 것, (4) I.T. 주입 후 종양 관련 항원 및 JX-594에의 면역 반응을 평가하는 것 (주입 부위 및 주입되지 않은 부위에서의 증가된 염증 침윤; 항체 형성의 중화; 사이토카인 반응; 및 종양 및 바이러스 특이적 T 림프구 유 도), (5) I.T. 주입을 통해 투여된 JX-594의 항종양 효능을 주입 부위 및 주입되지 않은 부위에서 평가하는 것이다.

B. 연구 설계

이는 영상 유도 하에 표면상에 주입가능한 종양 결절을 갖는 간 암종 환자에서의 제1상, 개방형(open-label), 용량 단계적 증량 연구이다. 불응성 종양을 갖는 환자는 순차적인 용량 단계적 증량 설계에서 다음의 4가지 투여 농도 중 하나의 치료를 받을 것이다: 코호트 1: 1 x 10⁸ pfu, 코호트 2: 3 x 10⁸ pfu, 코호트 3: 1 x 10⁹ pfu, 코호트 4: 3 x 10⁹ pfu.

이러한 연구의 목표 기간은 15 달일 것이다. 등록된 환자는 주기 당 1번의 치료를 받을 것이다. 만약 환자가 DLT 없이 치료를 받으며, 표적 종양이 진행되지 않을 경우, 환자에게 총 4 주기 이하에서 추가적인 주기를 수행할 것이다. 환자가 진행되는 표적 종양을 가지거나 또는 DLT 또는 다른 이유로 인해 연구를 멈춰야 하는 경우에는, 환자는 연구의 종결(End of Study Visit)을 수행할 것이며 추적 단계로 이행될 것이다. 주기는 3 주로서 정의된다. DLT는 제1 주기에서만 관찰될 것이다.

투여량은 1 내지 3개의 병변에 분포될 수 있다. 주입되는 병변(들)의 최대 지름의 총합은 10 cm 미만이어야만 한다. 3 명의 환자는 DLT가 관찰되지 않는다면 각각의 투여량 농도로 치료받을 것이다. 3 명 중 어떤 환자도 DLT를 겪지 않는 다면, 그 다음 투여량 농도에 등록시켜 진행할 것이고, 최초 3 명 중 1 명이 DLT를 겪는다면, 이 때에는 2차 DLT가 나타나거나 (이 시점에서 독성 투여량으로 정의됨) 또는 총 6 명의 환자가 치료받을 때까지 추가적인 환자를 등록시킬 것이다. 만약 2차 DLT가 코호트에서 나타나지 않는다면, 환자는 다음 투여량 농도로 진행될 것이다.

MTD는 JX-594로의 치료 후에 2 명의 환자가 DLT를 경험한 투여량의 바로 이전 투여량으로 정의된다. MFD는 MTD가 정의되지 않았을 때 최고 투여량 농도로 정의된다. MTD/MFD가 정의되는 경우, 이러한 투여량 농도에서의 안전성 및 독성의 더많은 데이타를 얻기 위해 6 명의 추가적 환자를 치료하였다. MTD가 코호트 4에서 나타나지 않고 이전 코호트 투여량에서의 2/3 이상에서 PR의 효능이 나타난다면, 6 명의 추가적 환자의 임상 연구는 이 투여량에서 수행되었다.

DLT는 JX-594에 기인한 것으로서, 1. 임의의 기간의 등급 4 독성; 2. > 5 일 동안 지속되는 (독감유사 증후군, 피로, 구역, 근육통, 열을 제외한) 등급 3 독성 중 임의의 하나로 정의된다. 미국의 국립 암 기관의 보편적인 독성 기준(National Cancer Institute common Toxicity Criteria of the US)은 이러한 연구에서 나타난 독성의 중증도를 정하기 위해 사용되었다.

1. 대조 종양(주입되지 않은 종양) (주기 1) 및 JX -594 주입 (주기 2+)에 대한 결정

연구자들은 주기 1 동안 대조 종양 부위를 결정한다. 대조 종양은 표적 종양의 간엽 이외의 다른 엽에 위치하는 순수한 종양 결절이어야 하고, 표적 종양의 림프 배관의 외측에 존재하여야 한다. 따라서, 대조 종양은 간의 좌엽 및 우엽에 분리되어 존재할 것이다. 그러나, 종양 결절이 간의 한쪽 범위내에 존재하는 경우, 대조 종양은 JX-594 주입되지 않은 종양 결절일 수 있으나, 대조 종양이 넓은 범위에 걸친 단일 결절을 갖는 경우에는 대조 종양이 확립되지 않을 수 있다. 이 대조 종양을 JX-594 처리된 종양과 동일한 방식으로 평가하였다. 이를 통해, 종양의 성장 및 국소 독성/활성에 대한 제어 효과를 평가할 수 있었다.

환자 치료가 주기 2로 들어가는 경우, JX-594를 대조 종양에 주기 1에서의 표적 종양과 동일한 수준으로 주입한다. 상기한 바와 같이, 투여량은 종양 크기를 기준으로하여 종양들 간에 비례적으로 분산될 것이다.

2. 비-표적(주입되지 않은) 종양이 관해된 환자

본 연구에서 주입되지 않은 종양이 관해될 수 있고, 이러한 현상은 환자에게 JX-594를 투여한 이전의 제1상 임상시험에서 보고되어 졌다. 이 효과의 메카니즘을 이해하는 것이 필요하며, 여기에는 주입된 종양으로부터의 바이러스 분포 및/또는 종양-특이적 세포독성(T-림프구(CTL)의 종양 침윤 및 후속적 세포독성 T-림프구-매개 종양 파괴)의 유도가 포함될 가능성이 있다. 이러한 효과의 메카니즘을 더욱 잘 이해하기 위하여, 연구자들은 하기의 내용과 같이 수행하였다. 주입되지 않은 종양이 임상적으로 관해되는 경우, 주입된 종양과 동일한 채취 시점에 중심부 생검 또는 미세바늘 흡인을 실시하였다(참조: 첨부문서 A; 비-표적 종양의 생검은 총 2개 부위를 초과하여 실시하지 않음). 주입되지 않은 종양으로부터 얻은 검체를 주입된 종양으로부터 얻은 것과 동일한 방법을 사용하여 분석하였다.

C. 환자 선정

1. 포함 기준

전형적으로, 환자는 하기 기준의 모두를 만족시킨다:(1) 19세 이상, (2) 영상 유도 하에 표면상에 주입 가능한 종양(최장 직경 10 cm 이하)이 있고, 표준 치료에도 불구하고 악화되고 있는(즉, 표준 치료에 내성) 임상적으로 또는 조직학적으로 확인된 (초기 또는 전이) 간암 환자, (3) 표준 치료, 예컨대 외과적 절제, 동맥내 화학색전술, 화학요법, 및 방사선 요법의 치료에도 불구하고 진행되는 종양, (4) 카르노프스키 수행 상태 (Karnofsky Performance Status)가 70 이상인 환자, (5) 예상되는 생존시간이 16주 이상인 환자, (6) 성관계를 갖는 환자인 경우, JX-594로 치료한 후 3개월 동안 피임법을 사용할 의향을 가진 환자, (7) 설명에 근거한 사전동의를 이해할 수 있고, 이에 서명할 의향이 있는 환자, (8) 연구 절차 및 추후 조사에 응할 수 있는 환자, (9) 적합한 골수 기능 (WBC > 3,000 세포/mm³, ANC > 1,500 세포/mm³, 혈색소 > 10 g/dL, 및 혈소판수 > 75,000 세포/mm³)을 가진 환자, (10) 적합한 신기능 (혈청 크레아티닌 < 1.5 mg/dL)을 가진 환자, (11) 적합한 간기능 (혈청 AST (≤ 정상 상한치(ULN)의 2.5), ALT (≤ 정상 상한치(ULN)의 2.5), 총 빌리루빈 (≤ 2.0 mg/dL))을 가진 환자이고, 환자는 초기 폐암과 관련하여 차일드-푸(Child Pugh) 등급에 따라 A 또는 B로 분류되어야 한다.

2. 제외 기준

환자는 하기 제외 기준의 어느 것에도 해당하면 안된다: (1) 임부 또는 수유부, (2) HIV 환자, (3) 차일드-푸(Child Pugh) 등급 C로 분류되는 환자, 등급 A 또 는 B(초기 간암환자의 경우)로 분류되는 환자 중에 총 빌리루빈이 2 mg/dL를 초과하는 환자, (4) 임상실험용 신약 치료에 대한 고위험 요소로 여겨지는 임상적으로 중요한 활성 감염증 또는 조절되지 않는 의학적 증상 (예를 들어, 호흡계, 신경계, 심장혈관계, 위장관계, 비뇨생식계)이 있는 환자, (5) 원인되는 질환 및/또는 복용 약물에 기인하는 심각한 면역결핍이 있거나 그러한 상태인 가족이 있는 환자, (6) 전신 요법을 요하는 습진 병력이 있는 환자, (7) 불안정 심장질환이 있는 환자 (본 연구의 환자 등록 전 6개월 내에 진단되고, 약물처치가 요구되는 MI, 불안정 협심증, 울혈성 심부전, 심근염, 부정맥 또는 심장 상태에 있어서 임의의 다른 임상적으로 중요한 증상을 포함함), (8) 약물 치료 연구 전 4주 내에 전신성 스테로이드 또는 임의의 다른 면역억제제를 투여받은 환자, (9) 본 연구의 환자 등록 전 4주 내에 임의의 다른 임상실험용 약물연구, 방사선요법, 화학요법 또는 수술을 받은 환자, (10) 설명에 근거한 사전동의에 서명할 수 없거나 서명할 의향이 없는 환자, (11) 연구 약물의 성분에 대한 과민성이 있는 환자.

D. 연구 방문 절차

본 연구 과정의 요약표를 관찰 및 시험 스케쥴 (Schedule of Observations and Tests)에 나타내었다. 일반적으로, 스케쥴로부터 +1/-1일 차이(window)는 허용되었으며, 주말 및 휴일은 계산하지 않았다.

1. 선별 방문 (제 -14일 ~ 제0일)

본 연구는 바이러스를 사용하는 연구이며, 환자와 논의하면서 진행하였다. 참여하길 원하는 어떤 환자라도 설명에 근거한 사전동의서를 제출해야만 했다. 설 명에 근거한 사전동의서에 서명한 후, 각각의 환자는 연구가 시작되기 전 14일 내에 하기의 평가를 받았다:

임상적 평가 항목은 다음을 포함한다: (1) 항암 치료를 포함하는 모든 약력 및 수술력, (2) 체중 및 활력 징후 (체온, 맥박수 및 혈압), (3) 신체검사(전신체), (4) 카르노프스키 수행 점수, (5) 가슴 x-선 (후방-전방 및 양측), (6) 12-리드 ECG (본 연구의 환자 등록 전 3 개월 이내에 실시한 경우라면 허용됨), (7) 동시투여되는 약물의 평가(환자가 본 연구 등록 전 14일 내에 복용한 모든 약물).

실험실 평가 항목은 다음을 포함한다: (1) 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), (2) 혈청 화학; 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤(random) 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, (3) 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간(PPT), 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, (4) HIV, HBV 및 알파 태아단백질 시험, (5) 중화 항체 역가, (6) 바이러스 게놈 (Q-PCR), (7) 통상적인 요검사 (현미경 검사를 포함함), (8) (가임 여성 대한) 임신 여부 검사, (9) 선별 검사시, 종양 유형에 따른 적절한 종양 마커 (CA125, CEA, AFP, PSA, CA19-9, 등) 시험; 그것이 증가하는 경우, 각 주기의 제22일에 시험을 실시하였다.

영상 기재 평가 및 종양의 측정은 복부 CT 스캔을 사용한 종양 결절의 측정 (최장 직경의 측정)을 포함하며, 제1일(치료전)에 얻은 CT로 교체될 수 있다 (본 연구의 환자 등록 전 2주 이내에 실시한 경우라면 허용됨).

제1일 (주기 1 - 4) - 염두에 두어야 할 것은 평가는 JX-594의 투여 전 또는 후에 실시하여야 한다는 것이다.

제1일: 치료전 - 임상 평가: 신체검사(전신체), 체중 및 활력 징후(체온, 맥박수 및 혈압), 카르노프스키 수행 점수, 동시 요법의 확인, 표적 종양의 시험 및 평가, 표적 종양 (n=1 내지 3)의 측정; 추가의 주입되지 않은 종양(n=1 내지 3)의 측정, 표적 종양의 생검.

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간(PPT), 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, 4. 사이토킨 (GM-CSF 포함), 5. 중화 항체 역가, 6. 바이러스 게놈 (Q-PCR)

실험실 평가: 기타 - 1. pfu 측정을 위한 요검사, 2. pfu 측정을 위한 인후면봉법(Throat swab)

연구 약물 투여 - 1. 제8장에서 기재한 바와 같은 JX-594의 투여

제1일 : 치료 후 - 1. 신체검사. 활력 징후는 1시간 마다 2번(30분 및 60분), 6시간 동안 측정하고, 그 후에는 정기적으로 측정하였다. 2. 사이토킨 분석을 위해 하기 시점에 채혈하였다: 치료 후 1 시간 및 3 시간. 3. 혈중 JX-594 게놈의 측정을 위해 하기 시점에 채혈하였다: 투여 시작 후 10 내지 15 분, 25 내지 35 분 및 4 내지 6 시간. 4. 바이러스 쉐딩(shedding) 검사를 위한 소변 및 인후면봉 샘플을 치료 후 3 내지 4 시간에 취하였다. 5. 부작용 및 병발(concurrent) 질병의 기록

제3일 (주기 1 - 4) - 실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, 4. 사이토킨 (GM-CSF 포함), 5. 중화 항체 역가, 6. 바이러스 게놈 (Q-PCR).

실험실 평가: 기타 - 1. pfu 측정을 위한 요검사, 2. pfu 측정을 위한 인후면봉법

임상 평가 - 부작용 및 병발 질병의 기록

영상 기재 평가: 임상 평가시 부작용이 의심되는 경우 복부 CT 스캔

제5일 (주기 1 - 4) - 임상 평가 - 부작용 및 병발 질병의 기록

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT), 및 국제규정비율(lNR); 피브리노겐, 4. 바이러스 게놈 (Q-PCR).

제8일 (주기 1 - 4) - 임상 평가 - 신체검사, CT 스캔; 표적 종양의 생검 (생검은 또한 염증, 괴사 또는 수축 등을 포함하는 중요한 변화를 나타내는 최대 1 또는 2개의 주입되지 않은 종양에 대해 수행함). 생검은 환자 상태에 대한 책임연 구자(PI)의 주관적 평가에 의해 주기 1 및 2 에서만 수행하였다. 부작용 및 병발 질병을 기록하였다.

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 및 국제규정비율(lNR); 피브리노겐, 4. 사이토킨 (GM-CSF 포함), 5. 중화 항체 역가, 6. 바이러스 게놈 (Q-PCR).

실험실 평가: 기타 - 1. pfu 측정을 위한 요검사, 2. pfu 측정을 위한 인후면봉법, 3. 괴사가 발생한 경우, 괴사의 미세바늘 흡인 (주기 1 및 2 에서만 수행).

제15일 (주기 1 - 4) - 임상 평가 - 신체검사.

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함) 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, 4. 바이러스 게놈 (Q-PCR).

실험실 평가: 기타 - 1. pfu 측정을 위한 요검사, 2. pfu 측정을 위한 인후면봉법

제22일 (주기 1 - 4) - 임상 평가 - 1. 신체검사, 2. 영상 기재 평가: 복부 CT 스캔 (주기 2 및 4 에서만 수행함), 3. 표적 종양 (n=1 내지 3)의 측정; 추가의 주입되지 않은 종양 (n=1 내지 3)의 측정, 4. 표적 종양의 생검 (생검은 또한 염증, 괴사 또는 수축을 포함하는 중요한 변화를 나타내는 최대 1 또는 2개의 주입되지 않은 종양에 대해 수행함), 5. 부작용 및 병발 질병의 기록, 6. 제22일은 다음 주기 전 제1일로 사용될 수 있었다. 제22일과 다음 주기의 제1일 사이에는 최대 1주일의 간격이 있을 수 있다.

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, 4. 중화 항체, 5. 바이러스 게놈 (Q-PCR), 6. 선별 검사시, 종양 유형에 따른 적절한 종양 마커 (CA125, CEA, AFP, PSA, CA19-9, 등) 시험; 그것이 증가하는 경우, 각 주기의 제22일에 시험을 실시하였다.

실험실 평가: 기타 - 1. pfu 측정을 위한 요검사, 2. pfu 측정을 위한 인후면봉법

제28일 또는 연구방문의 종료 - 임상 평가 - 신체검사, 및 부작용 및 병발 질병의 기록.

실험실 평가: 혈액 - 1. 통상의 혈액검사 (혈소판 계산 및 감별 계산을 포함함), 2. 혈청 화학검사: 나트륨, 칼륨, BUN, 크레아티닌, ALT, AST, 알칼리성 포스파타제, 총 빌리루빈, LDH, 칼슘, 인, 마그네슘, 랜덤 글루코스, 총 단백질, 알부 민 및 요산, 3. 응고 시험: 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 및 국제규정비율(INR); 피브리노겐, 4. 바이러스 게놈 (Q-PCR).

주기 3 - 4 - 1. 주기 2의 제22일에 주입 부위 종양의 최장 직경이 25 %를 초과하여 증가하지 않은 환자는 주기 3 - 4로 들어갔다. 2. 주기 2의 제22일에 주입 부위 종양의 최장 직경이 25% 내지 50 % 증가한 환자는 주기 3 - 4로 들어갈 수 있었다. 3. 주기 2의 제22일에 주입 부위 종양의 최장 직경이 50 %를 초과하여 증가한 환자에 대해서는 연구를 종결하였다.

환자 추적조사 및 검토 - 임상 연구가 완료된 환자에 대해 연구방문 종결 후 1년 동안 간암 환자에 대한 통상의 추적조사 방식으로 추적조사하였다. 임상 연구와 관계없이, 생존한 환자는 병원에 방문하여 진찰받을 때 간암 혈청검사 및 영상 기재 평가와 같은 통상의 검사를 받고, 3개월 마다 검사를 받았다. 임상 연구가 완료된 후 주목할 만한 임상적 잇점이 나타난 경우에는 설명에 근거한 별도의 사전동의를 받은 후에 최대 총 4회에 걸쳐 추가로 주입을 투여할 수 있었다. 이 경우, 연구의 모든 절차는 본 연구의 처음 4회 투여와 동일한 방식으로 진행하였다. 주기 4 까지의 연구가 완료된 후, 책임연구자(PI)가 중요한 임상적 잇점 (안정성 질병보다 큰 잇점)이 있다고 판단할 때까지 최대 총 4회에 걸친 연구 약물의 추가 주입이 투여될 수 있다. 이 경우, 책임연구자(PI)는 먼저 임상시험의뢰자와 상의하고, 그로부터 동의를 얻어야 했다. 모든 연구 계획은 본 임상 연구와 동일한 방식으로 진행되었다.

E. 바이러스 복제, 분포 및 특수 시험

1. 혈장 및 소변의 Q- PCR 및 플라크-형성 단위 분석 ( 약력학적 시험)

혈류로의 바이러스 분포는 정량 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR) 시험에 의해 평가하였다. 바이러스가 소변 및 인후면봉 중에 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 치료 후에 샘플을 채취하였다.

2. 종양 생검 및 미세바늘 흡인 (면역 반응 시험)

종양 부위에서의 바이러스 복제 여부를 확인하기 위하여, (안전하고, 용이하다고 간주되는 경우) 치료전, 후에 중심부 생검 및 미세바늘 흡인을 실시하였다. 바이러스 복제, 염증 및 면역 세포 침윤, 괴사 및 세포자멸사 여부를 입증하기 위해 생검 검사물을 분석하였다.

조직을 채취하기 위하여, 중심부 생검바늘을 사용하거나 영상 유도 하에 미세바늘 흡인 생검을 실시하였다. 그러나, 때로는 이러한 생검으로 인해 환자에게 응급 또는 위험한 상황이 초래될 수 있다. 따라서, 조직 채취를 위한 생검을 실시하는 경우에, 환자의 안전성이 우선적으로 고려되어야 한다. 환자의 상태가 매우 위험해지기 쉬운 경우(간피막 종양 등), 조직은 안전한 경로를 통해서 채취되어야 한다.

책임연구자(PI)가 조직 생검 (미세바늘 흡인)이 환자에게 위험을 초래할 가능성이 크다고 판단한 경우, 생검 (미세바늘 흡인)을 실시하지 않을 수 있다. 또한, 환자의 안전을 위해 필요한 경우에는 책임연구자(PI)의 재량으로 환자를 입원시키고, 조직 생검 (미세바늘 흡인) 및/또는 종양내 JX-594 주입 실시 전, 후로 최대 5일 동안 관찰할 수 있다.

3. 사이토킨 분석 (면역 반응 시험)

GM-CSF, IL-I, IL-4, IL-6, IL-IO, IFN-δ 및 TNF-α의 혈청 농도를 ELISA 분석으로 측정하였다.

4. 중화 항체 분석 ( 약력학적 시험)

환자의 계열 희석된 혈청 중 JX-594의 중화 항체 역가를 플라크 분석으로 확인하였다.

5. 약력학적 혈액 검사

약력학적 검사를 위해 각 혈액 3 ml를 소형 옐로우 톱 진공용기 넣었다.

F. 연구용 약물의 투여

l. 투여량, 투여 및 치료 스케쥴

투여량. 투여량은 전형적으로 다음과 같다: 코호트 (1): 1 x 10⁸ pfu, 코호트(2): 3 x 10⁸, 코호트 (3): 1 x 10⁹, 코호트 (4): 3 x 10⁹ pfu.

약물 투여. JX-594를 종양내 주입을 통해 투여할 수 있었다. 종양내 주입은 내과 전문의에 의해 하기한 것과 같은 방식으로 투여되었다. 주입할 종양(1 내지 3개 종양)의 총 부피의 약 25 %와 동등한 부피의 바이러스-함유 용액을 21-게이지 또는 더 작은 바늘을 사용하여 종양에 직접 주입하였다. 전형적으로, 주입은 영상(예를 들어, CT) 유도하에 수행하였다. 1 내지 3개의 종양에 주입하며, 각각의 종양에는 동등한 양의 용액이 투여되어야 했다. 2 내지 3개의 종양에 주입한 경우, 하나의 종양에 주입된 바이러스 용액 부피는 나머지 종양의 부피에 대한 종 양의 부피에 비례했다(즉, 하나의 종양 부피가 다른 것의 2배인 경우, 보다 큰 종양에 바이러스 용액 총 부피의 2/3가 투여됨).

주기 1에서 선택된 표적 종양의 성장이 멈출지라도, 전체 주기에서 주입은 계속하여 실시하여야 한다. 그러나, 필요에 따라, 주기 3에서 연구자들은 주기 1 에서의 표적 종양을 포함하여 주기 1 및 2에서 주입하지 않은 비-표적 종양을 3개까지 선택할 수 있다. 주입된 종양의 최대 직경은 전부 10 cm 이하이어야 한다. 종양내로 주입된 바이러스 용액의 투여량은 종양의 부피에 비례한다.

JX -594 제제. JX-594는 바이러스 제제 150 ㎕(0.1 ml를 전달하기 위함)를 함유한 일회용 유리 바이알이 냉동된 상태(-60 ℃ 이하)로 제공되었다. 상기 용액 100 ㎕ 부피는 1.9 x 10⁸ pfu 바이러스를 함유하였다. 바이알은 수직으로 세워 해동시켜야 하며, JX-594는 온수욕에 두어서는 안된다. 피펫으로 재현탁시켰다. 희석하고, 환자에게로 운반하는 동안, 바이러스는 4 ℃에서 보관하였다. 해동시킨 JX-594를 4시간 경과 후에 주입해서는 안된다.

수석 약사 및 다른 임명된 약사는 JX-594를 생물학적 안전 캐비넷 (클래스 2)에 주의하여(장갑, 보안경, 가운 등의 착용) 수직으로 보관하여야 한다. 모든 희석을 위한 처음 절차는 다음과 같다: 주사기를 사용하는 경우, 필요한 부피의 멸균 식염수를 취하여 규격화된 팔콘(falcon) 튜브에 옮겼다. 주입하기 위한 바이러스와 희석제의 최종 부피는 표적 종양 부피의 약 25 %와 같았다.

코호트 (1): JX-594 바이알 (1)을 코호트 (1)의 환자에게 사용하였다. 멸균 식염수에 옮긴 소정 부피의 JX-594를 마이크로 피펫/주사기를 사용하여 취하였다.

코호트 (2): JX-594 바이알(2)를 코호트 (2)의 환자에게 사용하였다. 제1 바이알의 함유물을 혼합한 후 제2 바이알에 옮겼다. 멸균 식염수에 옮긴 소정 부피의 JX-594를 마이크로 피펫/주사기를 사용하여 취하였다.

코호트 (3) 및 (4): JX-594 바이알 (4) 또는 (11)을 코호트 (3) 또는 (4)의 환자에게 사용하였다. 모든 함유물을 혼합된 소형 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 멸균 식염수에 옮긴 소정 부피의 JX-594를 마이크로 피펫/주사기를 사용하여 취하였다.

모든 희석을 위한 마지막 절차는 다음과 같다: 실온에서, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸거나, 차광 백(bag)에 넣어 두었다. 투여 전 10초 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 실온에 노출 후 30분 또는 해동 후 4시간이 지난 후에 주입해서는 안된다.

치료 스케쥴. 전형적으로, 등록된 환자는 주기 당 JX-594로 1회 치료 또는 투여량을 받았다. 주기의 말기에 JX-594 주입된 표적 종양의 진행이 없는 환자는 후속 주기(최대 총 4 주기)에서 치료를 받았다. 표적 종양이 진행된 환자는 방문을 종결하였다. 하나의 주기는 3주로 정의된다. 투여량은 1 내지 3개의 병변 사이에서 균등하게 분배될 수 있다. 주입된 종양의 최대 직경은 전부 10 cm 이하이어야 한다.

투여량의 단계적 증량. 임상 연구의 투여량의 단계적 증량 단계에서, 각 코호트 당 2 내지 6명의 환자가 등록되었다. 처음 3명의 환자 모두가 용량제한독 성(DLT)을 경험하지 않은 경우, 다음 코호트로 연구를 진행시켰다. 코호트의 처음 3명 환자 중 1명에게서 DLT이 발생한 경우, 연구는 최대 총 6명의 환자가 코호트에 등록될 때까지 또는 2명의 환자(첫번째 경험자 포함)에게서 DLT가 발생할 때까지 진행하였다.

첫번째 주입 후 2주까지 코호트 (1)에서 6명 중 2명 미만의 환자가 DLT를 경험한 경우, 연구는 다음 코호트로 진행되었다. 2명의 환자가 DLT를 경험한 경우, 바로 전단계의 투여량이 MTD로 정의되었다.

주기 1에서 첫번째 환자에게 처음 주입을 투여한 후 1주까지는 두번째 환자를 등록시키지 않았으며, 이러한 규칙은 다음 환자의 등록에서 적용되었다. 하나의 코호트에서 DLT가 발생한 경우, 모든 후속 등록환자의 치료는 주기 1에서 이미 등록된 환자 모두에게 첫번째 주입 투여를 완결하고 나서 2주 후에 시작하였다. 환자는 주기 1에서 이전 코호트의 마지막 환자에 대한 첫번째 주입 투여가 완결되고 나서 적어도 2주 후에 다음 단계 투여량의 코호트로 들어갔다.

코호트 (1)에서 2명을 초과하는 환자가 DLT를 경험한 경우, 임상 연구를 중단하였다.

G. 안전성

치료 후, 다음과 같은 전신 부작용이 발생할 수 있다: 열, 오한, 근육통, 피로/무력증, 오심, 및 구토. 주입된 종양 부위의 부작용, 예컨대 통증, 괴사, 궤양 및 염증이 발생할 수 있다. 예비-임상 연구 및 GM-CSF 임상 연구의 경험에 비추어볼 때, 일시적으로 호중구 증가를 수반한 림프구, 단핵구, 또는 백혈구 증가가 발 생할 수 있다. 주입된 종양 부위에 통증, 괴사, 궤양 및 염증 등이 발생할 수 있다.

가능성이 매우 낮고, 이전의 JX-594 제1상 임상시험에서 보고되지 않았을지라도, 파종성 백시니아(vaccinia)-관련 발진 또는 뇌염 발생이 이론상 가능하다; 이 합병증의 발생은 각각 백신을 투여받은 사람 10,000 명 중 약 1 명 및 1,000,000 명 중 약 1 명으로 보고되고 있다.

1. 용량-제한 독성 ( DLT )

DLT은 감기 유상 증상(예를 들어, 피로, 오심 또는 근육통)을 제외한 JX-594에 기인하는 임의의 3급 이상의 독성이 5일 이상 지속되거나, 임의의 4급 독성이 임의의 기간 동안 지속되는 것으로 정의된다.

시험 절차의 위험으로부터 환자의 안전 보장. 생검은 복강내 출혈 및/또는 종양 파열에 기인한 쇼크와 같은 합병증을 유발할 수 있다. 보고된 합병증 발병률이 0.1 % 미만이고 경도관 색전술로 치료될 수 있을지라도, 환자 안전성이 우선적으로 고려되어야 한다. 따라서, 치료하는 내과의가 생검이 환자에게 위험을 초래할 가능성이 크다고 판단한 경우, 생검을 실시하지 않을 수 있다. 또한, 환자의 안전을 위해 필요한 경우, 책임연구자(PI)의 재량으로 환자를 입원시키고, 조직 생검 및/또는 종양내 JX-594 주입 실시 전, 후로 최대 5일 동안 관찰할 수 있다.

H. 효능

이러한 연구의 일차적인 목적은 임상적 잇점이 아닌 안정성을 위한 제1상 임상시험이다. 그럼에도 불구하고, 본 연구는 직접적인 바이러스 효과(즉, 종양 파 괴 효과)에 기인하는 주입 및/또는 주입되지 않은 종양의 수축 및/또는 치료에 의해 유도된 면역-매개 종양 파괴를 일으킬 것이라고 기대된다.

효능 평가의 기준은 표적 병변에 따라 다르다. 비-표적 병변에 임의의 변화가 있는 경우에, 하기 표를 참고하여 표적 병변의 관해를 기준으로 평가하였다.

표적 병변의 평가. 완전관해 (Complete Response, CR): 모든 표적 병변의 소멸. 부분관해 (Partial Response, PR): 기준 시점에서의 최장 직경(LD)을 기준으로 하여 표적 병변의 모든 LD가 30 % 이상 감소. 진행성 질병 (Progressive Disease, PD): 치료를 시작한 후 기록된 최단 LD를 기준으로 하여 표적 병변의 모든 LD가 20 % 이상 증가. 안정성 질병(Stable Disease, SD): 치료를 시작한 후의 최단 LD를 기준으로 하여, PR 정도의 충분한 수축도 없고, PD 정도의 증가도 보이지 않는 경우.

전반적인 관해의 평가 기준을 하기 표에 나타내었다. 최고의 전반적인 관해는 치료의 시작점부터 질병의 진행/재발 시점까지 기록된 최고의 관해를 의미한다.

주: 건강 상태의 전체적 악화로 치료의 중단이 요구되는 환자는 질병 진행에 관한 객관적인 증거가 없더라도 "증상 악화"로 분류되어야 한다. 치료의 중단 후라도, 객관적인 질병 진행을 발견하기 위해 모든 노력을 기울여야 한다.

어떤 상황에서는, 정상 조직과 잔류 질병을 구별하는 것이 어려울 수 있다. 완전관해의 평가가 이 결정에 의해 좌우되는 경우, 완전관해 상태를 입증하기 전에 잔류 병변을 조사(미세-바늘 흡인/생검)하는 것이 권장된다.

측정 가능한 병변 평가를 위한 지침. 모든 측정은 주기 2의 마지막 날(제22일) 및 주기 4의 마지막 날 (제22일)에 CT 또는 MRI로 실시하고, 자 또는 캘리퍼스를 사용하여 미터법 표기로 기록해야 한다. 모든 기준 평가는 치료의 시작으로부터 가능한 한 가까운 시일 내에 수행되어야 하고, 치료 시작 전 4주보다 더 이전에 수행해서는 안된다.

주: 이전에 방사선조사를 받았던 병변은 측정가능한 병변으로 허용되지 않는다. 이 병변이 연구자의 재량에 의해 측정가능한 병변으로 허용되는 경우에는 이 병변의 고려조건을 프로토콜에 기재하여야 한다. 또한, 이전에 방사선조사를 받았던 부위에 위치한 종양 병변은 측정가능한 것으로 고려하지 않을 수 있다. 연구자가 측정가능한 병변으로서 적절하다고 간주한 경우에는 그런 병변이 고려되어야 하는 조건이 프로토콜에 정의되어야 한다.

평가시와 동일한 방법 및 동일한 기법이 기준시점 및 추적조사 동안에 확인 및 보고되는 각각의 병변의 특징을 규명하는데 사용되어야 한다. 치료의 항종양 효과를 평가하는데 두 방법이 모두 사용되는 경우, 임상검사에 의한 평가보다 영상 기재 평가가 바람직하다.

일반 CT는 절편 두께 10 mm 이하의 연속적인 절편으로 수행하여야 한다. 나선 CT는 5 mm 연속적 재구성 알고리즘을 사용하여 수행하여야 한다. 적용 가능하다면, PET-CT가 선별 방문에 사용될 수 있고, 이 경우 PET-CT는 주기 2의 제22일의 평가에 사용되어야 한다. 필요하다면, PET-CT는 주기 4의 제22일에 반복 사용될 수 있다.

측정의 확인/ 관해의 지속시간. 확인: PR 또는 CR의 상태를 정하기 위하여, 종양의 변화 측정은 관해에 대한 기준에 처음으로 부합된 후 8 주에 수행되어야 하는 반복 평가에 의해 확인되어야 한다. SD의 경우에, 최소 16 주 간격의 추적조사 측정은 연구에 들어간 후 한번 이상 SD기준에 부합되어야 한다.

관해의 지속시간: 모든 관해의 지속시간은 CR 또는 PR (어느 것이든 처음으로 증명된 것)이 처음으로 기록된 날부터 재발 또는 진행(진행은 치료 시작 후 기록된 최소 측정값을 기준으로 함)이 객관적으로 확인된 최초의 날까지의 기간으로 정의한다. 전체적 완전관해의 지속 기간은 CR이 처음으로 기록된 날부터 객관적으로 재발이 확인된 최초의 날까지로 정의한다.

안정성 질병( SD )의 지속시간: SD의 지속시간은 치료 후 SD가 처음으로 기록된 날부터 PD(치료 시작 후 기록된 최소 측정값을 기준으로 함)가 객관적으로 확인된 최초의 기간으로 정의한다.

종양 관해의 재평가. 필요한 경우, 본 연구와 무관한 방사선과의사가 종양 관해를 평가할 수 있다. 그러나, 평가 결과는 단지 연구 목적으로만 사용될 것이며, 임상적 결론에는 영향을 미치지 않을 것이다.

I. 통계 방법 및 데이터 분석

1. 표본 크기

평가된 표본 크기는 환자 18 명이며, 가능한 범위는 환자 2 내지 30 명 일 수 있다. 본 연구의 일차적 목적은 종양내 주입에 의한 JX-594의 안전성 및 MID 또는 MFD를 결정하는 것이다. 본 연구는 인간에서의 JX-594 제2상 임상 시험이다. 이전에 의미있는 통계 결과을 기준으로 한 인간에서의 임상 연구가 없었기 때문에, 본 연구를 위한 표본 크기는 임상적 안정성을 기준으로 선택하였다. 본 연구의 결과는 장래의 임상 연구를 위한 표본 크기 요구조건을 결정하는데 있어서 변수의 추정치를 제공하는데 사용될 수 있다.

각 코호트에 있는 환자에 대해 실제 MTD를 넘어 연구가 진행될 수 있을 뿐 아니라 실제 MTD에 도달하기 전에 연구가 중단될 수도 있다. 하기 표는 실제 DLT 발생을 기준으로 한 각 결과의 통계적 가능성을 나타낸다. 하기 표는 처음 3 명 환자의 코호트에서 각 결과의 확률(각 환자군에 있어서 각종 실제 발병률)을 나타낸 것이다.

하기 표는 6 명 환자의 코호트에서 각 결과의 확률을 나타낸다. 하기 표는 코호트에 있는 처음 3 명의 환자에서 하나의 DLT가 관찰되고, 3 명의 환자를 코호트에 더 추가한 후의 환자군에 있어서 각종 실제 발병률을 나타낸다.

* 처음 3 명 중 1 명의 환자 및 그 다음(두번째) 3 명 중 1 명의 환자

2. 통계 방법/데이터 분석

요약되는 군은 치료 목적(intent-to-treat,ITT)군, 즉 JX-594로 1회 이상 치료를 받은 모든 환자로 정의된다. 또한, 평가 가능한 환자군은 ITT 군의 서브세트로도 평가된다. 평가 가능한 환자는 치료 전 또는 후의 적절한 기간에 수행되는 적절한 종양 측정과 함께 1 주기 이상의 치료를 받은 환자이다.

본 연구는 코호트에 따라 2 내지 6 명 환자가 있는 4개 치료 코호트로 진행되었다. 각 코호트에 대한 데이터는 적절한 기술 통계학, 빈도표, 그래프, 및 데이터 목록으로 요약되었다. 치료 코호트로부터의 데이터를 선별 데이터 표시를 위해 취합하였다. 산출된 특정 데이터 표시는 하기하는 바와 같다.

대상자 연령, 체중, 및 신장을 기술 통계학 (평균, 중앙값, 표준 편차, 최소값 및 최대값)으로 요약한 반면, 성별 및 인종은 빈도표로 요약하였다. 치료 코호트에 대한 데이터를 취합하고, 각 환자에 대해 개별적으로 요약하였다. 이를 위해, 각 환자 목록을 만들었다. 신체 병력 데이터를 각 치료 코호트에 대해 분리하고 빈도표로 요약하기 위해 취합하였다. 치료 투여는 기술 통계학 (평균, 중앙값, 표준 편차, 최소값 및 최대값)으로 요약하였다. 연구 약물을 투여받은 임의의 환자는 안전성 분석에 포함되었다. 유해 사례(adverse event, AE), 실험실 결과, 독성, 활력 징후 및 금단 정보를 포함하는 안전성 데이터를 각 치료 코호트의 종료시점에 개별적으로 요약하였다. 유해 사례(AE)는 코스타르트(COSTART) 신체 시스템 분류 체계를 이용하여 코드화하고 표로 만들었다. AE가 있는 대상자 수 및 백분율을 치료 코호트 및 치료 목적에 의해 표로 만들었다; 또한, 데이터를 AE의 중증도 및 JX-594에 대한 연구자가 명시한 관계에 따라 분류하였다.

실험실 결과를 종결시점에 치료전 내지 후에 변화가 있는 환자의 수를 나타낸 전환표로 요약하였다. 선별된 변수에 대한 실험실 결과를 그래프로 나타내었다.

전반적인 종양 관해율에 추가하여 표적 및 비표적 부위에서의 종양 관해율을 나타내었다. 표적 및 비-표적 부위에서 시간에 따른 종양 진행을 나타내고, 전반적인 생존율 또한 나타내었으며, 각 군에서 적은 수의 환자로 비무작위 연구를 하는 경우에는 이것이 조절되지 않기 때문에 본 연구 단독으로부터의 시험 데이터에 대한 가설은 추정되지 않았다. 적절하다면, 치료 코호트간의 차이를 평가하기 위하여, 파라미터 또는 비-파라미터적 방법이 각 군을 비교하는데 사용될 수 있다.

실시예 2

절제 불가능한 악성흑색종의 치료

A. 투여량 및 스케쥴

1. 투여량 및 스케쥴에 대한 이론적 근거

치료 당 총 투여량 1 x 10⁸ pfu이 주어졌다. 이 투여량은 외과적으로 불치인 피부 흑색종 치료를 위한 JX-594 제1상 임상시험에서 안전하게 투여된 최고 주간 투여량 1.6 x 10⁸ pfu보다 낮다[참고: Mastrangelo et al., 1998]. 또한, 1 x 10⁸ pfu은 진행중의 JX-594 제1상 종양내 (IT) 임상시험에서 현재까지 안전하게 투여된 최고 투여량보다 10배 낮으며, 현재까지 처리된 최고 투여량 수준보다 3배 낮다. 상기 임상시험에서, 치료제는 IT 주입에 의해 1 내지 3개의 간 종양에 매 3주마다 투여되었다. 본 연구의 예비 결과를 통해 감기 유사 증상 및 혈액학적 파라미터는 전형적으로 JX-594로 치료 후 4일 내에 (즉, 5일째) 기준 수준으로 회복됨이 밝혀졌다.

주 1회 투여 요법은 진행중인 상기 간 IT 연구에서 모든 코호트에서의 환자가 5일째까지 경증 내지 중증의 치료 관련 독성으로부터 회복되었기 때문에 선택된 것이다. 또한, 문헌[Mastrangelo et al. 1998]의 데이터는 치료 당 최대 8 x 10⁷ pfu의 주 2회 IT 주입이 안전하고 효과적임을 보여주고 있다.

초기 제1상/제2상 임상 흑색종 연구에 의해 증명된 바와 같이[참조: Mastrangelo et al., 1998], 환자의 백시니아 바이러스에 대한 상당한 체액성 면역 반응이 재-백신주입 이후 14 내지 21일 내에 나타났다. 항체 역가는 계속적인 치료에도 불구하고 바이러스에 노출된 후 4 내지 6주에 플래토(plateau)에 도달했다. 따라서, 이 프로토콜은 높은 역가의 항체 및 T 세포의 발생에 앞서 JX-594의 전달 및 항종양 효과가 최대한 가능하게 하기 위하여 6주 동안 주 1회 IT 투여로 연구하는 것이다.

2. 연구에 대한 이론적 근거

흑색종은 상대적으로 주입하기 위한 접근 가능성이 높은 질병이며, IL-2 면역요법에 대해 양성 반응을 보이고, 전이 흑색종이 있는 환자에 대한 효과적이고 허용가능한 치료법의 부족하기 때문에 JX-594 면역요법을 위한 최적의 표적일 수 있다. 또한, JX-594 복제가 멜라닌세포에서 높게 발현되는 EGFR 경로를 표적으로 한다고 생각된다.

초기 제1상/제2상 임상 연구에서의 결과는 JX-594의 종양내 주입이 외과적으로 불치인 전이 흑색종이 있는 환자의 주입된 질병 및 원위 질병 모두를 치료하는데 있어서 안전하고 효과적이다는 것을 제시한다. JX-594 치료에 대해 부분관해 (6 + 개월) 및 완전관해 (4 + 개월)가 달성된 2 명의 환자를 포함하여, 주입된 종양 둘 다의 관해(7 명 중 5 명의 환자) 및 하나 이상의 주입되지 않은 종양의 관해(7 명 중 4 명의 환자)가 증명되었다. 특히, 주목할 만한 것은 치료전 백신주입(및, 그에 따른 선재성 항-백시니아 면역)에도 불구하고 모든 환자에게서 효능 및 유전자 발현이 나타났다는 점이다.

본 연구의 설계는 상기한 초기 제1상/제2상 임상 연구를 확대하고, 3기 또는 4기의 절제 불가능한 전이 흑색종이 있는 최대 15 명의 평가 가능한 환자에서의 주입된 종양의 관해를 평가하기 위하여 선택되었다. 또한, JX-594 안전성, JX-594에 대한 약력학적, 약동학적 면역 반응, 및 혈액 및 종양 조직 중 GM-CSF 형질전환 유전자의 발현이 평가되었다. 또한, JX-594가 정맥내로 분포되어 주입되지 않은 부위 및 원격 질병에 영향을 미쳐, 직접 종양내 주입한 부위에서 나타난 것과 유사한 항종양 효과를 부여할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이러한 발견은 또한 IT로 투여된 JX-594의 전반적인 임상 경험의 추가 이외에 진행/전이 질병의 치료, 특히 진행 악성흑색종의 치료에 있어서 IV 투여에 의한 JX-594의 치료를 강하게 지지할 것이다.

B. 연구용 제제 설명

JX-594는 통상적으로 사용되는 와이어드(Wyeth) 백신 균주(strain) (Dryvax®, 제조원: Wyeth laboratories)로부터 유래된 암-표적된, 복제-선택적 백시니아 바이러스이다. 바이러스는 티미딘 키나제(TK) 유전자 불활성화된 백신 균주로부터 유래된다. JX-594는 면역 반응과 관련된 유전자 및 hGM-CSF에 대한 프로모터인 강력한 사이토킨을 함유한다. JX-594는 또한 lacZ 유전자의 삽입으로 변형되어 조직내 바이러스의 추적을 가능하게 한다.

C. 목적

본 목적은 (a) 주입된 종양의 객관적 관해율, (b) IT 주입으로 투여된 JX-594의 안전성 및 독성, (c) JX-594를 IT 주입으로 투여 후 전체적인 질병 존재량(burden)의 객관적 관해율 (RECIST 기준), (d) 무진행 생존(Progression Free Survival,PFS) 시간, 및 (e) 주입되지 않은 종양의 관해율의 평가를 포함한다.

D. 연구 설계

1. 연구 개요

본 연구는 절제 불가능한 3기 또는 4기 악성흑색종이 있는 환자에서의 개방형 시험인 제3상 임상시험이다. 환자는 6주에 걸쳐 JX-594를 총 6회 종양내 주입투여받았다. 1 x 10⁸ 플라크-형성 단위 (Pfu)의 총 투여량을 각 치료시 투여했으며, 이는 최대 5개의 종양 사이에서 균등하게 분배되었을 것이다. 환자가 6회의 치료를 완료한 후 JX-594의 IT 치료에 대한 주입된 종양의 부분관해를 경험한 경우, 주 1회로 투여하는 추가의 3회 치료가 진행될 수 있었다.

2. 연구 종료점( endpoint )

임상 연구의 제1차 종료점은 전형적으로 완전관해율, 부분관해율, 및 관해의 지속시간을 포함하는 주입된 종양의 관해율이다. 임상 연구의 제2차 종료점은 치료-관련 유해 사례, 심각한 유해 사례 (SAE)의 발생으로 결정되는 안정성, 및 완전관해율, 부분관해율, 관해의 지속시간, 무진행 생존률(PFS), 주입되지 않은 종양의 관해율(완전관해율, 부분관해율, 및 관해의 지속시간을 포함)을 포함하는 통상의 실험실 파라미터의 기준으로부터의 임상적으로 중요한 변화를 포함할 수 있다. 다른 종료점은 전반적인 생존율, 임상적 잇점 (체중증가 및 활동도의 향상을 포함), JX-594 평가 (예를 들어, 혈장 및/또는 전혈 중 바이러스 게놈 (Q-PCR); 혈장 및/또는 전혈 중 감염성 바이러스, 임의의 (플라크 분석)), 면역 평가 (혈청 중 JX-594 중화 항체; 혈장 GM-CSF 측정 (ELISA 분석)), 조직 평가 (조직 중 바이러스 유전자 발현; GM-CSF 발현; lac-Z 발현; 염증 세포 침윤; 괴사; 세포자멸사; 세포질내의 바이러스 복제 공장(factory); EGFR 경로 상태; 및 종양 티미딘 키나제 상태)를 포함할 수 있다.

3. 투여량

전형적으로, 바이러스는 본 명세서에 기재한 바와 같이 멸균 생리식염수 중에 희석시켰다. 총 투여량 1 x 10⁸ 플라크-형성 단위 (Pfu)를 각 치료에 투여하였고, 이는 최대 5개의 종양 사이에서 균등하게 분배되었을 것이다.

4. 전반적인 연구 지속시간 및 추적조사

연구 기간은 전형적으로 선별, 연구 치료, 및 치료 후 추적조사 평가에 대한 환자 방문으로 구성되었다.

선별. 연구를 위한 환자 적격 여부는 JX-594로 치료하기 전 14일부터 치료 첫날 사이에 결정하였다.

치료. 적합한 환자에게는 1 x 10⁸ pfu의 투여량을 주 1회 (1, 8, 15, 22, 29, 및 36일) 종양내 주입으로, 6주에 걸쳐 총 6회 투여하여 치료하였다. 환자는 재-치료 전에 계속하여 모든 적격 기준에 부합하여야 한다. 어떠한 이유로든 치료를 놓친 경우, 그 치료는 적격 기준을 충족하는 다음 주에 이루어지도록 하며, 방문 일정을 조절하여 환자가 총 6회의 치료를 받을 수 있도록 한다. 주입은 누적하여 최대 4 주 동안 지연될 수 있다. 지연된 치료를 받는 환자는 여전히 모든 6회의 치료를 완료하고, 그들의 6번째 치료로부터 1주 후에 관해를 평가한다. 관해의 평가는 마지막 투여로부터 1주 후(즉, 43일)에 처음으로 수행하였다. 환자가 6회의 치료를 완료한 후 JX-594의 IT 치료에 대해 부분적 주입된 종양의 관해를 경험한 경우, 주 1회로 투여하는 추가의 3회 치료가 진행될 수 있었다.

치료 후 추적조사. 모든 환자는 JX-594의 마지막 치료일로부터 28일 후 (즉, 64일)에 추적조사를 위해 재방문하였다. 환자는 치료요법의 완료 후 6달 동안 또는 환자에게 주입 부위의 진행성 병변이 발생할 때까지, 새로운 항암치료를 시작하거나 사망하였다. 환자는 마지막 주입 후 3주마다 신체검사 (PE) (가능한 경우) 및 관해의 평가에 의한 종양 측정을 위하여 병원에 방문하였다. 환자는 또한 6주 마다 PE 및/또는 CT/MRI에 의한 관해 평가를 받았다. 추적조사의 6달 후부터는, 환자는 주입부위에 진행성 병변이 있거나, 사망하거나, 새로운 항암요법을 시작할 때까지 3개월마다 종양 측정 및 관해 평가(CT/MRl 포함)를 위해 병원에 방문하였다.

유전자 요법 제제의 장기 추적조사. 주입 부위에 진행성 병변이 있거나 새로운 항암요법을 시작한 후, 환자의 생존 및 현재의 FDA 지침에 따른 유전자 요법의 잠재적 장기 효과를 위하여 계속하여 모니터링하였다. 환자가 치료 또는 치료 후 추적조사를 위하여 더 이상 병원에 방문하지 않는 경우, 데이터는 우편 또는 전화를 통해 수집될 수 있었다.

E. 연구 대상군

1. 포함 기준

환자는 전형적으로 하기 모든 기준에 부합한다 : 조직학적으로 확인된 3기 또는 4기 악성흑색종 환자; 직접적 가시화(visualization) 또는 초음파유도에 의해 주입될 수 있고, CT/MRl 및/또는 신체검사에 의해 측정가능한 하나 이상의 종양이 있는 환자; 예상되는 생존시간이 16주 이상인 환자; 치료를 위한 외과적 절제가 불가능한 암환자; KPS 점수가 70 이상인 환자; 18세 이상; JX-594로 치료받는 동안 및 치료 후 3개월 동안 피임법을 사용할 의향이 있는 생식 잠재력이 있는 남성 및 여성; 기관심사위원회(Institutional Review Board,IRB)/독립윤리위원회(Independent Ethics Committee,IEC)-승인 작성된 설명에 근거한 사전동의를 이해하고 서명할 의향이 있는 자; 연구 절차 및 추적조사 검사에 응할 수 있는 자 ; 적절한 간기능 (총 빌리루빈 ≤ 2.0 mg/dL; AST, ALT ≤ ULN의 2.0 ); 적절한 골수 기능 (WBC > 3,500 세포/mm³ 및 < 50,000 세포/mm³; ANC > 1,500 세포/mm³, 혈색소> 10 g/dL; 혈소판수> 125,000/mm³); 허용가능한 응고 상태 (INR < (ULN + 10%)); 및 허용가능한 신기능 (혈청 크레아티닌 < 2.0 mg/dL)을 가진 환자.

2. 제외 기준

전형적으로, 환자는 하기 제외 기준의 어느 것에도 해당하면 안된다: 표적 종양이 유착되고/거나 침범한 주요 혈관 구조(예를 들어, 경동맥)를 갖는 환자; 임부 또는 수유부; HIV 감염 환자; JX-594의 처음 치료 전 4주 내에 전신성 스테로이드 또는 다른 면역억제제를 투여받은 환자; 연구용 신약 치료에 대한 고위험 요소로 여겨지는 임상적으로 유의한 활성 감염 또는 비조절성 의학적 조건 (예를 들어, 호흡계, 신경계, 심장혈관계, 위장관계, 비뇨생식계)이 있는 환자; 기저질환 및/또는 약물복용 (예를 들어, 전신성 스테로이드)에 기인한 심각한 면역결핍; 전신 요법을 요하는 일부 시기의 습진 병력이 있는 환자; 임상적으로 심각하고/거나 급속하게 체류되는 복수, 심장막 및/또는 흉막삼출 (예를 들어, 증상 조절을 위해 배액이 필요한 경우) 환자; 중증 또는 불안정 심장질환, 예컨대 선정되기 전 6개월 내에 진단되고 치료를 요하는 심근경색증, 불안정 협심증, 울혈성 심부전, 심근염, 부정맥 또는 심장 상태에 있어서 임의의 임상적 유의한 변화가 있는 경우를 포함하나 이에 국한되지 않는 경우; 선정되기 전 4주 내에 방사선요법, 화학요법, 수술 또는 다른 연구용 약물 (미토마이신 C 또는 니트로소우레아의 경우 6주)로 표적 종양의 치료를 받은 환자; 이전에 천연두 백신 주입으로 인해 심각한 반응 또는 부작용을 경험한 환자; 설명에 근거한 사전동의 또는 본 프로토콜에 요구되는 절차에 응할 수 없거나 의향이 없는 환자; 임산부 또는 수유부, 5세 미만의 어린이와 접촉하는 가족, 전신 요법을 요하는 일부 시기의 습진 병력이 있는 가족, 또는 원인되는 질환 (예를 들어, HIV) 및/또는 약물 복용 (예를 들어, 전신성 스테로이드)에 기인한 심각한 면역결핍질환의 가족이 있는 환자는 연구 약물을 투여받는 기간 및 마지막으로 투여받은 후 3주 동안의 기간에 주거지를 바꾸지 않는 한 제외된다.

3. 적격 기준의 기타 고려사항

적격 기준에 대한 편차. 상기 포함/제외 기준으로부터 사소한 편차(예를 들어, 사전에 지정된 범위 밖의 실험실 값)를 갖는 환자는 이러한 편차가 환자의 안전성, 연구의 수행, 또는 연구 결과의 해석에 영향을 미치지 않는 경우에 연구에 참여할 수 있다. 사소한 편차가 있는 환자의 등록에 대한 임상시험의뢰자 또는 그의 대리인에 의해 작성된 승인서가 요청되어야 한다.

4. 환자 등록 절차

일단 연구자가 선정 평가를 수행하고 환자의 적격 여부를 확인하면, 임상시험의뢰자가 대표로 선정 및 자격 정보를 검토하고 각 환자의 등록에 대한 서면 확인서를 연구자에게 제공한다. 등록이 확인되면, 환자는 미리 정해진 환자 번호 부여 방식을 사용하여 식별번호를 부여받는다. 환자 식별번호는 연구번호, 부위 번호, 환자 번호 및 환자 이니셜의 조합이다.

F. 연구용 제제

JX-594는 제조원(Jennerex Biotherapeutics)에 의해 제공되었다. 전형적으로, JX-594는 액체로 제제화되며, 일회용으로 고안된 유리 바이알에 넣어 냉동 보관하였다. 각 바이알은 0.15 ml를 함유하였다. 바이러스 용액은 무색 내지는 투명 내지 약간 유백광인 미황색이었으며, JX-594의 농도는 1.9 x 10⁹ pfu/mL이었다.

JX-594는 생물안전등급 2(Biosafety Level 2, BSL-2)의 감염성 물질로 여겨진다. BSL-2 명칭 및 관련 지침은 사람 및 환경에 대한 중간 정도의 잠재적 위험 요소가 있는 제제에 적용된다. 다른 BSL-2 제제의 예로는 홍역 바이러스, 살모넬라 및 B형 간염 바이러스 등이 있다. 제도적 감염 조절 방침을 협의하여야 한다.

JX-594는 전형적으로 모니터링되는, 접근이 제한되는 안전한 냉동고에 보관되었다. JX-594는 냉동고의 문 및 방의 문에 적절한 생물-위험 표지(제제의 성질을 표시함)를 하고 2차 포장내의 명료하게 표지된 바이알에 담아 -60 ℃이하에서 보관하였다. 냉동고는 냉장고 온도가 -60 ℃로 상승하기 전에 조치할 시간이 있도록 -65 ℃로 설정된 경보 한계가 있어야 한다. 장시간 동안 온도가 -60 ℃를 초과한 경우, 영향받은 물질은 역가가 확인될 때까지 격리해 둘 것이 요구된다.

JX-594의 적절한 취급 및 제조가 가능하도록 설계된 작업계획표가 추가 연구 정보와 함께 연구 장소에 제공되었다. 바이러스 벡터[생물안전등급 2 (BSL-2)]의 제조, 운반, 및 처리를 위한 제도적 감염 조절 방침을 협의하고 그에 따라야 한다. 장갑, 가운 및 보안경을 항상 착용해야 한다. JX-594에 관한 모든 조작은 공인된 약사/과학자의 지휘하에 약국/실험실에서 BSL-2 취급 지침에 따라 수직형 생물학적 안전 캐비넷 (클래스 2)내에서 수행되었다. 후드 자체는 각 사용 전, 후로 70% 에탄올로 깨끗이 닦았다.

해동. 해동은 바이알을 수직으로 세워 실온해서 이루어져야 한다. JX-594를 온수욕에 두어서는 안된다. 일단 해동되면, 바이알을 폴리프로필렌 원추형 원심분리용 튜브 (예를 들어, 커밍(Coming) 또는 팔콘)에 넣고, 튜브 뚜껑을 덮고, 2분 동안 100 x g로 원심분리시켰다. 그 후, 핀셋 또는 이와 같은 것을 사용하여 폴리프로필렌 튜브로부터 JX-594의 바이알을 꺼내었다. 바이러스 제제는 희석되고 환자에게 제공될 때까지 얼음 위 또는 냉장하여(2 내지 8 ℃) 보관하여야 한다. 주입은 바이러스 제제가 해동된 후 4시간 이상을 경과하여 시작해서는 안된다.

제조. 바이알을 원심분리한 후, 마이크로피펫 (200 ㎕ 마이크로피펫을 제시된 100 ㎕로 설정함)를 사용하여 서서히 재현탁하였다. 제제에 기포가 들어가지 않도록 주의해야 한다. 바이러스 용액 (JX-594 + 식염수) 약 2.75 mL를 전형적으로 제조하고, 각 0.5 mL의 5개 주사기에 분배하였다. 마이크로피펫을 사용하여, 멸균 생리식염수 2.64 mL를 적절한 크기의 폴리프로필렌 튜브 (예를 들어, 5 mL 팔콘 튜브)에 옮겼다. JX-594의 바이알(1)로부터 JX-594 116 ㎕를 취하여 식염수가 함유된 팔콘 튜브로 옮겼다. 판콘 튜브의 뚜껑을 덮고, 튜브를 차광(호일을 사용하거나 차광용기에 보관)하고, 즉시 차광된 튜브를 2 내지 8 ℃(냉장고 또는 젖은 얼음 위)에 두었다.

투여 전 30분 이내에 10초 동안 격렬히 볼텍싱하였다. 볼텍싱 후, 바이러스 용액 (JX-594 + 식염수) 0.5 ml를 각 5개의 주사기로 취하였다. 주사기에 캡을 씌우고 주입을 위해 연구자에게 전달하였다. 바이러스 제제가 해동된 후 4시간 이상이 경과한 경우 주입을 시작해서는 안된다. 바이러스 제제는 희석되고 환자에게 제공될 때까지 얼음 위 또는 냉장하여(2 내지 8 ℃) 보관하여야 한다.

1. JX -594의 투여

JX-594을 주 1회로 6주에 걸쳐 총 6회 동안 종양내로 투여하였다. 투여는 제1, 8, 15, 22, 29, 및 36일에 실시하였다. 환자에게 치료 당 1 x 10⁸ pfu로 투여하였으며, 이는 5개 이하의 병변에 걸쳐 분배되었을 것이다. 치료를 위해 경피 주입 (예를 들어, 촉진가능한 피부 결절 또는 림프절 전이) 또는 초음파(US) 유도하 주입을 통해 접근 가능한 병변만이 치료를 위해 적절하였다.

연구자가 각 치료에서 주입할 병변(종양)을 결정하였다. 종양의 크기를 기준으로 주입하였다(각 치료에서 가장 큰 병변에 주입하여야 한다). 연구자의 재량으로, 종양을 치료하는데 하나 이상의 주사기가 사용될 수 있었다.

바늘이 들어가는 부위의 피부를 멸균처리한 후, 국소 마취제를 투여하였다. 18 내지 22 게이지 바늘을 주입하는데 사용하였다. 주입 바늘이 하기하는 바와 같이 종양으로 삽입되었다. 주입은 수석 연구자 또는 부수석-연구자가 실시하였다.

각 종양으로의 주입은 중앙의 바늘 찌른 부위로부터 방사상으로 퍼져있는 각 종양 당 4개의 균등-간격의 바늘 경로를 통해 주사기 전체 부피(0.5 mL)를 주입함으로써 실시되었다. 하나의 예로써, 바이러스 주입은 다음과 같이 수행될 수 있다: (1) 바늘 (18 내지 22 게이지)을 종양의 중앙으로 삽입한다; (2) 바늘을 종양의 가장자리(종양 가장자리의 1 내지 3 mm 이내)를 향해 내민다; (3) 중앙의 바늘 찌른 부위를 향해 뒤로 끌어당기는 동안 주사기 부피의 약 25% (약 0.125 mL)를 주입한다; (4) 종양으로부터 바늘을 완전히 빼지 않은 채, 총 4군데의 바늘 경로에 대해 90°간격으로 상기 과정을 반복한다.

예상되는 독성. 치료 후 예상되는 전신 독성은 다음과 같다: 열, 오한, 식욕부진, 근육통, 피로/무력증 및/또는 두통. 일과성 질병은 중성구, 림프구, 혈소판 및 적혈구 용적에서 예상된다. 혈액 파라미터는 전형적으로 5일까지(전형적인 지속시간은 2 내지 3일임) 기준 수준으로 회복되었다. 주기 1에서, 최초 주입 후 처음 4일 이내에 백혈구가 증가할 가능성이 있다. 코호트 3의 2 명의 환자에서 투여 후 5 내지 8일 이내 총 백혈구 수 24,000/㎕ 및 118,000/㎕가 보고되었다. 호산구의 증가 또한 치료 후 예상되며, 전형적으로 8일 동안 증가된 채로 남아있다. 주입된 부위에서, 다음과 같은 독성이 발생할 수 있다: 통증, 괴사, 궤양 및 염증. 바이러스 복제의 다른 부분 (예를 들어, 원위 종양)에서, 통증, 괴사, 궤양, 및 염증의 가능성이 있다.

가능성이 매우 낮고, JX-594 치료 또는 노출 후에 관찰되지 않았을지라도, 파종성 백시니아-관련 발진 또는 뇌염 발생이 가능성이 있다; 이 합병증은 각각 천연두 백신을 투여받은 사람 10,000 명 중 약 1 명 및 1,000,000 명 중 약 1 명으로 보고되고 있다. 또한, 통계적으로 유의하게 증가된 심근염의 위험(백신을 투여받은 사람 10,000 당 1 내지 2 명)이 NYCBOH 백시니아 주에 대한 최근의 백신주입 프로그램에서 증명되었다[참고: Arness et al., 2004].

G. 통계치

1. 결과 정의

통계적 분석에 관한 결과의 정의는 다음과 같다. 독성 코드화 및 진행성 병변, 완전관해, 부분관해, 전반적인 관해의 지속시간, 평가 가능한 환자의 정의, 및 치료와 관련된 것은 본 프로토콜의 다른 부분에서 논의되어 있다.

무진행 생존. JX-594로 처음 치료한 때부터 연구자에 의해 평가되는 진행성 진단일, 또는 진행성 없이 사망일까지의 시간이며, 최종적으로 진행 없이 생존한다고 알려진 환자는 진행 여부에 관한 그들의 마지막 평가시에 검열된다. 진행성 병변의 증거 제출 전에 비-프로토콜 치료를 받은 환자는 또한 통계적 분석에서 검열받는 것으로 지명된다.

전반적인 생존. JX-594로 처음 치료한 때부터 사망일 또는 최종적으로 생존하였다고 알려진 마지막날까지의 시간이며, 최종적으로 생존하였다고 알려진 환자는 통계적 분석에서 검열받는 것으로 지명된다.

2. 분석 집단 또는 모집단

JX-594를 투여받은 모든 환자를 선정시 인구 통계학적 특성, 이어서 안정성, 효능, 약력학 및 약동학을 위해 분석한다. 요약되는 모집단은 JX-594를 1회 이상 투여받은 모든 환자로 정의되는 치료 목적군이다. 또한, 평가 가능한 환자군(ITT 군의 서브세트)이 평가된다. 환자가 1회 이상의 JX-594 치료를 받고, 기준시 및 치료 후 첫번째 적절한 시점에 적절한 종양 측정을 받은 경우에 평가 가능한 환자라고 여겨진다.

3. 분석 방법

연속 변수는 기술 통계학(n, 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소값, 및 최대값)을 사용하여 요약한다. 분류상 변수는 각 분류 내의 환자 수 및 백분율 (n, %)로 나타내어 요약한다. 분석은 평가 가능한 환자 및 치료 목적(ITT)군을 기초로 실시한다. 전반적인 분석을 실시하였으며, 또한, 안전성 및 효능 분석은 질병 단계와 관련된다.

안전성: 분석 방법. 임의의 연구 약물 투여를 받는 환자는 안전성 분석에 포함되었다. 유해 사례, 실험실 결과, 독성, 활력 징후 및 금단 정보를 포함하는 안전성 데이터를 시간에 따라 요약하였다. 환자 연령, 체중, 및 신장은 기술 통계학으로 요약한 반면, 성별 및 인종은 빈도표로 요약하였다. 병력 데이터는 빈도표로 요약하였다.

유해 사례는 MedORA 분류 체계를 이용하여 코드화하고 표로 만든다. 치료유발응급(treatment-emergent) AE의 발생률을 표로 만든다. 또한, 데이터를 유해 사례의 중증도(등급) 및 JX-594에 대한 연구자가 명시한 관계에 따라 분류한다. 안전성의 분석은 3 또는 4급의 비-혈액학적 유해 사례 및 4급의 혈액학적 유해 사례에 중점을 두었다. SAE 목록을 작성한다.

혈액 및 혈청의 화학 결과는 연속 변수을 위해 기술 통계학을 사용하여 요약한다. 또한, 선별된 혈액학 파라미터의 최하점 분석을 수행하고 요약한다. 실험실 결과를 기준 범위와 관계된 기준치로부터의 투여 후 변화가 있는 환자 수를 표시한 전환표로 시간에 따라 요약한다. 선별된 변수에 대한 실험실 결과를 또한 그래프로 나타낸다.

KPS 수행 점수를 분류상 변수을 위하여 기술 통계학을 사용하여 요약한다. 선별 및/또는 기준치와 비교한 KPS 수행 점수에서의 최대 이동을 또한 요약한다. 나머지의 안전성 변수을 기술 통계학을 사용하여 요약한다.

약력학적 /약동학적: 분석방법. 시간에 따른 바이러스 복제 및 혈액으로의 쉐딩을 혈액 중 게놈 농도에 따라 평가한다. JX-594의 혈중 농도 및 GM-CSF 수준을 모든 환자에게서 측정하고 약력학적 파라미터를 산출한다.

분석되는 약동학적 파라미터는 말초 혈구수, MIA, 및 종양 생검 조직상에서의 JX-594의 효과 및 GM-CSF를 포함한다. 백혈구의 서브세트(절대 호산구수, ANC, 림프구), 사이토킨의 기준치로부터의 변화, 및 JX-594에 대한 중화 항체의 형성을 포함하는 IT 주입에 따른 JX-594에 대한 면역 반응을 평가하고 요약한다.

염증 세포 침윤, 바이러스 유전자 발현, GM-CSF 발현, lac-Z 발현 및 종양 괴사를 포함하는 조직학적 종료점(종양조직 및 정상조직 대조군)의 기준치로부터의 변화를 평가하고 요약한다. 세포자멸사, 세포질 내의 바이러스 복제공장, EGFR 경로 상태, 및 종양 티미딘 키나제 상태를 또한 평가한다.

효능: 분석 방법. RECIST 기준을 기초로한 치료 관해율은 다음에 관하여 평가한다: 전반적인 관해, 주입된 종양 관해, 및 주입되지 않은 종양 관해. 완전관해율, 부분관해율, 안정성 질병(SD)률, 진행성 질병(PD)률을 요약한다. 무진행 생존률, 진행 시간, 관해의 지속시간, 및 전반적인 생존률을 또한 기록한다. 질병 단계에 관하여 평가한다.

무진행 생존율 및 관해의 지속시간은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 추정한다. 중앙값, 중앙값에 대한 2-면 95% 신뢰구간으로, 최소값, 및 최대 지속시간, 및 검열된 환자수를 나타낸다. 무진행 생존률에 대한 곡선 및 기술 통계를 작성한다. 환자에 대한 임상적 잇점의 평가를 또한 JX-594로 치료한 시간에 따른 체중증가 및 활동 상태의 개선의 평가로서 실시한다. 흑색종 억제 활성 단백질(MIA)의 시간에 따른 변화를 평가할 수 있다. MIA를 또한 치료 반응과 비교할 수 있다.

관해 평가의 독립적 검토. 연구자는 독립적인 방사선학 검토자(IRR)에게 선정한 환자에 대한 모든 방사선 데이터의 사본(선호되는 디지탈 또는 CD-ROM)을 제공하도록 요청받을 수 있다. 피부 병변이 있는 환자에 대하여는, 사진이 또한 독립적 검토를 하기 위한 IRR에게 보내질 수 있다. 연구자 및 IRR 양쪽으로부터 얻어진 결과가 보고된다. 보고서를 읽는 사람들 사이의 불일치에 대해 아무런 평가도 수행되지 않는다.

본 명세서에 기재되고 청구된 모든 제제 및/또는 방법은 본 발명 개시 사항에 비추어 과도한 실험 없이도 만들어질 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 제제 및 방법이 바람직한 실시태양으로서 기재되어 있을지라도, 본 발명의 구성, 요지 및 범위에서 벗어나지 않고서 본 명세서에 기재된 제제 및/또는 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 대한 수많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 기재된 제제와 화학적 및 생리적으로 관련된 특정 제제를 사용하여 본 발명과 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것 또한 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 그와 같은 유사한 대용 물질 및 변형법 모두는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 구성, 요지 및 범위 내에 드는 것으로 간주된다.

<참고문헌>

본원에 기술된 내용에 대한 예시적인 절차 또는 그밖의 상세한 보충설명을 위해, 하기 문헌은 특히 본원에 참고문헌으로 인용된다.

McFadden G. Poxvirus tropism. Nat Rev Microbiol. 3: 201-213, 2005

하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 측면을 추가로 나타내기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 존재하는 특정 실시태양의 상세한 설명과 함께 이러한 1 이상의 도면을 참조시 더욱 잘 이해될 수 있다.

도 1은 종양내 주입을 통한 JX-594에 의한 임상 시험 연구 설계를 나타낸다.

도 2는 종양내 주입을 통한 JX-594에 의한 임상 시험 연구 설계를 나타낸다.

도 3은 암 근절을 위한 표적화된 종양살상형 바이러스 치료의 여러가지 신규한 메카니즘을 나타낸다.

도 4는 전이성 흑색종을 가진자에게서 JX-594 제1상 임상 시험 후 질병 없이 장기간 생존한 자를 나타낸다. 위쪽에 나타낸 환자 1은 32세의 여성이다: 불응성:DTIC, IL-2; 주입된 종양: CR; 주입되지 않은 전이물: -피부성: CR; 유방: 수술 후 CR. 질병 없이 1.5 + 년 생존하였다. 아래에 나타낸 환자 2는 75세의 남성이다: 다수개의 전이성 부위 (n=24); 주입된 종양: CR; 주입되지 않은 전이물: -CR. 질병 없이 3 + 년 생존하였다.

도 5는 주입된 종양 및 주입되지 않은 종양 모두에서의 JX-594 제1상 임상 시험 반응을 나타낸다.

도 6은 JX594-IT-hep001에서의 환자 인구통계학 및 치료 상태 - 코호트 1 및 2 - 를 나타낸다.

도 7은 JX594-IT-hep001에서의 환자 인구통계학 및 치료 상태 - 코호트 3 - 을 나타낸다.

도 8은 혈류에서의 JX-594의 IV 분포의 PK를 나타낸다. 종양으로부터의 초기 누출은 투여량에 해당하며 대부분 6 시간에 소실되었다.

도 9는 80%의 환자에서 명백히 나타난 JX-594의 복제 바이러스 혈증을 나타낸다: 혈액에서의 JX-594의 2차 파장은 1 내지 7 주기 내에 나타남. (+): 투여량 투여 후 소실됨. (-): 검출 한계값 미만의 농도였음. 빈칸: 연구하지 않은 환자, (p): 계속 데이타를 내고 있음. 검출 한계값: 700 유전자/ml

도 10은 80%의 환자에서 명백히 나타난 JX-594의 복제 바이러스 혈증을 나타낸다: 혈액에서의 JX-594의 2차 파장은 1 내지 7 주기, 3 내지 22 일 내에 나타남.

도 11은 JX-594 복제-관련된 혈관 폐쇄를 나타낸다. 급성 치료-유도된 무혈관 괴사 (pt.1, 위암)를 보여준다.

도 12는 JX-594 주입된 종양에서의 목적 반응을 나타낸다. 편평 세포 암종 (흉선)에서는 내구성 반응을 나타낸다 (코호트 1).

도 13은 JX-594를 사용한 장기간 안정한 질병을 나타내다. 편평 세포 암종 조절을 나타낸다 (폐 - 코호트 2).

도 14는 JX-594 주입된 종양에서의 대사성 (PET) 반응을 나타낸다. JX-594의 2 주기 후의 흑색종 반응을 나타낸다 (코호트 3).

도 15는 JX-594 주입된 종양에서의 대사성 (PET) 반응을 나타낸다. 9 + 달 동안의 간 암종 장기간 조절을 나타낸다 (코호트 2).

도 16은 주입된 간암 전이물에서의 종양 반응을 나타낸다. 근절된 종양 대사(PET), 목적 반응을 나타낸다.

도 17은 종양 마커 반응: AFP의 99.9% 감소를 나타낸다. 빠른 간암 파괴는 혈액 마커를 통해 증명되었다.

도 18은 JX-594에서의 체중 증가를 나타낸다. 10% 증가 (6 kg; 14 lb.)는 허용성, 효과를 증명한다.

도 19는 전신성 바이러스 혈증 및 종양 반응: JX-594 관련된 바이러스 혈증, 생성된 전신성 효과 (HCC-코호트 2)를 나타낸다 - AFP는 40% 감소하였다.

도 20은 전신성 JX-594의 종양으로의 전달 및 반응: JX-594 바이러스 혈증, 흑색종으로의 전달, 관련된 효과 (n=2, 코호트 3)을 나타낸다. 간에 주입 후의 1차 및 2차 JX-594 바이러스 혈증을 나타낸다. Pt. 303: 전이성 흉막 심출, 복수 8일 - 고농도 Q-PCR (+), GM-CSF (+). Pt. 304: 2 주기 후 모든 종양에서의 종양 물질 (생검, 삼출물) PET 대사성 반응 8일 - JX-594 Q-PCR (+).

도 21은 치료, 효능 및 생존 데이타를 나타낸다. CT 및 PET, 장기간 생존자에서의 종양 반응을 나타낸다.

Claims (24)

1. 종양에서의 세포의 종양살상을 유도하기에 충분한, TK-결핍되고 GM-CSF-발현하는 복제-가능한 백시니아 바이러스 벡터의 1 x 10⁸ 이상의 바이러스 입자를 종양을 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 환자에서의 종양살상 유도 방법.
2. 제1항에 있어서, 1 x 10⁹ 이상의 바이러스 입자를 환자에게 투여하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터를 2, 3, 4, 5 회 이상 투여하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 백시니아 바이러스를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 주 이상에 걸쳐 투여하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 종양이 뇌암 종양, 두경부암 종양, 식도암 종양, 피부암 종양, 폐암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 간암 종양, 난소암 종양, 자궁암 종 양, 방광암 종양, 고환암 종양, 직장암 종양, 유방암 종양 또는 췌장암 종양인 방법.
7. 제6항에 있어서, 종양이 간세포성 암종 또는 흑색종인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 양은 상기 종양 중 20% 이상의 세포, 상기 종양 중 30% 이상의 세포, 상기 종양 중 40% 이상의 세포, 상기 종양 중 50% 이상의 세포, 상기 종양 중 60% 이상의 세포, 상기 종양 중 70% 이상의 세포, 상기 종양 중 80% 이상의 세포 또는 상기 종양 중 90% 이상의 세포의 종양살상을 유도하기에 충분한 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 종양이 재발성인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 종양이 원발성인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 종양이 전이성인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 종양이 다중 약물 내성인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 환자에게 제2 암 치료를 행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 제2 암 치료가 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 냉동 요법, 독소 요법 또는 수술인 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스 벡터의 제2 투여를 추가로 포함하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 환자가 면역손상된 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 종양은 치료 전에는 절제가능하지 않고 치료 후에는 절제가능한 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 치료 후 종양 세포 생존성을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 투여가 종양 물질 내로의 주입을 포함하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 투여가 종양 혈관계 내로의 주입을 포함하는 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 투여가 상기 종양에 대한 림프계 또는 혈관계 구역내로의 주입을 포함하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 투여 전에 상기 종양을 영상화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스가 1 이상의 변형된 바이러스 유전자를 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 1 이상의 변형된 바이러스 유전자가

    (a) 인터페론 조정 폴리펩티드;

    (b) 보체 조절 폴리펩티드;

    (c) TNF 또는 케모카인 조정 폴리펩티드;

    (d) 세린 프로테아제 억제제;

    (e) IL-1β 조정 폴리펩티드;

    (f) 비감염성 EEV 형태 폴리펩티드; 또는

    (g) 세포로부터 감염성 바이러스의 방출을 억제하는 작용을 하는 바이러스성 폴리펩티드 (비감염성 바이러스 형태 폴리펩티드)

    중 1 이상을 포함할 수 있는 방법.

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