BR112019022009A2 - Terapia de combinação de vírus vaccinia oncolítico e inibidor de ponto de verificação - Google Patents

Terapia de combinação de vírus vaccinia oncolítico e inibidor de ponto de verificação Download PDF

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Jeon Hongjae
Sang Moon Eun
Chi Sungkuon
Sarah Choi Jiwon
Jung Joon-Goo
Bae Jungu
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Abstract

uma combinação farmacêutica que compreende (i) um vírus vaccinia oncolítico replicativo e (ii) um inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico é fornecida bem como um kit que compreende a combinação farmacêutica e métodos para tratamento e/ou prevenção de câncer.

Description

“TERAPIA DE COMBINAÇÃO COM VÍRUS VACCINIA ONCOLÍTICO
E INIBIDOR DE PONTO DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICO”
RELATÓRIO DESCRITIVO
REFERÊNCIA REMISSIVA
A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS
[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente U.S. Provisório No. 62/488.623, depositado em 21 de abril de 2017 e do Pedido de Patente U.S. Provisório No. 62/550.486 depositado em 25 de agosto de 2017 que são incorporados aqui como referência em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se de forma geral à virologia e à medicina. Em certos aspectos, a invenção refere-se a uma combinação terapêutica que compreende um vírus vaccinia oncolítico replicatívo e um imunomodulador.
ANTECEDENTE
[0003] A homeostase de tecido normal é um processo altamente regulado de proliferação e morte celular. Um desequilíbrio da proliferação celular ou da morte celular pode evoluir para um estado canceroso. Por exemplo, câncer cervical, renal, pulmonar, pancreátíco, colorretal e cerebral são apenas alguns exemplos dos muitos cânceres que podem ocorrer. De fato, a ocorrência de câncer é tão alta que mais de 500.000 mortes por ano são atribuídas ao câncer apenas nos Estados Unidos.
[0004] Vírus oncolíticos seletivos em relação à replicação são uma promessa para o tratamento de câncer. Estes vírus podem causar morte celular do tumor através dos efeitos oncolíticos diretos dependentes da
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2/124 replicação e/ou dependentes da expressão de genes virais. Entretanto, a supressão imunológica por tumores e a eliminação prematura do vírus resultam frequentemente apenas em respostas imunológicas específicas para o tumor fracas, limitando o potencial destes vírus como um agente terapêutico para câncer.
[O0OS] Similarmente, os inibidores de pontos de verificação imunológicos exibiram alguma promessa no tratamento de certos cânceres, ainda somente uma porcentagem limitada de pacientes atinge resposta clínica objetiva. Permanece uma necessidade de terapias aprimoradas para câncer.
[0006] Os presentes inventores descobriram que a administração concorrente de um inibidor de ponto de verificação imunológico e um vírus vaccinia oncolítico replicativo administrado de forma intratumor a um modelo de câncer clinicamente relevante, na qual os agentes são administrados simultaneamente para urna primeira e preferencialmente para inúmeras administrações consecutivas, resulta em efeitos antitumor sinérgicos. Consequentemente, em várias modalidades, o presente pedido de patente fornece uma terapia de combinação para uso no tratamento e/ou na prevenção de câncer e/ou o estabelecimento de metastases em um mamífero que compreende a administração concorrente ao mamífero (i) de um vírus vaccinia oncolítico replicativo e (ii) um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o vírus vaccinia oncolítico é administrado de forma intratumor ao mamífero. Em certos aspectos, a administração concorrente dos parceiros da combinação farmacêutica a um mamífero fornece uma imunidade antitumor aumentada e até mesmo sinérgica comparada a qualquer um dos tratamentos individualmente.
[0007] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral, intravenosa, intra
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3/124 arterial ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, o virus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor. Em algumas modalidades, o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente à proteína de ponto de verificação imunológico, preferencialmente um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos.
[0008] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação inibe uma proteína de ponto de verificação imunológico selecionada do grupo que consiste em antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4 ou CTLA-4), proteína de morte celular programada 1 (PD-1), B7-H3, B7-H4, proteína de membrana de célula T 3 (TIM3), galectina 9 (GAL9), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), supressor de ativação de células T contendo o domínio V de imunoglobulina (Ig) (VISTA), Receptor Similar à Imunoglobulina de Célula Killer (KIR), atenuador de linfócitos BeT (BTLA), imunorreceptor de células T com Ig e domínios ITIM (TIGIT), indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto adicional, o inibidor de ponto de verificação imunológico interage com um ligante de uma proteína de ponto de verificação incluindo sem limitação, CTLA-4, PD-1, B7-H3, B7H4, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA, TIGIT ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades preferidas, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humano ou anticorpo humanizado), um fragmento de anticorpo ou uma proteína de fusão que
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4/124 se liga especificamente a uma proteína de ponto de verificação imunológico ou um ligante da mesma.
[0009] Em algumas modalidades preferidas, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação é um anticorpo ou um fragmento que se liga ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a (e inibe) PD-1, PD-L1, PD-L2, TIGIT, TIM3, LAG3 ou CTLA4. Como exemplo não limitativo, é fornecido um método de tratamento e/ou de prevenção de câncer em um mamífero que compreende a administração de forma concorrente ao indivíduo de quantidades eficientes de (i) um vírus vaccinia oncolítico replicativo através de injeção intratumoral e (ii) um inibidor de CTLA4 e/ou PD-1.
[0010] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD1 ou PD-L1, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em: BMS-936559, atezolizumab, durvalumab, avelumab, nivolumab, pembrolizumab e lambrolizumab. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA4, preferencialmente selecionado do grupo que consiste em ipilimumab e tremelimumab. Em algumas modalidades, vários inibidores de pontos de verificação imunológicos são administrados de forma concorrente ao indivíduo com o vírus vaccinia oncolítico. Em algumas modalidades, são administrados de forma concorrente ao indivíduo: (a) um inibidor de CTLA4, um inibidor de PD-1 e um virus vaccinia oncolítico replicativo: (b) um inibidor de CTLA4, um inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo; (c) um inibidor de PD-1, um inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo; ou (d) um inibidor de PD-1, um inibidor de CTLA4, um inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo; (e) um inibidor de LAG3, um inibidor de PD-1 e um vírus vaccinia oncolítico replicativo: ou (f) um inibidor de TIGIT, um inibidor de PD-1 e um vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é um da Cepa Wyeth, da Cepa Western Reserve, da Cepa Lister
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5/124 ou da Cepa Copenhagen. Em algumas modalidades, o virus vaccinia compreende uma ou mais modificações genéticas para aumentar a seletividade do vírus por células cancerosas, preferencialmente o vírus é engenheirado para não ter timidina quinase funcional e/ou para não ter o fator de crescimento de vaccinia funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia compreende um gene 14L e/ou F4L funcional.
[0011] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia é um da Cepa Wyeth, da Cepa Western Reserve, da Cepa Lister ou da Cepa Copenhagen com uma ou mais modificações genéticas para aumentar a seletividade do vírus vaccinia por células cancerosas tal coma inativação do gene da timidina quinase (TK) e/ou do gene do fator de crescimento do vírus vaccinia (VGF). Em modalidades relacionadas, o vírus vaccinia é engenheirado para expressar uma citocina tal como, sem limitação, GMCSF, IL-2, IL-4, IL-5 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-24, IFN-γ e/ou TNF-a, preferencialmente selecionada de IFN-y, TNF-ct, IL-2, GM-CSF e IL-12. Em outras modalidades relacionadas, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar um antígeno de tumor tal como, sem limitação, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, AIM2, CDK4, BMI1, COX-2, MUM-1, MUC-1, TRP-1 TRP-2, GP100, EGFRvHI, EZH2, LICAM, Livin, Livinp, MRP-3, Nestin, 0LIG2, S0X2, E6 do papilomavírus humano, E7 do papilomavírus humano, ART1, ART4, SART1, SART2, SART3, B-ciclina, β-catenina, Gli 1, Cav-1, catepsina B, CD74, Ecaderina, EphA2/Eck, Fra-1/Fosl 1, Gangliosídeo/GD2, GnT-V, β1,6-Ν, Her2/neu, Ki67, Ku70/80, IL-13Ra2, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, MART-1, PROXI, PSCA, SOXIO, S0X11, Survivina, caspase-8, UPAR, CA-125, PSA, pl85HER2, CD5, IL-2R, Fap-ct, tenascina, antígeno p97 associado a melanoma, WT-1, regulador de sinalização da proteína G 5 (RGS5), Surivina (BIRC5=inibidor baculoviral de apoptose que contém 5 repetições), Proteína de ligação ao fator de crescimento similar à insulina 3 (IGF-BP3), timidilato sintetase (TYMS), proteína que pode ser induzida por hipóxia 2, associado a gotículas lipídicas induzido por hipóxia (HIG2), metalopeptidase de matriz 7 (MMP7), homólogo de prune 2 (PRUNE2),
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6/124 similar à proteína RecQ (Similar à DNA helicase Q1) (RECQL), receptor de leptina (LEPR), inibidor de feedback do receptor ERBB 1 (ERRFI1), proteína lisossomal transmembrana 4 alfa (LAPTM4A); RAB1B, família do oncogene RAS (RAB1B), CD24, timosina beta 4 de Homo sapiens, ligado a X (TMSB4X), proteína A6 de ligação ao cálcio S100 de Homo sapiens (S100A6), receptor de adenosina A2 de Homo sapiens (ADORA2B), quadro aberto de leitura 61 do cromossomo 16 (C16orf61), regulador de diferenciação 1 de ROD1 (ROD1), sirtuína desacetilase-2 dependente de NAD (SIR2L), tubulina alfa 1c (TUBA1C), fator inibidor 1 de ATPase (ATPIF1), antígeno de estroma 2 (STAG2), caseína quinase nuclear e substrato 1 dependente de ciclina (NUCKS1). Em algumas modalidades, o antígeno de tumor é um antígeno de tumor de carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o antígeno de tumor de carcinoma de célula renal é selecionado do grupo que consiste em regulador de sinalização da proteína G 5 (RGS5), Surivina (BIRCSMnibidor baculoviral de apoptose que contém 5 repetições), Proteína de ligação ao fator de crescimento similar â insulina 3 (IGF-BP3), timidilato sintetase (TYMS), proteína que pode ser induzida por hipóxia 2, associado a gotículas lipídicas induzido por hipóxia (HIG2), metalopeptidase de matriz 7 (MMP7), homólogo de prune 2 (PRUNE2), similar à proteína RecQ (Similar à DNA helicase Ql) (RECQL), receptor de leptina (LEPR), inibidor de feedback do receptor ERBB 1 (ERRFI1), proteína lisossomal transmembrana 4 alfa (LAPTM4A); RAB1B, família do oncogene RAS (RAB1B), CD24, timosina beta 4 de Homo sapiens, ligado aX (TMSB4X), proteína A6 de ligação ao cálcio S100 de Homo sapiens (S100A6), receptor de adenosina A2 de Homo sapiens (ADORA2B), quadro aberto de leitura 61 do cromossomo 16 (C16orf61), regulador de diferenciação 1 de ROD1 (ROD1), sirtuína desacetilase-2 dependente de NAD (SIR2L), tubulina alfa 1c (TUBA1C), fator inibidor 1 de ATPase (ATPIF1), antígeno de estroma 2 (STAG2) e caseína quinase nuclear e substrato 1 dependente de ciclina (NUCKS1).
[0012] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia é administrado
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7/124 em uma quantidade de aproximadamente IO7 a aproximadamente 1011 ufp, preferencialmente aproximadamente 108-1010 ufp, com maior preferência aproximadamente 109-1010 ufp. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado em uma quantidade de aproximadamente 2 mg/kg a 15 mg/kg.
[0013] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica é administrada a um mamífero para tratar e/ou prevenir câncer em um mamífero. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer do tipo tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em melanoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula renal, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, mesotelioma, câncer gastrointestinal, leucemia, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula não pequena), câncer de estômago, câncer de esôfago, mesotelioma, câncer colorretal, sarcoma ou câncer de tireoide. Em outras modalidades preferidas, a combinação farmacêutica é administrada a um mamífero para tratar uma metástase. Em algumas modalidades, o indivíduo tem carcinoma de célula renal.
[0014] Em modalidades preferidas, o mamífero que será tratado com a combinação farmacêutica é um indivíduo humano. Em um aspecto relacionado, o indivíduo que necessita de tratamento é um ser humano com um câncer que é refratário (ou resistente) ao tratamento com um ou mais agentes quimioterapêuticos e/ ou refratário ao tratamento com um ou mais anticorpos. Em modalidades especificas, o ser humano tem um câncer (por exemplo, câncer colorretal) que é refratário (ou resistente) a um tratamento que compreende um inibidor de ponto de verificação imunológico e opcionalmente também é refratário ao tratamento com um ou mais agentes quimioterapêuticos. Em outras modalidades, o ser humano que necessita de tratamento é um ser humano identificado como um candidato para terapia com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos.
[0015] Em algumas modalidades, o indivíduo não teve sucesso em
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8/124 pelo menos um tratamento de quimioterapia ou de imunoterapia prévio. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer que é refratário a uma terapia com inibidor de ponto de verificação imunológico, preferencialmente o câncer é resistente ao tratamento com anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-CTLA-4. Em algumas modalidades, o indivíduo é identificado como um candidato para uma terapia com inibidor de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao indivíduo de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia (agentes alquilantes, análogos de nucleosídeos, modificadores de citoesqueleto, agentes citostáticos) e radioterapia. Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao indivíduo de uma terapia com vírus oncolítico adicional (por exemplo, rhabdovírus, Semliki Forest Virus). Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, uma primeira, dose do vírus vaccinia oncolítico replicativo e uma primeira dose do inibidor de ponto de verificação imunológico são administradas simultaneamente ao indivíduo, seguidas por pelo menos uma administração simultânea consecutiva subsequente do vírus e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende pelo menos uma primeira, uma segunda e uma terceira administrações simultâneas consecutivas do vírus vaccinia oncolítico replicativo e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende pelo menos uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta administrações simultâneas consecutivas do vírus vaccinia oncolítico replicativo e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo. Em algumas modalidades, a administração simultânea da primeira dose do vírus vaccinia oncolítico replicativo e da primeira dose do inibidor de ponto de verificação imunológico e pelo menos uma administração simultânea consecutiva subsequente do vírus e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo são seguidas pela administração de pelo menos uma dose de inibidor de ponto de
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9/124 verificação imunológico individualmente ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende um intervalo de 1-3 semanas entre as administrações simultâneas consecutivas dos agentes, preferencialmente que compreende um intervalo de aproximadamente uma semana, aproximadamente duas semanas ou aproximadamente 3 semanas.
[0016] O presente pedido de patente demonstra que a administração intratumoral de vírus vaccinia oncolítico replicativo (i) atrai células imunológicas do hospedeiro (por exemplo, células T que se infiltram no tumor) no tumor e (ii) induz a expressão de várias proteínas de ponto de verificação, incluindo PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT, em células tumorais, sensibilizando assim as células tumorais para o tratamento concorrente com inibidores da(s) proteína(s) de ponto de verificação.
[0017] Assim, em alguns aspectos, o nível de expressão de uma ou mais destas proteínas de ponto de verificação é utilizado como um biomarcador para selecionar pacientes humanos com câncer para tratamento com a terapia de combinação descrita aqui com base em seu(s) nível(is) de expressão. Em algumas modalidades, a expressão pode ser medida utilizado qualquer ensaio para medida dos níveis de proteína. Em algumas modalidades, a expressão de proteína pode ser medida utilizando um ensaio tal como um ensaio de FACS ou Nanotring.
[0018] Em modalidades relacionadas, o ser humano que necessita de tratamento é um ser humano com um tumor que não expressa uma proteína de ponto de verificação (por exemplo, um indivíduo refratárío ao inibidor de ponto de verificação imunológico) ou expressa uma proteína de ponto de verificação em um nível relativamente baixo em cujo caso o componente do vírus vaccinia oncolítico da terapia de combinação é administrado em uma quantidade eficiente para sensibilizar o tumor ao inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação através da indução da expressão da proteína de ponto de verificação (por exemplo, PD-L1). Em algumas modalidades, o ser humano pode ter um tumor que
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10/124 não expressa PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3 e/ou TIGIT ou que expressa uma ou mais destas proteínas de ponto de verificação em um nível relativamente baixo e o vírus vaccinia oncolítico é administrado em uma quantidade eficiente para sensibilizar o tumor a um inibidor de PD1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3 e/ou TIGIT. Em outras modalidades relacionadas, o nível de uma proteína de ponto de verificação é medido em um tumor antes da administração da terapia de combinação com o vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação imunológico e a terapia de combinação é administrada a um indivíduo se for determinado que a proteína de ponto de verificação não é expressa ou é expressa em um nível relativamente baixo no tumor. Em outras modalidades relacionadas, é fornecido um método para sensibilização de um tumor a um inibidor de ponto de verificação imunológico que compreende a administração a um ser humano com um tumor de uma quantidade de um vírus vaccinia oncolítico eficiente para induzir a expressão da proteína de ponto de verificação no tumor e a administração de forma concorrente ao ser humano do inibidor de ponto de verificação imunológico. Em alguns aspectos, um tumor que não expressa uma proteína de ponto de verificação ou expressa uma proteína de ponto de verificação em um nível relativamente baixo significa que menos de 50%, menos de 25%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 1% ou menos de 0,5% das células tumorais adquirem coloração positiva para a proteína de ponto de verificação o que é avaliado pela ímunohistoquímica (IHC) de uma amostra de tumor. Ver, por exemplo, Ilie et al., Virchows Arch, 468(5):511-525 (2016). Em alguns aspectos, o ser humano tem câncer pulmonar de célula não pequena, câncer gástrico, carcinoma de célula renal, câncer pancreático ou câncer colorretal.
[0019] Ainda em outras modalidades relacionadas, o ser humano que necessita de tratamento é um ser humano com um tumor que é imunologicamente “frio”, através do qual significa que o tumor é essencialmente ou relativamente livre de células imunológicas no
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11/124 microambiente do tumor. O tratamento com. um. virus vaccinia oncolítico atrai células imunológicas (por exemplo, células T) para dentro do tumor e age em sinergia com inibidores de pontos de verificação imunológicos administrados de forma concorrente para tratar o tumor. Um tumor “frio” pode ser identificado através de métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, imunohistoquímica (IHC) de coloração única ou multiplex, para marcadores imunológicos tais como CD3 e CD8 no centro do tumor e na margem invasiva, citometria de fluxo para fenotipagem, análise genômica do tecido do tumor, obtenção do perfil de RNA do tecido do tumor e/ou obtenção do perfil de citocinas no soro. [0020] O vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação são administrados de forma concorrente (por exemplo, simultaneamente) e podem ser administrados como parte da mesma formulação ou em formulações diferentes. Por administração simultânea (ou concorrente), entende-se que uma primeira dose de cada um dos parceiros da combinação é administrada a ou aproximadamente ao mesmo tempo (dentro do período de 24 horas um do outro, preferencialmente dentro do período de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 horas ou dentro do período de 1 hora um do outro) e preferencialmente pelo menos uma dose subsequente de cada um dos parceiros da combinação é administrada a ou aproximadamente ao mesmo tempo. Assim, em um aspecto, a terapia de combinação que é descrita aqui compreende uma primeira dose do vírus vaccinia oncolítico replicativo administrada simultaneamente com uma primeira dose do inibidor de ponto de verificação imunológico (por exemplo, o tratamento de um indivíduo com a terapia de combinação implica pelo menos uma primeira administração na qual o vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação imunológico são administrados simultaneamente ao indivíduo) e preferencialmente compreende ainda pelo menos uma, duas, três, quatro ou mais administrações simultâneas consecutivas adicionais do vírus vaccinia oncolítico e do inibidor de ponto de verificação imunológico. Assim, um regime de tratamento concorrente com a
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12/124 combinação farmacêutica pode compreender pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou mais doses administradas simultaneamente consecutivas dos agentes. Em modalidades preferidas, o intervalo entre doses administradas simultaneamente consecutivas do vírus vaccinia oncolítico e do inibidor de ponto de verificação ímunológico varia de aproximadamente 1 dia a aproximadamente 3 semanas ou qualquer intervalo intermediário tal como 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias ou 21 dias. Em algumas modalidades preferidas, o intervalo entre doses administradas simultaneamente consecutivas do vírus vaccinia oncolítico e do inibidor de ponto de verificação ímunológico é de aproximadamente 1 semana ou aproximadamente 2 semanas. Após pelo menos uma dose administrada simultaneamente inicial do vírus oncolítico e do inibidor de ponto de verificação ímunológico, uma ou mais doses do inibidor de ponto de verificação ímunológico individualmente podem ser administradas ao indivíduo.
[0021] Ainda em outros aspectos, a presente invenção fornece uma embalagem comercial que compreende como agentes ativos uma combinação de um vírus vaccinia oncolítico que é descrito aqui e um inibidor de ponto de verificação ímunológico, junto com instruções para uso simultâneo no tratamento e/ou na prevenção de câncer como é descrito aqui. Em um aspecto preferido, a embalagem comercial compreende como agentes ativos uma combinação de um vírus vaccinia da cepa Western Reserve, Copenhagen, Wyeth ou Lister e um inibidor de PD-1, PD-L1, TIGIT ou CTLA4.
[0022] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo e (b) um inibidor da proteína de ponto de verificação ímunológico. Em
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13/124 algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intravenosa. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é fornecido apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o virus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor e (b) um inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é
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14/124 administrado IV. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de PD-1, PDLl, CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-L1. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é LAG3. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-1. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIM3. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer sólido. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer colorretal. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um carcinoma de célula renal.
[0023] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação dual, o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD-1 ou PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em BMS-936559, atezolizumab, durvalumab, avelumab, nivolumab, pembrolizumab e lambrolizumab.
[0024] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação dual, o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4 é selecionado do grupo que consiste em ipilimumab e tremelimumab.
[002S] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação dual, o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação
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15/124 imunológico em um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
[0026] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação dual, o método compreende uma etapa de medida do nível de expressão da proteína de ponto de verificação imunológico no tumor antes da administração da combinação.
[0027] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo, (b) um inibidor de PD-1 e/ou PD-L1 e (c) um inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intravenosa. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é fornecido apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica.
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Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor, (b) um inibidor de PD-1 e/ou PDL1 e (c) um inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico, em que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é LAG3. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIM3. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer sólido. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer colorretal. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um carcinoma de célula renal.
[0028] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação tripla, o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD1 ou PD-L1. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD-1 ou PD-L1 é selecionado do grupo que consiste em BMS-936559, atezolízumab, durvalumab, avelumab, nívolumab, pembrolizumab e lambrolizumab.
[0029] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação tripla, o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4. Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4 é selecionado do grupo que consiste em
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17/124 ipilimumab e tremelimumab.
[0030] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação tripla, o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
[0031] Em algumas modalidades do método de tratamento de combinação tripla, o método compreende uma etapa de medida do nível de expressão da proteína de ponto de verificação no tumor antes da administração da combinação.
[0032] Outras modalidades da invenção são discutidas ao longo de todo este pedido de patente. Qualquer modalidade discutida em relação a um aspecto da invenção também se aplica a outros aspectos da invenção e vice-versa. As modalidades na seção de Exemplos são entendidas como sendo modalidades da invenção que são aplicáveis a todos os aspectos da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0033] Os desenhos a seguir fazem parte do presente Relatório
Descritivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida com referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.
[0034] Fig. 1A-1C. Fig. IA: Gráfico que representa um regime de tratamento de combinação concorrente com injeção intratumoral (IT) de mJX-594 e anticorpo anti-PD-1 administrado de forma intraperitoneal inibidor de ponto de verificação imunológico. Camundongos BALB/c imunologicamente competentes de 8 semanas de idade receberam injeção de 5 χ 105 células Renca (câncer renal). Assim que o tamanho do tumor atingiu > 50 mm3, os camundongos foram tratados (Dia 0) com PBS (controle, dias 0, 3, 6 e 9), anticorpo anti-PD-1 individualmente (Dias 0,
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3, 6 e 9), mJX-594 individualmente (Dias 0, 2 e 4) ou anti-PD-1 e mJX594 fornecidos de forma concorrente (administração simultânea dos agentes nos Dias 0, 2 e 4 seguida pela administração de anti-PD-1 individualmente nos Dias 6 e mJX-594 foi administrado de forma intratumoral (IT) a lxlO7 ufp e anti-PD-1 a 10 mg/kg de forma intraperitoneal (IP). Fig. IB: Fêmeas de camundongos BALB/c de oito semanas de idade receberam injeção de células RENCA (células 2x 106) em 100 pL de PBS dentro da subcápsula do rim esquerdo. No dia 10 após a implantação, os camundongos carregando tumores Renca (50 mm3-100 mm3 que são visualizados com o sistema de obtenção de imagem in vivo 1VIS® Spectrum) foram tratados de forma intraperitoneal (i.p) com (i) PBS (controle) (ii) monoterapia com virus vaccinia (JX-929) (6x 107 UFP nos dias 10, lie 12 após a implantação para um total de 3 doses) (ill) monoterapia anti-PD 1 (BioXcell, West Lebanon, NH, 100 pL) (dias 10, 11 e 12 após a implantação para um total de 3 doses) ou (iv) tratamento concorrente com JX929 + anti-PDl (cada um administrado nos dias 10, 11 e 12 após a implantação, com JX-929 administrado de manhã e ICI na tarde do mesmo dia com um intervalo de 9 horas) de acordo com o regime mostrado. Fig. 1C: Camundongos Balb/c carregando tumores Renca que excedem 50 mm3 receberam a administração de quatro doses intratumorais de mJX594 (1 x 107 em cada um dos dias 0, 3, 6 e 9) ou controle com PBS de acordo com o regime de tratamento mostrado.
[003S] Figs. 2A-2B. Fig. 2A: Gráfico que representa os efeitos dos regimes de tratamento descritos na Figura IA sobre o volume do tumor. O tratamento de combinação concorrente (PDl+mJX594) suprimiu de forma significativa o crescimento do tumor (após o Dia 18 depois da implantação) comparado com todos os outros grupos de tratamento. Fig. 2B: fotografia e gráfico que representam o peso do tumor em cada grupo de tratamento descrito na Figura IA. O tratamento de combinação concorrente (PDl+mJX594) agiu em sinergia reduzindo notavelmente o volume do tumor em relação a qualquer monoterapia.
[0036] Figs. 3A-3B. O tratamento de combinação concorrente com
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19/124 mJX-594 e anti-PD-1 IT aumenta notavelmente a infiltração de células T intratumoral comparado com o controle e o tratamento individual com. um dos agentes. Os camundongos foram tratados de acordo com os regimes de administração representados na Figura 1. Figura 3A: Imagens que demonstram aumento notável na infiltração de células T CD8 tanto na região peritumoral quanto intratumoral no grupo de tratamento de combinação concorrente comparado com os grupos de controle e de monoterapia. Figura 3B: Gráficos que demonstram o aumento notável na infiltração de células T CD8 peritumoral e intratumoral no grupo de combinação concorrente comparado com o controle e qualquer monoterapia.
[0037] Figs. 4A-4B. O tratamento de combinação concorrente com mJX-594 e anti-PD-1 IT regula para mais da expressão de PD-L1 intratumoral. Os camundongos foram tratados de acordo com os regimes de administração representados na Figura 1. Figura 4A: Imagens que demonstram um aumento notável no nível de expressão de PD-L1 tanto na região periférica quanto na região central do tumor no grupo de tratamento de combinação concorrente comparado com o controle e qualquer monoterapia (coloração de PD-L1). Figura 4B: Imagens que demonstram um aumento notável na apoptose intratumoral no grupo de tratamento de combinação concorrente comparado com o grupo de controle e de qualquer monoterapia.
[0038] Figs. 5A-5B. Células T CD8 e células supressoras derivadas de linhagem mieloide CDllb+Grl+ (MDSCs) são aumentadas no grupo de terapia de combinação concorrente comparado com o controle. Fig. 5 A: gráficos de citometria de fluxo que mostram positividade para CD8 e Gr-1 nos tumores de cada grupo de tratamento, com um aumento significativo nas células T CD8+ demonstrado para tumores do grupo de combinação concorrente comparado com qualquer monoterapia. Um aumento nas MDSCs também é mostrado em relação a qualquer monoterapia. Fig. 5B: Gráficos de barra que representam os resultados da citometria de fluxo.
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[0039] Fig. 6. Gráfico que representa o regime de tratamento de combinação com injeção IT de mJX-594 e anticorpo inibidor de ponto de verificação Ímunológico anti-PD 1 (+/- anti-CTLA4) fornecido de forma intraperitoneal. 5 x 105 células RENCA foram injetadas de forma subcutânea no flanco direito de camundongos BALB/c de 8 semanas de idade. O tratamento foi iniciado (Dia 0) quanto o tamanho do tumor atingiu 50-100 mm3. No Dia 0, os camundongos (carregando tumores Renca) foram tratados com PBS (controle), combinação de mJX594+anti-PDl fornecida sequencialmente, combinação de mJX594+anti-PD-1 fornecida de forma concorrente e combinação trípia de mJX-594+anti-PD-l+anti-CTLA4 fornecida de forma concorrente. mJX594 foi administrado a 1x107 ufp IT, anti-PDl a 10 mg/kg IP e antiCTLA4 a 4 mg/kg IP.
[0040] Fig. 7. Gráfico que representa os efeitos dos regimes de tratamento descritos na Figura 6 sobre o volume do tumor. O tratamento de combinação concorrente com aPDl+mJX594 e aPDl+mJX594+oCTLA4 suprimiu de forma significativa o crescimento do tumor a partir do Dia 6 (após o tratamento) comparado com todos os outros grupos de tratamento e ambos os grupos de tratamento de combinação concorrentes retardaram notavelmente o crescimento do tumor comparados com o controle e o grupo de tratamento de combinação sequencial (mJX594-+aPDl), no qual a regressão do tumor foi observada a partir do 12° dia.
[0041] Fig. 8. Gráfico que representa o regime de tratamento de combinação com injeção IT de mJX-594 e anticorpo inibidor de ponto de verificação ímunológico anti-CTLA4 fornecido de forma intraperitoneal. 5 x 105 células RENCA foram injetadas de forma subcutânea no flanco direito de camundongos BALB/c de 8 semanas de idade. O tratamento foi iniciado (Dia 0) quando o tamanho do tumor atingiu 50-100 mm3. No Dia 0, os camundongos (carregando tumores Renca) foram tratados com PBS (controle), antí-CTLA4 individualmente, mJX-594 individualmente, combinação de mJX-594+CTLA4 fornecida sequencialmente e
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21/124 combinação de m.JX-594+CTLA4 fornecida de forma concorrente. mJX594 foi administrado a 1x107 ufp IT e o anti-CTLA4 a 4 mg/kg.
[0042] Fig. 9. Gráfico que representa os efeitos dos regimes de tratamento descritos na Figura 8 sobre o volume do tumor. O tratamento de combinação concorrente com mJX594+aCTLA4 retardou notavelmente o crescimento do tumor comparado com o tratamento de combinação sequencial com mJX594+aCTLA4 e qualquer monoterapia.
[0043] Figs. 10A-10B. A combinação concorrente de mJX594 e antiCTLA4 IT aumenta notavelmente a infiltração no tumor de células T CD8+ e reduz o nível de MDSC comparada com a combinação sequencial e qualquer monoterapia. Fig. 10A: gráficos de citometria de fluxo que mostram a positividade para CD8 e Gr-1 nos tumores de cada grupo de tratamento, com um aumento significativo nas células T CD8+ e uma redução significativa nas MDSCs demonstrados para tumores do grupo de combinação concorrente comparado com o grupo de tratamento sequencial e qualquer monoterapia. Fig. 10B: Gráficos de barra que representam os resultados de citometria de íluxo.
[0044] Fig. 11. Gráfico que representa o regime de tratamento de combinação com injeção intravenosa (IV) de mJX-594 e anticorpo inibidor de ponto de verificação imunológico anti-PDl fornecido de forma intraperitoneal. 5 x 105 células RENCA foram injetadas de forma subcutânea no flanco direito de camundongos BALB/c de 8 semanas de idade. O tratamento foi iniciado (Dia 0) quando o tamanho do tumor atingiu 50-100 mm3. No Dia 0, os camundongos (carregando tumores Renca) foram tratados com PBS (controle), anti-PDl individualmente, mJX-594 individualmente ou mJX-594+anti-PDl fornecido de forma concorrente. mJX-594 foi administrado a 2 x 107 ufp IV, anti-PDl a 10 mg/kg IP.
[004S] Fig. 12. Gráfico que representa os efeitos dos regimes de tratamento descritos na Figura 11 sobre o volume do tumor. O tratamento de combinação concorrente com mJX594 IV+ aPDl era inferior ao tratamento com mJX594 individualmente e não era melhor
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22/124 que o tratamento com aPDl individualmente.
[0046] Fig. 13. Um gráfico que demonstra as quantidades de alterações (em relação aos níveis pré-tratamento) das proteínas de pontos de verificação imunológicos nos camundongos carregando tumor Renca tratados de forma intratumoral com quatro doses a 1 x IO7 ufp de mJX594mJX594 (vírus vaccinia Wyeth engenheirado para conter uma interrupção do gene da timidina quinase viral e a inserção de GM-CSF de camundongo) administradas a cada três dias.
[0047] Fig. 14. Fornece dados em relação ao número de injeções de mJX594 e à inibição de crescimento do tumor. Para descobrir a imunoterapia ótima com mJX594, foram testados vários números de doses no câncer renal Renca. O crescimento do tumor foi reduzido dependendo do número crescente de doses de mJX594.
[0048] Fig. 15. Imagens que mostram o recrutamento intratumoral de células T CD8+ após o tratamento com mJX594.
[0049] Fig. 16. Imagens que mostram o recrutamento intratumoral de células T CD8+ após o tratamento com mJX594. Nos tumores tratados com mJX594, foram observados agregados de células linfoides CD8+, que são similares aos folículos linfoides.
[0050] Fig. 17. Dados que mostram que mJX594 aumenta o número e a função efetora de células T CD8+ intratumorais. A proporção de células T CD8+ para células T reguladoras foi aumentada gradativamente após o tratamento com mJX594. A expressão de ICOS e granzyme B nas células T CD8+ foi aumentada após o tratamento com mJX594. Embora o número de célula T reguladora CD4+Foxp3+CD25+ bem como de células T CD8+ e CD4+ fosse expandido simultaneamente no compartimento de célula linfoide, a proporção de células T CD8+ efetoras para células T reguladoras foi mais aumentada comparada com o controle. Adicionalmente, a expressão de ICOS e granzyme B (GzB), que são marcadores coestimuladores e de ativação para as células T, foi aumentada nas células T CD8+.
[0051] Fig. 18. Dados que mostram que o tratamento com mJX594
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23/124 repolarizou as células mieloides (Ly6G-Ly6C+f, Ly6G+Ly6Cintj). mJX594 aumenta as células mieloides monociticas GDI lb+Ly6G-Ly6C+ e reduz as células mieloides granulociticas GDI lb+Ly6G+Ly6Cmt. Na análise dos subconjuntos do compartimento de células mieloides, os presentes inventores descobriram aumentos de células mieloides monociticas GDI lb+Ly6G-Ly6C+ e redução de células mieloides granulociticas com CD1 lb+Ly6G+Ly6Cint, indicando um aumento significativo da proporção de monociticas para glanulocíticas através da administração de mJX594.
[0052] Fig. 19. Dados que mostram um esquema para o tratamento com experimento de anticorpo de depleção. Para descobrir quais componentes do sistema imunológico eram responsáveis pela eficácia terapêutica após o tratamento com mJX594, foi verificado efeito da depleção em relação à célula T CD8+, à célula T CD4+ e GM-CSF no crescimento do tumor e na imunidade anticâncer.
[0053] Fig. 20. Dados que mostram que a depleção de células T ou GM-CSF neutralizou significativamente o efeito anticâncer de mJX594. Ambas as células T CD8+ e CD4+ são mediadores indispensáveis no efeito anticâncer do tratamento com mJX594 e o GM-CSF também poderia fornecer benefício imunoterapêutico. Embora a inibição de tumor eficiente tenha sido detectada com a monoterapia com mJX594, a depleção de qualquer uma das células T CD8+ ou CD4+ resultou na anulação do efeito terapêutico.
[0054] Fig. 21. Dados que mostram que a depleção de células T CD4+ ou GM-CSF diminuiu a infiltração de células T CD8+ intratumoral após mJX594. A depleção de células T CD4+ reduziu as células T CD8+ intratumorais, sugerindo que as células T CD4+ estavam envolvidas na ativação das células T CD8+. A depleção de GM-CSF reduziu tanto as células T CD8+ quanto CD4+. A depleção das células T CD4+ com injeção de mJX594 reduziu as células T CD8+ intratumorais, sugerindo que as células T CD4+ estavam envolvidas na ativação das células T CD8+. Em contraste, a depleção das células T CD8+ não induziu alteração
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24/124 significativa das células T CD4+ indicando que as células T CD8+ não afetavam as células T CD4+. Estes dados mostraram que o tratamento com mJX594 induziam a preparação das células T CD8+ e CD4+ que são indicativas de imunidade anticâncer. A infiltração das células T CD8+ e CD4+ é indicativa de um. efeito anticâncer.
[0055] Fig. 22. Um esquema do experimento para a terapia de combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aCTLA-4. mJX594
[0056] Fig. 23. Dados que mostram que a combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aCTLA-4 retardou notavelmente o crescimento do tumor. De maneira notável, a combinação tripla de mJX594, oPD-1 e aCTLA-4, causou a regressão completa do tumor Renca em alguns camundongos (37,5%). Enquanto que a combinação dual de oPD-1 e aCTLA-4 retardou o crescimento do tumor em 14,5% e a monoterapia com mJX594 inibiu o crescimento do tumor em 36,9% comparado com o controle, a combinação tripla exibiu 76,5% de inibição do crescimento do tumor. De maneira notável, a combinação tripla de mJX594, oPD-1 e aCTLA-4, causou a regressão completa do tumor (taxa de resposta completa: 37,5%), que não foi observada nos tumores tratados com a combinação dual ou a monoterapia com mJX594.
[0057] Fig. 24. Dados que mostram que a imunoterapia de combinação tripla de mJX594, PD-1 e CTLA-4 prolonga a sobrevivência total. Os camundongos tratados com terapia de combinação tripla exibiram efeitos notáveis do tratamento anticâncer. Além disso, para confirmar se estes efeitos anticâncer potentes induzidos pela terapia de combinação tripla podería ser traduzido em benefício de sobrevivência em longo prazo, foi realizada uma análise de sobrevivência dos camundongos que carregam tumor. Os camundongos tratados com a terapia de combinação tripla exibiram benefício de sobrevivência comparados com aqueles com a monoterapia ou a imunoterapia de combinação dupla.
[0058] Fig. 25. Um esquema do experimento para a terapia de combinação tripla com mJX594, o.PD-1 e aLAG3.
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[0059] Fig. 26. Dados que mostram que a combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aLAG3 retardou moderadamente o crescimento do tumor. Neste experimento, a combinação tripla não mostrou uma diferença estatisticamente significativa comparada com a combinação dual de mJX594 e aPD-1. Enquanto a combinação dual de mJX594 e aPD-1 retardou o crescimento do tumor em 41,9% e a monoterapia com aLAG3 inibiu o crescimento do tumor em 5,7% comparadas com o, a combinação tripla exibiu 30,1% de inibição do crescimento do tumor.
[0060] Fig. 27. Dados que mostram que a combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aLAG3 aumentou as células T CD8+ e CD4+. A análise dos subconjuntos do compartimento de células linfoides revelou um aumento no número absoluto de células T CD8+ e CD4+ intratumorais com tratamentos de combinação dual e tripla.
[0061] Fig. 28. Um esquema do experimento para a terapia de combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aTIGIT.
[0062] Fig. 29. Dados que mostram que a combinação tripla de mJX594, aPD-1 e aTIGIT retardou moderadamente o crescimento do tumor. A combinação tripla não exibiu diferença significativa comparada com a combinação dual de mJX594 e aPD-1 no tumor Renca.
[0063] Fig. 30. Dados que mostram que a combinação tripla de mJX594, aPD-Ι e aTIGIT aumentou as células T CD8+ e CD4+. A análise dos subconjuntos do compartimento de células linfoides revelou um aumento no número absoluto de células T CD8+ e CD4+ Intratumorais com tratamentos de combinação dual e tripla.
[0064] Fig. 31. Dados que mostram que a mJX594 age em sinergia com o tratamento anti-PDl para retardar o crescimento do câncer de cólon. Para vencer a resistência à monoterapia com ICI, a eficácia da combinação de mJX594 e o bloqueio de pontos de verificação imunológicos no modelo de câncer de cólon CT26 foram avaliados. Neste modelo, a monoterapia com aPD-1 exibiu pouco efeito sobre o crescimento do tumor com a monoterapia com mJX594 inibindo moderadamente o crescimento do tumor. Entretanto, a combinação da
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26/124 terapia dual com mJX594 e anticorpo para aPD-1 impediu de forma notável o crescimento do tumor.
[0065] Fig. 32. Dados que mostram que a combinação de mJX594 e o tratamento anti-PDl aumentaram as células T CD8+ intratumorais. Junto com a inibição do crescimento do tumor, análises microscópicas mostraram o recrutamento notável de células T CD8+ tanto na região periférica quanto na central de tumores tratados com a terapia de combinação.
[0066] Fig. 33A-33G. mJX594 (JX) induz alterações dinâmicas de genes de relação imunológica no TME imunossupressor. Os tumores Renca foram implantados s.c. em camundongos BALB/c e foram tratados com uma única injeção i.t. de 1 x 107 ufp de mJX-594 quando os tumores atingiram > 50 mm3. (A) Imagens representativas de tumores Renca tratados com JX. Tumores corados com vírus vaccinia (W), CD31, CD8, CD 11c e PD-L1. (B) Quantificações de expressões de vírus vaccinia*, vasos sanguíneos CD31*, células T citotóxicas CD8*, células dendríticas CD 11c* e células PD-L1*. (C) Alterações temporais de W, CD8 e PD-L1 no microambiente do tumor após o tratamento com JX. (D) Imagens que mostram a expressão de PD-L1 com regulação aumentada (vermelho) em vários tipos de células (verde) dentro do TME após o tratamento com JX. Observar que a expressão de PD-L1 era principalmente observada nas células tumorais Pan-CK* (pontas de setas), mas algumas células mieloides CD 11b* (ponta de seta) também expressavam ocasionalmente PD-L1, enquanto que as células T CD3* não o faziam. (E) Mapa térmico da expressão de genes de relação imunológica NanoString. As cores vermelha e verde representam as regulações para mais e para menos, respectivamente. (F) Volcano plot, que mostra as expressões gênicas em tumores tratados com JX. São indicados os genes relacionados à estimulação imunológica. A linha vermelha indica p < 0,05. (G) Comparação da expressão de genes relacionados aos pontos de verificação imunológicos inibidores (ICs), ICs agonistas, resposta de Thl, resposta de Th2, TME e célula mieloide. A não ser que seja indicado o
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27/124 contrário, η ::: 5 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle. Barras de escala, 50 pm. Alguns dados também mostrados na Figura 13.
[0067] Fig. 34A-34M. JX suprime o crescimento do tumor com maior infiltração de células T e modulação de célula mieloide. Os camundongos carregando tumor Renca foram tratados i.t. com PBS ou 1 x 107 ufp de JX 1 a 3 vezes. (A-B) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX. Curva de crescimento do tumor médio (A) e individual (B) ao longo do tempo. (C-D) Imagens representativas (C) e comparações (D) de célula T CD8+ nas reigões periou intratumorais de tumores tratados com 1 a 3 vezes de JX. (E) Gráfico representativo de citometria de fluxo que mostra frações de células T CD8+ e CD4+ no tumor. (F) Números absolutos de células T CD8’ e CD4+ por grama de tumor, calculados partindo da citometria de íluxo. (G) Comparação de frações de CD45+, CD8+ e CD4+ nos tumores tratados com a administração tripla de JX. (H-J) Comparação de frações de CD4+Foxp3’CD25+ (Treg), proporção de CD8/Treg, CD8+ICOS+ e CD8+GzB+ no tumor. (K) Comparação de frações de células mieloides CDllb+Grl+ no tumor. (L) Gráfico representativo de citometria de íluxo que mostra frações de células mieloides CDllb+ no tumor. (M) Comparação de frações de células mieloides monocíticas Ly6G'Ly6C+, células mieloides granulocíticas Ly6G+Ly6Cint e proporção de monocítica/granulocítica sobre CDllb+ no tumor. A não ser que seja indicado o contrário, n = 5-6 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle: #p < 0,05 versus JXxl; $p < 0,05 versus JX x2. ns, não significativo. Barras de escala, 100 pm. Alguns dados também mostrados nas Figuras 19-21.
[0068] Fig. 35A-35E. Injeções intratumorais de JX induzem infiltração de linfócitos CD8+ tanto em tumores locais quanto distantes. Os camundongos foram injetados s.c. com Renca no flanco direito e com Renca ou tumor CT26 no flanco esquerdo. Setas indicaram tratamento com JX i.t. (A) Diagrama esquemático de implantação e tratamento do
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28/124 tumor e curvas de crescimento de tumor Renca injetado com JX e tumor Renca não injetado. (B-C) Imagens representativas (B) e comparações (C) de células T CD8+ (verde) nos tumores injetados com JX e não injetados. (D) Diagrama esquemático de implantação e tratamento e curva de crescimento do tumor Renca injetado com JX e do tumor CT26 não injetado. (E-F) Imagens representativas (E) e comparações (F) de células T CD8+ (verde) nos tumores injetados com JX e distantes. A não ser que seja indicado o contrário, n = 5 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle, ns, não significativo. Barras de escala, 50 pm.
[0069] Fig. 36A-36D. A imunidade antitumor desempenha um papel importante na eficácia terapêutica total de JX. Os camundongos foram implantados s.c. com Renca e tratados com JX i.t. ou anticorpos de depleção i.p. para células T CD8+, CD4+ ou GM-CSF de camundongo. (A) Esquema de tratamento. (B-C) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX ou anticorpos de depleção. Curva de crescimento do tumor médio (B) e individual (C) ao longo do tempo. *p < 0,05 versus o controle; $p < 0,05 versus aGM-CSF. (D-E) Números absolutos de células T CD8+ (D) e CD4+ (E) por grama de tumores tratados com JX e anticorpos de depleção de células imunológicas. A não ser que seja indicado o contrário, n = 7-8 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle; #p < 0,05 versus VX; $p < 0,05 versus aGM-CSF. ns, não significativo.
[0070] Fig. 37A-37E. A terapia de combinação de JX e aPD-1 induz de forma sinérgica a imunidade de tumor mediada por células T CD8+. Os camundongos carregando tumor Renca foram tratados com PBS, JX, anticorpo para aPD-1 ou JX mais anticorpo para aPD-1. (A-B) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX e/ou anticorpo para aPD-1. Curva de crescimento do tumor médio (A) e individual (B) ao longo do tempo. (C-D) Imagens representativas (C) e comparações (D) de células T CD8+, vasos sanguíneos CD31+, células apoptóticas com caspase3 (Casp3)+ ativada e células PD-L1+ no tumor
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29/124 tratado com JX e/ou anticorpo para aPD-1. (E) Diagrama que descreve a superação do TME imunossupressor através da terapia de combinação de JX e bloqueio de aPD-1. A não ser que seja indicado o contrário, n ::: 7 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle; #p < 0,05 versus JX; $p < 0,05 versus aPD-1. ns, não significativo. Barras de escala, 100 pm. Alguns dados também mostrados nas Figuras 19-21.
[0071] Fig. 38A-38F. A eficácia da imunoterapia de combinação com JX intratumoral e ICIs sistêmicos não é enormemente afetada pelo cronograma de tratamento. Os camundongos foram implantados s.c. com tumor Renca e tratados com JX mais ICIs em vários cronogramas. (A) Diagrama que descreve vários cronogramas de tratamento. Setas indicam tratamento com fornecimento i.t. de JX (setas vermelhas) ou fornecimento de bloqueio de pontos de verificação imunológicos (setas azuis). (B-C) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX e anticorpo para aPD-1 utilizando cronogramas diferentes. Curva de crescimento do tumor médio (B) e individual (C) ao longo do tempo. (D) Gráfico representativo de citometria de fluxo que mostra as frações de células T CD8+ e CD4+ que se infiltram no tumor. (E-F) Comparações dos números absolutos de células CD8+, CD4+, CD8+ICOS+ e CD8+GzB+ por grama de tumores. A não ser que seja indicado o contrário, n = 7 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle, ns, não significativo.
[0072] Fig. 39A-39E. A combinação tripla de JX, aPD-1 e aCTLA-4 anticorpos leva â regressão completa e à maior sobrevivência total. Os camundongos foram implantados s.c. com tumor Renca e tratados com JX na presença ou na ausência de bloqueio de pontos de verificação imunológicos para PD-1 e CTLA-4. (A-B) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX e/ou bloqueios de pontos de verificação imunológicos. Curva de crescimento do tumor médio (A) e individual (B) ao longo do tempo. (C) Gráfico em cascata que mostra as alterações percentuais máximas partindo da linha de base no tamanho
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30/124 do tumor. (D) Gráfico de Kaplan-Meier para sobrevivência total. (E) Comparação do tamanho do tumor novo desafio de células de tumor Renca em camundongos com regressão completa do tumor. A não ser que seja indicado o contrário, n ::: 8 para cada grupo. *p < 0,05 versus o controle; #p < 0,05 versus JX; $p < 0,05 versus aPD-l + aCTLA-4. ns, não significativo. Alguns dados também mostrados nas Figuras 23 e 24. [0073] Fig. 40A-40L. A terapia de combinação tripla retarda o crescimento do tumor e a metástase no modelo de câncer de mama espontâneo. O crescimento do tumor foi analisado semanalmente em tumores mamários espontâneos de camundongos MMTV-PyMT partindo de 9 semanas após o nascimento. As amostras foram coletadas 13 semanas após o nascimento. (A) Diagrama que descreve o cronograma de tratamento. As setas indicam tratamento com fornecimento i.t. de JX ou fornecimento de anticorpos para ctPD-1 e aCTLA-4. (B) Imagem representativa que mostra a aparência bruta dos tumores. Os círculos com linhas pontilhadas demarcam os nódulos palpáveis de tumores mamários. (C) Comparação da carga tumoral total. A carga tumoral foi calculada através da soma do volume de todos os nódulos de tumor por camundongo. (D) Comparação do número de nódulos palpáveis de tumores. (E) Comparação de volume de cada nódulo de tumor. Cada nódulo de tumor nos camundongos MMTV-PyMT foi representado graficamente na forma de pontos individuais. (F) Curvas de Kaplan-Meier para a sobrevivência total. (G) Seções de tumor com coloração com H&E mostrando as regiões intratumorais. As estruturas acinar de grupos JX e JX+P+C são lesões menos invasivas iniciais (Ea) que mostram o limite distintivo com o tecido adiposo mamário circundante (Adi). Considerando, as regiões de carcinoma dutal invasivo (Ca) de Cont e P+C que invadiram massivamente o tecido circundante e formaram placas sólidas de células tumorais sem estrutura acinar remanescente. Barras de escala, 200 pm. (H-J) Imagens representativas e comparações de células T CD8+ (H e I) e vasos sanguíneos de tumor CD31+ (H e J) no tumor. (K) Seções representativas de pulmão coradas corn H&E. As setas
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31/124 indicaram focos metastásicos. Barras de escala, 200 pm. (L) Comparação do número de colônias metastásicas por seção de pulmão. A não ser que seja indicado o contrário, n ::: 6-7 para cada grupo. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle; #p < 0,05 versus JX; $p < 0,05 versus aPD-l+ aCTLA-4. ns, não significativo. Barras de escala, 100 pm.
[0074] Fig. 41. O vírus vaccinia não é detectado em tumores distantes. Embora uma replicação robusta do vírus vaccinia (W) (verde) seja observada nos tumores injetados à direita, o vírus vaccinia não foi detectado nos tumores não injetados à esquerda. Barras de escala, 100 pm.
[007S] Fig. 42A-42H. A terapia de combinação de JX e ACTLA-4 induziu de forma sinérgica a imunidade de tumor mediada por células T CD8+. Os camundongos carregando tumores Renca foram tratados com PBS, JX, anticorpo para aCTLA-4 ou JX mais anticorpo para aCTLA-4. (A-B) Comparação do crescimento do tumor nos camundongos tratados com JX e/ou anticorpo para aCTLA-4. Curva de crescimento do tumor médio (A) e individual (B) ao longo do tempo. (C-E) Imagens e comparações de células T CD8+ (C e D) e vaso sanguíneo CD31+ (C e E) no tumor. (F-H) Números absolutos de células imunológicas CD45+ (F), células T CD8+ (G) e células CD4+ (H) por grama de tumores desafiados com JX e/ou anticorpo para aCTLA-4. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle; #p < 0,05 versus JX; $p < 0,05 versus aCTLA-
4. ns, não significativo. Barras de escala, 100 pm.
[0076] Fig. 43A-43E. JX potencializa a eficácia anticâncer com resposta imunológica de ACTLA-4 independentemente dos cronogramas de tratamento. (A-B) Comparação do crescimento do tumor em camundongos tratados com JX e anticorpo para aCTLA-4 utilizando esquemas com cronogramas diferentes. Curva de crescimento do tumor médio (A) e individual (B) ao longo do tempo. (C) Gráfico representativo de citometria de fluxo que mostra as frações de células T CD8+ e CD4+ que se infiltram no tumor. (D-E) Números absolutos de células CD8+, CD4+, CD8+ICOS+ e CD8+GzB+ por grama de tumores tratados com JX
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32/124 e anticorpo para uCTLA-4. Os valores são a média ± SEM. *p < 0,05 versus o controle, ns, não significativo. Alguns dados também mostrados na Figura 38.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0077] Os termos “inibição”, “redução” ou “prevenção” ou qualquer variação destes termos, quando utilizados nas Reivindicações e/ou no Relatório Descritivo incluem qualquer redução ou inibição completa mensurável para atingir um resultado desejado.
[0078] Como utilizado aqui, o termo “combinação” significa a administração combinada dos agentes anticâncer, a saber, o vírus vaccinia oncolítico e o Inibidor de ponto de verificação ímunológico, que pode ser dosada independentemente ou pelo uso de combinações fixas diferentes com quantidades distinguidas dos parceiros de combinação. O termo “combinação” também define um “kit” que compreende os parceiros de combinação que serão administrados simultaneamente. Preferencialmente, os intervalos de tempo entre as administrações simultâneas consecutivas dos parceiros de combinação são escolhidos de forma que a combinação de agentes exibe um efeito sinérgico. Como utilizado aqui, o termo “sinérgico(a)” ou “sinergia” significa que o efeito atingido com as combinações de agentes anticâncer abrangidos nesta Invenção é maior que a soma dos efeitos que resultam da utilização de agentes anticâncer, a saber, o vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação ímunológico como uma monoterapia. Vantajosamente, tal sinergia fornece maior eficácia nas mesmas doses e/ou previne ou retarda o desenvolvimento de resistência a vários fármaco s.
[0079] O termo “câncer refratârio”, como utilizado aqui se refere a câncer que falha em responder favoravelmente a um tratamento antineoplásico ou alternativamente, retorna ou reincide após responder
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33/124 favoravelmente a um tratamento antineoplásico. Consequentemente, “um câncer refratário a um tratamento” como utilizado aqui significa um câncer que falha em responder favoravelmente a ou é resistente ao tratamento ou alternativamente, retorna ou reincide após responder favoravelmente ao tratamento. Por exemplo, tal tratamento anterior pode ser um regime de quimioterapia ou pode ser um regime de imunoterapia que compreende a administração de um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a PD-1, PD-L1 ou CTLA4.
[0080] O uso da palavra “um” ou “uma” quando feito em associação com o termo “compreendendo” nas Reivindicações e/ou no Relatório Descritivo pode significar “um(a)”, mas também é coerente com o significado de “um(a) ou mais”, “pelo menos um(a)” e “um(a) ou mais de um(a)”.
[0081] É considerado que qualquer modalidade discutida aqui pode ser implementada em relação a qualquer método ou composição da invenção e vice-versa. Além disso, as composições e os kits da invenção podem ser utilizados para realizar os métodos da invenção.
[0082] Ao longo de todo este pedido de patente, o termo “aproximadamente” é utilizado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro para o dispositivo ou o método que será empregado para determinar o valor.
[0083] O uso do termo “ou” nas Reivindicações é feito para significar “e/ou” a não ser que seja explicitamente indicado o contrário como se referindo apenas a alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação sustente uma definição que se refere a alternativas apenas e “e/ou”.
[0084] Como utilizadas neste Relatório Descritivo e na(s) Reivindicação(ões), as palavras “compreender” (e qualquer forma de compreender, tal como “compreendem” e “compreende”), “ter” (e qualquer forma de ter, tal como “têm” e “tem”), “incluir” (e qualquer forma de incluindo, tal como “inclui” e “incluem”) ou “conter” (e qualquer forma de contendo, tal como “contém” e “contêm”) são inclusivas ou ilimitadas e
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34/124 não excluem elementos não citados ou etapas de métodos adicionais. [0085] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes partindo da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem as modalidades específicas da invenção, são fornecidos apenas com a finalidade de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e do âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na técnica partindo desta descrição detalhada.
[0086] Foi descoberto que a terapia de combinação com um vírus vaccinia oncolítico e um inibidor de ponto de verificação imunológico resulta no aprimoramento inesperado no tratamento de câncer. Quando os agentes são administrados de forma concorrente e o vírus vaccinia oncolítico é administrado, os agentes interagem cooperativamente e até mesmo de forma sinérgica para fornecer efeitos antitumorais significativamente aprimorados em relação a uma única administração de cada agente. Surpreendentemente, estes efeitos não são proeminentemente observados se os agentes forem administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intravenosa. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, quando o vírus oncolítico replicativo é fornecido apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, quando o vírus oncolítico replicativo é fornecido apenas através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico
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35/124 replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos, quando o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica.
[0087] Foi descoberto ainda que o vírus vaccinia oncolítico regula para mais a expressão de proteínas de ponto de verificação tais como PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, LAG3 e TIGIT em tumores humanos sensibilizando assim os tumores ao tratamento com inibidores de pontos de verificação imunológicos e apoiando a presente terapia de combinação não somente em pacientes com tumores que expressam um inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação, mas também em pacientes com tumores que não expressam um inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação ou que expressam níveis relativamente baixos de inibidor de ponto de verificação imunológico.
[0088] Em várias modalidades, é fornecida uma terapia de combinação para uso no tratamento e/ou na prevenção de câncer e/ou o estabelecimento de metástases em um mamífero (preferencialmente um ser humano) que compreende a administração concorrente ao mamífero de (i) um vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação e (ii) um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação é administrado de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação é administrado de forma intravenosa. Em algumas
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36/124 modalidades, o vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação é administrado apenas de forma intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação é administrado apenas de forma intra-arterial. Em algumas modalidades, a terapia de combinação fornece efeitos sinérgicos quando o vírus oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica.
II. VÍRUS VACCINIA ONCOLÍTICO
[0089] O vírus vaccinia é um vírus envelopado complexo grande que tem um genoma de DNA de filamento duplo linear de aproximadamente 190K pb e que codifica aproximadamente 250 genes. O vaccinia é bem conhecido por sua função como uma vacina que erradicou a varíola. Após a erradicação da varíola, os cientistas vêm explorando o uso do vaccinia como uma ferramenta de fornecimento de genes para tecidos biológicos (terapia genética e engenharia genética). O vírus vaccinia é único dentre os vírus de DNA uma vez que se replica apenas no citoplasma da célula hospedeira. Portanto, o genoma grande é requerido para codificar as várias enzimas e proteínas necessárias para a replicação do DNA viral. Durante a replicação, o vaccinia produz várias formas infecciosas que
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37/124 diferem em relação as suas membranas externas: o virion maduro intracelular (1MV), o virion envelopado intracelular (IEV), o virion envelopado associado à célula (CEV) e o virion envelopado extracelular (EEV). O IMV é a forma infecciosa mais abundante e acredita-se que seja responsável pela propagação entre os hospedeiros. Por outro lado, acredita-se que o CEV desempenha um papel na propagação célula-paracélula e acredita-se que EEV seja importante para a disseminação de longo alcance dentro do organismo hospedeiro.
[0090] Qualquer cepa oncolítica conhecida do vírus vaccinia pode ser administrada de forma concorrente com um inibidor de ponto de verificação imunológico acordo com os métodos descritos aqui. Em modalidades preferidas, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Copenhagen, Western Reserve, Lister ou Wyeth, com maior preferência uma cepa Western Reserve ou Wyeth. O genoma da cepa de vaccinia Western Reserve foi sequenciado (Número de acesso AY243312). Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Copenhagen. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Western Reserve. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Lister. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Wyeth.
[0091] O vírus vaccinia oncolítico replicativo pode ser engenheirado para não ter um ou mais genes funcionais com a finalidade de aumentar a seletividade do câncer do vírus. Em algumas modalidades preferidas, o vírus vaccinia oncolítico é engenheirado para não ter atividade da timídina quinase (TK). Um vírus vaccinia deficiente em relação à TK requer trifosfato de timídina para a síntese de DNA, que leva à replicação preferencial nas células em divisão (particularmente células cancerosas). Em outro aspecto, o vírus vaccinia oncolítico pode ser engenheirado para não ter o fator de crescimento do vírus vaccinia (VGF). Esta proteína secretada é produzida logo no início do processo de infecção, agindo como um mitógeno para preparar as células circundantes para infecção. Em outro aspecto, o vírus vaccinia oncolítico pode ser engenheirado para não
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38/124 ter tanto o VFG quanto a atividade de TK. Em. outros aspectos, o vírus vaccinia oncolítico pode ser engenheirado para não ter um ou mais genes envolvidos na evasão da resposta de interferon (IFN) do hospedeiro tais como E3L, K3L, B18R ou B8R. Em algumas modalidades preferidas, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Western Reserve, Copenhagen, Lister ou Wyeth e não tem um gene TK funcional. Em outras modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Western Reserve, Copenhagen, Lister ou Wyeth que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Western Reserve, Copenhagen, Lister ou Wyeth e não tem um gene TK funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Western Reserve e não tem um gene TK funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Copenhagen e não tem um gene TK funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Lister e não tem um gene TK funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Wyeth e não tem um gene TK funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Western Reserve, Copenhagen, Lister ou Wyeth que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Western Reserve que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Copenhagen que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Lister que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico é uma cepa Wyeth que não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Western Reserve, Copenhagen, Lister ou Wyeth e não tem um gene TK funcional bem como não tem um gene B18R e/ou B8R funcional. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende genes 14L e/ou F4L funcionais. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico
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39/124 replicativo não expressa uma quimiocina (por exemplo, o vírus vaccinia não expressa CXCL-11).
[0092] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação compreende genes 14L e/ou F4L funcionais.
[0093] Em outras modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação não expressa uma quimiocina (por exemplo, o vírus vaccinia não expressa CXCL-11).
[0094] Uma sequência heteróloga (por exemplo, que codifica uma citocina e/ou um antígeno de tumor) pode ser colocada sob o controle de um promotor de vírus vaccinia e integrada no genoma do vírus vaccinia. Alternativamente, a expressão da sequência heteróloga pode ser conseguida através da transfecção de um vetor shuttle (bifuncional) ou um plasmídeo tal como os encontrados na Tabela 1 de Current Techniques in Molecular Biology'·, (Ed. Ausubel, et al.) Unit 16.17.4 (1998) contendo a sequência controlada pelo promotor de vaccinia dentro de uma célula que foi infectada com o vírus vaccinia e da introdução da sequência heteróloga através de recombinação homóloga. Os promotores do virus vaccinia tardios fortes são preferidos quando são desejados níveis altos de expressão. Os promotores dos estágios inicial e intermediário também podem ser utilizados. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga está sob o controle de um promotor de vírus vaccinia contendo elementos promotores iniciais e tardios. Os promotores iniciais adequados incluem sem limitação, um promotor do gene do vírus vaccinia que codifica o polipeptídeo 42K, 19K ou 25K. Os promotores tardios iniciais adequados incluem, sem limitação, um promotor do gene do vírus vaccinia que codifica o polipeptídeo 7.5K. Os promotores tardios adequados incluem, sem limitação, um promotor do gene do vírus vaccinia que codifica o polipeptídeo 11K ou 28K. Em modalidades relacionadas, a sequência heteróloga é inserida em uma sequência de TK e/ou VGF para inativar a sequência de TK e/ou VGF.
[0095] Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados em combinação corn um ou
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40/124 mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados de forma intratumoral em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados de forma intravenosa (IV; ou de forma intravascular) em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados de forma intraperitoneal (IP) em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados de forma intra-arterial em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é fornecido apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. A administração intratumoral geralmente requer injeção dentro de uma massa tumoral ou dentro da vasculatura associada ao tumor. Em certos aspectos, são obtidas imagens do tumor antes ou durante a administração do virus. A administração intravascular geralmente requer injeção dentro do sistema vascular e é uma forma de administração sistêmica. A administração intraperitoneal geralmente requer injeção dentro do peritônio (por exemplo, cavidade corporal). Em algumas
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41/124 modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos e ambos são administrados de forma sistêmica, por exemplo, através de administração IV. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos, na qual o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos são administrados de forma sistêmica, por exemplo, através de administração IV. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos, na qual o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos são administrados de forma sistêmica, por exemplo, através de administração IV. Em algumas modalidades, os vírus vaccinia oncolíticos replicativos descritos aqui são administrados em combinação com um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos, na qual o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos são administrados de forma sistêmica, por exemplo, através de administração IV.
[0096] Os vírus vaccinia oncolíticos que são descritos aqui podem ser administrados em uma única administração ou em várias administrações (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais vezes). O vírus pode ser administrado na dosagem de 1 x 10s unidades formadoras de placas (UFP), 5 χ 105 UFP, 1 χ 105 UFP, pelo menos 1 χ 105 UFP, 5 x 10õ ou aproximadamente 5 χ 106 UFP, 1 χ 107, pelo menos 1 χ 107 UFP, 1 x
108 ou aproximadamente 1 x 10s UFP, pelo menos 1 χ 108 UFP, aproximadamente ou pelo menos 5 χ 108 UFP, 1 χ 109 ou pelo menos 1 x
109 UFP, 5 χ 109 ou pelo menos 5 χ 109 UFP, 1 x 1010 UFP ou pelo menos 1 x 1010 UFP, 5 x 1010 ou pelo menos 5 x 1010 UFP, 1 x 1011 ou pelo
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42/124 menos 1 x 10 n, 1 x 1012 ou pelo menos 1 x 10]·2, 1 x 1013 ou pelo menos 1 x 10i3. Por exemplo, o vírus pode ser administrado em uma dosagem entre aproximadamente 105-1013 ufp, entre aproximadamente 107-1013 ufp, entre aproximadamente 108-1013 ufp, entre aproximadamente 1091012 ufp, entre aproximadamente 108-1012ufp, entre aproximadamente
107- 1012 ufp, entre aproximadamente 106-10i2 ufp, entre aproximadamente 105-109 ufp, entre aproximadamente 106-108 ufp, entre aproximadamente 107-1010 ufp, entre aproximadamente 107-109 ufp, entre aproximadamente 108-1010 ufp ou entre aproximadamente
108- 109 ufp Preferencialmente, o vírus é administrado em uma dosagem de pelo menos 107 ufp, entre 107 e 1010 ufp, entre 107-109ufp, entre 107108ufp, entre 108-10i0ufp, entre 108-109ufp ou entre 109 e 1010ufp.
[0097] É considerado que uma dose única de vírus se refere à quantidade administrada a um indivíduo ou um tumor ao longo de um período de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 24 horas, incluindo todos os valores intermediários. A dose pode ser difundida ao longo do tempo ou através de injeção separada. Tipicamente, várias doses são administradas na mesma região alvo geral, tal como na proximidade de um tumor. Em certos aspectos, a dose viral é fornecida através de um equipamento de injeção que compreende uma seringa ou agulha de porta única ou várias portas em uma única agulha ou prongs múltiplos acoplados a uma seringa ou uma combinação dos mesmos. Uma única dose do virus vaccinia pode ser administrada ou as inúmeras doses podem ser administradas ao longo de um período de tratamento que pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais semanas. Por exemplo, o vírus vaccinia pode ser administrado em dias alternados, semanalmente, a cada duas semanas, a cada três semanas durante um período 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais meses.
[0098] O vírus vaccinia pode ser propagado utilizando os métodos descritos por Earl e Moss em Ausubel et al, 1994 ou os métodos descritos na Publicação WIPO No. WO2013/022764, dos quais todos são incorporados aqui corno referência.
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ΠΙ. INIBIDORES DE PONTOS DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICOS (ICIsj
[0099] As proteínas de pontos de verificação imunológicos interagem com ligantes específicos que enviam um sinal para as células T que inibe a função das células T. As células cancerosas exploram isso através da indução da expressão em altos níveis de proteínas de ponto de verifica.çã.o sobre a sua superfície suprimindo assim a resposta imunológica anticâncer.
[00100] Um inibidor de ponto de verificação imunológico (também referido como um ICI) para uso na combinação farmacêutica descrita aqui é qualquer composto capaz de inibir a função de uma proteína de ponto de verificação imunológico. A inibição inclui a redução da função bem como bloqueio total. Em particular, a proteína de ponto de verificação imunológico é uma proteína de ponto de verificação humana. Assim, o inibidor de ponto de verificação imunológico é preferencialmente um inibidor de um ponto de verificação imunológico humano.
[00101] As proteínas de ponto de verificação incluem, sem limitação, CTLA-4, PD-1 (e seus ligantes PD-L1 e PD-L2), B7-H3, B7-H4, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA, TIGIT e/ou IDO. As vias que envolvem LAG3, BTLA, B7-H3, B7-H4, TIM3 e KIR são reconhecidas na técnica como constituindo as vias de pontos de verificação imunológicos similares às vias dependentes de CTLA-4 e PD-1 (ver, por exemplo, Pardoll, 2012, Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011, Nature 480:480-489). Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4, PD-1 (e seus ligantes PD-L1 e PD-L2), B7-H3, B7-H4, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA, TIGIT e/ou IDO. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIGIT e/ou TI M3. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-L1.
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Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um. inibidor de CTLA-4. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de TIGIT. Em. algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de LAG3. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de TIM3.
[00102] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação é um anticorpo. O termo “anticorpo” como utilizado aqui abrange anticorpos que ocorrem naturalmente e engenheirados anticorpos bem como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos funcionais ou seus análogos que são capazes de se ligar, por exemplo, ao ponto de verificação imunológico ou ao epítopo alvo (por exemplo, mantendo a parte de ligação ao antígeno). O anticorpo para uso de acordo com os métodos descritos aqui pode ser de qualquer origem incluindo, sem limitação, humano, humanizado, de animal ou quimérico e pode ser de qualquer isotipo com uma preferência por um isotipo IgGl ou IgG4 e pode ainda ser glicosilado ou não glicosilado. O termo anticorpo incluí também anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos contanto que o(s) anticorpo(s) exiba(m) a especificidade de ligação descrita aqui.
[00103] Anticorpos humanizados referem-se a um anticorpo não humano (por exemplo, de camundongo, rato etc.) cuja sequência de proteína foi modificada para aumentar a similaridade com um anticorpo humano. Anticorpos quiméricos referem-se a anticorpos que compreendem um ou mais elementos de uma espécie e um ou mais elementos de outra espécie, por exemplo, um anticorpo não humano que compreende pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina humana.
[00104] Muitas formas de anticorpo podem ser engenheiradas para uso na combinação da invenção, cujos exemplos representativos incluem um fragmento Fab (fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI), um fragmento F(a.bj2 (fragmento bivalente que
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45/124 compreende dois fragmentos Fab ligados por pelo menos uma ponte dissulfeto na região de dobradiça), um fragmento Fd (que consiste nos domínios VH e CHI), um fragmento Fv (que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo), um fragmento dAb (que consiste num único fragmento de domínio variável (domínio VH ou VL), uma única cadeia Fv (scFvj que compreende os dois domínios de um fragmento Fv, VL e VH, que são fundidos um com o outro, eventualmente com um ligante para produzir uma cadeia única de proteína.
[00105] Em algumas modalidades, os inibidores de proteínas de pontos de verificação imunológicos (também referidos como ICIs) da terapia de combinação são anticorpos ou seus fragmentos que se ligam especificamente a uma proteína de ponto de verificação imunológico selecionada do grupo que consiste em: CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7H3, B7-H4, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, BTLA e TIGIT. Em modalidades particularmente preferidas, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal, um anticorpo totalmente humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que é capaz de antagonizar pelo menos parcialmente CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM3, LAG3 ou TIGIT. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a CTLA4. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a PD-L1. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a PD-L2. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo
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46/124 que se liga especificamente a B7-H3. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a B7-H4. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a TIM3. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a GAL9. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a LAG3. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a VISTA. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a KIR. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente a BTLA. Em algumas modalidades, o inibidor de proteína de ponto de verificação imunológico da terapia de combinação é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente aTIGIT.
[00106] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de CTLA-4, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) CTLA-4. A sequência de ácido nucleico completa do CTLA-4 humano pode ser encontrada sob o GenBank Accession No. LI 5006. Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a CTLA4 incluem, sem limitação, Ipilimumab (Yervoy®; BMS) e Tremelimumab (AstraZeneca/Medlmmune), bem como anticorpos divulgados nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 2005/0201994,
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2002/0039581 e 2002/086014, cujo conteúdo de cada uma é incorporado aqui como referência e anticorpos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.811.097, 5.855.887, 6.051.227, 6.984.720, 6.682.736, 6.207.156, 5.977.318, 6.682.736, 7.109.003, 7.132.281 e 8.491.895 cujo conteúdo de cada uma é incorporado aqui como referência ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos.
[00107] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de PD-1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-1. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos completas da PD-1 humana podem ser encontradas sob o GenBank Accession No. U64863 e NP_005009.2. Os anticorpos monoclonais contra PD-1 incluem, sem limitação, lambrolizumab (por exemplo, divulgado como hPDIOQA e seus derivados humanizados 11409A11, h409A16 e 11409A17 na Patente U.S. No. 8.354.509, incorporada aqui como referência), Nivolumab (Opdivo®; Bristol-Myers Squibb; code name BMS-936558) divulgado na Patente U.S. No. 8.008.449, incorporada aqui como referência, Pembrolizumab (Keytruda®) e Pidilizumab (CT-011; divulgado em Rosenblatt et al., Immunother. 34:409-418 (2011)) ou um anticorpo que compreende as regiões de cadeias pesada e leve destes anticorpos. Outros anticorpos anti-PD-1 são descritos, por exemplo, nas W02004/004771, W02004/056875, W02006/121168, W02008/156712, W02009/ 014708, W02009/114335, WO2013/043569 e WO2014/047350. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação farmacêutica ê uma proteína de fusão antiPD-1 tal como AMP-224 (composta do domínio extracelular de PD-L2 e a região Fc da IgG 1 humana).
[00108] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de PD-L1, preferencialmente um anticorpo
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48/124 monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-L1. Anticorpos monoclonais contra PD-LI incluem, sem limitação, pembrolizumab (MK3475, divulgado na W02009/114335)), BMS-936559 (MDX-1105), Atezolizumab (Genentech/Roche: MPD133280A) divulgado na Patente U.S. No. 8.217.149, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência, Durvalumab (AstraZeneca/Medlmmune; MEDI4736) divulgado na Patente U.S. No. 8.779.108, incorporada aqui como referência, MIH1 (Affymetrix que pode ser obtido via eBioscience (16.5983.82)) e Avelumab (MSB0010718C; Merck KGaA) ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico é uma proteína de fusão antí-PD-Ll tal como a proteína de fusão PD-L2-Fc conhecida como AMP-224 (divulgada em Mkritchyan M., et al., J. Immunol., 189:2338-47 (2010).
[00109] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de PD-L2 tal como MIH18 (descrito em Pfistershammer et al., Eur J Immunol. 36: 1104-1113 (2006).
[00110] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de LAG3 tal como LAG3 solúvel (IMP321 ou LAG3-Ig divulgado na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20110008331, incorporada aqui como referência e em Brignon et al., Clin. Cancer Res. 15:6225-6231 (2009)), IMP701 ou outros anticorpos humanizados que bloqueiam LAG3 humano descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2010-0233183, incorporada aqui como referência, na Patente U.S. No. 5.773.578, incorporada aqui como referência ou BMS-986016 ou outros anticorpos totalmente humanos que bloqueiam LAG3 descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011-0150892, incorporada aqui como referência.
[00111] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister
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49/124 ou Copenhagen e um inibidor de BLTA tal como o anticorpo 4C7 divulgado na Patente U.S. No. 8.563.694, incorporada aqui como referência.
[00112] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de ponto de verificação imunológico B7H4 tal como um anticorpo que é divulgado na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2014/0294861, incorporada aqui como referência ou uma forma recombinante solúvel de B7H4, por exemplo, que ê divulgada na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20120177645, incorporada aqui como referência.
[00113] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de ponto de verificação imunológico B7-H3 tal como o anticorpo MGA271 divulgado como BRCA84D ou um derivado que é divulgado na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20120294796, incorporada aqui como referência.
[00114] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de ponto de verificação imunológico TIM3 tal como um anticorpo que ê divulgado na Patente U.S. No. 8.841.418, incorporada aqui como referência ou o anti-TIM3 humano que bloqueia o anticorpo F38-2E2 divulgado por Jones et al., J. Exp. Med., 205(12):2763-79 (2008).
[00115] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de ponto de verificação imunológico KIR tal como o anticorpo lirilumab (descrito em Romagne et al., Blood, 114(13):2667-2677 (2009)).
[00116] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de TIGIT. Os inibidores de pontos de
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50/124 verificação imunológicos TIGIT preferencialmente inibem a interação de TIGIT com. o receptor de poliovirus (CD 155) e Incluem, sem limitação, anticorpos direcionados para TIGIT humano, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. No. 9.499.596 (incorporada aqui como referência) e nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 20160355589, 20160176963 (incorporadas aqui como referência) e variantes do receptor de poliovirus tais como aqueles divulgados na Patente U.S. No. 9.327.014 (incorporada aqui como referência).
[00117] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de IDO. IDO é reconhecido como uma proteína de ponto de verificação imunológico sua expressão nas células tumorais contribui para a tolerância imunológica através do bloqueio das células T efetoras. Acredita-se que IDO contribua para a resistência a terapias anti-CLTA-4. Os inibidores de IDO para uso de acordo com os métodos descritos aqui incluem, sem limitação, miméticos de triptofano tais como D-1MT (isoforma D de 1-metil-DL-tríptofano (MT)), L-1MT (isoforma L de MT), MTH-Trp (metiltiohidantoin-dl-triptofano; supressor transcricional de IDO) e β-carbolinas, miméticos de indol tais como agentes à base de naftoquinona, S-alil-brassinina, S-benzil-brassinina, 5-Bromo-brassinina, bem como agentes à base de fenilimidazol, 4fenilimidazol, exiguamina A, epacadostat, ácido rosmarínico, norharmano e NSC401366. Os inibidores de IDO preferidos incluem INCB 024360 (epacadostat; l,2,5-Oxadíazol-3-carboximídamida, 4-((2((Aminossulfonil)amino)etil)amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidróxí-, (C(Z))-; Incyte), indoximod (NLG2101; D-1MT; NewLink Genetics), vacina com o peptídeo de IDO (Copenhagen University) e NLG919 (NewLink Genetics).
[00118] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen, um inibidor de PD-1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-1 e um inibidor de
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CTLA-4, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) CTLA-4. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos completas da PD-1 humana pode ser encontrada sob o GenBank Accession No. U64863 e NP_005009.2. Os anticorpos monoclonais contra PD-1 incluem, sem. limitação, lambrolizumab (por exemplo, divulgado como 11PD109A e seus derivados humanizados h409All, 11409A16 e h409A17 na Patente U.S. No. 8.354.509, incorporada aqui como referência), Nivolumab (Opdivo®; Bristol-Myers Squibb; code name BMS-936558) divulgado na Patente U.S. No. 8.008.449, incorporada aqui como referência, Pembrolizumab (Keytruda®) e Pidilizumab (CT-011; divulgado em Rosenblatt et al., Immunother. 34:409-418 (2011)) ou um anticorpo que compreende as regiões de cadeias pesada e leve destes anticorpos. Outros anticorpos anti-PD-1 são descritos, por exemplo, nas W02004/004771, W02004/056875, W02006/121168, W02008/156712, W02009/ 014708, W02009/114335, WO2013/043569 e WO2014/047350. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação ímunológico da combinação farmacêutica ê uma proteína de fusão antiPD-1 tal como AMP-224 (composta do domínio extracelular de PD-L2 e a região Fc da IgGl humana). A sequência de ácido nucleico de CTLA-4 humano completo pode ser encontrada sob o GenBank Accession No. LI 5006. Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a CTLA4 incluem, sem limitação, Ipilimumab (Yervoy®; BMS) e Tremelimumab (AstraZeneca/Medlmmune), bem como anticorpos divulgados nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 2005/0201994, 2002/0039581 e 2002/086014, cujo conteúdo de cada uma é incorporado aqui como referência e anticorpos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.811.097, 5.855.887, 6.051.227, 6.984.720, 6.682.736, 6.207.156, 5.977.318, 6.682.736, 7.109.003, 7.132.281 e 8.491.895 cujo conteúdo de cada uma ê incorporado aqui como referência ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos.
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[00119] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen, um inibidor de PD-L1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-L1 e um inibidor de CTLA-4, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) CTLA-4. Os anticorpos monoclonais contra PD-L1 incluem, sem limitação, pembrolizumab (MK-3475, divulgado na W02009/114335)), BMS-936559 (MDX-1105), Atezolizumab (Genentech/Roche; MPD133280A) divulgado na Patente U.S. No. 8.217.149, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência, Durvalumab (AstraZeneca/Medlmmune; MEDI4736) divulgado na Patente U.S. No. 8.779.108, incorporada aqui como referência, MIH1 (Affymetrix que pode ser obtido via eBioscience (16.5983.82)) e Avelumab (MSB0010718C; Merck KGaA) ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico é uma proteína de fusão anti-PD-Ll tal como a proteína de fusão PD-L2-Fc conhecida como AMP-224 (divulgada em Mkritchyan M., et al., J. Immunol., 189:2338-47 (2010). A sequência de ácido nucleico de CTLA-4 humano completo pode ser encontrada sob o GenBank Accession No. LI 5006. Os anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a CTLA4 incluem, sem limitação, Ipilimumab (Yervoy®; BMS) e Tremelimumab (AstraZeneca/Medlmmune), bem como anticorpos divulgados nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 2005/0201994, 2002/0039581 e 2002/086014, cujo conteúdo de cada uma é incorporado aqui como referência e anticorpos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.811.097, 5.855.887, 6.051.227, 6.984.720, 6.682.736, 6.207.156, 5.977.318, 6.682.736, 7.109.003, 7.132.281 e 8.491.895 cujo conteúdo de cada uma é incorporado aqui como referência ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos.
[00120] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica
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53/124 compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen, um inibidor de PD-1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-1 e um inibidor de LAG3 tal como LAG3 solúvel (IMP321 ou LAG3-Ig divulgado na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011-0008331, incorporada aqui como referência e em Brignon et al., Clin. Cancer Res. 15:6225-6231 (2009)), IMP701 ou outros anticorpos humanizados que bloqueiam LAG3 humana descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20100233183, incorporada aqui como referência, Patente U.S. No. 5.773.578, incorporada aqui como referência ou BMS-986016 ou outros anticorpos totalmente humanos que bloqueiam LAG3 descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011-0150892, incorporada aqui como referência. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos completas da PD-1 humana podem ser encontradas sob o GenBank Accession No. U64863 e NP 005009.2. Os anticorpos monoclonais contra PD-1 incluem, sem limitação, lambrolizumab (por exemplo, divulgado como hPD109A e seus derivados humanizados h409All, h409A16 e 11409A17 na Patente U.S. No. 8.354.509, incorporada aqui como referência), Nivolumab (Opdivo®; Bristol-Myers Squibb; code name BMS-936558) divulgado na Patente U.S. No. 8.008.449, incorporada aqui como referência, Pembrolizumab (Keytruda®) e Pidilizumab (CT-011; divulgado em Rosenblatt et al, Immunother. 34:409-418 (2011)) ou um anticorpo que compreende as regiões de cadeias pesada e leve destes anticorpos. Outros anticorpos anti-PD-1 são descritos, por exemplo, nas W02004/004771, W02004/ 056875, W02006/121168, W02008/156712,
W02009/014708, W02009/114335, WO2013/043569 e
WO2014/047350. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação farmacêutica é uma proteína de fusão anti-PD-1 tal como AMP-224 (composta do domínio extracelular de PD-L2 e a região Fc da IgGl humana).
[00121] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister
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54/124 ou Copenhagen, um inibidor de PD-L1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-L1 e um inibidor de LAG3 tal como LAG3 solúvel (IMP321 ou LAG3-Ig divulgado na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011-0008331, incorporada aqui como referência e em Brignon et al., Clin. Cancer Res. 15:6225-6231 (2009)), IMP701 ou outros anticorpos humanizados que bloqueiam a LAG3 humana descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2010-0233183, incorporada aqui como referência, Patente U.S. No. 5.773.578, incorporada aqui como referência ou BMS-986016 ou outros anticorpos totalmente humanos que bloqueiam LAG3 descritos na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011-0150892, incorporada aqui como referência. Os anticorpos monoclonais contra PD-L1 incluem, sem limitação, pembrolizumab (MK-3475, divulgado na W02009/114335)), BMS-936559 (MDX-1105), Atezolizumab (Genentech/Roche; MPD133280A) divulgado na Patente U.S. No. 8.217.149, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência, Durvalumab (AstraZeneca/Medlmmune; MEDI4736) divulgado na Patente U.S. No. 8.779.108, incorporada aqui como referência, MIH1 (Affymetrix que pode ser obtido via eBioscience (16.5983.82)) e Avelumab (MSB0010718C: Merck KGaA) ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico é uma proteína de fusão anti-PD-Ll tal como a proteína de fusão PD-L2-Fc conhecida como AMP-224 (divulgada em Mkritchyan M., et al., J. Immunol., 189:2338-47 (2010).
[00122] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de virus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen, um inibidor de PD-1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico ΤΊΜ3 tal como um anticorpo que é divulgado na Patente U.S. No. 8.841.418, incorporada aqui como referência ou o anti-TIM3 humano que bloqueia o anticorpo F38-2E2
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55/124 divulgado por Jones et al., J. Exp. Med., 205(12):2763-79 (2008). As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos completas da PD-1 humana podem ser encontradas sob o GenBank Accession No. U64863 e NP 005009.2. Os anticorpos monoclonais contra PD-1 incluem, sem limitação, lambrolizumab (por exemplo, divulgado como 11PD109A e seus derivados humanizados h409All, h409A16 e h409A17 na Patente U.S. No. 8,354,509, incorporada aqui como referência), Nivolumab (Opdivo®; Bristol-Myers Squibb; code name BMS-936558) divulgado na Patente U.S. No. 8.008.449, incorporada aqui como referência, Pembrolizumab (Keytruda®) e Pidilizumab (CT-011; divulgado em Rosenblatt et al., Immunother. 34:409-418 (2011)) ou um anticorpo que compreende as regiões de cadeias pesada e leve destes anticorpos. Outros anticorpos anti-PD-1 são descritos, por exemplo, nas W02004/004771, W02004/056875, W02006/121168, W02008/ 156712,
W02009/014708, W02009/114335, WO2013/043569 e
WO2014/047350. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação farmacêutica é uma proteína de fusão anti-PD-1 tal como AMP-224 (composta do domínio extracelular de PD-L2 e a região Fc da IgGl humana).
[00123] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen, um inibidor de PD-L1, preferencialmente um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a (e inibe) PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico TFM3 tal como um anticorpo que é divulgado na Patente U.S. No. 8.841.418, incorporada aqui como referência ou o anti-TIM3 humano que bloqueia o anticorpo F38-2E2 divulgado por Jones et al., J. Exp. Med., 205(12):2763-79 (2008). Os anticorpos monoclonais contra PD-L1 incluem, sem limitação, pembrolizumab (MK-3475, divulgado na W02009/114335)), BMS936559 (MDX-1105), Atezolizumab (Genentech/Roche; MPD133280A) divulgado na Patente U.S. No. 8.217.149, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência, Durvalumab (AstraZeneca/ Medlmmune;
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MEDI4736) divulgado na Patente U.S. No. 8.779.108, incorporada aqui como referência, MIH1 (Affymetrix que pode ser obtido via eBioscience (16.5983.82)) e Avelumab (MSB0010718C; Merck KGaA) ou um anticorpo que compreende as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de qualquer um destes anticorpos. Em uma modalidade relacionada, o inibidor de ponto de verificação imunológico é uma proteína de fusão anti-PD-Ll tal como a proteína de fusão PD-L2-Fc conhecida como AMP-224 (divulgada em Mkritchyan M., et al., J. Immunol., 189:2338-47 (2010).
[00124] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de TIGIT. Os inibidores de pontos de verificação imunológicos TIGIT preferencialmente inibem a interação de TIGIT com o receptor de poliovirus (CD 155) e incluem, sem limitação, anticorpos direcionados para TIGIT humano, tais como aqueles divulgados na Patente U.S. No. 9.499.596 (incorporada aqui como referência) e Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 20160355589, 20160176963 (incorporada aqui como referência) e variantes do receptor de poliovirus tais como aqueles divulgados na Patente U.S. No. 9.327.014 (incorporada aqui como referência).
[00125] Em algumas modalidades, a combinação farmacêutica compreende uma cepa de vírus vaccinia Western Reserve, Wyeth, Lister ou Copenhagen e um inibidor de IDO (Indolamina-pirrol 2,3-dioxigenase. Os inibidores de IDO incluem inibidores metabólicos que inibem preferencialmente as vias metabólicas e incluem, sem limitação, Norharmano, (ver, Chiarugi A, et. al, “Combined inhibition of indolamine 2,3-dioxygenase and nitric oxide synthase modulates neurotoxin release by interferon-gamma-activated macrophages”, Journal of Leukocyte Biology. 68 (2): 260-6. (2000)), ácido rosmarinico (ver, Lee HJ, et al, “Rosmarinic acid inhibits indolamine 2,3-dioxygenase expressão in murine células dendriticas”, Biochemical Pharmacology. 73 (9): 1412-21 (2007)), inibidores de COX-2 (ver, Cesario A, et al., “The interplay between indolamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) and cyclooxygenase (COX)-2 in
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57/124 chronic inflammation and cancer”, Current Medicinal Chemistry. 18 (15): 2263-71 (2011)), 1-metiltriptofano (Hou DY, et al., “Inhibition of indolamine 2,3 -dioxygenase in células dendriticas by stereoisomers of 1methyl-tryptophan correlates with antitumor responses”. Cancer Research. 67 (2): 792-801 (2007) e Chauhan N, et al., (April 2009). “Reassessment of the reaction mechanism in the heme dioxygenases”. Journal of the American Chemical Society. 131 (12): 4186-7 (2009)), incluindo, por exemplo, o racemer específico 1-metil-D-triptofano (conhecido como indoximod) (um candidato a teste clínico), Epacadostat (INCB24360), navoximod (GDC-0919) (ver, Jochems C, et al., “The IDO1 selective inhibitor epacadostat enhances célula dendrítica immunogenicity and lytic ability of tumor antigen-specific T cells”, Oncotarget. 7 (25): 37762-37772. (2016)) e ou BMS-986205. Em algumas modalidades, o inibidor de IDO é selecionado do grupo que consiste em Norharmano, ácido rosmarínico, inibidores de COX-2, 1-metiltriptofano, Indoximod, Epacadostat (INCB24360), navoximod (GDC-0919) e/ou BMS-986205.
[00126] Como o perito na técnica estará ciente, nomes alternativos e/ou equivalentes podem estar em uso para certos anticorpos mencionados acima. Tais nomes alternativos e/ou equivalentes são intercambiáveis no contexto da presente invenção.
[00127] Em alguns aspectos, a combinação farmacêutica descrita aqui inclui (i) mais de um inibidor de ponto de verificação imunológico e (ii) um vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em uma modalidade preferida, um inibidor de PD-1 e um inibidor de CTLA-4 são administrados de forma concorrente com o vírus vaccinia. Outros exemplos incluem, sem limitação, a administração concorrente de um inibidor de LAG3 e um inibidor de PD-1 com o vírus vaccinia ou a administração concorrente de um inibidor de LAG3 e um inibidor de PDLl. Outros exemplos incluem a administração concorrente de um inibidor de IDO e um inibidor de CTLA-4 e/ou um inibidor de PD-1. Em algumas modalidades, o inibidor de IDO é selecionado do grupo que
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58/124 consiste em Norharmano, ácido rosmarínico, inibidores de COX-2, 1metiltriptofano, Indoximod, Epacadostat (INCB24360), navoximod (GDC0919) e/ou BMS-986205.
IV· CITOCINAS
[00128] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica compreende uma sequência heteróloga que codifica uma citocina, em que a citocina é expressa pelo vírus.
[00129] Em algumas modalidades, é fornecido um vírus vaccinia oncolítico replicativo que é engenheirado para expressar uma citocina selecionada do grupo que consiste em fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-7 (IL-7), interleucina-12 (IL-12), interleucina-15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18), interleucina-21 (IL-21), interleucina-24 (IL-24), interferon-y (IFN-γ) e fator de necrose de tumor(i (TNF-a). Em modalidades particularmente preferidas, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma cepa Wyeth, Western Reserve, Copenhagen ou Lister. Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar GM-CSF. Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-2 (IL-2). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-4 (IL-4). Em algumas modalidades, urn vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-5 (IL-5). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-7 (IL-7). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-12 (IL-12). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-15 (IL-15). Em. algumas modalidades, um vírus vaccinia
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59/124 oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-18 (IL18). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-21 (IL-21). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar interleucina-24 (IL-24), interferon-γ (IFN-γ). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é engenheirado para expressar fator de necrose de tumor-α (TNF-a). Em algumas modalidades, um vírus vaccinia oncolítico replicativo é mJX594, que é engenheirado para expressar GM-CSF.
V. ANTÍGENOS DE TUMOR
[00130] Em várias modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um antígeno de tumor e opcionalmente uma citocina, em que o antígeno de tumor e opcionalmente a citocina são expressos em uma célula infectada com o vírus, preferencialmente uma célula de tumor. Os antígenos de tumor abrangem antígenos específicos para o tumor e antígenos associados ao tumor. O vírus vaccinia oncolítico competente em relação à replicação pode expressar o antígeno de tumor de comprimento completo ou um peptídeo imunogênico do mesmo. Em algumas modalidades, a citocina é expressa em uma célula infectada corn o vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um antígeno de tumor e uma citocina, em que o antígeno de tumor e a citocina são expressos em urna célula infectada com o vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de tumor.
[00131] Em algumas modalidades, os antígenos de tumor podem incluir, sem limitação, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, Nacetilglucosaminiltransferase-V, p-15, gplOO, MART-l/Melan A, TRP-1 (gp75), TRP-2, Tirosina.se, quinase dependente de ciclina 4, β-catenina,
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MUM-1, CDK4, HER-2/neu, E6 do papilomavírus humano, E7 do papilomavírus humano, CD20, antígeno carcinoembrionário (CEA), receptor do fator de crescimento epidérmico, MUC-1, caspase-8, CD5, mucina-1, Lewisx, CA-125, pl85HER2, 1L-2R, Fap-α, tenascina, antígenos associados a uma metaloproteinase, CAMPATH-1, RCC: Regulador de sinalização da proteína G 5 (RGS5), Surivina (BIRCS^inibidor baculoviral de apoptose que contém 5 repetições), Proteína de ligação ao fator de crescimento similar à insulina 3 (1GF-BP3), timidilato sintetase (TYMS), proteína que pode ser induzida por hipóxia 2 = associado a goticulas lipídicas induzido por hipóxia (HIG2), metalopeptidase de matriz 7 (MMP7), homólogo de prune 2 (PRUNE2), similar à proteína RecQ (Similar à DNA helicase Ql) (RECQL); receptor de leptina (LEPR); inibidor de feedback do receptor ERBB 1 (ERRFI1); proteína lisossomal transmembrana 4 alfa (LAPTM4A); RAB1B, família do oncogene RAS (RAB1B); CD24; timosina beta 4 de Homo sapiens, ligado a X (TMSB4X); proteína A6 de ligação ao cálcio S100 de Homo sapiens (S100A6); receptor de adenosina A2 de Homo sapiens (ADORA2B); quadro aberto de leitura 61 do cromossomo 16 (C16orf61); regulador de diferenciação 1 de ROD1 (ROD1); sírtuína desacetílase-2 dependente de NAD (SIR2L); tubulina alfa 1c (TUBA1C); fator inibidor 1 de ATPase (ATPIF1); antígeno de estroma 2 (STAG2); e caseína quinase nuclear e substrato 1 dependente de ciclina (NUCKS1). Em algumas modalidades, o antígeno é um listado na Patente U.S. No. 9.919.047, incorporada aqui como referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, o antígeno de tumor é um antígeno de tumor de carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o antígeno de tumor de carcinoma de célula renal é selecionado do grupo que consiste em regulador de sinalização da proteína G 5 (RGS5), Surivina (BIRC5=inibidor baculoviral de apoptose que contém 5 repetições), Proteína de ligação ao fator de crescimento similar à insulina 3 (IGF-BP3), timidilato sintetase (TYMS), proteína que pode ser induzida por hipóxia 2, associado a goticulas lipídicas induzido por hipóxia (HIG2), metalopeptidase de matriz 7 (MMP7), homólogo de
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61/124 prune 2 (PRUNE2), similar à proteína RecQ (Similar à DNA helicase QI) (RECQL), receptor de leptina (LEPR), inibidor de feedback do receptor ERBE? 1 (ERRFI1), proteína lisossomal transmembran a 4 alfa (LAPTM4A); RAB1B, familia do oncogene RAS (RAB1B), CD24, timosina beta 4 de Homo sapiens, ligado aX (TMSB4X), proteína A6 de ligação ao cálcio S100 de Homo sapiens (S100A6), receptor de adenosína A2 de Homo sapiens (ADORA2B), quadro aberto de leitura 61 do cromossomo 16 (C16orf61), regulador de diferenciação 1 de ROD1 (ROD1), sirtuina desacetilase-2 dependente de NAD (SIR2L), tubulina alfa 1c (TUBA1C), fator inibidor 1 de ATPase (ATPIF1), antígeno de estroma 2 (STAG2) e caseina quinase nuclear e substrato 1 dependente de ciclina (NUCKS1). Em algumas modalidades, os antígenos de tumor incluem, sem limitação, KS 1/4 antígeno de pan-carcinoma, antígeno de carcinoma de ovário (CA125), fosfato ácido prostátíco, antígeno específico para a próstata, antígeno p97 associado a melanoma, antígeno de melanoma gp75, antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de membrana específico para a próstata, CEA, antígeno de mucina epítelial polimórfica, antígeno de glóbulo de gordura do leite, antígenos associados a tumor colorretal (tais como: CEA, TAG-72, CO 17-Lã, GICA 19-9, CTA-1 e LEA), antígeno-38.13 de linfoma de Burkitt, CD 19, antígeno-CD20 de linfoma de B, CD33, antígenos específicos para melanoma (tais como gangliosídeo GD2, gangliosídeo GD3, gangliosídeo GM2, gangliosídeo GM3), tipo de antígeno de superfície celular de transplante específico para o tumor (TSTA) (tal como antígenos de tumor induzidos por vírus incluindo vírus de tumor de DNA com antígeno T e antígenos do Envelope de vírus de tumor de RNA), fetoproteína alfa de antígeno oncofetal tal como CEA do cólon, antígeno oncofetal de tumor de bexiga, antígeno de diferenciação (tal como antígeno de carcinoma pulmonar humano L6 e L20), antígenos de fibrossarcoma, antígeno Gp37 de célula T de leucemia, neoglicoproteína, esfingolipídeos, antígenos de câncer de mama (tais como EGFR (Receptor do fator de crescimento epidérmico), antígeno de HER2 (p!85HER2) e epítopo neu de HER2), mucina epítelial polimórfica
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62/124 (PEM), antígeno APO-1 maligno de linfócito humano, antígeno de diferenciação (tal como o antígeno I encontrado nos eritrócitos fetais, antígeno I de endoderma primário encontrado em eritrócitos de adultos, I(Ma) de embriões pré-implantação encontrado em adenocarcinomas gástricos, M18, M39 encontrada no epitélio de mama, SSEA-1 encontrado em célula mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, D156-22 encontrados em câncer colorretal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado em adenocarcinoma de cólon, F3 encontrado em adenocarcinoma de pulmão, AH6 encontrado em câncer gástrico, hapteno Y, Le>’ encontrado em células de carcinoma embrionário, TL5 (grupo sanguíneo A), receptor de EGF encontrado em células A431, série Ei (grupo sanguíneo B) encontrado em câncer pancreático, FC10.2 encontrado em células de carcinoma embrionário, antígeno de adenocarcinoma gástrico, 00-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado em Adenocarcinoma, NS-10 encontrado em adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49 encontrado no receptor de EGF de células A431, MH2 (grupo sanguíneo ALeb/Ler) encontrado em adenocarcinoma de cólon, 19.9 encontrado em câncer de cólon, mucinas de câncer gástrico, T5A7 encontrado em células mieloides, R24 encontrado em melanoma, 4.2, GD3, Dl.l, OFA-1, Gm2, OFA-2, Gd2 e Ml:22:25:8 encontrados em células de carcinoma embrionário e SSEA-3 e SSEA-4 encontrados em embriões no estágio de 4 a 8 células), peptídeo derivado do receptor de célula T de um Linfoma de célula T Cutâneo, proteína reativa C (CRP), antígeno de câncer-50 (CA-50), antígeno de câncer 15-3 (CA 15-3) associado ao câncer de mama, antígeno de câncer-19 (CA-19) e antígeno de cáncer-242 associado aos cânceres gastrointestinais, antígeno associado a carcinoma (CAA), cromogranina A, antígeno de mucina epítelial (MC5), antígeno específico para o epitélio humano (EIA), antígeno (a) de Lewis, antígeno de melanoma, antigenos associados a melanoma 100, 25 e 150, antígeno associado a carcinoma similar à mucina, proteína relacionada à resistência a vários fármacos (MRPmõ), proteína relacionada à resistência a vários fármacos (MRP41), proteína
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63/124 do oncogene Neu (C-erbB-2), enolase específica para o neurônio (NSE), glicoproteína P (produto do gene mdrl), antígeno relacionado à resistência a vários fármacos, pl70, antígeno relacionado à resistência a vários fármacos, antígeno específico para a próstata (PSA), CD56 e NCAM,
[00132] Em algumas modalidades, outros antígenos de tumor incluem, sem limitação, AIM2 (ausente em melanoma 2), BMI1 (oncogene de polycomb ring finger BMI1), COX-2 (ciclooxigenase-2), EGFRvIII (receptor do fator de crescimento epidérmico variante III), EZH2 (intensificador do homólogo de zeste 2), LI CAM (molécula de adesão celular LI humana), Livin, Livinp, MRP-3 (proteína de resistência a vários fármacos 3), Nestin, 0LIG2 (fator de transcrição de oligodendrócito), S0X2 (HMG-box 2 relacionado a SRY), ART1 (antígeno reconhecido por células T 1), ART4 (antígeno reconhecido por células T 4), SART1 (antígeno de carcinoma de célula escamosa reconhecido por células T 1), SART2, SART3, B-ciclina, Glil (homólogo do oncogene associado a glioma 1), Cav-1 (caveolina-1), catepsina B, CD74 (cluster de Diferenciação 74), E-caderina (adesão epitelial dependente de cálcio), EphA2/Eck (receptor de EPH A2/quinase epitelial) , Fra-1/Fosl 1 (antígeno relacionado afos 1), KÍ67 (antígeno associado à proliferação nuclear do anticorpo Ki67), Ku70/80 (subunidades de proteínas do heterodímero Ku humano), IL13Ra2 (subunidade alfa-2 do receptor de interleucina 13), NY-ESO-1 (carcinoma de célula escamosa do esôfago 1 New York), PROX1 (proteína de homeobox prospero 1), PSCA (antígeno de célula tronco da próstata), SOXIO (HMG-box 10 relacionado com SRY), SOX11, Survivina, UPAR (receptor do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase) e WT-1 (proteína do tumor de Wilms 1).
VL REGIMES DE TRATAMENTO E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[00133] O vírus vaccinia oncolítico replicativo e o inibidor de ponto de verificação imunológico da combinação farmacêutica são
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64/124 administrados simultaneamente, em que o vírus vaccinia oncolítico é fornecido através de administração intratumoral. A administração simultânea pode, por exemplo, ocorrer na forma de uma combinação fixa que compreende estes agentes ou através da administração simultânea de cada agente em formulações independentes. Em algumas modalidades, vírus vaccinia oncolítico replicativo e o inibidor de ponto de verificação imunológico PD-1 ou PD-L1 da combinação farmacêutica são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo e o inibidor de ponto de verificação imunológico CTLA-4 da combinação farmacêutica são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo e o inibidor de ponto de verificação imunológico TIGIT da combinação farmacêutica são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo, o inibidor de ponto de verificação imunológico PD-1 ou de PD-L1 e o inibidor de ponto de verificação imunológico CTLA-4 da combinação farmacêutica são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, vírus vaccinia oncolítico replicativo, o inibidor de ponto de verificação imunológico PD-1 ou de PD-L1 e o inibidor de ponto de verificação imunológico TIGIT da combinação farmacêutica são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral, intravenosa, intra-arterial e/ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intravenosa. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado apenas através de administração intratumoral. Em
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65/124 algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico ê administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um antígeno de tumor e opcionalmente uma cítocína, em que o antígeno de tumor e opcionalmente a citocina são expressos em uma célula infectada com o vírus, preferencialmente uma célula de tumor.
[00134] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo e (b) um inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TÍM3 e TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-L1. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é LAG3. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-1. Em
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66/124 algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é ΊΤΜ3. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um. câncer sólido. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer colorretal. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um. carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral, IV e/ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração IV. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um antígeno de tumor e opcionalmente uma citocina, em que o antígeno de tumor e opcionalmente a citocina são expressos em uma célula infectada
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67/124 com o vírus, preferencialmente uma célula de tumor.
[00135] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um tumor em um ser humano que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo, (b) um inibidor de PD-1 e/ou PD-L1 e (c) um inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é LAG3. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é TIGIT. Em algumas modalidades do método de tratamento, a proteína de ponto de verificação imunológico é T1M3. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer sólido. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um câncer colorretal. Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor é um carcinoma de célula renal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral, IV e/ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração IV. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus
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68/124 oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação imunológico ê administrado de forma sistêmica. Em. algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação imunológico ê administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um antígeno de tumor e opcionalmente uma citocina, em que o antígeno de tumor e opcionalmente a citocina são expressos em uma célula infectada com o vírus, preferencialmente uma célula de tumor.
[00136] Em algumas modalidades do método de tratamento, o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, um nível alto é indicado por um escore proporcional de tumor igual ou maior que 50%. Em algumas modalidades, um nível alto é indicado por um escore proporcional de tumor maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior que 90%, maior que 95%, aproximadamente 99% ou aproximadamente 100%). Em algumas modalidades, um nível alto para um tumor tratado previamente é indicado por um escore proporcional de tumor maior que 1%. Em algumas modalidades, um nível alto é indicado por células de tumor que expressam PD-L1 em quantidade igual ou maior que 50% (por exemplo, mais de 50% de células tumorais expressam PD-L1). Em algumas modalidades, um nível alto é indicado por células de tumor que expressam PD-L1 em quantidade maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior que 90%, maior que 95%, aproximadamente 99% ou aproximadamente 100%. Em algumas modalidades, um nível alto para um tumor tratado previamente é indicado por células de tumor que expressam PD-L1 em quantidade maior que 1%) (por exemplo, mais de
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1% das células tumorais, expressa PD-L1). Em algumas modalidades, qualquer teste de diagnóstico de PD-LI pode ser empregado para medir a expressão de PD-L1. Em algumas modalidades, quando o ponto de verificação PD-L1 é medido, o PD-L1 DaKo Companion Diagnostic Test é empregado para medir o nível de PD-L1.
[00137] Em algumas modalidades do método de tratamento, o método compreende uma etapa de medida do nível de expressão da proteína de ponto de verificação no tumor antes da administração da combinação.
[00138] A administração do vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação imunológico seguirá protocolos gerais para a administração de cada terapia particular, levando em consideração a toxicidade, se alguma, do tratamento. Ê esperado que os ciclos de tratamento sejam repetidos quando necessário. Também é considerado que várias terapias padronizadas, bem como intervenção cirúrgica, podem ser aplicadas em adição à terapia de combinação da invenção.
[00139] Os regimes de tratamento podem variar e dependem frequentemente do tipo de tumor, da localização do tumor, da progressão da doença e da saúde e da idade do paciente. Certos tipos de tumor necessitarão de tratamento mais agressivo, enquanto que ao mesmo tempo, certos pacientes não podem tolerar protocolos mais pesados.
[00140] Em certas modalidades, o tumor que será tratado pode, pelo menos inicialmente, não ser cirúrgico. O tratamento com uma terapia de combinação da invenção pode aumentar a possibilidade de cirurgia do tumor devido ao encolhimento nas margens ou através da eliminação de certos pedaços particularmente invasivos. Após o tratamento, a cirurgia pode ser possível. Tratamentos adicionais subsequentes à cirurgia servirão para eliminar a doença residual microscópica no local do tumor. [00141] A determinação de uma interação sinérgica entre um ou mais componentes, a faixa ótima para o efeito e as faixas de doses absolutas de cada componente para o efeito podem ser medidas definitivamente através da administração dos componentes ao longo de faixas de
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70/124 proporção p/p e doses diferentes aos pacientes que necessitam de tratamento. Para humanos, a complexidade e o custo da realização de estudos clínicos nos pacientes tornam impraticável o uso desta forma de teste como um modelo primário para sinergia. Entretanto, a observação da sinergia em uma espécie pode prever o efeito em outras espécies e há modelos com animais, que são descritos aqui, para medir um efeito sinérgico e os resultados destes estudos também podem ser utilizados para prever as faixas de doses eficientes e de proporção da concentração no plasma e as doses absolutas e as concentrações no plasma, necessárias em outras espécies através da aplicação de métodos farmacocinéticos/farmacodinâmicos. As correlações estabelecidas entre os modelos de tumor e os efeitos observados no ser humano sugerem que a sinergia nos animais pode, por exemplo, ser demonstrada em um modelo de tumor de xenoenxerto humano.
[00142] Em algumas modalidades, a combinação é utilizada para tratar e/ou prevenir câncer em um mamífero. Em algumas modalidades, o câncer inclui, mas não está limitado a um câncer de cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer do timo, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de útero, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de testículo, câncer retal, câncer de mama e câncer pancreático. Em algumas modalidades, o câncer selecionado do grupo que consiste em câncer do cérebro, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer do timo, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de útero, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de testículo, câncer retal, câncer de mama e câncer pancreático. Em uma modalidade preferida, a combinação é utilizada para tratar e/ou prevenir uma metástase. Em outras modalidades preferidas, a combinação é utilizada para tratar um câncer que inclui, mas não é limitado a carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, carcinoma de célula renal, câncer de bexiga, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula não pequena) , câncer de estômago,
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71/124 câncer de esôfago, sarcoma, mesotelioma, melanoma, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer cervical e de fígado. Em algumas modalidades, a combinação é utilizada para tratar um câncer selecionado do grupo que consiste em carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, carcinoma de célula renal, câncer de bexiga, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula não pequena), câncer de estômago, câncer de esôfago, sarcoma, mesotelioma, melanoma, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer cervical e de fígado. Em algumas modalidades, a combinação é utilizada para tratar câncer colorretal, particularmente câncer colorretal metastásico. Em algumas modalidades, o mamífero que será tratado é um ser humano. Em outro aspecto preferido, a combinação é utilizada para tratar um câncer que é resistente a um ou mais inibidores de pontos de verificação imunológicos (por exemplo, o câncer é resistente à imunoterapia com inibidores de PD-1, CTLA-4, LAG3 e/ou TIGIT). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer sólido ou um tumor sólido. [00143] Os métodos incluem a administração concorrente de quantidades terapeuticamente eficientes de um vírus vaccinia oncolítico replicativo e um inibidor de ponto de verificação imunológico. Uma quantidade terapeuticamente eficiente do vírus oncolítico é definida como a quantidade suficiente para induzir a oncólíse - o rompimento ou a Use de uma célula cancerosa. Preferencialmente, o vírus vaccinia oncolítico e o inibidor de ponto de verificação imunológico são administrados em quantidades sinergicamente eficientes. O termo incluí o retardo, a inibição ou a redução no crescimento ou no tamanho de um tumor e incluí a erradicação do tumor em certos casos. Em algumas modalidades, uma quantidade eficiente de vírus vaccinia oncolítico resulta na disseminação sistêmica do vírus terapêutico para os tumores, por exemplo, infecção de tumores não injetados. Em algumas modalidades, uma quantidade eficiente do vírus vaccinia oncolítico é uma quantidade suficiente para indução da oncólíse - o rompimento ou a lise de urna célula cancerosa.
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[00144] Em algumas modalidades, o tratamento e/ou a prevenção do câncer indica uma redução e/ou um decréscimo de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou aproximadamente 100% no tamanho e/ou na presença do tumor após o tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento e/ou a prevenção do câncer indica regressão completa do tumor após o tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento e/ou a prevenção do câncer indica complete a remissão do tumor após o tratamento. Em algumas modalidades, o câncer é refratário ou resistente a uma terapia com inibidor de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o câncer é refratário ou resistente ao tratamento com anticorpos anti-PD-1, anticorpos antiPD-11 e/ou anticorpos anti-CTLA-4. Em algumas modalidades, o câncer é resistente ao tratamento com anticorpos anti-PD-1. Em algumas modalidades, o câncer é resistente ao tratamento com anticorpos antiCTLA-4. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo e um inibidor de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIGIT e/ou TIM3. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncoíítico replicativo, um inibidor de PD-1 ou PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-1 ou PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto
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73/124 de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4, um. inibidor de LAG3, um inibidor de TIGIT ou um inibidor de ΤΙΜ3. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em. que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de LAG3. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de LAG3. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de TIGIT. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-L1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de TIGIT. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-1 e um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de ΤΙΜ3. Em algumas modalidades, o tratamento compreende a administração de um vírus vaccinia oncolítico replicativo, um inibidor de PD-L1 e um inibidor de ponto de
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74/124 verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de ΤΊΜ3.
[00145] Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral, IV e/ou intraperitoneal. Em. algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração IV. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado através de administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado apenas através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado apenas através de administração intratumoral.
[00146] O inibidor de ponto de verificação imunológico que é divulgado aqui pode ser administrado através de várias rotas incluindo, por exemplo, de forma oral ou parenteral, tal como de forma intravenosa, de forma intramuscular, subcutânea, intraorbital, intracapsular, intraperitoneal, intrarretal, intracisterna, intratumoral, intravasal, intradérmica ou pela absorção passiva ou facilitada através da pele utilizando, por exemplo, um adesivo dérmico ou iontoforese transdérmica, respectivamente. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma sistêmica. O inibidor de ponto de verificação imunológico também pode ser administrado no local de uma condição patológica, por exemplo, de forma intravenosa ou intra-arterial em um vaso sanguíneo que supre um tumor. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIGIT e/ou TI M3.
[00147] Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é
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75/124 administrado de forma intratumoral e o inibidor de ponto de verificação ímunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intravenosa e o inibidor de ponto de verificação ímunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intraperitoneal e o inibidor de ponto de verificação ímunológico é administrado de forma sistêmica. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico replicativo é administrado de forma intra-arterial e o inibidor de ponto de verificação ímunológico é administrado de forma sistêmica.
[00148] A quantidade total de um agente que será administrado na prática de um método da invenção pode ser administrada a um indivíduo na forma de uma dose única, na forma de um bolo ou por infusão ao longo de um período de tempo relativamente curto ou pode ser administrada utilizando um protocolo de tratamento fracionado, no qual várias doses são administradas ao longo de um período de tempo prolongando. Um perito na técnica estará ciente que a quantidade da composição para tratar uma condição patológica em um indivíduo depende de muitos fatores incluindo a idade e a saúde geral do indivíduo bem como a rota de administração e o número de tratamentos que será administrado. Em vista destes fatores, o perito na técnica ajustará a dose particular quando necessário. Em geral, a formulação da composição e as rotas e a frequência de administração são determinadas, inicialmente, utilizando testes clínicos de Fase I e Fase II.
[00149] Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação ímunológico é administrado em 0,01-0,05 mg/kg, 0,05-0,1 mg/kg, 0,ΙΟ,2 mg/kg, 0,2-0,3 mg/kg, 0,3-0,5 mg/kg, 0,5-0,7 mg/kg, 0,7-1 mg/kg, 1-2 mg/kg, 2-3 mg/kg, 3-4 mg/kg, 4-5 mg/kg, 5-6 mg/kg, 6-7 mg/kg, 7-8 mg/kg, 8-9 mg/kg, 9-10 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou qualquer combinação dessas doses. As dosagens adequadas do inibidor de ponto de verificação ímunológico variam de aproximadamente 0,5 mg/kg a 25 mg/kg, preferencialmente de aproximadamente 1 mg/kg a cerca de 20
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76/124 mg/kg, com maior preferência de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. Em certas modalidades o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado pelo menos uma vez por semana, pelo menos duas vezes por semana, pelo menos três vezes por semana, pelo menos uma vez a cada duas semanas ou pelo menos uma vez a cada mês ou vários meses. Em certas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado na forma de uma dose única, em duas doses, em três doses, em quatro doses, em cinco doses ou em 6 ou mais doses. Preferencialmente, o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado de forma intravenosa (por exemplo, através de infusão ou injeção intravenosa) ou intratumoral. Com a finalidade de exemplo não limitante, o ipilimumab é preferencialmente administrado através de infusão intravenosa a uma dose de 3 mg/kg a cada três semanas para um total de quatro doses. Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIGIT e/ou TIM3.
A. Agentes Terapêuticos Anticâncer Adicionais
[00ISO] Um ou mais agentes quimioterapêuticos adicionais podem ser administrados com a combinação da invenção, incluindo, sem limitação, 5-fluorouracil (FU), ácido folínico (FA) (ou leucovorina), metotrexato, capecitabina (Xeloda; um pró-fármaco oral de 5-FU), oxaliplatína (Eloxatin), bevacizumab (Avastin), cetuximab (Erbitux) e panitumumab (Vectibix), em qualquer combinação. Estes agentes podem ser administrados de acordo com protocolos de tratamento conhecidos. Geralmente, o agente quimioterapêutico adicional é administrado de forma intravenosa, com a exceção da capecitabina que é uma formulação oral.
[001S1] Em outros aspectos, os métodos da invenção compreendem ainda a administração de uma terapia para câncer adicional tal como radioterapia, terapia hormonal, cirurgia e combinações dos mesmos.
[00152] A radioterapia inclui, sem limitação, raios γ, raios X e/ou o fornecimento direto de radioisótopos para as células tumorais. Também
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77/124 são consideradas outras formas de fatores que danificam o DNA tais como micro-ondas e irradiação de UV. E mais provável que todos estes fatores produzam uma faixa ampla de danos no DNA, nos precursores do DNA, na replicação e no reparo do DNA e na montagem e na manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagem para os raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens ao longo de períodos de tempo prolongados (3 a 4 semanas), a doses individuais de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para os radioisótopos variam amplamente e dependem da meia-vida do isótopo, da intensidade e do tipo de radiação emitida e da captação pelas células neoplásicas.
[001S3] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, de diagnóstico ou de classificação, curativa e paliativa. A cirurgia curativa é um tratamento para câncer que pode ser utilizado em combinação com outras terapias, tais como o tratamento da presente invenção, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia genética e/ou terapias alternativas.
[001S4] A cirurgia curativa inclui uma resseção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removida, cortada e/ou destruída. A resseção do tumor refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Em adição à resseção do tumor, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia com laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia controlada microscopicamente (cirurgia de Mohs). Ê também considerado que a presente invenção pode ser utilizada em combinação com a remoção de cânceres superficiais, pré-cânceres ou quantidades incidentals de tecido normal.
[001S5] Após a excisão de parte ou de todas as células cancerosas, o tecido ou tumor, pode ser formado uma cavidade no corpo. O tratamento pode ser realizado por perfusão, injeção direta ou aplicação local na área de uma terapia anticãncer adicional terapia. Tal tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses.
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Estes tratamentos também podem ser de dosagens variadas.
[00156] Outra forma de terapia para uso em combinação com os presentes métodos inclui hipertermia, que é um procedimento no qual o tecido de um paciente é exposto a altas temperaturas (de até 106 F). Dispositivos de aquecimento externos ou internos podem estar envolvidos na aplicação de hipertermia local, regional ou no corpo todo. A hipertermia local envolve a aplicação de calor em uma área pequena, tal como um tumor. O calor pode ser gerado externamente com ondas de alta frequência direcionadas para um tumor oriundas de um dispositivo fora do corpo. O aquecimento interno pode envolver uma sonda esterilizada, incluindo fios elétricos finos aquecidos ou tubos ocos preenchidos de água quente, antenas de micro-ondas implantadas ou eletrodos de radiofrequência.
[00157] Um órgão ou um membro do paciente é aquecido para terapia regional, que é realizada utilizando dispositivos que produzem alta energia, tais como imãs. Alternativamente, parte do sangue do paciente pode ser removida e aquecida antes de sofrer perfusão em uma área que será aquecida internamente. O aquecimento do sangue total também pode ser implementado em casos em que o câncer se espalho por todo o corpo. Cobertores de água quente, cera quente, bobinas de indução e câmaras térmicas podem ser utilizados para esta finalidade.
[00158] A terapia hormonal também pode ser utilizada em combinação com a presente invenção ou em combinação com qualquer outra terapia para câncer descrita anteriormente. O uso de hormônios pode ser empregado no tratamento de certos cânceres tal como câncer de mama, próstata, ovário ou cervical para reduzir o nível ou bloquear os efeitos de certos hormônios tal como testosterona ou estrogênio.
B. Composições e Formulações
[00159] O vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é administrado para tratar câncer e/ou diretamente nas
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79/124 células tumorais e consequentemente, as composições farmacêuticas divulgadas aqui são formuladas para a rota de administração desejada (por exemplo, através de injeção intratumoral, administração de forma intravenosa, intra-arterial e/ou intraperitoneal). Em algumas modalidades, o virus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração através de rotas de administração intratumoral, intravenosa, intra- arterial e/ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração através de administração intratumoral. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração através de administração intravenosa. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração intra-arterial. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração através de administração intraperitoneal. Em algumas modalidades, o vírus vaccinia oncolítico replicativo da combinação farmacêutica é formulado para administração somente através de administração intratumoral.
[00160] A injeção intratumoral do vírus vaccinia oncolítico pode ocorrer através de seringa ou qualquer outro método utilizado para injeção de uma solução, contanto que uma construção de expressão possa passar através do calibre particular da agulha necessária para a injeção. Foi rescrito recentemente um novo sistema de injeção sem agulha (Patente U.S. 5.846.233, incorporada aqui como referência) que tem um bocal que define uma câmara de ampola para carregar a solução e um dispositivo de energia para impulsionar a solução para fora do bocal no local de fornecimento. Também foi descrito um sistema com seringa para uso na terapia genética que permite várias injeções de quantidades predeterminadas de uma solução precisamente em qualquer profundidade (Patente U.S. 5.846.225, incorporada aqui como referência).
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[00161] Soluções dos compostos ativos na forma de base livre ou sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados em água adequadamente misturadas com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos. As formas farmacêuticas adequadas para uso Injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (Patente U.S. 5.466.468, especificamente incorporada aqui como referência em sua totalidade). Em todos os casos a forma tem que estar estéril e tem que ser fluida até a extensão de que haja fácil seringabilidade. Esta tem que ser estável sob as condições de manufatura e armazenamento e tem que ser conservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares), misturas adequadas dos mesmos e/ou óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de particular requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida através do uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00162] Para injeção intratumoral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada, se necessário e
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81/124 o diluente liquido é primeiramente tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Nesta associação, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos pelos peritos na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCl isotônica e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (ver, por exemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo do estado de saúde do indivíduo que será tratado. A pessoa responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose apropriada para o indivíduo. Além disso, para administração a seres humanos, as preparações devem satisfazer os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza que são requeridos pelo FDA Office of Biologies Standards.
[00163] As soluções injetáveis estéreis são preparadas através da incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados anteriormente, quando necessário. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação dos vários ingredientes ativos estéreis em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e de secagem por congelamento que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional partindo de uma solução previamente esterilizada por filtração do mesmo.
[00164] As composições divulgadas aqui podem ser formuladas em uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com
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82/124 grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico e bases orgânicas tais como isopropil amina, trimetilamina, histidina, procaína e similares. Após a formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em quantidade tal que seja terapeuticamente eficiente. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármaco e similares.
[00165] Como utilizado aqui, “carreador” inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacteriano e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. O uso destes meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto no caso em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso é considerado nas composições terapêuticas. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00166] A expressão “farmaceuticamente aceitável” ou “farmacologicamente aceitável” refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou adversa similar quando administradas a um ser humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente ativo é bem conhecida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas na forma de preparações injetáveis, na forma de soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução nas mesmas ou suspensão nas mesmas, antes da injeção também podem ser preparadas.
EXEMPLOS
[00167] Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de
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83/124 ilustração de várias modalidades da invenção e não devem ser entendidos como limitantes da presente invenção de forma alguma. Um perito na técnica avaliará facilmente que a presente invenção é bem adaptada para a realização dos objetivos e para a obtenção das finalidades e das vantagens mencionadas, bem como aqueles objetivos, finalidades e vantagens Inerentes aqui. Os presentes exemplos, junto com os métodos descritos aqui são atualmente representativos das modalidades preferidas, são exemplos e não são pretendidos como limitações do âmbito da invenção. Alterações mostradas aqui e outros usos que são abrangidos dentro do espírito da invenção que é definido pelo âmbito das Reivindicações ocorrerão aos peritos na técnica.
EXEMPLO 1
[00168] A capacidade do tratamento de combinação com vírus vaccinia oncolítico e inibidor(es) de ponto(s) de verificação ímunológico(s) de regredir tumores no modelo de camundongo síngênico de carcinoma de célula renal metastásico (Renca) foi avaliada. O padrão de crescimento deste tumor imita acuradamente o do carcinoma de célula renal em adultos humanos, particularmente em relação à metástase espontânea para o pulmão e o fígado. Este modelo de Renca é hipervascular, resistente à imunoterapia anti-PD-1 e capaz de responder ao sistema imunológico. Uma vez que a infecção é independente do tecido de origem, este modelo de Renca é relevante para todos os cânceres.
Materiais e Métodos
[00169] Camundongos e Linhagens de Células Camundongos BALB/c machos livre de agentes patogênicos específicos foram alojados em gaiolas com topo de filtro com água e alimento fornecidos com um ciclo de 12 horas de dia e de noite invertido. Todos os camundongos foram anestesiados através da injeção intramuscular de uma combinação de anestésicos (80 mg/kg de cetamina e 12 mg/kg de xilazina) antes de
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84/124 serem sacrificados. A linhagem de células de carcinoma renal Renca e a linhagem de células de câncer de cólon CT26 foram obtidas na ATCC e cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e 1% dos antibióticos Penicilina-Estreptomicina a 37°C com. 5% de COs.
Amplificação do Vírus [00170] mJX594 é um vírus vaccinia Western Reserve engenheirado para conter uma interrupção do gene da timidina quinase viral e a inserção de GMCSF-GFP de camundongo (mGMSCF-GFP) sob o controle do promotor inicial tardio sintético. Um nível de confluência de 100% de células HeLaS3 foi infectado com mJX594 com multiplicidade de infecção (moi) = 1-3 e colocado em um íncubador de CO2 a 37°C durante 1,5 h seguida pela aplicação de DMEM contendo 2,5% de FBS e pela incubação durante 48 a 72 horas. As células foram coletadas por centrifugação e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 10 mM de Tris-CI, pH 9,0, homogeneizadas e um homogeneízador Bounce e centrifugadas. A pelota de células foi ressuspensa em 10 mM de Trís-Cl, pH 9,0, centrifugada e o sobrenadante foi combinado com o primeiro sobrenadante. O sobrenadante foi combinado corn o primeiro sobrenadante. O lisado submetido ao ultrassom foi colocado no topo de 36% de sacarose e centrifugado a 32.900 x g durante 80 min a 4°C. Então a pelota foi ressuspensa em 10 mM de Tris-CI, pH 9,0, armazenada abaixo de -60°C.
Inibidores ICI (também referidos aqui como inibidores de pontos de verificação imunológicos) [00171] Os anticorpos contra CTLA-4 e PD-1 foram obtidos na BioXcell. O anticorpo monoclonal 9D9 reage com CTLA-4 de camundongo. Isotipo: IgG2b de Camundongo. O anticorpo monoclonal J43 reage com PD-1 de camundongo. Isotipo: Armenian Hamster IgG.
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Modelo de Tumor e Cronograma de Tratamento [00172] Para gerar um modelo de tumor renal clinicamente relevante, suspensões de células tumorais Renca (câncer renal, singênicas) (5 x 105 células em 100 pL) foram injetadas de forma subcutânea no flanco dorsal direito de machos de camundongos Balb/c imunologicamente competentes de 8 a 10 semanas de idade. Quando o volume médio do tumor excedeu 50 mm3, os camundongos foram separados aleatoriamente e receberam os regimes de tratamento descritos abaixo.
[00173] O tamanho do tumor foi medido a cada 3 dias em todos os grupos com um. calibre digital. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula 0,5 X AXB2, em que A é o maior diâmetro de um tumor e B é seu diâmetro perpendicular. Indicado dias depois, os camundongos foram sacrificados com COs e os tecidos foram coletados para, análises adicionais.
Análises Histológicas [00174] Para estudos de imunofluorescência, as amostras foram fixadas em 1% de PFA, desidratadas em solução de sacarose a 20% durante toda a noite e incrustadas no meio de congelamento de tecido (Leica). Os blocos congelados foram cortados em seções de 50 pm. As amostras foram bloqueadas com soro de caprino (ou burro) a 5% em PBST (0,03% de Trition X-100 em PBS) e então incubados durante 3 h à temperatura ambiente (RT) com os seguintes anticorpos primários: antiGFP (coelho, Millipore), anti-CD31 (hamster, clone 2H8, Millipore), antiVEGFR2 (coelho, Cell Signaling), anti-CD8a (rato, BD pharmingen), antiCDllb (rato, BD pharmingen), anti-FoxP3 (rato, eBioscience), anticaspase3 (coelho, R&D systems), anti- Vaccinia (coelho, Abeam) e antiPD-1.1 (rato, eBioscience). Após várias lavagens, as amostras foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com os seguintes anticorpos secundários: anti-IgG de hamster conjugado com FITC, Cy3 ou Cy5 (Jackson ImmunoResearch), anti-IgG de coelho conjugado com
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FITC ou Cy3 (Jackson Immuno Research), anti-IgG de rato conjugado com. Cy3 (Jackson ImmunoResearch) ou anti-IgG de camundongo conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Os núcleos foram, corados com 4’,6-diamidino-2-fenilindoI (DAPI, Invitrogen). Então as amostras foram, montadas com meio de montagem fluorescente (DAKO) e as imagens imunofluorescentes foram obtidas utilizando um microscópio confocal Zeiss LSM880 (Carl Zeiss).
Análises Morfométricas [00175] A medida da densidade dos vasos sanguíneos, das células T CD8 ou da área apoptótica foi realizada com o software ImageJ (http://rsb.mfo.nih.gov/ij). CD31, CD8 ou área de caspase3+ por áreas aleatórias de 0,42 mm2 foi medida nas regiões peri- e intratumorais. Todas as medidas foram realizadas em pelo menos cinco campos diferentes por camundongo.
Citometria de fluxo
[00176] Os tecidos tumorais coletados foram cortados em pedaços e incubados em tampão de FACS (1% de FBS ern PBS) contendo colagenase D (Roche) e DNase I (Roche) a 37°C durante 1-2 horas em banho de água agitado. As células digeridas foram filtradas com urna tela de nylon de 40 pm para remover os grumos de células. RBC foi removida através da incubação da suspensão de células ern tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente. As células isoladas resultantes foram incubadas durante 30 minutos com os seguintes anticorpos em tampão de FACS: anti-CD45 de camundongo conjugado com PerCP-cy5.5 (rato, eBioscience), anti-CD3e de camundongo conjugado com APC (hamster, eBioscience), anti-CD4 de camundongo conjugado com FITC (rato, eBioscience), a.nti-CD8a. conjugado com PE (rato, eBioscience), antiCD 1. lb de camundongo conjugado com FITC (rato, eBioscience), a.nti-Grl de camundongo conjugado com. APC (rato, eBioscience) e anti-CDllc de
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87/124 camundongo conjugado com APC (hamster, eBioscience).
Análises Estatísticas [00177] Os valores são apresentados na forma da média ± desvio padrão. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de Student não pareado ou análise de variância com uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. A significância estatística foi ajustada em p<0,05.
Resultados
Efeitos Antitumor da Terapia de combinação com Vírus Vaccinia + anti-PD-1
[00178] Para a terapia de com binação com anti-PD-1 e mJX-594, 5 x 10s células tumorais Renca foram injetadas no flanco dorsal direito de camundongos BALB/c e o tratamento foi iniciado (Dia 0) quando o tamanho do tumor atingiu 50-100 mm3. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento: (i) Grupo de controle: o PBS foi injetado de forma intratumoral a cada três dias; (ii) grupo de monoterapia com mJX-594: 1 x 107 ufp de mJX-594 foram injetadas de forma intratumoral a cada 2 dias e total de 3 vezes nos dias 0, 2 e 4; (iii) grupo de monoterapia com anti-PD-1: 10 mg/kg de anticorpo foram injetados de forma intraperitoneal a cada 3 dias e total de 4 vezes nos dias 0, 3, 6 e 9; (iv) grupo de combinação de mJX-594 + anti-PD-1: mJX-594 e anti-PD-1 foram administrados de forma concorrente, com mJX-594 injetado de forma intratumoral e cada dois dias nos dias 0, 2 e 4 para um total de três injeções e anti-PD-1 administrado de forma intraperitoneal nos dias 0, 2, 4, 6 e 9 para um total de cinco injeções (ver a Figura 1 A).
[00179] A supressão do crescimento do tumor foi observada no grupo de monoterapia com mJX-594 e no grupo de combinação com mJX
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594/anti-PD-1 (“Grupo de combinação”) comparados com o controle (ver a Figura 2A). A supressão do crescimento do tumor era mais significativa no grupo de combinação (ver a Figura 2A, comparar “PDl +mJX594” com “mJX594” e “PD1”). A supressão do crescimento do tumor não foi observada no grupo de monoterapia com. anti-PD-1 (Figura 2A, comparar “PD1” com “Controle”). Foi mostrado que o peso do tumor era reduzido no grupo de monoterapia com mJX-594 (Ver a Figura 2B). Uma redução significativa no peso do tumor foi observada no grupo de combinação, que era substancialmente maior que a redução observada no grupo de monoterapia com mJX-594 (ver a Figura 2B). Assim, a administração concorrente de mJX-594 e anti-PD-1 resultou em uma redução notável no peso e no volume do tumor comparada com a monoterapia com cada um.
[00180] A infiltração de células T CD8 nas regiões tanto peritumoral quanto intratumoral foi aumentada na monoterapia com PD-1, na monoterapia com mJX-594 e nos grupos de combinação concorrentes. (Ver a Figura 3A). Embora a infiltração de células T CD8 fosse aumentada na região periférica ao invés de na região central no grupo de monoterapia com anti-PD-1, o grupo com mJX-594 exibiu um número mais alto de infiltração de células T tanto na região central quanto na periférica. (Ver a Figura 3B). O mJX-594 e o anticorpo anti-PD-1 administrados de forma concorrente aumentaram notavelmente a infiltração de células T intratumoral comparados com o controle e com a monoterapia com qualquer um dos agentes individualmente que é medida pela coloração de CD8+ peritumoral e intratumoral. (Ver a Figura 3B). Uma densidade vascular menor também foi observada nos grupos de tratamento comparados com o controle (Ver a Figura 3B).
[00181] O nível de expressão de PD-L1 tanto na região periférica quanto central do tumor foi aumentado na monoterapia com anti-PD-1, na monoterapia com mJX-594 e nos grupos de combinação concorrentes comparados com o controle. (Ver a Figura 4A). Enquanto o grupo de monoterapia corn anti-PD-1 exibiu maior nível de expressão de PD-L1 na
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89/124 região periférica ao invés de na região central, o grupo de monoterapia com mJX-594 exibiu um aumento similar no nível de expressão de PDL1 tanto na região periférica quanto na central (Ver a Figura 4A). A administração concorrente de JX-595 e anticorpo anti-PD-1 resultou em um aumento na expressão de PD-L1 intratumoral comparada com a monoterapia com qualquer um dos agentes individualmente (Ver a Figura 4A). Os tumores Renca são resistentes à imunoterapia com antiPDl. Um aumento na expressão de PD-L1 no tumor no grupo de tratamento de combinação concorrente reflete a sensibilização destes tumores à terapia com anti-PD-1 concomitante com a infiltração de células T CD8+ no tumor e é um indicador de eficácia de tratamento. Estes padrões sugerem que na linha de base, as células T são imunossuprimidas e incapazes de se infiltrar no microambiente do tumor. mJX-594 causa inflamação e vasodilatação, possibilitando que as células T exerçam seus efeitos antitumor. A administração concorrente de mJX-594 e anticorpo anti-PD-1 leva à ativação e à infiltração de células T nas regiões centrais do tumor.
[00182] Foi observado que a apoptose intratumoral era maior na monoterapia com PD-1, na monoterapia com mJX-594 e nos grupos de combinação concorrentes comparados com o controle que é medida através da coloração da caspase3 (Ver a Figura 4B). Um aumento notável na apoptose intratumoral foi confirmado no grupo de combinação concorrente comparado com qualquer um dos grupos de monoterapia (Ver a Figura 4B). Os efeitos an ti vasculares (mostrados na Figura 3B) combinados com a apoptose no grupo de combinação concorrente sugerem uma necrose de tumor significativa no grupo de combinação concorrente.
[00183] Uma alteração no microambiente imunológico após mJX-594 e anticorpo anti-PD-1 concorrentes foi observada comparada com o controle e a monoterapia com qualquer um dos agentes que é medida por CD4 e CD 11b. (Ver a Figura 5A). Com importância, a infiltração no tumor de células T CD8 era a mais alta no grupo de combinação concorrente. A
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90/124 clepleção de células CD8+ utilizando anticorpo anti-CD8 resultou na redução da inibição de crescimento do tumor confirmando a função destas células no efeito antitumor (dados não mostrados). As células supressoras derivadas de linhagem mieloide (MDSCs) foram aumentadas em mJX-594 e grupos de combinação concorrentes comparados com o controle. Tradicionalmente, as células CDllb+Grl+ têm sido simplesmente consideradas como células de supressão imunológica; entretanto, uma evidência recente demonstrou que estas células não podem ser definidas de forma tão simples (comparar o aumento relativo das MDSCs observado no grupo de combinação concorrente com aPDl com o aumento das MDSCs observado no grupo de combinação concorrente com aCTLA4 (Figs. 10A-10B).
[00184] O efeito da coadministração de mJX-594 e PD-1 ± CTLA4 sequencialmente versus concorrentemente sobre o crescimento do tumor foi avaliado. 5 x 105 células Renca (câncer renal, singênicas) foram injetadas de forma subcutânea no flanco direito de camundongos BALB/c imunologicamente competentes de 8 semanas de idade. O tratamento foi iniciado (Dia 0) quando o tamanho do tumor atingiu 50 mm3.
[00185] Os camundongos foram separados em quatro grupos de tratamento: (i) Grupo de controle: PBS foi injetado nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 15; (ii) grupo de combinação sequencial de mJX-594 + anti-PD-1: mJX594 foi injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9 e anti-PD-1 foi injetado de forma intraperitoneal nos dias 6, 9, 12 e 15 (ill) grupo de combinação concorrente com mJX-594 e anti-PD-1: mJX-594 e anti-PD1 foram administrados de forma concorrente, com mJX-594 injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9 e anti-PD-1 administrado de forma intraperitoneal nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 15; (iv) grupo de combinação concorrente tripla de mJX-594 + anti-PD-1 + anti-CTLA4: mJX-594 foi injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9; anti-PD-1 e CTLA4 foram injetados de forma intraperitoneal nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 15 (Ver a Figura 6).
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[00186] 0 crescimento do tumor foi suprimido nos grupos de administração sequencial e concorrente de mJX-594 + anti-PD-1 bem como no grupo de administração concorrente tripla de mJX-594 + antiPD-1 + anti-CTLA4 comparados com o controle (Ver a Figura 7). Surpreendentemente, a administração concorrente de mJX-594 e antiPD-1 resultou na supressão (retardo) mais significativa do crescimento do tumor que na administração sequencial destes agentes (Ver a Figura 7). Um retardo adicional do crescimento do tumor foi observado no grupo de administração concorrente tripla (“Combi (mJX-594+ aPDl + aCTLA4”). (Ver a Figura 7).
[00187] Quando o tamanho do tumor de cada camundongo foi comparado entre os grupos de tratamento, a regressão de tumor foi confirmada nos grupos de combinação comparados com o controle. Embora a regressão de tumor tenha sido observada a partir do dia 12 no grupo sequencial, os tumores tendiam a voltar a partir do dia 6 nos grupos de combinações concorrentes e concorrentes triplas.
[00188] Estes resultados sugerem de forma surpreendentemente que o regime de administração e potencialmente a rota de administração pode afetar significativamente os efeitos antitumor da terapia de combinação. Em particular, o vírus vaccinia age em sinergia com o inibidor de ponto de verificação imunológico (anti-PD-1, CTLA-4) induzindo uma reação imunológica antitumor forte se o vírus vaccinia e o inibidor de ponto de verificação imunológico forem administrados de forma concorrente. Em alguns casos, havia uma reação imunológica antitumor forte quando o vírus vaccinia foi administrado de forma intratumoral como parte da administração concorrente. Os efeitos antitumor sinérgicos observados na administração concorrente do vírus vaccinia e do inibidor de ponto de verificação imunológico são particularmente surpreendentes porque é conhecido na técnica que os inibidores de pontos de verificação imunológicos inibem a replicação de vírus oncolíticos tal como o vaccinia (Rojas et al., J. Immunol., 192 (1 Supplement): 142.3 (2014)).
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Virus Vaccinia + auti-CTLA4
[00189] 5 x 105 células Renca (câncer renal) foram injetadas de forma subcutânea no flanco direito de camundongos BALB/c imunologicamente competentes de 8 semanas. O tratamento foi iniciado (Dia 0) quando o tamanho do tumor atingiu 50-100 mm3.
[00190] Os camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento: (i) Grupo de controle: PBS foi injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 15; (ii) grupo de monoterapia com mJX-594: 1 x IO7 ufp de mJX-594 foram injetadas de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9; (iii) grupo de monoterapia com anti-CTLA4: 4 mg/kg de anticorpo foram injetados de forma intraperitoneal nos dias 0, 3, 6, 9, 12, 15; (iv) grupo de combinação sequencial de mJX-594 + anti-CTLA4: mJX-594 e anti-CTLA4 foram administrados sequencialmente, com mJX594 injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9 e anti-CTLA4 administrado de forma intraperitoneal nos dias 6, 9, 12 e 15; (v) grupo de combinação simultânea de mJX-594 e anti-CTLA4: mJX-594 e antiCTLA4 foram administrados sequencialmente, com mJX-594 injetado de forma intratumoral nos dias 0, 3, 6 e 9 e anti--CTLA4 injetado de forma intraperitoneal nos dias 0, 3, 6, 9, 12 e 15 (Ver a. Figura 8).
[00191] O tamanho dos tumores foi medido a. cada 3 dias em todos os grupos. Os camundongos foram, sacrificados quando a observação foi realizada (dia 16) com CO2 e o tumor foi retirado e submetido à análise de citometria de fluxo (linfócito que se infiltra em tumor CD4+ e CD8+ (TIL), Grl+/CDllb+ MDSC).
[00192] Foi confirmado que o crescimento do tumor foi suprimido em todos os grupos de tratamento comparados com o controle. (Ver a Figura 9). Foi observada uma supressão do crescimento do tumor significativamente maior nos grupos de tratamento de combinação, com a maior supressão do crescimento do tumor observada no grupo de administração concorrente (Ver a Figura 9).
[00193] Quando o tamanho do tumor de cada camundongo foi
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93/124 comparado entre os grupos de tratamento, a regressão de tumor foi confirmada nos grupos de combinação comparados com os grupos de monoterapia e de controle. Uma maior infiltração de células T foi observada em todos os grupos de tratamento comparados com o controle. (Ver a Figura 1OA). Embora o nível de MDSC tenha aumentado no grupo de monoterapia com mJX-594 comparado com o controle, nenhuma alteração significativa foi observada no grupo de tratamento de combinação sequencial e uma redução no nível de MDSC foi observada no grupo de tratamento de combinação concorrente (Ver a Figura 10B).
Administração concorrente de JX929 e inibidores de pontos de verificação imunológicos
[00194] Os efeitos antitumor foram testados no modelo de Renca em camundongos descrito anteriormente para JX929 administrado IT (6 x 107 ufp) de forma concorrente com inibidor de ponto de verificação imunológico PD-1 administrado de forma intraperitoneal. JX929 é uma cepa vírus vaccinia Western Reserve com interrupções nos genes TK e VGF virais (fenótipo TK-/VGF-) e não expressa GM-CSF.
Linhagens de Células [00195] As células RENCA de camundongo (ATCC) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina e foram mantidas a 37°C com 5% de CO2.
Estudos In Vivo [00196] Fêmeas de camundongos BALB/c de oito semanas de idade receberam injeção de células RENCA (2x 106 células) em 100 pL de PBS dentro da subcápsula do rim esquerdo. No dia 10 após a implantação, os camundongos carregando tumores Renca (50 mm3 100 mm3 que foram visualizados com o IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System) foram, tratados de forma intraperitoneal (i.p) com (i) PBS (controle) (ii)
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94/124 monoterapia com virus vaccinia (JX-929) (6x 107 UFP nos dias 10, 11 e 12 após a implantação para um total de 3 doses) (iii) monoterapia antiPD1 (BioXcell, West Lebanon, NH, 100 pL) (dias 10, He 12 após a implantação para um total de 3 doses) ou (iv) tratamento concorrente com JX929 + anti-PDl (cada um administrado nos dias 10, 11 e 12 após a implantação, com JX-929 administrado de manhã e ICI à tarde do mesmo dia com um intervalo de 9 horas) de acordo com o regime mostrado na
[00197] Os camundongos foram sacrificados 2 dias após ο tratamento final para análises histológicas e de citometria de íluxo adicionais.
Citometria de Fluxo
[00198] Amostras de sangue periférico foram coletadas e as células vermelhas do sangue foram lisadas com tampão de lise RBC. As células foram lavadas em PBS contendo 1% de FBS, então coradas corn anticorpos monoclonais anti-CD8 de camundongo, anti-CD4 de coelho, anti-CD3 de coelho (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído e então incubadas corn antianticorpos de coelho de caprino conjugados com FITC ou de camundongo de caprino conjugado corn APC (Santa Cruz Biotechnology). Para cada amostra, 10.000 células foram analisadas utilizando o equipamento FACS Calibur (BD bioscienc.es, CA, USA).
Análise Histológica [00199] Os camundongos foram submetidos à eutanásia e os órgãos vitais incluindo rins e pulmões carregando tumores foram, obtidos, fixados com 10% de formalina. neutra (BBC Biochemical, WA, USA). Os tecidos foram incrustados em parafina e seções (4 pm de espessura) foram coradas utilizando hematoxilina e eosina para análise histológica básica. Para, imunofluorescência e imunohistoquímica, as seções foram
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95/124 coradas através do método padronizado utilizando um anticorpo monoclonal de camundongo especifico para CD8 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Então as seções foram incubadas com antianticorpo de camundongo de caprino conjugado com FITC (Santa Cruz Biotechnology) para imunofluorescência ou com o kit Vectastain® Elite ABC-Peroxidase (Vector Laboratories, CA, USA) e visualizadas pelo Vector SG (Vector Laboratories) para imunohistoquímica. O peso e o volume dos tumores coletados de cada grupo de tratamento foram medidos e comparados.
Ensaio ELISpot
[00200] As células que secretam ΙΕΝγ foram avaliadas utilizando o kit ELISpot mouse IFNy (Mabtech, Cincinnati, OH) de acordo com o protocolo do fabricante. Os baços foram isolados e preparados na forma de suspensões de células isoladas. Os esplenócitos foram misturados corn células tumorais Renca ou esplenócitos de camundongos infectados corn vírus Vaccinia a uma proporção de 5:1, incubados durante 24 horas a 37°C. A intensidade dos spots específicos foi analisada utilizando o software ImageJ (ΝΤΉ).
Análise Estatística [00201] Todos os valores foram apresentados na forma da. média ± desvio padrão (SD). A análise estatística foi realizada utilizando Instai 3 (GraphPad Software, CA, USA). Várias comparações foram analisadas utilizando a análise de variância. de uma via (ANOVA) e um teste de comparação pareada post-hoc de Bonferroni.
Tratamento com. mJX594 induz a expressão de proteínas d.e ponto de verificação
[00202] Aos camundongos BALB/c carregando tumores Renca excedendo 50 mm3 foram administradas quatro doses intratumorais de
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96/124 mJX594 (1 x 107 em cada um dos dias 0, 3, 6 e 9) ou controle com PBS de acordo com o regime de tratamento mostrado na Figura 1C.
[00203] O nível de proteína de ponto de verificação imunológico nos tumores animais de controle e tratados com mJX594 foi medido no dia 0 (antes do tratamento) e no 12 após o sacrifício. A Figura 13 ilustra as quantidades de alterações nas proteínas de ponto de verificação após o tratamento nos camundongos tratados com mJX594 em relação aos camundongos de controle. Com mostrado na Figura 13, o tratamento com mJX594 induz a expressão das proteínas de pontos de verificação incluindo PD-1 (aumento de 4 vezes), PD-L1, PD-L2, CTLA4 (aumento de mais de 2 vezes), LAG3, TIM3 (aumento de mais de 3 vezes) e TIGIT (aumento de mais de 2 vezes). O tratamento com o vírus vaccinia oncolítico replicativo resulta em alterações dinâmicas no microambiente imunológico do tumor incluindo aumentos significativos nas proteínas de ponto de verificação PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3 e TIGIT, sensibilizando assim os tumores para o bloqueio de cada uma destas proteínas de ponto de verificação com seus respectivos inibidores de pontos de verificação imunológicos. Testes clínicos demonstraram que as células que se infiltram no tumor e a expressão de proteínas de ponto de verificação (por exemplo, PD-L1) são indicadores do potencial de tratamento com inibidores de pontos de verificação imunológicos (por exemplo, tratamento com anti-PD-Ll), sustentando a eficácia da terapia de combinação descrita aqui não somente em pacientes com tumores que expressam proteínas de ponto de verificação particulares, mas também em pacientes com tumores que expressam baixos níveis de (ou não expressam) proteínas de ponto de verificação particulares.
EXEMPLO 2
[00204] Remodelagem d© Microambiente d© Tumor pel© Viras Vaccinia Oncolítico Intratumoral Aumenta A Eficácia d© Bloqueio dos Pontos de Verificação Imunológicos
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SUMÁRIO
[00205] A imunoterapia para câncer é uma modalidade de tratamento potente e durável, mas seu benefício clínico ainda não é universal. Aqui, os presentes inventores empregaram mJX-594, um vírus vaccinia oncolítico (W) direcionado e armado com GM-CSF, como um parceiro de combinação para inibidores de pontos de verificação imunológicos (ICIs) em camundongos com. câncer renal implantado, câncer de cólon e aqueles com câncer de mama espontâneo. A injeção intratumoral de W induziu uma remodelagem profunda do microambiente do tumor, transformando o tumor de tumor não inflamado sem células T em inflamado com células T com maior número e maior função efetora de células T CD8+. Além disso, a terapia de combinação de W e ICIs era capaz de induzir a regressão de tumor com sobrevivência e feito antimetastásico aprimorados. As descobertas dos presentes inventores indicam que VV induz imunidade anticâncer robusta em combinação com ICIs, superando a resistência à imunoterapia.
INTRODUÇÃO
[00206] A imunoterapia para câncer com inibidores de pontos de verificação imunológicos (ICIs) direcionados para PD-1 ou CTLA-4 demonstrou uma eficácia terapêutica potente e durável e emergiu como uma nova arma na guerra contra o câncer (Hegde et al., 2016; Topalian et al., 2015; Wolchok e Chan, 2014). Entretanto, a eficácia clínica dos ICIs é limitada a tumores com microambiente do tumor inflamado com células T (TME) (Gajewski, 2015: Topalian et al., 2016). Em tumores pouco imunogênicos com alguns linfócitos que se infiltram, no tumor (TILs), o TME não tem a assinatura de interferon do tipo 1 e as quimiocinas para o recrutamento de células T (Gajewski et al., 2013). Além disso, as vasculaturas do tumor e os componentes do estroma podem impor uma barreira contra o tráfego intratumoral de T células e
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98/124 suas funções efetoras nas células tumorais (De Palma e Jain, 2017; Rivera e Bergers, 2015; Sharma et al., 2017). Portanto, intervenções terapêuticas adicionais são necessárias para que estes tumores inflamados sem. células T remodelem apropriadamente o TME para tornar estes tumores mais sensíveis aos tratamentos com ICI.
[00207] Os vírus oncolítícos (OVs) foram propostos como uma nova classe de terapia anticâncer e os OVs com estruturas e transgenes diferentes estão sendo atualmente avaliados nos testes clínicos (Bell, 2014; Lichty et al., 2014). Embora o sucesso dos OVs tenha sido inicialmente avaliado através de sua replicação rápida e maior capacidade oncolítica durante a última década, estes estão agora começando a ser reconhecidos como um agente ímunoterapêutico devido às respostas mais fortes e duráveis após a viroterapia oncolítica ter sido acoplada à indução bem sucedida de imunidade antitumor com maior efeito específico para o tumor e células T de memória (Bell, 2014; Chiocca e Rabkin, 2014; Thorne, 2014). Todavia, devido ao fato de que a eficácia terapêutica do OV era enormemente impedida pelo TME imunossupressor, a liberação dos “freios” do sistema imunológico é crítica para maximizar a eficácia imunoterapêutica dos OVs (Bell e Ilkow, 2017; Hou et al., 2016; Liu et al., 2017). Portanto, a combinação de OVs e ICIs é uma estratégia racional e atraente para superar a TME pouco imunogênica e imunossupressora.
[00208] JX-594 (pexastimogene devacirepvec, Pexa-vec) é um vírus vaccinia oncolítico (W) que é engenheirado para expressar um transgene de ativação imunológica, GM-CSF e tem o gene da timidina quinase viral interrompido (Kirn e Thorne, 2009). JX-594 exibiu atividade anticâncer impressionante com baixa toxicidade em estudos pré-clínicos e clínicos e se tornou uma das plataformas de OV mais factível e promissora no desenvolvimento clínico (Breitbach et al., 2011a; Gripe et al., 2015; Heo et al., 2013; Park et al., 2008). Além de sua atividade oncolítica e de interrupção vascular, é proposto que JX-594 exiba efeito de vacinação para câncer in situ porque este pode induzir uma resposta imunológica
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99/124 adaptativa contra antigenos de tumor para rompimento de tumor seletivo e liberação de antígeno de tumor adicional subsequente (Breitbach et al., 2011b; Breitbach et al., 2015a). Embora o JX-594 esteja sendo submetido agora ao teste clínico aleatório de fase III em carcinoma hepatocelular avançado (Abou-Alfa et al., 2016), muitos poucos estudos caracterizaram suas funções de modulação imunológica no TME primário bem como em lesões distantes após o tratamento com JX-594 (Kim et al., 2018). Além disso, a combinação ótima de JX-594 com agentes imunoterapêuticos tais como ICIs ainda não foi realizada e verificada. [00209] Aqui, os presentes inventores analisaram de forma abrangente a remodelagem dinâmica do TME com uma variante de JX594 de camundongo (mJX-594, WR.TK-mGM-CSF) e investigaram seu potencial imunoterapêutico de fornecer uma estratégia combinatória racional com ICIs em modelos de tumor pouco imunogênico.
RESULTADOS mJX-594 converte tumores não inflamados imunossupressores em tumores inflamados
[00210] Para determinar o potencial de imunomodulação do vírus oncolítico mJX-594, os presentes inventores examinaram, as alterações temporais do microambiente do tumor nos tumores Renca pouco imunogênicos após uma única injeção de mJX-594. O nível de mJX-594 já era alto no dia 1, teve seu máximo no dia 3 e era quase indetectável no dia 7 após a injeção (Figuras 33A e 33B). Em contraste, a vasculatura do tumor exibiu a resposta oposta para os níveis virais; a densidade vascular do tumor foi notavelmente reduzida entre o dia 1 e o dia 3, mas foi recuperada no dia 7 e, depois disso, após a injeção (Figuras 33A e 33B), indicando que mJX-594 induz uma interrupção vascular do tumor potente, mas transitória. Ê digno de nota que, a população de células Τ citotóxicas CD8+ dentro da área intratumoral, que compreende o aspecto mais crítico da imunidade anticâncer, começou a aumentar de maneira
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100/124 impressionante no dia 5, teve seu máximo no dia 7 e permaneceu em. uma alta densidade 2 semanas após a injeção (Figuras 33A e 33B), demonstrando claramente a conversão distinta e de longa duração do tumor não inflamado no tumor inflamado com células T pelo mJX-594. Em comparação, as células dendríticas CD lie* (DCs) emergiram, de forma transitória no dia 3 e diminuíram depois disso (Figuras 33A e 33B). O nível de expressão de PD-L1 era mínimo no dia 0 e era regulado para mais após o tratamento com mJX-594 (Figuras IA e 1B). De maneira intrigante, o momento da regulação para mais de PD-L1 ocorre imediatamente após o influxo massivo de TILs CD8* (Figura 1C), indicando a ativação da via de feedback negativo que tenta suprimir a imunidade mediada por células T. A maioria das células que expressam PD-L1 era de células tumorais citoqueratina* e algumas células mieloides CD 11b* também expressam PD-L1, enquanto que as células T não o fazem (Figura 1D). Assim, mJX-594 é um intensificador da imunidade anticâncer potente e durável através do recrutamento de célula T CD8* citotóxica para dentro dos tumores frios bem como um indutor de interrupção transitória da vasculatura do tumor.
[00211] Para elucidar as vias imunológicas do câncer moduladas por mJX-594, os presentes inventores analisaram de forma abrangente as alterações nos níveis de expressão de 750 genes de relação imunológica após a monoterapia com mJX-594 utilizando um painel PanCancer Immune Profiling. Os resultados mostraram diferenças proeminentes nas assinaturas imunológicas relacionadas aos genes entre os tumores de controle e os tratados com mJX-594 (Figura 33E). Aproximadamente 100 genes imunomoduladores exibiram alterações estatisticamente significativas em seus níveis de expressão, incluindo aqueles envolvidos na ativação da sinalização do IFN do tipo I, na maturação de DCs e na ativação de células T (Figura 33F). Em particular, os presentes inventores observaram expressões geralmente mais altas tanto de moléculas de pontos de verificação imunológicos inibidoras (incluindo Pd-1, Pd-11, Ctla-4 e Lag-3) quanto agonistas (incluindo Icos, Gitr e Cd27)
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101/124 no TME comparadas com o controle (Figuras 33G). Além disso, análises adicionais do TME revelaram aumentos nos genes relacionados à resposta de Thl e Th2, o que sugere imunomodulação por monoterapia com mJX-594 (Figuras 33G). Os presentes inventores também, descobriram que vários genes envolvidos no TME e células mieloides tiveram suas quantidades aumentadas significativamente (Figuras 33G). De maneira notável, aumentos nas expressões de Nos2 e Cd86 representam a polarização células mieloides em macrofagos Ml. Estes resultados indicam que mJX-594 induz a ativação imunológica de longo prazo através de alterações dinâmicas no TME para remodelar tumores não inflamados em tumores inflamados com células T que podem responder ao bloqueio dos pontos de verificação imunológicos.
mJX-S94 aumenta. a infiltração de células T CD8+ e induz a rejmlarisação de células mieloides
[00212] O retardo no crescimento do tumor induzido por mJX-594 era dependente da dose (Figuras 34A e 34B). Em paralelo, os aumentos induzidos por mJX-594 na infiltração de células T CD8+ tanto nas regiões peri-tumoral quanto intratumoral também eram dependentes da dose (Figuras 34C e 34D). De fato, a análise dos subconjuntos por citometria de fluxo do compartimento linfoide também revelou que os números absolutos aumentados induzidos por mJX-594 de células T CD8+ e CD4+ intratumorais eram dependentes da dose (Figura 34E e 34G). Embora o número de células T reguladoras CD4+Foxp3+CD25+ também tenha aumentado após a administração tripla de mJX-594 (Figura 34H), a proporção de células T CD8+ para as células T reguladoras era 5,3 vezes maior comparada com a do tratamento de controle (Figura 341), implicando em um aumento total na função efetora das células T no TME através do tratamento com mJX-594. Adicionalmente, as expressões de ICOS e granzyme B (GzB), que são marcadores coestimuladores e de ativação de células T, foram aumentadas nas células T CD8+ após o
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102/124 tratamento com mJX-594 (Figura 34J). Uma análise adicional dos subconjuntos do compartimento de células mieloides revelou que não havia alterações significativas na fração de células mieloides CD1 lb+Grl+ nos tumores tratados com o tratamento com mJX-594 (Figura 34K). Entretanto, a fração de células mieloides monocíticas CD1 lb+Ly6GLy6C+ foi aumentada, enquanto que a fração de células mieloides granulocíticas CD1 lb+Ly6G’Ly6Cint foi reduzida, indicando a polarização das células mieloides após a administração de mJX-594 (Figuras 34L e 34M). Estas descobertas demonstram que a administração repetida de mJX-594 aumentou a imunidade anticâncer, resultando em maior infiltração de células T ativadas e repolarização de células mieloides.
Injeção intratumoral de mJX-594 leva a respostas sistêmicas e imunológicas específicas para câncer
[00213] Para determinar se a injeção local de mJX-594 podería induzir urna resposta imunológica sistêmica em tumores distantes não injetados, os presentes inventores administraram mJX-594 dentro do tumor do lado direito depois da implantação dos tumores Renca em ambos os flancos laterais. Este tratamento suprimiu o crescimento dos tumores Renca tanto a direita quanto à esquerda (oposto, lado não injetado) (Figura 35A). De acordo com a inibição do crescimento do tumor bilateralmente, as infiltrações de células T CD8+ nas regiões intratumorais eram 7,9 e 5,5 vezes mais altas nos tumores Renca tanto à direita quanto à esquerda (Figuras 35B e 35C), sugerindo que a viroteropia local com mJX-594 é capaz de ativar fortemente uma imunidade anticâncer sistêmica.
[00214] Depois disso, para excluir a possibilidade de espalhamento viral direto para tumores distantes através da circulação sistêmica após a viroterapia local, os presentes inventores examinaram a replicação viral nos tumores Renca não injetados à esquerda e não observaram vírus vaccinia detectável nos tumores à esquerda (Figura 41), indicando que a
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103/124 atividade anticâncer de mJX-594 era mediada pelo sistema imunológico e não era um resultado do espalhamento viral sistêmico.
[00215] Para avaliar se a resposta imunológica sistêmica observada era específica para o tumor, os presentes inventores realizaram um experimento similar utilizando camundongos implantados com tumores Renca no flanco direito e tumores CT26 no flanco esquerdo. O tratamento intratumoral do tumor Renca à direita com mJX-594 reduziu notavelmente o crescimento do tumor injetado, enquanto que o crescimento do tumor CT26 não tratado à esquerda não foi afetado (Figura 35D). Análises microscópicas fornecerem resultados consistentes em que as células T CD8+ se acumularam em Renca, mas não nos tumores CT26 (Figuras 35E e 35F), indicando que a viroterapia com mJX-594 induziu uma resposta de células T CD8+ específica para o tumor. Assim, estes resultados sugerem que o tratamento local com mJX-594 pode induzir a imunidade anticâncer sistêmica, com infiltração de linfócitos específicos para o tumor mesmo em tumores distantes.
Imunidade anticâncer desempenha um papel crítico na eficácia terapêutica total de JX.
[00216] Para determinar quais componentes do sistema imunológico eram responsáveis pela eficácia terapêutica de mJX-594, os presentes inventores examinaram seu efeito sobre tumores em camundongos tratados com anticorpos neutralizadores contra CD8, CD4 ou GM-CSF (Figura 36A). De importância especial, a depleção de células T CD8+ ou CD4+ anulou a inibição eficiente do crescimento do tumor através da monoterapia corn mJX-594 (Figuras 36B e 36C), enfatizando a importância do mecanismo mediado pelo sistema imunológico ao invés da oncólise direta, na inibição de tumor induzida por mJX-594. De maneira intrigante, a depleção de células T CD4+ no momento da injeção de mJX-594 reduziu a infiltração intratumoral de células T CD8+ (Figura 36D), indicando que as células T CD4+ estão envolvidas na ativação e no
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104/124 recrutamento das células T CD8+ no TME. Entretanto, a depleção das células T CD8+ não alterou significativamente a infiltração de células T CD4+ (Figura 36E), indicando que as células T CD8+ não afetava as células T CD4+ no TME. Estes dados mostram que o tratamento intratumoral de mJX-594 induz a preparação das células T CD8+ e CD4+, que podem interagir umas com as outras para mediar a imunidade anticâncer. A viroterapia previa com base nos vírus herpes e vaccinia utilizava GM-CSF como um transgene de ativação imunológica, que recruta e ativa as células apresentadores de antígeno (APCs) que subsequentemente desencadeiam a resposta de células T. Entretanto, o uso de GM-CSF ainda é controverso devido as suas funções imunossupressoras potenciais sobre a progressão do tumor tal como a indução da proliferação de células supressoras derivadas de linhagem mieloide (MDSCs) (Thorne, 2014). Consequentemente, os presentes inventores exploraram o fato de o GM-CSF ser requerido para o efeito terapêutico de mJX-594. De maneira interessante, a depleção de GMCSF neutralizou o efeito antitumor de mJX-594 e redução os níveis tanto de células T CD8+ quanto CD4+, sugerindo que GM-CSF é importante para a eficácia imunoterapêutica de mJX-594 (Figuras 36C-36E). Assim, tanto as células T CD8+ quanto CD4+ são mediadores indispensáveis do efeito anticâncer de mJX-594 e o GM-CSF podería fornecer um benefício imunoterapêu tico.
Combinação de mJX-594 com bloqueio de pontos de verificação imunológicos induzem um efeito anticâncer sinérgico com maior infiltração de linfócitos T no tumor
[00217] Para vencer a resistência a monoterapia com ICI, os presentes inventores avaliaram o benefício de combinar mJX-594 com ICI. A combinação de aPD-1 e mJX-594 reduziu o crescimento do tumor em 70%, enquanto que cada monoterapia com aPD-1 e mJX-594 retardou o crescimento do tumor em. 22,8% e 44% 12 dias após os
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105/124 tratamentos (Figuras 37A e 37B). Apoiando estas descobertas, análises microscópicas identificaram um aumento notável no recrutamento de células T CD8+ em ambas as regiões peritumoral (18,8 vezes) e intratumoral (21,4 vezes) dos tumores tratados com terapia de combinação comparados com o controle (Figuras 37C e 37D). Os vasos sanguíneos do tumor CD31+foram reduzidos de forma significativa nestas regiões (1,8 vez e 2,6 vezes, respectivamente; Figuras 37C e 37D). Em adição, uma apotose mais extensiva foi observada nos tumores tratados com terapia de combinação comparados com o controle (Figuras 5C e 5D). Embora a expressão de PD-L1 fosse mínima nos tumores de controle, esta é altamente regulada para mais após o tratamento com mJX-594 (Figuras 37C e 37D). Esta descoberta sugere que a expressão de PD-L1 induzida no TME é um mecanismo de feedback negativo adaptativo que referia a imunidade anticâncer após a viroterapia oncolítica, fornecendo, portanto, um fundamento racional para a terapia de combinação de mJX-594 e PD-1/bloqueio de PD-L1 para potencializar o efeito imunoterapêutico de mJX-594 (Figura 37E).
[00218] De forma geral, estes resultados sugerem que a terapia de combinação pode vencer a resistência à monoterapia com mJX594 ou aPD-1 através da imunidade anticâncer aumentada através do aumento da infiltração de células T CD8+.
[00219] Similarmente, o tratamento de combinação com o. CTLA-4 e mJX-594 também era sinérgico. Embora o crescimento do tumor fosse inibido de forma modesta pela monoterapia com mJX-594 (42,0%) ou aCTLA-4 (20,0%)), uma inibição mais forte (57,6%) foi observada com a terapia de combinação (Figuras 42A e 42B). Em adição, após a terapia de combinação, foi observado um acúmulo mais alto de células T CD8+ em ambas as regiões periféricas (aumento de 27,0 vezes) e central (aumento de 26,4 vezes) dos tumores comparados com os controles (Figuras 42C e 42D). Junto com os níveis aumentados de células T CD8+intratumorais, os vasos CD31+também foram interrompidos notavelmente tanto na região periférica quanto na central comparados
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106/124 com o controle (reduções de 2,1 vezes e 3,8 vezes, respectivamente; Figuras 42C e 42E). Além disso, a citometria de fluxo revelou que a infiltração intratumoral de células T CD8+ e CD4+ também foi aumentada através da terapia de combinação de mJX-594 e oCTLA-4 (Figuras 42F~ 42H).
[00220] Considerados juntos, estes resultados indicam que a terapia de combinação utilizando mJX-594 e ICI pode vencer a resistência à imunoterapia em TMEs imunossupressores, resultando em efeitos anticâncer sinérgicos.
A eficácia da imunoterapia de combinação com mJX-594 e ICIs intratumorais uão é enormemente afetada pelo cronograma de tratamento
[00221] Uma vez que os ICIs podem afetar negativamente a replicação viral e levar á eliminação prematura do OV, vários estudos exploraram cronogramas ótimos de tratamento utilizando combinações de viroterapia oncolítica sistêmica e ICIs e relataram que alguns cronogramas de combinação poderíam induzir a antagonização da eficácia terapêutica (Liu et al., 2017; Rojas et al., 2015). Entretanto, estudos similares examinando a viroterapia oncolítica local não foram relatados. Para estabelecer o cronograma de combinação ótimo para mJX-594 e ICIs intratumorais, os presentes inventores compararam os seguintes: (1) administração simultânea de mJX-594 e ICI (cronograma I); (2) início de ICI 3 dias após a administração de mJX-594 (cronograma II); e (3) administração de mJX-594 3 dias após o início de ICI (cronograma III; Figura 38A). Todos os cronogramas de combinação retardaram o crescimento do tumor em -40% (Figuras 38B e 38C). Similarmente, os níveis de células T CD8+ e CD4+ que se infiltram no tumor aumentaram >8 vezes e >4,0 vezes, respectivamente, o que também exibiu níveis notavelmente maiores de expressão de ICOS e GzB nas células T CD8+ (Figuras 38D-38F).
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[00222] Similarmente à terapia de combinação com mJX-594 e aPD1, a combinação de mJX-594 e a.CTLA-4 inibiu o crescimento do tumor em -40% independentemente do cronograma de tratamento (Figuras 43A e 43B). Além disso, a infiltração intratumoral de linfócitos T CD8+ e CD4+ (aumentos >7 vezes e >7 vezes, respectivamente), bem como a expressão de GzB e ICOS nas células CD8+, eram maiores independentemente do cronograma de tratamento (Figuras 43C-43E).
[00223] Coletivamente, a terapia de combinação com injeção de mJX594 intratumoral e bloqueio sistêmico de pontos de verificação imunológicos levou a uma resposta imunológica anticâncer eficiente independentemente do cronograma de tratamento, sugerindo que a administração intratumoral de mJX-594 não é significativamente afetada através da variação do cronograma de administração de ICI. A combinação tripla de mJX-594, aPDl e aCTLA4 pode induzir a regressão completa do tumor e fornece um benefício de sobrevivência em longo prazo no câncer renal implantado.
[00224] Uma vez que as combinações duais de mJX-594 e ICIs não induziram a regressão completa do tumor, os presentes inventores exploraram a terapia de combinação tripla utilizando mJX-594, aPD-1 e aCTLA-4. Enquanto a combinação dual de aPD-1 e aCTLA-4 retardou o crescimento do tumor em 14,5% e a monoterapia com mJX-594 inibiu o crescimento do tumor em 36,9%, a combinação tripla inibiu o crescimento do tumor em 76,5% (Figuras 39A e 39B). De maneira notável, uma pequena parte (-40%) deste grupo de combinação tripla resultou na regressão completa do tumor, o que não foi observado em quaisquer outros grupos (Figura 39C).
[00225] Para confirmar se os efeitos anticâncer potentes induzidos pela terapia de combinação tripla poderíam se traduzir em um benefício de sobrevivência em longo prazo, os presentes inventores realizaram análises de sobrevivência de camundongos que carregam tumor. De fato, os camundongos tratados corn a terapia de combinação tripla exibiram um benefício de sobrevivência notável comparada com os outros
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108/124 tratamentos (Figura 39D). Além disso, os camundongos com regressão completa do tumor ficaram, livres de tumores durante mais de 12 semanas após o término do tratamento e ficaram totalmente protegidos contra um novo desafio com células tumorais, sugerindo o estabelecimento de uma memória imunológica em. longo prazo eficiente (Figura 39E).
[00226] Estas descobertas demonstram que a imunoterapia de combinação tripla tem o potencial de induzir a regressão completa do tumor e a sobrevivência em longo prazo.
Terapia de combinação tripla aprimora as respostas imunológicas anticâncer em um modelo de câncer de mama espontâneo
[00227] Para validar de forma definitiva a eficácia imunoterapêutica em longo prazo da terapia de combinação tripla no tumor com resistente ao sistema imunológico, os presentes inventores empregaram o modelo de camundongo transgênico MMTV-PyMT, que é a modelo de câncer de mama espontâneo com resistência intrínseca à imunoterapia para câncer (Schmittnaegel et al., 2017). Após 4 semanas de tratamento, os camundongos tratados com a combinação tripla de mJX-594, aPD-1 e aCTLA-4 exibiram uma redução significativa na carga tumoral total de 38,7% e no número de nódulos do tumor mamário palpáveis comparados com os camundongos de controle (Figura 40A-40D). Além disso, a terapia de combinação tripla levou a uma redução de 48,1% no tamanho médio de cada nódulo de tumor e melhorou a sobrevivência geral comparada com os outros tratamentos (Figura 40E-40F). As análises histológicas (Figura 40G, ver a legenda para uma explicação detalhada) revelaram carcinoma menos invasivo com as margens do tumor bem preservadas no grupo de combinação tripla, indicando que a combinação tripla retarda eficientemente a progressão e a invasão do tumor. Por outro lado, os tumores tratados com uma combinação dual de aPD-1 e aCTLA4 exibiram fenótipo de carcinoma invasivo que é comparável com o grupo
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109/124 de controle, que invadiu os tecidos circundantes e formaram placas sólidas de células tumorais. Consequentemente, após a terapia de combinação tripla, o recrutamento intratumoral de células T CD8+ foi notavelmente aumentado > 50 vezes comparada com quaisquer outros tratamentos (Figuras 40H e 401). Entretanto, a densidade vascular do tumor era similar entre os grupos de tratamento (Figura 40J). Estas descobertas Indicam que a imunidade anticâncer aprimorada, não o efeito de interrupção vascular, é crítica para a eficácia terapêutica de longa duração da imunoterapia de combinação tripla com mJX-594 e ICIs. Finalmente, o número de metástases pulmonares hematogênicas foi reduzido significativamente no grupo de combinação tripla (Figuras 40K e 40L), indicando efeitos antimetastásicos eficientes através da terapia de combinação tripla.
[00228] Considerados juntos, estes resultados demonstraram que a imunoterapia de combinação tripla com mJX-594 e ICIs podem induzir uma anticâncer resposta imunológica robusta mesmo em um modelo de câncer de mama espontâneo pouco imunogênico.
DISCUSSÃO
[00229] Aqui, os presentes inventores demonstraram que a terapia de combinação com mJX-594 e ICIs é uma estratégia terapêutica eficiente para tumores resistentes ao sistema imunológico. A terapia de combinação levou a um “ponto de ebulição” imunológico no qual um tumor não inflamado frio é suficientemente inflamado para possibilitar que o sistema imunológico do hospedeiro erradique as células tumorais. O efeito mais profundo foi observado na imunoterapia tripla com mJX594, anti-PD-1 e anti-CTLA4, que induziu regressão completa em -40% dos tumores Renca, que é um dos tumores singênicos mais resistentes à imunoterapia. Esta forte sinergia pode ser explicada pela cooperação mutuamente complementar de OV e ICIs.
[00230] JX-594 é um OV no estágio mais avançado dos testes
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110/124 clínicos, que é conhecido por agir através de vários mecanismos (AbouAlfa et al., 2016). Embora este possa induzir rapidamente a oncólise direta e a ruptura vascular no tumor, estes efeitos são transitórios diminuem em grande parte dentro de 1 semana da injeção. Depois disso, as células T CD8* se infiltram extensivamente no tumor para iniciar as respostas imunológicas anticâncer. Entretanto, ao mesmo tempo, os tumores começam a evoluir para evitar a eliminação mediada pelo sistema imunológico através da regulação para mais de moléculas de pontos de verificação inibidoras do sistema imunológico tal como PD-1, PD-L1 ou CTLA-4 no TME. Uma vez que os efeitos anticâncer mais potentes e duráveis do OV são atingidos quando este é acoplado à indução bem sucedida e à manutenção da imunidade antitumor, é razoável combinar ICIs com OV para prevenir o desligamento precoce da imunidade anticâncer induzida pelo OV.
[00231] Embora a monoterapia com ICI tenha revolucionado o panorama tratamento de câncer, sua resposta terapêutica dramática fica confinada a um subgrupo de pacientes. Isto deu origem ao conceito de tumores imunologicamente ‘quentes’ ou ‘frios’; os tumores quentes respondem bem aos ICIs uma vez que são imunologicamente inflamados com TILs e têm alta expressão de PD-L1, enquanto que os tumores frios são refratários aos ICIs devido à escassez dos TILs CD8+ e ao TME imunossupressor (Bell e Ilkow, 2017; Gajewski et al., 2013). Portanto, os esforços atuais são concentrados em vencer a resistência aos ICIs através da conversão de tumores imunologicamente frios em tumores quentes. Nestes aspectos, o resultado dos presentes inventores apresenta mJX594 como um parceiro de combinação ideal para os ICIs. Este pode ser replicado seletivamente em células tumorais, destruí-las e liberar antígenos de tumor para estimular o sistema imunológico do hospedeiro. Além disso, o estudo dos presentes inventores mostra que este pode converter drasticamente o TME do estado frio para quente através de introdução de respostas inflamatórias intratumorais: indução de respostas de Thl, ativação e recrutamento de células T, regulação para
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111/124 mais de PD-L1 e polarização das células mieloides para a atividade antitumor. De maneira intrigante, é sabido que a replicação e o espalhamento do OV são mais ativos nos tumores frios onde há poucas células imunológicas para eliminar o OV, enquanto que nos tumores quentes com muitos TILs residentes poderíam induzir a eliminação prematura do OV e atenuar seus efeitos terapêuticos (Bell e Ilkow, 2017). Portanto, junto com os resultados deste estudo, mJX-594 é um parceiro de combinação ótimo para os ICIs, especialmente para tumores frios não inflamados com resistência intrínseca â imunoterapia.
[00232] GM-CSF é a carga genética terapêutica útil mais comumente utilizada dos OVs. Dois OVs nas fases mais avançadas dos testes clínicos, T-Vec e Pexa-Vec (JX-594), são armados com GM-CSF. Embora o GMCSF seja conhecido de forma geral como indutor da proliferação de várias células imunológicas tais como as DCs, há uma preocupação em relação à proliferação indesejada de células imunossupressoras tais como as MDSCs (Hou et al., 2016). No presente estudo, os presentes inventores revelaram que o mJX-594 não alterou significativamente a fração de células CDllb+Grl* intratumorais. Em adição, a neutralização do GMCSF removeu a eficácia terapêutica do mJX-594, o que era parcialmente devido à redução nos TILs CD8+, indicando que o GM-CSF tem um papel indispensável na imunidade para câncer induzida pelo mJX-594.
[00233] Estudos anteriores relataram que, embora a combinação de OV e ICIs induza resposta imunológica impressionante, sua eficácia terapêutica pode ser enormemente afetada pela rota de administração e pelo cronograma de tratamento. Em particular, quando tanto o OV quanto os ICIs são administrados simultaneamente de forma sistêmica, a combinação poderia ser antagonista devido â imunidade antiviral induzida pelos ICIs que pode facilitar a eliminação viral prematura, indicando a importância do espaço de tempo adequado entre os tratamentos para que o OV induza uma imunidade anticâncer bem sucedida. No presente estudo, a injeção local de mJX-594 induziu consistentemente a imunidade anticâncer sem ser significativamente
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112/124 afetada pelas sequências de administração. Os presentes inventores presumem que isto ocorre porque a injeção intratumoral forneceu ao OV um tempo lag suficiente para inflamar o TME antes de ser eliminado pela imunidade antiviral sistêmica. Portanto, no planejamento destes testes clínicos da combinação de 1CI e OV, a terapia com OV intratumoral podería ser mais factível comparada com a terapia com OV sistêmica em termos de cronograma de administração.
[00234] Em adição aos resultados encorajadores dos presentes inventores com a combinação de mJX-594 e ICIs, já estão em andamento vários testes clínicos para investigar a eficácia de JX-594 em combinação com ctPD-1, aCTLA-4 ou aPD-Ll de se direcionar a vários cânceres sólidos, incluindo câncer de fígado, câncer renal e câncer de cólon (ClinicalTrials.gov: NCT03071094, NCT02977156, NCT03294083 e NCT03206073). Assim, os presentes inventores seriam capazes de verificar as descobertas deste estudo em um cenário clínico no futuro próximo.
[00235] Em conclusão, este estudo indicou que a injeção intratumoral de mJX-954 induz uma remodelagem profunda do TME do estado frio para quente e induz uma imunidade anticâncer robusta em combinação com os ICIs, vencendo a resistência à imunoterapía.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Camundongos e linhagens de células
[00236] Os camundongos BALB/c machos entre 6 a 8 semanas de idade foram obtidos na Orient Bio Inc. (Seongnam, Gyeonggi, Korea) e as fêmeas de camundongos transgênicos MMTV-PyMT (P'VB/N) foram, obtidas no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA, #002374). Os camundongos foram alojados em uma unidade de animais livre de agentes patogênicos específicos na CHA University (Seongnam, Geyonggi, Korea). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, #170025) of CHA
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University e foram realizados de acordo com. os protocolos aprovados. A linhagem de células de câncer renal Renca de camundongos e a linhagem de células de câncer de cólon CT26 de camundongos foram obtidas na American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA #CRL-2947) e no Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea, #80009). Estas células foram, mantidas no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ou Melo de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), cada um suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina e foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 em uma incubadora.
Produção e quantificação de virus
[00237] mJX-594, fornecido por Sillajen, Inc. (Seoul, Korea), é uma linhagem Western Reserve (WR) do virus vaccinia que codifica GM-CSF de camundongo no locus do gene da timidina quinase do virus vaccinia sob o controle do promotor p7.5 e foi utilizado ao longo de todo este estudo. Este vírus foi amplificado em células HeLaS3 antes da purificação. Sucintamente, as células HeLaS3 foram infectadas com o vírus vaccinia recombinante durante 3 dias, coletadas por centrifugação, então homogeneizadas e centrifugadas mais uma vez. O sobrenadante contendo o vírus foi colocado em camada sobre um colchão de sacarose a 36% e centrifugado a 32.900 g e pelota viral purificada, foi ressuspensa em 1 mM de Tris, pH 9,0. Para determinar o título viral, o vírus diluído em série em DMEM sem soro foi aplicado sobre uma monocamada de células U-2 OS durante 2 h e então foi adicionado 1,5% de carboximetilcelulose em DMEM suplementado com 2 % de FBS. Após 72 h, as células foram coradas com cristal violeta, a 0,1% e as placas foram contadas.
Modelos de tumor e regimes de tratamento
[00238] Os tumores foram implantados através da injeção subcutânea. de 2 x 105 células Renca no flanco direito de camundongos
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BALB/c do tipo selvagem.. Quando os tumores atingiram > 50 mm.3, os camundongos foram tratados com PBS ou 1 x 107 unidades formadoras de placas (ufp) de mJX-594 através de injeção intratumoral a cada 3 dias. Para o modelo de tumor bilateral, 2 χ 105 células RENCA foram, implantadas de forma subcutânea no flanco direito e 1 χ 105 células Renca ou CT26 foram implantadas de forma subcutânea no flanco esquerdo 4 dias later. Para o estudo de depleção de células, anticorpos contra CD4 (200 pg, clone GK1.5, BioXCell), CD8 (200 pg, clone 53-6.72, BioXCell) ou GM-CSF (200 pg, clone MP1-22E9, BioXCell) foram injetados de forma intraperitoneal junto com mJX-594. Para o bloqueio dos pontos de verificação imunológicos, anticorpos anti-PD-1 (10 mg/kg, clone J43, BioXCell) e/ou anti-CTLA-4 (4 mg/kg, clone 9D9, BioXCell) foram injetadas de forma intraperitoneal com ou sem mJX-594, a cada 3 dias dependendo do cronograma de dosagem. Os tumores foram medidos a cada 2 ou 3 dias utilizando um calibre digital e os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula elipsoide modificada (1/2 x (comprimento x largura2)). No dia 50, os camundongos sobreviventes com regressão completa do tumor foram desafiados novamente com 2 χ 105 células Renca no flanco esquerdo e monitorados em relação ao crescimento do tumor e à sobrevivência. Os camundongos foram submetidos à eutanásia quando os tumores atingiram 1.5 cm de diâmetro ou quando os camundongos ficaram moribundos.
[00239] As fêmeas de camundongos transgênicos MMTV-PyMT foram obtidas no Jackson Laboratory. Nove semanas após o nascimento, o volume de cada nódulo de tumor palpável (> 20 mm3) foi medido e o volume total de todos os tumores combinados foi utilizado para calcular a carga tumoral por camundongo. Os camundongos MMTV-PyMT foram separados aleatoriamente de acordo com sua carga tumoral inicial e foram tratados com 1 χ 107 ufp de mJX-594 na presença ou na ausência dos inibidores de pontos de verificação imunológicos PD-1 (10 mg/kg) ou CTLA-4 (4 mg/kg) nos pontos de tempo indicados. Após 4 semanas de tratamento, os camundongos foram anestesiados e os tecidos foram
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115/124 coletados para análises adicionais. As análises para MMTV-PyMT foram realizadas como descrito anteriormente (Kim et al., 2014; Park et al., 2016).
Análise histologies
[00240] Para coloração com hematoxilina e eosina (H&E), os tumores foram fixados durante toda a noite em 4% de paraformaldeído (PFA). Após o processamento do tecido utilizando procedimentos padronizados, as amostras foram incrustadas em parafina e cortadas em seções de 3 pm seguidas pela coloração com H&E. A imunofluorescência foi realizada em seções de tecido congeladas. Os tumores foram fixados em 1% de PFA à temperatura ambiente e foram lavados várias vezes com PBS, infiltrados com 30% de sacarose e congelados em composto OCT. As seções congeladas (50 pm de espessura) foram bloqueadas com 5% de soro caprino normal em PBS-T (0,1% de triton X-100 em PBS) e então incubadas durante toda a noite com os seguintes anticorpos primários: antivírus vaccinia (coelho, Abeam), anti-CD31 (hamster, clone 2H8, Millipore; coelho, Abeam), anti-CD8 (rato, clone 53-6.7, BD Pharmingen), anti-CDllc (hamster, clone HL3, BD Pharmingen), anti-PD-11 (coelho, clone 28-8, Abeam), anti-Caspase3 (coelho, R&D Systems), anti-PanCítoqueratína (Camundongo, clone AE1/AE3, DAKO), anti-CDllb (rato, clone Ml/70, BD Pharmingen) ou anti-CD3e (Hamster, clone 145-2C11, BD Pharmingen). Após várias lavagens, as amostras foram incubadas durante 2 h ti temperatura ambiente com os seguintes anticorpos secundários: anti-IgG de coelho conjugado com FITC, Cy3 ou Cy5 (Jackson ImmunoResearch), anti-IgG de rato conjugado com FITC (Jackson ImmunoResearch), anti-IgG de hamster conjugado com FITC ou Cy3 (Jackson ImmunoResearch) ou anti-IgG de camundongo conjugado com FITC (Jackson ImmunoResearch). Os núcleos das células foram contracorados com 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI Invitrogen). Finalmente, as amostras foram montadas com. meio de montagem.
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116/124 fluorescente (DAKO) e as imagens foram obtidas com um microscópio Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss).
Análise morfométrica
[00241] As medidas de densidade do vírus vaccinia, dos vasos sanguíneos, dos linfócitos T e das células dendríticas, bem como a medida da área, das células mieloides, foram realizadas utilizando o software Imaged (http://rsb.info.nih.gov/ij). Para determinar o nível de infecção pelo vírus vaccinia, a área W+ por campo aleatório de 0,49 mm2 foi calculada nas seções de tumor. Para a densidade dos vasos sanguíneos, a área de CD3P por campo aleatório de 0,49 mm2 foi calculada nas regiões perí- e intratumorais. O grau de infiltração de linfócitos T citotóxicos foi apresentado na forma da porcentagem da área de CD8+ por campo aleatório de 0,49 mm2 nas regiões peri- e intratumorais. O nível de células dendríticas foi medido através do cálculo da porcentagem da área de CD1 lc+ em campos aleatórios de 0,49 mm2. A extensão da apoptose foi exibida na forma de porcentagem da. área de Caspase3+ for campos aleatórios de 0,49 mm2. Para definir as células PD-L1+, a colocalização de PD-L1+ com Pan-CK+, CDllb+ e CD3+ foi identificada, no campo aleatório de 0,01 mm2. A metástase de tumor nos camundongos MMTV-PyMT foi quantificada através da medida de colônias de tumor >100 pm de diâmetro. Todas as medidas foram realizadas em pelo menos 5 campos por camundongo.
Análise de eitometòa de flwo de células imunológicas que se infiltram no tumor
[00242] Os tumores de cada grupo de tratamento foram cortados em pedaços antes da incubação com agitação durante 1 h a 37°C, na presença de colagenase D (20 mg/mL, Roche) e DNase I (2 mg/mL, Roche). As suspensões de células foram geradas através da pipetação repetida, e então filtradas através de uma peneira de células de 70 pm. e
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117/124 lisadas para remover as células vermelhas. Após a lavagem com PBS, células ressuspensas foram filtradas através de uma tela de nylon. As suspensões de células isoladas dos tecidos de tumor foram bloqueadas com um anticorpo contra CD 16/32 (clone 2.4G2, BD Pharmingen) e coradas com. um corante de viabilidade que pode ser fixado (eFlouor450, eBioscience) para distinguir as células vivas. Para a análise dos marcadores de superfície, as células foram coradas em PBS contendo 1% de FBS, com anticorpos direcionados para CD45 (30-F11, BD Pharmingen), CD4 (RM4-5, BD Pharmingen), CD8 (53-6.7, BD Pharmingen), CD3 (17A2 ou 145-2C11, eBioscience), ICOS (7E.17G9 ou 15F9, eBioscience), CDllb (Ml/70, BD Pharmingen), F4/80 (BM8, eBioscience), MHC II (M5/114.15.2, eBioscience), Ly6C (HK1.4, eBioscience), Ly6G (1A8-Ly6g ou RB6-8C5, eBioscience) ou CD206 (MR5D3, eBioscience), durante 30 min em gelo. As células foram adicionalmente permeabilizadas utilizando um kit de fixação e permeabilização de FoxP3 (eBioscience) e coradas em relação a FoxP3 (FJK-16s, eBioscience), CD25 (PC61.5, eBioscience) ou Granzyme B (NGZB, eBioscience). As células marcadas foram obtidas utilizando um citômetro de fluxo CytoFLEX (Beckman Coulter) e analisadas utilizando o software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR).
Isolamento de RNA e análise da expressão gênica com NanoString
[00243] O RNA total foi extraído de lisados de tumor total utilizando TRIzol (Invitrogen) e purificado com etanol; a qualidade do RNA foi confirmada utilizando urn equipamento Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies, IA, USA). A obtenção de um perfil imunológico foi realizada com um digital multiplexed NanoString nCounter PanCancer Immune Profiling Mouse Panel (NanoString Technologies), utilizando 100 ng de RNA total isolados dos tecidos do tumor. As hibridízações foram realizadas a 65 °C durante 16-30 h através da combinação de 5 pL de cada amostra de RNA com 8 pL da sonda nCounter Reporter em tampão
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118/124 de hibridização e 2 pL de sondas nCounter Capture, para um volume de reação total de 15 pL. A sonda em excesso foi removida através da purificação à base de esferas magnéticas em duas etapas utilizando a nCounter Prep Station (NanoString Technologies). A abundância das moléculas alvos específicas foi quantificada com o nCounter Digital Analyzer através da contagem de código de barras fluorescentes individuais e da avaliação das moléculas alvos correspondentes. Para cada ensaio, foi realizada uma varredura de alta densidade abrangendo 280 campos de visão. Os dados foram coletados utilizando o nCounter Digital Analyzer após a aquisição de imagens dos repórteres fluorescentes imobilizados no cartucho de amostra com uma câmera CCD. A análise dos dados foi realizada utilizando o software nSolver (NanoString Technologies). Os dados para a obtenção de perfil do mRNA foram normalizados em relação aos genes housekeeping (de manutenção) e analisados utilizando o software R (www.r-project.org).
Análise estatística
[00244] As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) e PASW statistics 18 (SPSS). Os valores são representados na forma da média +/erro padrão da média (SEM) a não ser que seja indicado o contrário. As diferenças estatísticas entre as médias foram testadas utilizando testes t de Student não pareados. As curvas de sobrevivência foram geradas utilizando o método de Kaplan-Meier e as diferenças estatísticas entre as curvas foram analisadas utilizando o teste log-rank. O nível de significância estatística foi ajustado em p < 0,05.
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[00245] Todas as composições e/ou os métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentos excessivos à luz da presente divulgação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os peritos na técnica que podem ser aplicadas variações nas composições e/ou nos métodos e nas
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123/124 etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se afastar do conceito, do espírito e do âmbito da invenção. Mais especificam ente, será evidente que certos agentes que são tanto quimícamente quanto fisíologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui enquanto que os mesmos resultados ou similares seria antingidos. Todos estes substitutos e modificações similares evidentes para os peritos na técnica são considerados como estando dentro do espírito, do âmbito e do conceito da invenção que são definidos pelas Reivindicações em anexo.
[00246] Os exemplos apresentados acima são fornecidos para fornecer aos peritos comuns na técnica uma divulgação e uma descrição completadas de como fazer e utilizar as modalidades das composições, dos sistemas e dos métodos da invenção e não é pretendido que limitem o âmbito do que os inventores consideram como sua invenção. É pretendido que as modificações dos modos para realização da invenção descritos acima que são óbvios para os peritos na técnica estejam dentro do âmbito das Reivindicações a seguir. Todas as patentes e publicações mencionadas no Relatório Descritivo são indicativas dos níveis de perícia dos peritos na técnica à qual a invenção pertence. Todas as referências citadas nesta divulgação são incorporadas como referência até a mesma extensão como se cada referência fosse incorporada como referência sem sua totalidade individualmente.
[00247] Todos os títulos e as denominações de seções são utilizados com a finalidade de clareza e referência apenas e não devem ser considerados como límitantes de forma alguma. Por exemplo, os peritos na técnica terão em consideração a utilizada de combinar vários aspectos de títulos e seções diferentes quando apropriado de acordo com o espírito e o âmbito da invenção descritos aqui.
[00248] Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui como referência em suas totalidades e para todas as finalidades até a mesma extensão como se cada publicação ou patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado com
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124/124 sendo incorporado como referência em sua totalidade para todas as finalidades.
[00249] Muitas modificações e variações deste pedido de patente podem ser feitas sem se afastar de seu espírito e seu âmbito, como será evidente para os peritos na técnica. As modalidades e os exemplos específicos descritos aqui são oferecidos apenas com a finalidade de exemplo e o pedido de patente deve ser limitado apenas pelos termos das Reivindicações em anexo, junto com o âmbito total de equivalentes para os quais as Reivindicações são designadas.

Claims (66)

1. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, caracterizado por que compreende a administração de forma concorrente ao indivíduo de uma quantidade eficiente de uma combinação que compreende (a.) um vírus vaccinia oncolítico replicativo e (b) um. ou mais inibidores de pontos de verificação imunológícos.
2. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral, intravenosa, intraarterial ou intraperitoneal.
3. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral.
4. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo corn qualquer uma das Reivindicações de 1-3, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor.
5. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-4, caracterizado por que o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
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6. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-5, caracterizado por que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente à proteína de ponto de verificação imunológico, preferencialmente um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos.
7. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-6, caracterizado por que o inibidor de ponto de verificação imunológico inibe uma proteína de ponto de verificação imunológico selecionada do grupo que consiste de antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4), proteína de morte celular programada 1 (PD-1), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, mediador de entrada de herpesvirus (HVE1M), proteína de membrana de célula T 3 (TIM3), galectina 9 (GAL9), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), supressor de ativação de células T contendo o domínio V de imunoglobulina (Ig) (VISTA), Receptor Similar à Imunoglobulina de Célula Killer (KIR), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), imunorreceptor de células T com Ig e domínios ITIM (TIGIT), indolamina. 2,3-dioxigenase (IDO) e combinações dos mesmos.
8. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD-1 ou PD-L1, preferencialmente selecionado do grupo que consiste de: BMS-936559, atezolizumab, durvalumab, avelumab, nivolumab, pembrolizumab e lambrolizumab.
9. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em
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Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o inibidor de ponto de verificação ímunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA4, preferencialmente selecionado do grupo que consiste de ipilimumab e tremelimumab.
10. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-9, caracterizado por que vários inibidores de pontos de verificação imunológicos são administrados de forma concorrente ao indivíduo com o vírus vaccinia oncolítico.
11. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que é administrado de forma concorrente ao indivíduo:
(a) um inibidor de CTLA4, um inibidor de PD-1 e um. vírus vaccinia oncolítico replicativo;
(b) um inibidor de CTLA4, um inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo;
(c) um inibidor de PD-1, um inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo; ou (d) um inibidor de PD-1, um inibidor de CTLA4, um. inibidor de IDO e um vírus vaccinia oncolítico replicativo;
(e) um inibidor de LAG3, um inibidor de PD-1 e um vírus vaccinia oncolítico replicativo; ou (f) um inibidor de TIGIT, um inibidor de PD-1 e um. vírus vaccinia oncolítico replicativo.
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12. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-11, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é uma Cepa Wyeth, uma Cepa Western Reserve, uma Cepa Lister ou uma Cepa Copenhagen.
13. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-12, caracterizado por que o vírus vaccinia compreende uma ou mais modificações genéticas para aumentar a seletividade do vírus por células cancerosas, preferencialmente o vírus é engenheirado para não ter timidina quinase funcional e/ou para não ter fator de crescimento de vaccinia funcional.
14. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-13, caracterizado por que o vírus vaccinia compreende um gene 14L e/ou F4L funcional.
15. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-14, caracterizado por que o vírus vaccinia é engenheirado para expressar (i) uma citocina preferencialmente selecionada de GNÍ-CSF, IL-2, IL-4, IL-5 JL-7, 1L-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-24, lFN-γ, TNF-o. e/ou (ii) um antígeno de tumor preferencialmente selecionado de BAGE, GAGE-1, GAGE-2, CEA, AIM2, CDK4, BMI1, COX-2, MUM-1, MUC-1, TRP-1 TRP-2, GP100, EGFRvIll, EZH2, LICAM, Livin, Είνίηβ, MRP-3, Nestin, OLIG2, SOX2, E6 do papilomavírus humano, E7 do papilomavírus humano, ART1, ART4, SART1, SART2, SAR.T3, B-ciclina, β-catenina, Gli 1, Cav-1, catepsina B, CD74, E-caderina, EphA2/Eck, Fra-l/Fosl 1, Gangliosídeo/GD2, GnTV, β 1,6-N, Her2/neu, Ki67, Ku70/80, IL-13Ra2, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, MART-1, PROXI, PSCA, SOXIO, SOX11, Survivina, caspase
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8, UPAR, CA-125, PSA, pl85HER2, CD5, IL-2R, Fap-α, tenascina, antígeno p97 associado a melanoma e WT-1, regulador de sinalização de proteína G 5 (RGS5), Surivina (BIRC5:::inibidor baculoviral de apoptose que contém 5 repetições), Proteína de ligação ao fator de crescimento similar à insulina 3 (IGF-BP3), timidilato sintetase (TYMS), proteína que pode ser induzida por hipóxia 2, associado a gotículas lipídicas induzido por hipóxia (HIG2), metalopeptidase de matriz 7 (MMP7), homólogo de prune 2 (PRUNE2), similar à proteína RecQ (similar â DNA helicase Ql) (RECQL), receptor de leptina (LEPR), inibidor de feedback do receptor ERBB 1 (ERRFI1), proteína lisossomal transmembrana 4 alfa (LAPTM4A); RAB1B, família do oncogene RAS (RAB1B), CD24, timosina beta 4 de Homo sapiens, ligado aX (TMSB4X), proteína A6 de ligação ao cálcio SI00 de Homo sapiens (S100A6), receptor de adenosina A2 de Homo sapiens (ADORA2B), quadro aberto de leitura 61 do cromossomo 16 (C16orf61), regulador de diferenciação
1 de ROD1 (ROD1), sirtuína desacetilase-2 dependente de NAD (SIR2L), tubulina alfa 1c (TUBA1C), fator inibidor 1 de ATPase (ATPIF1), antígeno de estroma 2 (STAG2), caseína quinase nuclear e substrato 1 dependente de ciclina (NUCKS1).
16. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Qne Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-15, caracterizado por que o vírus vaccinia é administrado em uma quantidade de 107 a 1011 unidades formadoras de placa (pfu), preferencialmente 108-1010 pfu, com maior preferência 109 -1010 pfu.
17. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-16, caracterizado por que o inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado em uma quantidade de
2 mg/kg a 15 mg/kg.
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18. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-17, caracterizado por que o indivíduo tem um câncer selecionado de carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, carcinoma de célula renal, câncer de bexiga, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula não pequena), câncer de estômago, câncer de esôfago, sarcoma, mesotelioma, melanoma, câncer pancreâtico, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer cervical e de fígado.
19. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o indivíduo tem carcinoma de célula renal.
20. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-19, caracterizado por que o indivíduo não teve sucesso em pelo menos um tratamento de quimioterapia ou de imunoterapia prévio.
21. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o indivíduo tem um câncer que é refratário a uma terapia com inibidor de ponto de verificação imunológico, preferencialmente o câncer é resistente ao tratamento com anticorpos anti-PD-1 e/ou anticorpos anti-CTLA-4.
22. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que o indivíduo é identificado como um candidato para uma terapia com. inibidor de ponto de verificação imunológico.
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23. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-22, caracterizado por que compreende a administração ao indivíduo de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia (agentes alquilantes, análogos de nucleosídeos, modificadores de citoesqueleto, agentes citostáticos) e radioterapia.
24. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-23, caracterizado por que compreende a administração ao indivíduo de uma terapia com vírus oncolítico adicional (por exemplo, rhabdovírus, Semliki Forest Vírus).
25. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-24, caracterizado por que o indivíduo é um ser humano.
26. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1-25, caracterizado por que uma primeira dose do vírus vaccinia oncolítico replicativo e uma primeira dose do inibidor de ponto de verificação imunológico são administradas simultaneamente ao indivíduo seguidas por pelo menos uma administração simultânea consecutiva subsequente do vírus e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo.
27. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por que compreende pelo menos uma primeira, uma segunda e uma terceira administrações simultâneas consecutivas do vírus vaccinia oncolítico replicativo e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo.
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28. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com a Reivindicação 27, caracterizado por que compreende pelo menos uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta administrações simultâneas consecutivas do vírus vaccinia oncolítico replicativo e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo.
29. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 26-28, caracterizado por que a administração simultânea da primeira dose do vírus vaccinia oncolítico replicativo e da primeira dose do inibidor de ponto de verificação imunológico e pelo menos uma administração simultânea consecutiva subsequente do vírus e do inibidor de ponto de verificação imunológico ao indivíduo são seguidas pela administração de pelo menos uma dose de inibidor de ponto de verificação imunológico individualmente ao indivíduo.
30. Método Para Tratamento e/ou Prevenção de Câncer em Indivíduo Que Necessite de Tal Tratamento, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 26-29, caracterizado por que compreende um intervalo de 1-3 semanas entre as administrações simultâneas consecutivas dos agentes, preferencialmente que compreende um intervalo de uma semana, duas semanas ou 3 semanas.
31. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, caracterizado por que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um. vírus vaccinia oncolítico replicativo e (b) um inibidor de uma proteína de ponto de verificação imunológico.
32. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o vírus vaccinia
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9/13 oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral, intravenosa, intra-arterial ou intraperitoneal.
33. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral.
34. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor.
35. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em. um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
36. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 34 ou 35, caracterizado por que compreende uma etapa de medida do nível de expressão da proteína de ponto de verificação imunológico no tumor antes da administração da combinação.
37. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 31-36, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, ΤΊΜ3 e TIGIT.
38. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4.
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10/13
39. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação ímunológico é PD-L1.
40. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação ímunológico é LAG3.
41. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação ímunológico é TIGIT.
42. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação ímunológico é PD-1.
43. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação ímunológico é TI M3.
44. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 31-43, caracterizado por que o tumor é um câncer sólido.
45. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 31-43, caracterizado por que o tumor é um câncer colorretal.
46. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 31-43, caracterizado por que o tumor é um carcinoma de célula renal.
47. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 39 ou 42, caracterizado por que o inibidor da
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11/13 proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD-1 ou PD-L1 preferencialmente selecionado do grupo que consiste de BMS-936559, atezolizumab, durvalumab, avelumab, nivolumab, pembrolizumab e lam bro lizum ab.
48. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 38, caracterizado por que o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4, preferencialmente selecionado do grupo que consiste de ipilimumab e tremelimumab.
49. Métod© de Tratamento de Tumor em Ser Humano, caracterizado por que compreende a administração de forma concorrente ao ser humano de uma combinação que compreende (a) um vírus vaccinia oncolítico replicativo, (b) um inibidor de PD-1 e/ou PD-L1 e (c) um inibidor de uma proteína de ponto de verificação imunológico.
50. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizado por que o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em. um nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
51. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral, intravenosa, intra-arterial ou intraperitoneal.
52. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado de forma intratumoral.
53. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo
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12/13 com a Reivindicação 49, caracterizado por que o vírus vaccinia oncolítico replicativo é administrado em uma quantidade eficiente para induzir a expressão de uma proteína de ponto de verificação imunológico no tumor.
54. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizado por que o tumor não expressa a proteína de ponto de verificação imunológico ou expressa a proteína de ponto de verificação imunológico em um. nível relativamente baixo antes da administração do vírus vaccinia oncolítico replicativo.
55. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 53 ou 54, caracterizado por que compreende uma etapa de medida do nível de expressão da proteína de ponto de verificação no tumor antes da administração da combinação.
56. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 49-55, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é selecionada de CTLA-4, LAG3, ΤΙΜ3 e TIGIT.
57. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 56, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é CTLA-4.
58. Método de Tratamento do Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 56, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é LAG3.
59. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 56, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é TIGIT.
60. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo
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13/13 com a Reivindicação b6, caracterizado por que a proteína de ponto de verificação imunológico é TI M3.
61. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 49-60, caracterizado por que o tumor é um câncer sólido.
62. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 49-61, caracterizado por que o tumor é um câncer colorretal.
63. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 49-62, caracterizado por que o tumor é um carcinoma de célula renal.
64. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizado por que o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a PD-1 ou PD-L1 preferencialmente selecionado do grupo que consiste de BMS-936559, atezolizumab, durvalumab, avelumab, nívolumab, pembrolizumab e lambrolizumab.
65. Método de Tratamento de Tumor em Ser Humano, de acordo com a Reivindicação 57, caracterizado por que o inibidor da proteína de ponto de verificação imunológico é um anticorpo monoclonal que se liga seletivamente a CTLA-4, preferencialmente selecionado do grupo que consiste de ipilimumab e tremelimumab.
66. Uso de Composição, conforme definida nas Reivindicações independentes 1, 31 e 49 e/ou suas Reivindicações dependentes, em particular 6, 7, 16 e 17, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para tratar e/ou prevenir câncer em sujeito necessitado desse tratamento.
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